Протеомні робочі процеси з високоефективним травленням білків

Протеоміка є важливою галуззю для розуміння біологічних процесів і систем, а розщеплення білків становить критично важливий етап її робочих процесів. Традиційно розщеплення білків проводять у розчині за допомогою протеолітичних ферментів, таких як трипсин, який специфічно гідролізує пептидні зв’язки біля залишків лізину та аргініну. Унаслідок цього процесу утворюються пептиди, добре придатні для іонізації та фрагментації під час мас-спектрометрії (MS). Однак традиційні методи розщеплення потребують 12–24 годин для повного завершення процесу, створюючи значні перешкоди в протеомних робочих процесах.
Ультразвукова обробка пропонує потужну альтернативу, різко скорочуючи час розщеплення з годин до лише кількох хвилин. У поєднанні з передовими сонікаторами для одночасної обробки кількох зразків, такими як Hielscher CupHorn, VialTweeter та сонікатор для 96-лункових планшетів UIP400MTP, ультразвукова обробка забезпечує прискорені протеомні дослідження з високою пропускною здатністю. Ці технології оптимізують робочі процеси, скорочуючи час підготовки зразків і підвищуючи ефективність без погіршення відтворюваності чи якості даних.

Роль ультразвукової енергії в травленні білків

Ультразвукова обробка використовує сфокусовані ультразвукові хвилі для створення кавітації – локалізованих мікробульбашок, які колапсують, генеруючи інтенсивні зсувні сили. Це явище покращує масоперенесення, сприяє змішуванню ферментів із субстратами та розгортає структури білків, відкриваючи сайти розщеплення для протеолітичних ферментів, таких як трипсин.
Результат? Значне скорочення часу травлення без компромісів щодо ефективності або відтворюваності.

Протеолітичне травлення, посилене ультразвуком: методологія та результати

Протокол прискореного травлення

Травлення за допомогою ультразвука поєднує протеолітичні ферменти та ультразвукову енергію для прискорення робочих процесів. Наприклад, використовуючи Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), робочий процес травлення відбувається наступним чином:

1. Редукція: Зразки білків (0,5 mg/mL, 20 µL) обробляються DTT (2 µL, 110 mM) у буфері амонію бікарбонату (12,5 mM). Ультразвукова обробка застосовується при 50% амплітуді протягом 5 хвилин.
2. Алкілування: Після додавання IAA (2 µL, 400 mM) ультразвукова обробка повторюється за тих самих умов.
3. Розщеплення: зразки розводять та інкубують із наночастинками, що несуть іммобілізований трипсин. Завершальний цикл ультразвукової обробки (5 хвилин) забезпечує завершення розщеплення. Пептиди відокремлюють, висушують і зберігають для аналізу методом MS.

Цей ультразвуковий метод скорочує загальний час підготовки з 12 годин до менш ніж 30 хвилин. Попри прискорений процес, вихід і якість пептидів залишаються узгодженими з традиційними нічними методами.

Ефективність ультразвукового травлення білків

У порівняльних дослідженнях з використанням протеомів E. coli:

• Ідентифікація білків: У зразках, оброблених ультразвуком, було ідентифіковано 777 білків за 5 хвилин, порівняно з 817 за 12 годин. Спільні ідентифікації білків перевищили 70%.
• Відтворюваність: Повторні аналізи показали значення кореляції понад 98% у межах кожного методу, демонструючи надійність.
• Селективність: Деякі білки переважно травлювалися кожним методом, причому ультразвукове травлення сприяло травленню 65 білків, а нічне травлення – 54 білків. Такі нюансовані відмінності підкреслюють унікальний потенціал ультразвукової обробки для специфічних застосувань.

Результати безміткового кількісного визначення білків для семи доданих білків у зразку E. coli
Наступні білки були додані на двох різних рівнях, як зазначено в стовпці
під назвою “Theo Ratio”. Theo Ratio – це теоретичне співвідношення між двома рівнями, використаними в цьому
експерименті. Бичачий сироватковий альбумін (ALBU), β-лактоглобулін (LACB), α-S1 казеїн (CASA1),
α-S2 казеїн (CASA2), цитохром c (CYC), овальбумін (OVAL) та карбоангідраза 2
(CAH2). Співвідношення були розраховані з використанням інтенсивностей LFQ білків, отриманих з аналізу
MaxQuant. Т-критерій Стьюдента був застосований для порівняння значень, отриманих кожним методом (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Дослідження та графік: © Martins et al., 2019)

Іммобілізований на наночастинках трипсин

Інтеграція іммобілізованих наночастинок трипсину (наприклад, T-FMNPs) з ультразвуковою обробкою додатково покращує протеомні робочі процеси. Ці наночастинки забезпечують високу площу поверхні для взаємодій фермент–субстрат, підвищуючи ефективність. При застосуванні до складних протеомів, таких як E. coli, комбінований метод досягає:

• Швидкість: Повне травлення протягом 5 хвилин.
• Точність: Порівнянна кількість білка з традиційними методами (p > 0,01, n=3).
• Масштабованість: Адаптація до багатолуночних платформ, таких як UIP400MTP, забезпечує високопродуктивну обробку.

Натисніть тут, щоб переглянути детальний протокол із покроковими інструкціями!
(пор. Martins et al., 2019)

Протеолітичне травлення на високій швидкості та з високою пропускною здатністю за допомогою ультразвукових гомогенізаторів Hielscher

Найкращі моделі ультразвукових гомогенізаторів для протеоміки

Hielscher Ultrasonics пропонує різноманітні моделі ультразвукових гомогенізаторів для одночасної підготовки зразків, що сприяє високопродуктивним робочим процесам. Незалежно від того, чи працюєте ви з флаконами, пробірками, багатолуночними планшетами (наприклад, 6-, 24-, 96-луночними планшетами) або чашками Петрі – ми пропонуємо вам ідеальні ультразвукові гомогенізатори для ваших експериментів.

Ультразвуковий гомогенізатор для багатолуночних планшетів UIP400MTP

Для максимальної пропускної здатності UIP400MTP забезпечує можливість ультразвукової обробки 96-луночних планшетів. Сумісний із будь-яким стандартним мікропланшетом, UIP400MTP не потребує дорогих пропрієтарних витратних матеріалів і надає вам свободу вибору найкращого багатолуночного планшета для ваших досліджень. Забезпечуючи рівномірну подачу енергії по всьому планшету, він дозволяє швидко проводити відновлення, алкілування та травлення до 200 складних протеомів лише за 1 годину. Такий рівень автоматизації та ефективності є критично важливим для високопродуктивної протеоміки та клінічних застосувань. Дізнайтеся більше про ультразвуковий гомогенізатор для багатолуночних планшетів!

VialTweeter

VialTweeter розроблений для лабораторій, яким потрібна одночасна ультразвукова обробка до 10 флаконів або пробірок. Його неінвазивний підхід усуває ризики перехресного забруднення, забезпечуючи відтворюване білкове травлення. Цей пристрій ідеально підходить для дослідників, які працюють з обмеженими об’ємами зразків або різноманітними типами зразків.
Дізнайтеся більше про багатопробірковий ультразвуковий гомогенізатор VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Сонікатор CupHorn – це потужний пристрій, призначений для одночасної обробки кількох зразків у герметично закритих контейнерах. Він забезпечує рівномірний розподіл ультразвукової енергії та точний контроль температури. Можливість одночасно обробляти до п’яти зразків у поєднанні із сумісністю з робочими процесами, що включають відновлення, алкілування та розщеплення, робить CupHorn надійним інструментом для протеоміки на основі MS.
Дізнайтеся більше про ультразвуковий реактор CupHorn SonoReactor!

Покроковий протокол для протеолітичного травлення за допомогою ультразвукової обробки з використанням іммобілізованого на наночастинках трипсину

Цей протокол Martins et al. (2019) оптимізовано для швидкого розщеплення білків із використанням ультразвукової енергії та іммобілізованого на наночастинках трипсину (T-FMNPs). Описані етапи забезпечують ефективне відновлення, алкілування та протеоліз, придатні для застосування в мас-спектрометрії (MS).
Етапи протоколу

1. Відновлення дисульфідних зв’язків
   • Додайте 2 µL розчину DTT (110 mM) до 20 µL зразка білка (0,5 mg/mL) у буфері AmBic.
   • Помістіть пробірку зі зразком у ультразвуковий реактор UP200St-CupHorn.
   • Проведіть ультразвукову обробку зразка протягом 2,5 хвилин при амплітуді 50% (200 W, 26 kHz).
   • Зробіть коротку паузу для охолодження, потім проведіть ультразвукову обробку ще протягом 2,5 хвилин за тих самих умов.
2. Алкілування відновлених залишків цистеїну
   • Додайте 2 µL розчину IAA (400 mM) до відновленого зразка білка.
   • Проведіть ультразвукову обробку протягом 2,5 хвилин при амплітуді 50% для сприяння алкілуванню.
   • Зробіть паузу для охолодження, потім проведіть ультразвукову обробку ще протягом 2,5 хвилин.

   Примітка: мінімізуйте вплив світла на алкілований зразок, щоб запобігти деградації IAA.

3. Розведення зразка
   • Розведіть алкілований зразок білка до кінцевого об’єму 100 µL, використовуючи 25 mM буфер AmBic, що містить 4% ацетонітрилу (v/v).
   • Ретельно перемішайте шляхом м’якого піпетування.
4. Протеолітичне травлення за допомогою іммобілізованого на наночастинках трипсину
   • Додайте 20 µL розчину T-FMNP (3 mg/mL) до розведеного зразка білка.
   • Обробіть суміш ультразвуком у sonoreactor протягом 2,5 хвилин при амплітуді 50%.
   • Зробіть паузу для охолодження, потім обробіть ультразвуком ще 2,5 хвилини за тих самих умов.
5. Відділення наночастинок трипсину
   • Використовуйте магніт для відділення T-FMNPs від супернатанту, що містить перетравлені пептиди.
   • Перенесіть супернатант у нову пробірку для мікроцентрифуги.
6. Підготовка пептидів для аналізу методом MS
   • Висушіть супернатант, що містить пептиди, у вакуумній центрифузі.
   • Зберігайте висушені пептиди при -20°C до подальшого аналізу методом мас-спектрометрії.