Лізис дріжджових клітин у мікропланшетах за допомогою ультразвукової обробки високої інтенсивності

Мікробіологи та дослідники в галузі наук про життя, які працюють з Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii, а також у інших системах, що використовують дріжджі, добре знають цю проблему: дріжджові клітини є стійкими, їхній відтворюваний лізис може бути складним, а ручне руйнування зразків швидко стає «вузьким місцем», коли потрібно провести скринінг великої кількості штамів, клонів, умов культивування або експресійних конструкцій.

Високопродуктивний лізис дріжджів для мікробіології, молекулярної біології та аналізу білків

Ультразвукові апарати для мікропланшетів компанії Hielscher, такі як UIP400MTP (400 Вт) та UIP550MTP (550 Вт), забезпечують високопродуктивне рішення для механічного лізису дріжджових клітин безпосередньо в мікропланшетах. Замість обробки зразків поодинці за допомогою зонда, можна піддавати ультразвуковій обробці цілі мікроплашки в однакових умовах. Це робить ультразвуковий лізис дріжджів швидшим, більш відтворюваним та простішим для інтеграції в сучасні робочі процеси мікробіології, експресії білків, скринінгу ферментів та омічних досліджень.
Незалежно від того, чи потрібно вам виділити рекомбінантні білки з P. pastoris, підготувати дріжджові лізати для ферментативних аналізів, розбити клітини S. cerevisiae для аналізу білків або провести паралельний скринінг десятків дріжджових клонів, ультразвукові апарати Hielscher для мікропланшетів забезпечують потужне руйнування клітин на основі кавітації з точним контролем процесу.

Чому дріжджові клітини потребують ефективного механічного лізису

Клітини дріжджів лізуються важче, ніж клітини багатьох бактерій або ссавців, оскільки вони захищені жорсткою клітинною стінкою, що складається переважно з полісахаридів, глюканів, маннопротеїнів та хітину. Ця клітинна стінка забезпечує механічну стабільність, але водночас обмежує вивільнення внутрішньоклітинних білків, нуклеїнових кислот, метаболітів та ферментів.
До традиційних методів лізису дріжджів належать розбивання на кульках, ферментативне розщеплення, цикли заморожування-розморожування, хімічний лізис та ультразвукова обробка з використанням зонда. Ці методи можуть бути ефективними, але вони також мають свої обмеження. Подрібнення кульками може призвести до утворення уламків та нагрівання, ферментативне розщеплення — до збільшення витрат та мінливості результатів, а ультразвукова обробка з використанням зонда для окремих зразків є трудомісткою, коли необхідно обробити велику кількість зразків.
Високоінтенсивна, сфокусована ультразвукова кавітація дозволяє подолати ці обмеження завдяки впливу на суспензію дріжджів інтенсивних механічних зсувних сил, коливань тиску та мікропотоків. Результатом є швидке руйнування клітинних стінок і мембран, покращене внутрішньоклітинне вивільнення та висока відтворюваність підготовки зразків у форматі планшетів.

Ультразвукова обробка мікропланшетів для паралельної підготовки зразків дріжджів

Прилади Hielscher UIP400MTP та UIP550MTP призначені для рівномірної обробки ультразвуком мікропланшетів, багатолункових планшетів, ПЛР-планшетів та відповідних штативів для зразків. На відміну від обробки ультразвуком за допомогою зонда, зразки не потрібно обробляти окремо. Вся плашка піддається дії контрольованої ультразвукової енергії, що робить цей робочий процес ідеальним для паралельної обробки зразків.

Це особливо корисно для:

• Скринінг Пекарські дріжджі мутанти або штами з підвищеною експресією
• Лізис Батько, пастир / K. phaffii клони після експресії рекомбінантного білка
• Підготовка дріжджових лізатів для ферментативних аналізів
• Вилучення білків для SDS-PAGE, Вестерн-блот, ELISA, LC-MS/MS або визначення активності
• Вивільнення внутрішньоклітинних метаболітів для метаболоміки
• Підготовка зразків ДНК та РНК після відповідного подальшого очищення
• Оптимізація буферів для лізису, добавок та умов екстракції з високою пропускною здатністю

Як ультразвукова кавітація руйнує клітини дріжджів

Під час ультразвукової обробки сфокусований ультразвук високої потужності генерує в рідкій пробі почергові цикли стиснення та розрідження. При достатній інтенсивності ці коливання тиску викликають акустичну кавітацію. Кавітаційні бульбашки утворюються, коливаються та руйнуються, створюючи локалізовані зсувні сили, мікрострумені, турбулентність та сильні градієнти тиску.
У суспензіях дріжджів ці механічні впливи послаблюють і руйнують клітинну стінку та клітинну мембрану. Внутрішньоклітинні білки, ферменти, нуклеїнові кислоти та метаболіти вивільняються у лізисний буфер. Оскільки цей процес є механічним, його можна застосовувати з багатьма різними буферними системами та поєднувати з інгібіторами протеаз, відновниками, детергентами, солями або м’якою ферментативною попередньою обробкою.

Загальний протокол: лізис дріжджових клітин у мікропланшетах

Наведений нижче протокол є практичною відправною точкою для лізису дріжджів із використанням ультразвукового апарату для мікропланшетів Hielscher UIP400MTP або UIP550MTP. Параметри слід оптимізувати з урахуванням штаму дріжджів, щільності клітин, молекули-мішені, складу буфера, типу планшета та подальшого аналізу.

1. Збір та промивання дріжджових клітин

Вирощуйте Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces або інший штам дріжджів у необхідних умовах культивування. Зберіть клітини шляхом центрифугування та видаліть культуральне середовище. Промийте осад холодною дистильованою водою, PBS або обраним буфером для лізису, щоб видалити залишки компонентів середовища, які можуть перешкоджати подальшому аналізу.
Для екстракції білків зразки слід зберігати в холоді та працювати швидко. Якщо існує ризик впливу протеаз, попередньо охолодіть усі буфери та витратні матеріали.

2. Ресуспендувати осад клітин

Ресуспендуйте осад дріжджів у відповідному холодному буфері для лізису. Для ефективного вивільнення білків часто доцільно використовувати високу щільність клітин. Для початку використовуйте приблизно 10–20 % (мас./об.) вологого осаду клітин або густу суспензію, що відповідає значенню OD₆₀₀ > 10, залежно від методу аналізу.

Типовий буфер для лізису дріжджових білків може містити:

• буферна система, така як Тріс-HCl, фосфатний буфер або HEPES
• сіль, наприклад NaCl або KCl
• Коктейль з інгібіторами протеази
• опціональний відновник, такий як ДТТ або β-меркаптоетанол
• додатковий детергент, такий як Triton X-100, NP-40, SDS або CHAPS, залежно від сумісності з подальшими етапами процесу
• додаткові інгібітори фосфатази для досліджень фосфорилювання

У разі складних штамів дріжджів або для дуже щадного вилучення білків перед ультразвуковою обробкою можна провести короткочасну попередню обробку препаратами Zymolyase, Lyticase або іншим ферментом, що розщеплює клітинну стінку. Така ферментативна попередня обробка не є обов’язковою, але може підвищити ефективність лізису або знизити необхідну інтенсивність ультразвуку.

3. Перенести зразки у відповідну мікроплашку

Перенесіть суспензію дріжджів у мікропланшет, придатний для ультразвукової обробки. Зазвичай віддають перевагу планшетам з округлим дном, оскільки вони покращують збір зразків і зменшують кількість «мертвих зон». Для підвищення відтворюваності результатів використовуйте однакові об’єми зразків у всіх лунках.
Накрийте чашку відповідною герметичною підкладкою або плівкою, щоб запобігти випаровуванню, утворенню аерозолю та перехресному забрудненню. Переконайтеся, що герметична кришка сумісна з обраними умовами температури та ультразвукової обробки.
Типові робочі об’єми залежать від формату планшета та сфери застосування. До поширених форматів належать 96-лункові планшети, планшети з глибокими лунками, ПЛР-планшети або відповідні штативи для пробірок.

4. Налаштування системи охолодження

Для лізису дріжджів потрібна висока інтенсивність ультразвуку, а механічне руйнування супроводжується виділенням тепла. Тому контроль температури має вирішальне значення, особливо під час аналізу білків, ферментів, РНК або фосфорилювання.

Застосовуйте відповідну стратегію охолодження, наприклад:

• попередньо охолоджений буфер для лізису
• попередньо охолоджені мікроплашки
• паузи для охолодження між інтервалами ультразвукової обробки
• зовнішнє охолодження ультразвукової платформи, якщо це доречно

Мета полягає в тому, щоб підтримувати зразок у достатньо холодному стані, щоб запобігти денатурації білків, інактивації ферментів, деградації РНК та змінам властивостей зразка під впливом тепла.

5. Обробити суспензію дріжджів ультразвуком

Помістіть герметичну плашку в ультразвуковий апарат для мікроплашок Hielscher UIP400MTP або UIP550MTP і виберіть програму імпульсної обробки ультразвуком. Рекомендується використовувати імпульсний режим, оскільки він забезпечує механічне руйнування під час фаз увімкнення та відведення тепла під час фаз вимкнення.
Як вихідний етап для лізису дріжджових клітин:

У разі суспензій дріжджів з високою стійкістю, щільної біомаси P. pastoris або складного вилучення рекомбінантних білків поступово збільшуйте сумарний час роботи в режимі «ON». Для теплочутливих білків або ферментних аналізів використовуйте коротші імпульси, довші паузи охолодження та нижчу початкову амплітуду.

Високопродуктивний лізис дріжджів у багатолункових планшетах за допомогою пристрою UIP400MTP

6. Очистити лізат

Після обробки ультразвуком відцентрифугуйте мікроплашку або перенесіть зразки в пробірки для центрифугування. Видаліть клітинні залишки шляхом центрифугування на відповідній швидкості та температурі. Зберіть супернатант для подальшого аналізу.

Залежно від призначення лізат можна використовувати для:

• Кількісне визначення білка
• аналізи ферментативної активності
• SDS-PAGE та Вестерн-блоттинг
• ELISA та імунологічні аналізи
• Протеоміка методом LC-MS/MS
• аналіз метаболітів
• Очищення ДНК або РНК

7. Оптимізувати та задокументувати метод

Для забезпечення відтворюваності процесу лізису дріжджів слід зафіксувати всі відповідні параметри, включаючи штам, умови культивування та оптичну густину (OD)₆₀₀, маса вологої клітинної маси, склад буферного розчину, тип пластини, об’єм зразка, амплітуда, цикл імпульсу, сумарний час увімкнення, метод охолодження та кінцева температура зразка.
Якщо ультразвуковий апарат Hielscher оснащений функцією автоматичного запису даних, дані про процес можна використовувати для ведення документації, розробки методів, масштабування та контролю якості.

Поради щодо оптимізації лізису дріжджів

Для максимального вивільнення білків використовуйте густі суспензії дріжджів, високу інтенсивність ультразвуку та достатню сумарну тривалість роботи. У разі чутливих білків зменште амплітуду, подовжіть паузи для охолодження та підтримуйте пластину в охолодженому стані протягом усього циклу.
Якщо лізис є неповним, поступово збільшуйте тривалість ультразвукової обробки, спробуйте провести ферментативну попередню обробку, зменшіть в’язкість зразка або оптимізуйте буфер. Якщо білки деградують або втрачають активність, покращіть охолодження, скоротіть інтервали увімкнення (ON), додайте інгібітори та переконайтеся, що система детергентів сумісна з цільовим білком.
Оскільки штами дріжджів суттєво відрізняються за структурою клітинної стінки, фазою росту, системою експресії та щільністю біомаси, рекомендується використовувати коротку матрицю оптимізації. Наприклад, слід перевірити три амплітуди, два цикли імпульсів і два загальні часи увімкнення, а потім оцінити ефективність лізису та цілісність білка.

Переваги ультразвукових апаратів Hielscher для мікропластинок при лізисі дріжджів

Ультразвукові апарати Hielscher для мікропланшетів ідеально підходять для лабораторій, яким необхідний відтворюваний лізис для великої кількості зразків. Вони дозволяють уникнути повільної обробки зразків по одному, характерної для ультразвукової обробки з використанням зонда, та зменшують варіативність, спричинену ручним позиціонуванням зонда, глибиною занурення та відмінностями в обробці окремих зразків.

Серед ключових переваг можна виділити наступні:

• Високопродуктивна обробка: Проведіть ультразвукову обробку багатьох зразків дріжджів одночасно в мікропланшетах або сумісних штативах для зразків.
• Умови, що можна відтворити: Однакові умови ультразвукової обробки у всіх лунках для отримання однорідних та порівнянних результатів лізису.
• Відсутність перехресного забруднення зонда: Під час ультразвукової обробки зразки залишаються герметично закритими, що зменшує ризик перенесення забруднень та скорочує кількість етапів очищення.
• Підходить для стійких клітин: Ультразвук високої інтенсивності сприяє руйнуванню клітинних стінок дріжджів.
• Ефективний робочий процес: Ідеально підходить для скринінгу штамів, клонів, умов експресії та буферів для лізису.
• Ефективний робочий процес: Програмовані налаштування, автоматичний запис даних та можливість використання в системах лабораторної автоматизації.

Застосування в біотехнології дріжджів та наукових дослідженнях у галузі наук про життя

Ультразвуковий лізис дріжджів у мікропланшетах сприяє виконанню багатьох дослідницьких та скринінгових робочих процесів. Під час експресії рекомбінантних білків клони P. pastoris та S. cerevisiae можна піддавати лізису паралельно, щоб порівняти рівні експресії або ферментативну активність. У системній біології та оміках стандартизований лізис покращує порівнянність результатів за різних умов. У мікробіології ультразвукова обробка сприяє швидкому отриманню лізатів із різних штамів, умов культивування або після стресових впливів.
До типових сфер застосування належать:

• екстракція білка з дріжджів
• скринінг рекомбінантних білків
• скринінг ферментативної активності
• відбір клонів після трансформації
• оптимізація ферментації
• підготовка зразків для протеоміки
• підготовка зразків для метаболоміки
• дослідження руйнування клітинної стінки
• високопродуктивні мікробіологічні аналізи

Надійний лізис дріжджів починається з контрольованої ультразвукової обробки

Лізис дріжджів може виявитися складним при збільшенні кількості зразків, але ультразвукові апарати для мікропланшетів компанії Hielscher роблять цей процес швидшим, чистішим та більш відтворюваним. Моделі UIP400MTP та UIP550MTP дають дослідникам змогу обробляти цілі планшети за заданих ультразвукових умов, підвищуючи пропускну здатність та водночас зменшуючи обсяг ручної роботи.
Для мікробіологів, молекулярних біологів, дослідників білків та біотехнологічних лабораторій ультразвукова обробка мікропланшетів є ефективним інструментом для вивільнення внутрішньоклітинних компонентів дріжджів — ефективно та з відтворюваними результатами.

Література / Список літератури