Підготовка високопродуктивних зразків FFPE: екстракція білка та зсув нуклеїнових кислот
За допомогою високопродуктивного ультразвукового UIP400MTP компанія Hielscher Ultrasonics вирішує проблеми фіксації формаліну та препарування тканин з парафіновим вбудовуванням (FFPE). Дізнайтеся, як ультразвук обробляє зразок FFPE у великих кількостях для депарафінізації FFPE, лізису тканин, гомогенізації, екстракції білка та зрізу ДНК/РНК! Скористайтеся перевагами ультразвукового препарування тканин FFPE – обробка великих номерів зразків в багатолункових пластинах! Отримуйте високоякісні зразки та отримуйте високі показники зразків за достовірними результатами досліджень! І останнє, але не менш важливе: економія часу і грошей!
Підготовка зразків FFPE полегшується високопродуктивним ультразвуковим дослідженням
Фіксація формаліну та парафінове вбудовування (FFPE) є найбільш поширеним методом збереження та архівації твердих тканин. Екстракція біомолекул із зразків тканин FFPE часто представляє значні проблеми через якість збережених зразків. Ці зразки, які є безцінним активом у молекулярній біології та клінічних дослідженнях, є багатим джерелом біологічної інформації для ретроспективних досліджень та перевірки діагностичних біомаркерів. Однак процес фіксації формаліну і вбудовування парафіну, зберігаючи тканинну архітектуру і морфологію, ускладнює екстракцію високоякісних нуклеїнових кислот і білків. Формалін індукує перехресне зшивання нуклеїнових кислот і білків, що призводить до молекулярної фрагментації і хімічної модифікації. Дізнайтеся, як високопродуктивний ультразвуковий UIP400MTP долає труднощі підготовки зразків FFPE!
Ультразвуковий апарат для ефективної підготовки зразків FFPE
- Простий у використанні робочий процес: спрощені та зручні для користувача процеси.
- Депарафінізація, екстракція білка, зріз ДНК / РНК
- Швидка високопродуктивна обробка: ефективне поводження з багатолунковими пластинами.
- Ефективна депарафінізація: Покращена солюбілізація білків.
- Нетоксичні розчинники: Уникає використання шкідливих органічних розчинників, таких як ксилол.
UIP400MTP високопродуктивний звуковий апарат для обробки зразків FFPE з високою пропускною здатністю в багатолункових пластинах
Досягнення в методах екстракції білка з тканини FFPE
Hielscher Ultrasonics вирішує проблеми високопродуктивної підготовки зразків FFPE. Ультразвукова система використовує ультразвукові хвилі для створення механічних коливань і сфокусованої кавітації, ефективно руйнуючи клітинні структури та посилюючи солюбілізацію біомолекул. Ця методика здобула популярність завдяки своїй здатності підвищувати ефективність і вихід екстракції нуклеїнових кислот і білків з тканин FFPE, а також зрізу ДНК і РНК для отримання бібліотеки. Дуже важливо підкреслити, що ультразвук з використанням багатолункового пластинчастого сонника UIP400MTP зберігає цілісність цих біомолекул для подальших застосувань.
Зсув нуклеїнових кислот за допомогою високопродуктивного ультразвуку
Багатолунковий ультразвуковий UIP400MTP для використання в умовах високої пропускної здатності, виводить підготовку зразків FFPE на новий рівень. Цей метод багатолункової ультразвукової діагностики забезпечує ефективне та надійне рішення для одночасної обробки кількох зразків. Він сприяє швидкій та відтворюваній екстракції ДНК, РНК та білків, які мають вирішальне значення для різних аналітичних методів, включаючи секвенування наступного покоління (NGS), кількісну ПЛР та протеомний аналіз. Оптимізація параметрів ультразвуку, таких як амплітуда, тривалість і температура, ще більше підвищує якість і кількість виділених біомолекул.
Ультразвуковий апарат UIP400MTP для багатолункових пластин дає значні переваги для фрагментації та зсуву ДНК і РНК з тканини FFPE. Однією з видатних особливостей цієї системи є її здатність досягати вузьких розмірів фрагментів ДНК і РНК, забезпечуючи точну настройку інтенсивності звуку для отримання коротких фрагментів по 150-200 пар основ (bp) або довших фрагментів по 15-20 пар кілооснов (kbp). Ця універсальність робить UIP400MTP незамінним як для додатків секвенування з коротким, так і з довгим, забезпечуючи високоякісні результати для секвенування наступного покоління (NGS) і секвенування всього геному (WGS). Його точний контроль за розміром фрагментів має вирішальне значення для дослідників у всіх областях геноміки, оскільки дозволяє готувати зразки відповідно до специфікацій.
Зв'яжіться з нами, щоб отримати передові рішення для тканини FFPE
Відкрийте для себе UIP400MTP багатолунковий пластинчастий ультразвуковий апарат для ефективного відновлення біомолекул із зразків FFPE, збереження цілісності екстрагованих нуклеїнових кислот і білків і забезпечення відтворюваності результатів. Ця технологія легко інтегрується з іншими підготовчими та аналітичними робочими процесами, оптимізуючи та покращуючи молекулярні дослідження з використанням архівів тканин FFPE.
Фіксатори та їх ефекти
Фіксація є важливим етапом підготовки зразків, який зберігає клітинні структури, зупиняє біохімічні реакції та запобігає деградації. Використовуються різні фіксатори в залежності від конкретних експериментальних вимог. Двома найбільш поширеними фіксаторами є формальдегід і параформальдегід, які зшивають білки і нуклеїнові кислоти, зберігаючи морфологію і антигенність клітин і тканин. Інші фіксатори, такі як етанол, метанол і глутаровий альдегід, використовуються для конкретних застосувань.
Фіксатори формальдегіду та параформальдегіду утворюють метиленові містки між аміногрупами, що призводить до зшивання білків. Цей процес ефективно знерухомлює клітинні компоненти, зберігаючи їх цілісність на наступних етапах аналізу. На ефекти цих фіксаторів можуть впливати такі фактори, як концентрація, рН і температура, і оптимізація цих параметрів має вирішальне значення для забезпечення оптимального збереження клітинних структур.
Переваги ультразвукового препарування FFPE
Ультразвук – це потужна техніка руйнування фіксованих клітин і тканин, яка перевершує звичайні методи. Він має кілька помітних переваг перед традиційними методами лізису:
- Швидкість та ефективність: Ультразвуковий лізис забезпечує швидке руйнування клітин і тканин, значно скорочуючи час обробки в порівнянні з механічними або хімічними методами лізису. Високочастотні звукові хвилі, що генеруються ультразвуковим зондом, створюють механічні зсувні сили, викликаючи порушення роботи нерухомих клітинних структур. Цей швидкий та ефективний збій дозволяє дослідникам обробляти великі обсяги зразків за короткий проміжок часу.
- Ніжний і регульований: Ультразвуковий лізис забезпечує м'який механізм руйнування, який мінімізує пошкодження чутливих біомолекул, таких як білки, нуклеїнові кислоти та ферменти. На відміну від механічних методів, які генерують надмірне тепло або зсувні сили, ультразвуковий лізис використовує контрольовану кавітацію для руйнування клітин, зберігаючи цілісність і функціональність внутрішньоклітинних компонентів.
- Універсальність: Ультразвуковий лізис може застосовуватися до різних фіксаторів, що дозволяє дослідникам працювати з широким спектром фіксованих зразків. Незалежно від того, чи використовується формальдегід, параформальдегід або альтернативні фіксатори, ультразвуковий лізис стабільно забезпечує ефективне руйнування, забезпечуючи оптимальне відновлення клітинних компонентів.
- Висока врожайність і якість: Ультразвуковий лізис сприяє високому виходу непошкоджених клітинних компонентів завдяки своїй здатності рівномірно порушувати фіксовані клітини і тканини. Це дозволяє подальшим програмам, таким як аналіз білка, екстракція нуклеїнових кислот та ферментативні аналізи, давати надійні та відтворювані результати.
- Сумісність з автоматизацією: Ультразвуковий лізис може бути легко інтегрований в автоматизовані системи, що дозволяє проводити високопродуктивну обробку зразків. Ця сумісність дозволяє дослідникам оптимізувати робочий процес і підвищити продуктивність, особливо у великомасштабних дослідженнях.
96-лунковий пластинчастий сонікатор UIP400MTP для ультразвукового дослідження мікротитру та багатолункових пластин
Ультразвуковий лізис зробив революцію в руйнуванні фіксованих клітин і тканин, пропонуючи численні переваги перед традиційними методами лізису. Його швидкість, ефективність, вибірковість, універсальність, висока продуктивність і сумісність з автоматизацією роблять його незамінним інструментом у дослідженнях молекулярної біології та біотехнології. Пропонуючи безконтактні ультразвукові апарати, а також зондовий сонікатор, Hielscher Ultrasonics пропонує найбільш підходящий ультразвуковий гомогенізатор для вашого застосування в галузі наук про життя. Незалежно від того, чи хочете ви обробляти одиничні зразки, кілька зразків або дуже високі номери зразків одночасно, ми запропонуємо вам найкращий ультразвуковий апарат, який відповідає вашим дослідницьким та діагностичним вимогам.
Дізнайтеся більше про безконтактні ультразвукові апарати Hielscher для багатовибіркової та високопродуктивної пробопідготовки!
- Одноразова інвестиція
- Використовуйте власні витратні матеріали
- відсутність повторюваних витрат на фірмові аксесуари та витратні матеріали
- висока пропускна здатність
- Контроль точності
- Найсучасніші технології
- надійність & Надійності
- Регульований, точний контроль процесу
- Промисловий клас: може безперервно працювати 24/7
- Простота і безпека в експлуатації
- низькі експлуатаційні витрати
Дізнайтеся більше про застосування ультразвукових апаратів у науці про життя!
Пластинчастий сонікатор UIP400MTP для будь-яких 96-лункових пластин, мікротитрових пластин і багатолункових пластин.
Проектування, виробництво та консалтинг – Якість зроблено в Німеччині
Ультразвукові апарати Hielscher добре відомі своїми найвищими стандартами якості та дизайну. Надійність і простота експлуатації дозволяють плавно інтегрувати наші ультразвукові апарати в промислові об'єкти. З важкими умовами та вимогливими умовами легко справляються ультразвукові апарати Hielscher.
Hielscher Ultrasonics є сертифікованою компанією ISO і приділяє особливу увагу високопродуктивним ультразвуковим апаратам, які відрізняються найсучаснішими технологіями та зручністю для використання. Звичайно, ультразвукові апарати Hielscher відповідають вимогам CE та відповідають вимогам UL, CSA та RoHs.
Зв'яжіться з нами! / Запитайте нас!
UIP400MTP Ультразвуковий апарат: Високопродуктивна підготовка зразків FFPE у Multi-Well-Plate
ПОШИРЕНІ ЗАПИТАННЯ
Нижче ми відповідаємо на поширені запитання, які мають відношення до підготовки тканин FFPE та ультразвукового дослідження зразків FFPE.
Як готується тканина FFPE?
Етапи підготовки тканин FFPE: Ретельне поводження та обробка свіжої тканини мають вирішальне значення для створення високоякісних зразків FFPE. Забезпечення збереження клітинної архітектури, нуклеїнових кислот і білків має важливе значення для точного подальшого аналізу. Кожен етап — від збору до вбудовування — вимагає точності для збереження цілісності зразка для різних аналізів, включаючи гістологічне дослідження, імуногістохімію та молекулярні дослідження. При правильному виконанні цей процес фіксації та вбудовування гарантує, що збережена тканина точно відображає стан in vivo, забезпечуючи надійні результати діагностики та досліджень.
Ми розповімо вам про 6 основних етапів процесу вбудовування зразків тканин FFPE.
- Збір тканин
Біопсія живих ссавців і культура тканин є життєздатними джерелами для отримання свіжої тканини для підготовки зразка FFPE.
Важливо використовувати асептичну техніку: використовуйте стерильні інструменти та рукавички, щоб уникнути зараження. В ідеалі збирати тканини в стерильному середовищі, наприклад, у хірургічному кабінеті або витяжці з ламінарним потоком.
Оскільки зразок дуже крихкий, важливо поводитися з ним делікатно: мінімізувати затримки в обробці та негайно розпочати подальшу обробку тканин після видалення. Це має вирішальне значення для запобігання аутолізу та деградації. Тримайте тканину при кімнатній температурі; Уникайте заморожування, оскільки це може спричинити утворення кристалів льоду та пошкодження тканин. - Фіксація тканин
Спочатку тканину обробляють фіксуючим розчином: використовують 10% нейтрально-буферний формалін (NBF), який еквівалентний 4% формальдегіду у воді, буферизованому до нейтрального рН.
Повністю занурте тканину в формалін. Забезпечте співвідношення фіксатора до об'єму тканин не менше 10:1. Час фіксації зазвичай коливається від 6 до 24 годин, в залежності від типу і розміру тканини. Важливо, щоб фіксатор зміг проникнути в тканини грунтовно. Однак надмірна фіксація може призвести до перехресного зшивання, що ускладнює вилучення антигену, тоді як недостатня фіксація може призвести до поганого збереження тканин. - Обрізка тканин
По-друге, обріжте тканину до товщини близько 3-5 мм, щоб забезпечити належне проникнення фіксатора. Забезпечте правильну орієнтацію тканини для захоплення відповідних гістологічних структур. Це полегшує процес екстракції, коли тканина в подальшому використовується для аналізу. - Обробка зафіксованого зразка
Тепер фіксована тканина повинна бути зневоднена: після фіксації тканину потрібно зневоднити, щоб забезпечити глибоке проникнення парафіну. Пропустіть тканину через градуйовану серію етанолу (70%, 80%, 90% і 100%), щоб видалити воду.
Очищення ксилолом: Парафін не розчиняється у воді, але розчиняється в ксилолі. Тому вода в тканині повинна бути замінена на ксилол. Однак сам ксилол не розчиняється у воді, але розчиняється в спирті, що вимагає проміжного етапу, коли вода спочатку замінюється спиртом. Занурте тканину в ксилол або замінник ксилолу, щоб видалити етанол і підготувати тканину до парафінової інфільтрації.
Інфільтрація за допомогою парафіну: Вбудуйте тканину в розплавлений парафін, забезпечуючи повну інфільтрацію. Цей етап зазвичай передбачає кілька змін парафіну для забезпечення ретельного просочення. - Вбудовування тканини
На цьому етапі тканина формується в тканинний блок: помістіть тканину в форму з потрібною орієнтацією і залийте її розплавленим парафіном. Дайте парафіну застигнути, охолодивши при кімнатній температурі або на холодній плиті. - Секціонування та монтаж
Мікротомія: щоб розрізати вбудовану тканину, використовуйте мікротом, щоб вирізати тонкі ділянки (зазвичай 4-5 мікрометрів) з парафінового блоку. Потім зразок монтують, розміщуючи зрізи на предметних скельцях для подальшого фарбування і мікроскопічного аналізу.
Нарешті, перевірте якість гістології: оцініть перші зрізи під мікроскопом, щоб забезпечити правильну фіксацію та обробку. За потреби коригуйте протоколи залежно від типу тканини та спостережуваної якості.
Тканини FFPE можуть бути використані для відновлення РНК, ДНК і білків, а також для виявлення ознак раку або іншого захворювання. Вони можуть зберігатися роками і є важливою частиною того, як дослідники та лікарі використовують зразки тканин для діагностики та досліджень.
Які поширені проблеми та виклики з тканиною FFPE?
Зразки тканин з фіксованою формаліном, парафіном (FFPE) широко використовуються в дослідженнях і діагностиці, але вони представляють кілька проблем і загальних проблем:
- Деградація біомолекул: Тривала фіксація може призвести до деградації ДНК, РНК і білків, що ускладнює вилучення високоякісних нуклеїнових кислот або білків для подальшого застосування. Правильна фіксація (уникнення недостатньої та надмірної фіксації) має важливе значення для збереження тканин.
- Маскування антигену: Процес фіксації може маскувати антигенні ділянки, знижуючи ефективність зв'язування антитіл в імуногістохімії та інших імунологічних аналізах. Для цього часто потрібне вилучення антигену, процедура, за допомогою якої маскування епітопу змінюється на протилежне і відновлюється зв'язування епітопу з антитілом. Однак повна антигенність не завжди може бути відновлена.
- Змінна якість фіксації: Відмінності в часі та умовах фіксації можуть призвести до непостійної якості зразка, що впливає на відтворюваність та порівнянність результатів. Використовуйте надійні протоколи фіксації та уникайте недостатньої та надмірної фіксації.
- Пошкодження та фрагментація ДНК: Фіксація формаліну в зразках FFPE може викликати різні типи пошкоджень ДНК, включаючи дезамінування цитозину (мутації від C до T), окислювальне пошкодження (наприклад, 8-оксо-гуанін, що призводить до мутацій від G до T), а також фізичні порушення, такі як порізи, розриви та базові ділянки, які перешкоджають активності ДНК-полімерази. Процес фіксації формаліну може викликати фрагментацію ДНК, що ускладнює генетичний і геномний аналіз, такий як ПЛР і секвенування.
- Якість РНК: РНК, витягнута з тканин FFPE, часто фрагментована та хімічно модифікована, що ускладнює виконання високоякісного транскриптомічного аналізу.
- Модифікації білка: Формалін може викликати хімічні модифікації білків, впливаючи на їх структуру та функцію, що може перешкоджати проведенню протеомних аналізів.
- Артефакти обробки зразків: Під час процесу вбудовування та секціонування механічний вплив та тепло можуть внести артефакти та спричинити подальше пошкодження тканини.
- Варіативність від партії до партії: Відмінності в протоколах фіксації та вбудовування між різними партіями можуть призвести до значної варіативності результатів, що ускладнює порівняння між дослідженнями.
- Проблеми зі зберіганням: Тривале зберігання блоків FFPE може призвести до додаткової деградації та втрати цілісності нуклеїнових кислот з часом, що вплине на життєздатність архівних зразків для ретроспективних досліджень.
Перехресне зшивання: Фіксація формаліну викликає перехресне зшивання білків і нуклеїнових кислот, що може перешкоджати молекулярному аналізу і впливати на точність імуногістохімії та інших аналізів.
Використання оптимізованих протоколів, ретельна обробка зразків і застосування передових методів допомагають підвищити якість і надійність даних, отриманих з тканин FFPE.
У чому різниця між FFPE і замороженою тканиною?
Тканину FFPE (Formalin-Fixed, Paraaffin-Embedded) консервують за допомогою формаліну для фіксації тканини, а потім вбудовують у парафін, що дозволяє довго зберігати її при кімнатній температурі зі збереженням морфології тканини. На відміну від них, заморожена тканина швидко зберігається при заморожуванні, яка краще зберігає цілісність нуклеїнових кислот і білків, але вимагає зберігання при дуже низьких температурах.
Які хімічні речовини використовуються для вбудовування FFPE?
Хімічні речовини, які використовуються для вбудовування FFPE, зазвичай включають формалін для фіксації та парафін для вбудовування. Для вбудовування FFPE тканини зазвичай фіксують за допомогою 10% (об/об) нейтрального буферного формаліну (FA) або свіжоприготованого 4% (w/v) розчину формальдегіду (PFA), виготовленого з порошку параформальдегіду. Формалін, який є розчином формальдегіду у воді, буферизований до нейтрального рН для збереження морфології тканин і запобігання надмірному зшиванню. Розчин на основі параформальдегіду також забезпечує ефективну фіксацію за рахунок зшивання білків, тим самим стабілізуючи структуру тканини для подальшого вбудовування в парафін. Ці хімічні речовини необхідні для підтримки цілісності та морфології тканин під час процесу фіксації та вбудовування.
Як відбувається видалення парафіну зі зразків ФПЕ?
Щоб видалити парафін із зразків FFPE, ділянки тканини зазвичай піддають серії промивань ксилолом з подальшою регідратацією за допомогою градуйованої серії спиртів і, нарешті, води. Оскільки ксилол дуже токсичний, створюючи ризики для здоров'я, такі як проблеми з диханням, подразнення шкіри та потенційні довгострокові наслідки при повторному впливі, ультразвукове видалення парафіну стає перспективною альтернативою в багатьох лабораторіях. Цей метод використовує інтенсивні ультразвукові хвилі для ефективного та безпечного видалення парафіну без необхідності використання токсичних розчинників, таких як ксилол, тим самим знижуючи ризик для персоналу лабораторії та створюючи більш безпечне робоче середовище.
Як довго я повинен фіксувати свої тканини для хорошої якості зразка FFPE?
Загальні рекомендації щодо тривалості фіксації зазвичай пропонують фіксацію зразків тканин у формаліні на термін від 24 до 48 годин. Ця тривалість, як правило, достатня для збереження морфології тканин і клітинних структур при мінімізації надмірної фіксації, що може призвести до надмірного зшивання і деградації нуклеїнових кислот і білків. Однак оптимальний час фіксації може варіюватися в залежності від розміру та типу тканини, причому менші або делікатніші зразки вимагають коротшого часу фіксації. Дуже важливо збалансувати адекватну фіксацію, щоб запобігти аутолізу та деградації тканин, уникаючи при цьому тривалої фіксації, яка може ускладнити подальший молекулярний аналіз.