Лізіс дріжджових клітин у мікропланшетах за допомогою високоефективної ультразвукової обробки

Мікробіологи та дослідники у сфері наук про життя, які працюють з Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii, та іншими системами дріжджів, знають цю проблему: дріжджові клітини є стійкими, відтворюваний лізіс може бути складним, а ручне руйнування зразків швидко стає вузьким місцем, коли необхідно скринінгувати багато штамів, клонів, умов культивування або конструктів експресії.

Високопродуктивний лізіс дріжджів для мікробіології, молекулярної біології та аналізу білків

Мікропланшетні ультразвукові обробники Hielscher, такі як UIP400MTP (400 W) та UIP550MTP (550 W), пропонують високоефективне рішення для механічного лізісу дріжджових клітин безпосередньо в мікропланшетах. Замість обробки зразків по одному за допомогою зонда, цілі мікропланшети можуть оброблятися ультразвуком за однорідних умов. Це робить ультразвуковий лізіс дріжджів швидшим, більш відтворюваним та легшим для інтеграції в сучасні робочі процеси мікробіології, експресії білків, скринінгу ферментів та оміксних досліджень.
Незалежно від того, чи потрібно вам вивільнити рекомбінантні білки з P. pastoris, підготувати лізати дріжджів для ферментативних аналізів, зруйнувати S. cerevisiae для аналізу білків, або скринінгувати десятки клонів дріжджів паралельно, мікропланшетні ультразвукові обробники Hielscher забезпечують потужне руйнування клітин на основі кавітації з точним контролем процесу.

Чому дріжджові клітини потребують ефективного механічного лізісу

Дріжджові клітини складніше лізувати, ніж багато бактеріальних або ссавцевих клітин, оскільки вони захищені жорсткою клітинною стінкою, що складається переважно з полісахаридів, глюканів, маннопротеїнів та хітину. Ця клітинна стінка забезпечує механічну стабільність, але також обмежує вивільнення внутрішньоклітинних білків, нуклеїнових кислот, метаболітів та ферментів.
Традиційні методи лізісу дріжджів включають бідінг (bead beating), ферментативне травлення, цикли заморожування-розморожування, хімічний лізіс та ультразвукову обробку зондом. Ці методи можуть бути ефективними, але вони також мають обмеження. Бідінг може вносити уламки та нагрівання, ферментативне травлення може додавати вартість та варіабельність, а ультразвукова обробка зондом окремих зразків є тривалою, коли необхідно обробити велику кількість зразків.
Високоінтенсивна, фокусована ультразвукова кавітація долає ці обмеження, застосовуючи інтенсивні механічні зсувні сили, флуктуації тиску та мікрострумині до суспензії дріжджів. Результатом є швидке руйнування клітинних стінок та мембран, покращене внутрішньоклітинне вивільнення та високо відтворювана підготовка зразків у форматі планшета.

Ультразвукова обробка мікропланшетів для паралельної підготовки зразків дріжджів

Hielscher UIP400MTP та UIP550MTP розроблені для однорідної ультразвукової обробки мікропланшетів, багатоямкових планшетів, ПЛР-планшетів та відповідних стійок для зразків. На відміну від ультразвукової обробки зондом, зразки не потребують індивідуальної обробки. Повний планшет піддається дії контрольованої ультразвукової енергії, що робить робочий процес надзвичайно придатним для паралельної обробки зразків.

Це особливо корисно для:

• Скринінгу S. cerevisiae мутантів або експресійних штамів
• Лізісу P. pastoris / K. phaffii клонів після експресії рекомбінантних білків
• Підготовки лізатів дріжджів для ферментативних аналізів
• Екстракції білків для SDS-PAGE, Western blot, ELISA, LC-MS/MS або тестування активності
• Вивільнення внутрішньоклітинних метаболітів для метаболоміки
• Підготовки зразків ДНК та РНК після відповідної подальшої очистки
• Високопродуктивної оптимізації буферів для лізісу, добавок та умов екстракції

Як ультразвукова кавітація руйнує дріжджові клітини

Під час ультразвукової обробки сфокусований ультразвук високої потужності генерує в рідкому зразку чергування циклів стиснення та розрідження. При достатній інтенсивності ці коливання тиску створюють акустичну кавітацію. Бульбашки кавітації утворюються, коливаються та колапсують, створюючи локальні зсувні сили, мікрострумені, турбулентність та сильні градієнти тиску.
У суспензіях дріжджів ці механічні ефекти послаблюють та руйнують клітинну стінку та клітинну мембрану. Внутрішньоклітинні білки, ферменти, нуклеїнові кислоти та метаболіти вивільняються в буфер для лізису. Оскільки процес є механічним, його можна використовувати з багатьма різними буферними системами, а також поєднувати з інгібіторами протеаз, відновлювальними агентами, детергентами, солями або м’якою ферментативною передобробкою.

Загальний протокол: лізис дріжджових клітин у мікропланшетах

Наведений нижче протокол надає практичну початкову точку для лізису дріжджів за допомогою ультразвукового обробника для мікропланшетів Hielscher UIP400MTP або UIP550MTP. Параметри слід оптимізувати відповідно до штаму дріжджів, щільності клітин, цільової молекули, складу буфера, типу планшета та подальшого аналізу.

1. Збір та промивання дріжджових клітин

Вирощуйте Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces або інший штам дріжджів за бажаних умов культивування. Зберіть клітини шляхом центрифугування та видаліть середовище культивування. Промийте осад холодною дистильованою водою, PBS або вибраним буфером для лізису, щоб видалити залишкові компоненти середовища, які можуть заважати подальшому аналізу.
Для екстракції білків тримайте зразки холодними та працюйте швидко. Якщо існує ризик дії протеаз, попередньо охолодіть усі буфери та витратні матеріали.

2. Ресуспендування осаду клітин

Ресуспендуйте осад дріжджів у відповідному холодному буфері для лізису. Для ефективного вивільнення білків висока щільність клітин часто є переважною. Як початкову точку використовуйте приблизно 10–20% w/v вологого осаду клітин або густу суспензію, що відповідає OD₆₀₀ > 10, залежно від аналізу.

Типовий буфер для лізису дріжджових білків може містити:

• буферну систему, таку як Tris-HCl, фосфатний буфер або HEPES
• сіль, таку як NaCl або KCl
• коктейль інгібіторів протеаз
• опціональний відновлювальний агент, такий як DTT або β-меркаптоетанол
• опціональний детергент, такий як Triton X-100, NP-40, SDS або CHAPS, залежно від сумісності з подальшими етапами
• опціональні інгібітори фосфатаз для досліджень фосфорилювання

Для складних штамів дріжджів або дуже м’якої екстракції білків можна використовувати коротку передобробку за допомогою Zymolyase, Lyticase або іншого ферменту, що розщеплює клітинну стінку, перед ультразвуковою обробкою. Ця ферментативна передобробка є опціональною, але може покращити ефективність лізису або зменшити необхідну інтенсивність ультразвуку.

3. Перенесення зразків у відповідний мікропланшет

Розподіліть суспензію дріжджів у мікропланшет, сумісний з ультразвуковою обробкою. Планшети з круглим дном часто є переважними, оскільки вони покращують збір зразків та зменшують мертві зони. Використовуйте рівні об’єми зразків у лунках для покращення відтворюваності.
Загерметизуйте планшет відповідним герметизуючим матом або плівкою, щоб запобігти випаровуванню, утворенню аерозолів та перехресному забрудненню. Переконайтеся, що герметизація сумісна з вибраною температурою та умовами ультразвукової обробки.
Типові робочі об’єми залежать від формату планшета та застосування. Поширені формати включають 96-луночні планшети, планшети з глибокими лунками, ПЛР-планшети або відповідні стійки для пробірок.

4. Налаштування охолодження

Лізис дріжджів вимагає високої інтенсивності ультразвуку, а механічне руйнування генерує тепло. Тому контроль температури є критичним, особливо для аналізу білків, ферментів, РНК або фосфорилювання.

Використовуйте відповідну стратегію охолодження, таку як:

• попередньо охолоджений буфер для лізису
• попередньо охолоджені мікропланшети
• паузи для охолодження між інтервалами ультразвукової обробки
• зовнішнє охолодження платформи для ультразвукової обробки, де це застосовно

Мета полягає в тому, щоб зберігати зразки достатньо холодними, щоб запобігти денатурації білків, інактивації ферментів, деградації РНК та варіабельності зразків, спричиненій нагріванням.

5. Ультразвукова обробка суспензії дріжджів

Помістіть запечатану мікропланшету в ультразвуковий гомогенізатор для мікропланшет Hielscher UIP400MTP або UIP550MTP і виберіть програму імпульсної ультразвукової обробки. Імпульсний режим рекомендований, оскільки він дозволяє здійснювати механічне руйнування під час фаз ВКЛ та розсіювання тепла під час фаз ВИКЛ.
Як початкові параметри для лізису дріжджових клітин:

Для highly стійких суспензій дріжджів, щільної біомаси P. pastoris або складного екстрагування рекомбінантних білків поступово збільшуйте сукупний час ВКЛ. Для термочутливих білків або ферментативних аналізів використовуйте коротші імпульси, довші паузи для охолодження та нижчу початкову амплітуду.

Високопродуктивний лізис дріжджів у багатолункових планшетах за допомогою UIP400MTP

6. Прозоріть лізат

Після ультразвукової обробки відцентруйте мікропланшету або перенесіть зразки в пробірки для центрифугування. Видаліть клітинні залишки шляхом центрифугування при відповідній швидкості та температурі. Зберіть супернатант для подальшого аналізу.

Залежно від застосування, лізат можна використовувати для:

• кількісного визначення білків
• аналізів ферментативної активності
• SDS-PAGE та вестерн-блотингу
• ІФА та імуноаналізів
• протеоміки LC-MS/MS
• аналізу метаболітів
• очищення ДНК або РНК

7. Оптимізуйте та задокументуйте метод

Для відтворюваного лізису дріжджів задокументуйте всі відповідні параметри, включаючи штам, умови культивування, OD₆₀₀, масу вологих клітин, склад буфера, тип планшети, об’єм зразка, амплітуду, цикл імпульсів, сукупний час ВКЛ, метод охолодження та кінцеву температуру зразка.
Якщо ультразвуковий гомогенізатор Hielscher оснащений автоматичним записом даних, дані процесу можна використовувати для документування, розробки методу, масштабування та контролю якості.

Поради щодо оптимізації лізису дріжджів

Для максимального вивільнення білків використовуйте щільні суспензії дріжджів, високу інтенсивність ультразвуку та достатній сукупний час ВКЛ. Для чутливих білків зменшіть амплітуду, подовжте паузи для охолодження та підтримуйте холодну температуру планшети протягом усього процесу.
Якщо лізис неповний, поступово збільшуйте час ультразвукової обробки, перевірте ферментативну попередню обробку, зменшіть в’язкість зразка або оптимізуйте буфер. Якщо білки деградують або втрачають активність, покращіть охолодження, скоротіть інтервали ВКЛ, додайте інгібітори та переконайтеся, що система детергентів сумісна з цільовим білком.
Оскільки штами дріжджів суттєво відрізняються за структурою клітинної стінки, фазою росту, системою експресії та щільністю біомаси, рекомендується коротка матриця оптимізації. Наприклад, протестуйте три амплітуди, два цикли імпульсів та два загальні часи ВКЛ, а потім оцініть ефективність лізису та цілісність білків.

Переваги ультразвукових гомогенізаторів Hielscher для мікропланшет у лізисі дріжджів

Ультразвукові гомогенізатори Hielscher для мікропланшет ідеально підходять для лабораторій, яким потрібен відтворюваний лізис багатьох зразків. Вони усувають повільну обробку одного зразка за раз, характерну для зондових ультразвукових гомогенізаторів, і зменшують варіабельність, спричинену ручним позиціонуванням зонда, глибиною занурення та відмінностями в обробці зразків.

Основні переваги включають:

• Високопродуктивна обробка: Ультразвукова обробка багатьох зразків дріжджів паралельно в мікропланшетах або сумісних стійках для зразків.
• Відтворювані умови: Однакові умови ультразвукової обробки для всіх лунок для однорідних, порівнюваних результатів лізису.
• Відсутність перехресного забруднення зондом: Зразки залишаються герметично закритими під час ультразвукової обробки, що зменшує перенесення матеріалу та етапи очищення.
• Підходить для стійких клітин: Ультразвук високої інтенсивності сприяє руйнуванню клітинних стінок дріжджів.
• Ефективний робочий процес: Ідеально підходить для скринінгу штамів, клонів, умов експресії та буферів для лізису.
• Ефективний робочий процес: Програмовані налаштування, автоматизоване ведення журналу даних та придатність для лабораторної автоматизації.

Застосування в дріжджовій біотехнології та дослідженнях у галузі наук про життя

Ультразвуковий лізис дріжджів у мікропланшетах підтримує багато дослідницьких та скринінгових робочих процесів. У рекомбінантній експресії білків клони P. pastoris та S. cerevisiae можна лізувати паралельно для порівняння рівнів експресії або активності ферментів. У системній біології та омічних дослідженнях стандартизований лізис покращує порівнянність між різними умовами. У мікробіології ультразвукова обробка підтримує швидке приготування лізатів із багатьох штамів, умов середовища або стресових обробок.
Типові сфери застосування включають:

• екстракція білків із дріжджів
• скринінг рекомбінантних білків
• скринінг ферментативної активності
• відбір клонів після трансформації
• оптимізація ферментації
• підготовка зразків для протеоміки
• підготовка зразків для метаболоміки
• дослідження руйнування клітинної стінки
• аналізи з високим пропуском у мікробіології

Надійний лізис дріжджів починається з контрольованої ультразвукової обробки

Лізис дріжджів може бути складним, коли зростає кількість зразків, але мікропланшетні соникатори Hielscher роблять процес швидшим, чистішим та більш відтворюваним. UIP400MTP та UIP550MTP дозволяють дослідникам обробляти повні планшети за визначених умов ультразвукової обробки, підвищуючи пропускну здатність та зменшуючи ручну обробку.
Для мікробіологів, молекулярних біологів, фахівців із білків та біотехнологічних лабораторій ультразвукова обробка в мікропланшетах є потужним інструментом для ефективного та відтворюваного вивільнення внутрішньоклітинних компонентів дріжджів.

Література / Посилання

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics 2024.