Протеомні робочі процеси з високопродуктивним зварюванням білків

Протеоміка є важливою галуззю для розуміння біологічних процесів і систем, а перетравлення білків є критичним етапом у її робочих процесах. Традиційно перетравлення білків здійснюється в розчині за допомогою протеолітичних ферментів, таких як трипсин, який специфічно гідролізує пептидні зв'язки в залишках лізину та аргініну. Цей процес генерує пептиди, які добре підходять для іонізації та фрагментації в мас-спектрометрії (MS). Однак звичайні методи травлення вимагають 12–24 годин для досягнення завершення, що створює значні вузькі місця в протеомних робочих процесах.
Ультразвук є потужною альтернативою, яка значно скорочує час травлення з годин до кількох хвилин. У поєднанні з удосконаленими багаторазовими звуковими пристроями, такими як Hielscher CupHorn, VialTweeter і 96-лунковий пластинчастий звуковий UIP400MTP, ультразвук дозволяє прискорювати протеоміку з високою пропускною здатністю. Ці технології оптимізують робочі процеси, скорочуючи час підготовки зразків і підвищуючи ефективність без шкоди для відтворюваності або якості даних.

Роль ультразвукової енергії в засвоєнні білків

Ультразвук використовує сфокусовані ультразвукові хвилі для створення кавітації — локалізованих мікропухирців, які руйнуються, створюючи інтенсивні сили зсуву. Це явище підсилює масообмін, сприяє змішуванню ферментів з субстратами і розгортає білкові структури, піддаючи ділянки розщеплення протеолітичні ферменти, такі як трипсин.
До чого це призвело? Значне скорочення часу травлення без шкоди для ефективності або відтворюваності.

Протеолітичне травлення, посилене ультразвуком: методологія та результати

Протокол прискореного травлення

Травлення за допомогою ультразвуку поєднує протеолітичні ферменти та ультразвукову енергію для прискорення робочих процесів. Наприклад, при використанні Hielscher UP200St-CupHorn (200 Вт, 26 кГц) робочий процес травлення протікає наступним чином:

1. Відновлення: зразки білка (0,5 мг/мл, 20 мкл) обробляють DTT (2 мкл, 110 мМ) у буфері бікарбонату амонію (12,5 мМ). Ультразвук застосовується з амплітудою 50% протягом 5 хвилин.
2. Алкілування: після додавання ІАА (2 мкл, 400 мМ) ультразвукове дослідження повторюють в тих же умовах.
3. Травлення: зразки розбавляють та інкубують з іммобілізованими наночастинками трипсину. Заключний раунд ультразвукової діагностики (5 хвилин) завершує травлення. Пептиди відокремлюють, висушують і зберігають для аналізу на РС.

Цей ультразвуковий метод скорочує загальний час приготування з 12 годин до менш ніж 30 хвилин. Незважаючи на прискорений процес, вихід і якість пептидів залишаються на рівні традиційних методів ночівлі.

Ефективність ультразвукового зварювання білків

У порівняльних дослідженнях з використанням протеомів E. coli:

• Ідентифікація білка: Зразки, перетравлені ультразвуком, виявили 777 білків за 5 хвилин, порівняно з 817 за 12 годин. Загальна ідентифікація білка перевищила 70%.
• Відтворюваність: Реплікатний аналіз показав значення кореляції вище 98% в межах кожного методу, що свідчить про надійність.
• Вибірковість: Певні білки переважно перетравлювалися кожним методом, при цьому ультразвукове травлення сприяло 65 білкам, а нічне перетравлення – 54 білкам. Такі нюанси відмінностей підкреслюють унікальний потенціал ультразвуку для конкретних застосувань.

Результати кількісного визначення білка без етикеток семи шипованих білків у кишкову паличку
Зразка. Наступні білки були додані на двох різних рівнях, як зазначено в колонці
названий як «Theo Ratio». Theo Ratio - це теоретичне співвідношення між двома рівнями, яке використовується при цьому
експеримент. Сироватковий альбумін великої рогатої худоби (ALBU), β-лактоглобулін (LACB), казеїн α-S1 (CASA1),
α-S2 казеїн (CASA2), цитохром c (CYC), овальбумін (OVAL) та карбоангідраза 2
(КА2). Коефіцієнти були розраховані з використанням інтенсивності білка LFQ, отриманого з MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Дослідження та графіка: © Martins et al., 2019)

Іммобілізований наночастинками трипсин

Інтеграція іммобілізованих наночастинок трипсину (наприклад, T-FMNP) з ультразвуковим випромінюванням ще більше покращує робочі процеси протеоміки. Ці наночастинки забезпечують високу площу поверхні для взаємодії фермент-субстрат, підвищуючи ефективність. При застосуванні до складних протеомів, таких як кишкова паличка, комбінованим методом досягають:

• Швидкість: Повне перетравлення протягом 5 хвилин.
• Точність: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Масштабованість: Адаптація до багатолункових платформ, таких як UIP400MTP, забезпечує високопродуктивну обробку.

Натисніть тут, щоб ознайомитися з детальним протоколом з покроковою інструкцією!
(пор. Мартінс та ін., 2019)

Протеолітичне травлення на високій швидкості та високій пропускній здатності за допомогою ультразвукорежисерів Хільшера

Кращі моделі УЗД для протеоміки

Hielscher Ultrasonics пропонує різні моделі звукових апаратів для одночасної підготовки кількох зразків, що сприяє робочим процесам з високою пропускною здатністю. Незалежно від того, чи працюєте ви з флаконами, пробірками, багатолунковими пластинами (наприклад, 6-, 24-, 96-лунковими) або чашками Петрі – Ми пропонуємо вам ідеальні ультразвукові апарати для ваших експериментів.

UIP400MTP багатолунковий пластинчастий сонник

Для максимальної пропускної здатності UIP400MTP надає можливість ультразвукової обробки 96-лункових пластин. Сумісна з будь-якою стандартною мікропланшеткою, UIP400MTP не вимагає дорогих фірмових одноразових виробів і дає вам свободу вибору найкращої багатолункової пластини для вашого дослідження. Доставляючи рівномірну енергію по пластині, він забезпечує швидке відновлення, алкілування та перетравлення до 200 складних протеомів всього за 1 годину. Цей рівень автоматизації та ефективності має вирішальне значення для високопродуктивної протеоміки та клінічних застосувань. Дізнайтеся більше про багатолунковий пластинчастий сонник!

VialTweeter

VialTweeter розроблений спеціально для лабораторій, яким потрібне одночасне ультразвукове дослідження до 10 флаконів або пробірок. Його неінвазивний підхід усуває ризики перехресного забруднення, забезпечуючи при цьому відтворюване перетравлення білка. Цей пристрій ідеально підходить для дослідників, які працюють з обмеженими обсягами зразків або різноманітними типами зразків.
Дізнайтеся більше про багатоламповий звуковий апарат VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Ультразвуковий апарат CupHorn - це потужний пристрій, призначений для одночасної обробки декількох зразків в герметичних контейнерах. Він забезпечує рівномірний ультразвуковий розподіл енергії та точний контроль температури. Здатність обробляти до п'яти зразків одночасно в поєднанні з його сумісністю зі зниженими, алкілованими та перетравленими робочими процесами робить CupHorn надійним інструментом для протеоміки на основі РС.
Дізнайтеся більше про реактор CupHorn SonoReactor!

Покроковий протокол протеолітичного травлення за допомогою ультразвуку з використанням іммобілізованого наночастинками трипсину

Цей протокол Martins et al. (2019) оптимізований для швидкого перетравлення білка за допомогою ультразвукової енергії та іммобілізованого наночастинками трипсину (T-FMNP). Описані кроки забезпечують ефективне відновлення, алкілування та протеоліз, придатні для застосування в мас-спектрометрії (MS).
Етапи протоколу

1. Відновлення дисульфідних зв'язків
   • Додайте 2 мкл розчину DTT (110 мМ) до зразка білка 20 мкл (0,5 мг/мл) у буфері AmBic.
   • Помістіть трубку для зразка в сонорактор UP200St-CupHorn.
   • Звуковий звук зразка протягом 2,5 хвилин з амплітудою 50% (200 Вт, 26 кГц).
   • Зробіть паузу на короткий інтервал, щоб дати можливість охолонути, потім проведіть ультразвукове дослідження ще 2,5 хвилини в тих же умовах.
2. Алкілування відновлених залишків цистеїну
   • Додайте 2 мкл розчину ІАА (400 мМ) до відновленого зразка білка.
   • Робіть звук протягом 2,5 хвилин з амплітудою 50% для полегшення алкілування.
   • Зробіть паузу для охолодження, потім зробіть ультразвук ще 2,5 хвилини.

   Примітка: Мінімізуйте вплив алкілованого зразка на світло, щоб запобігти деградації IAA.

3. Розведення зразка
   • Розбавте зразок алкілованого білка до кінцевого об'єму 100 мкл за допомогою 25 мМ AmBic буфера, що містить 4% ацетонітрилу (об/об).
   • Ретельно перемішайте шляхом делікатного піпетування.
4. Протеолітичне травлення з іммобілізованим наночастинками трипсином
   • Додайте 20 мкл розчину T-FMNP (3 мг/мл) до зразка розведеного білка.
   • Проведіть звуковий звук суміші в соноракторі протягом 2,5 хвилин з 50% амплітудою.
   • Зробіть паузу для охолодження, потім проведіть ультразвук ще 2,5 хвилини в тих же умовах.
5. Розділення наночастинок трипсину
   • За допомогою магніту відокремте T-FMNP від супернатанту, що містить перетравлені пептиди.
   • Перенесіть супернатант у нову мікроцентрифужну пробірку.
6. Підготовка пептидів до аналізу на РС
   • Висушіть супернатант, що містить пептиди, у вакуумній центрифузі.
   • Зберігайте висушені пептиди при температурі -20 °C до подальшого аналізу за допомогою мас-спектрометрії.