Високопродуктивна підготовка зразків FFPE: екстракція білків і подрібнення нуклеїнових кислот
Завдяки високотехнологічному ультразвуковому обробнику UIP400MTP компанія Hielscher Ultrasonics вирішує проблеми підготовки тканин, зафіксованих у формаліні та вбудованих у парафін (FFPE). Дізнайтеся, як ультразвукова обробка обробляє зразки FFPE у великих кількостях для депарафінізації, лізису тканин, гомогенізації, екстракції білків і подрібнення ДНК/РНК! Скористайтеся перевагами ультразвукової підготовки тканин FFPE – обробкою великої кількості зразків у багатолуночних планшетах! Отримуйте зразки високої якості та велику кількість зразків для надійних результатів досліджень! І нарешті, що не менш важливо, заощаджуйте час і гроші!
Підготовка зразків FFPE, полегшена високотехнологічною ультразвуковою обробкою
Фіксація у формаліні та вбудовування у парафін (FFPE) є найпоширенішим методом збереження та архівування твердих тканин. Екстракція біомолекул із зразків тканин FFPE часто створює значні труднощі через якість збережених зразків. Ці зразки, які є безцінними активами у молекулярній біології та клінічних дослідженнях, надають багате джерело біологічної інформації для ретроспективних досліджень та валідації діагностичних біомаркерів. Однак процес фіксації у формаліні та вбудовування у парафін, попри збереження архітектури та морфології тканини, ускладнює екстракцію високоякісних нуклеїнових кислот і білків. Формалін індукує перехресне зв’язування нуклеїнових кислот і білків, що призводить до молекулярного фрагментування та хімічних модифікацій. Дізнайтеся, як високотехнологічний ультразвуковий обробник UIP400MTP долає труднощі підготовки зразків FFPE!
Ультразвуковий обробник для ефективної підготовки зразків FFPE
- Простий у використанні робочий процес: спрощені процеси, які є зручними для користувача.
- Депарафінізація, екстракція білків, подрібнення ДНК / РНК
- Швидка високотехнологічна обробка: ефективна робота з багатолуночними планшетами.
- Ефективна депарафінізація: покращена розчинність білків.
- Нетоксичні розчинники: уникає використання шкідливих органічних розчинників, таких як ксилол.
високотехнологічний ультразвуковий обробник UIP400MTP для високотехнологічної обробки зразків FFPE у багатолуночних планшетах
Досягнення в техніках екстракції білків із тканин FFPE
Компанія Hielscher Ultrasonics вирішує проблеми високотехнологічної підготовки зразків FFPE. Ультразвукова обробка використовує ультразвукові хвилі для створення механічних вібрацій та сфокусованої кавітації, ефективно руйнуючи клітинні структури та покращуючи розчинність біомолекул. Ця техніка набула популярності завдяки здатності підвищувати ефективність та вихід екстракції нуклеїнових кислот і білків із тканин FFPE, а також подрібнення ДНК і РНК для підготовки бібліотек. Дуже важливо підкреслити, що ультразвукова обробка за допомогою багатолуночного ультразвукового обробника UIP400MTP зберігає цілісність цих біомолекул для подальших застосувань.
Подрібнення нуклеїнових кислот за допомогою високотехнологічної ультразвукової обробки
Багатоямковий ультразвуковий обробник UIP400MTP для використання в умовах високої пропускної здатності виводить підготовку зразків FFPE на новий рівень. Цей метод ультразвукової обробки багатоямкових планшетів забезпечує ефективне та надійне рішення для одночасної обробки кількох зразків. Він сприяє швидкому та відтворюваному виділенню ДНК, РНК та білків, які є критично важливими для різних аналітичних методів, включаючи секвенування наступного покоління (NGS), кількісну ПЛР та протеомні аналізи. Оптимізація параметрів ультразвукової обробки, таких як амплітуда, тривалість та температура, додатково підвищує якість та кількість виділених біомолекул.
Ультразвуковий обробник UIP400MTP для багатоямкових планшетів пропонує значні переваги для фрагментації та подрібнення ДНК і РНК з тканин FFPE. Однією з визначних особливостей цієї системи є її здатність досягати вузьких розмірів фрагментів ДНК і РНК, забезпечуючи точне регулювання інтенсивності ультразвукової обробки для отримання коротких фрагментів довжиною 150–200 пар основ (bp) або довших фрагментів довжиною 15–20 кілопар основ (kbp). Ця універсальність робить UIP400MTP незамінним як для застосувань секвенування з короткими, так і з довгими прочитаннями, гарантуючи високі результати для секвенування наступного покоління (NGS) та секвенування повного геному (WGS). Його точний контроль розміру фрагментів є вирішальним для дослідників у всіх галузях геноміки, оскільки він дозволяє готувати зразки відповідно до специфікацій.
Зв’яжіться з нами для отримання передових рішень для тканин FFPE
Дізнайтеся про багатоямковий ультразвуковий обробник UIP400MTP для ефективного відновлення біомолекул із зразків FFPE, збереження цілісності виділених нуклеїнових кислот та білків і забезпечення відтворюваності результатів. Ця технологія безшовно інтегрується з іншими підготовчими та аналітичними робочими процесами, оптимізуючи та покращуючи молекулярні дослідження з використанням архівів тканин FFPE.
Фіксатори та їхні ефекти
Фіксація є критичним етапом підготовки зразків, який зберігає клітинні структури, зупиняє біохімічні реакції та запобігає деградації. Різні фіксатори застосовуються залежно від конкретних експериментальних вимог. Двома найпоширенішими фіксаторами є формальдегід та параформальдегід, які утворюють поперечні зв’язки між білками та нуклеїновими кислотами, зберігаючи морфологію та антигенність клітин і тканин. Інші фіксатори, такі як етанол, метанол та глутаровий альдегід, використовуються для специфічних застосувань.
Фіксатори на основі формальдегіду та параформальдегіду утворюють метиленові містки між аміногрупами, що призводить до поперечного зшивання білків. Цей процес ефективно іммобілізує клітинні компоненти, зберігаючи їхню цілісність під час наступних етапів аналізу. Ефекти цих фіксаторів можуть залежати від таких факторів, як концентрація, pH та температура, і оптимізація цих параметрів є критичною для забезпечення оптимального збереження клітинних структур.
Переваги ультразвукової підготовки FFPE
Ультразвукова обробка є потужною технікою для руйнування фіксованих клітин і тканин, яка перевершує conventional techniques. Вона пропонує кілька помітних переваг порівняно з традиційними методами лізису:
- Швидкість та ефективність: Ультразвуковий лізис забезпечує швидке руйнування клітин і тканин, значно скорочуючи час обробки порівняно з механічними або хімічними методами лізису. Високочастотні звукові хвилі, що генеруються ультразвуковим зондом, створюють механічні зсувні сили, спричиняючи руйнування фіксованих клітинних структур. Це швидке та ефективне руйнування дозволяє дослідникам обробляти великі обсяги зразків за короткий проміжок часу.
- М’який та регульований: Ультразвуковий лізис пропонує м’який механізм руйнування, який мінімізує пошкодження чутливих біомолекул, таких як білки, нуклеїнові кислоти та ферменти. На відміну від механічних методів, що генерують надмірне тепло або зсувні сили, ультразвуковий лізис використовує контрольовану кавітацію для руйнування клітин, зберігаючи при цьому цілісність та функціональність внутрішньоклітинних компонентів.
- Універсальність: Ультразвукове лізування можна застосовувати до різних фіксаторів, що дозволяє дослідникам працювати з широким спектром зафіксованих зразків. Незалежно від того, чи використовується формальдегід, параформальдегід або альтернативні фіксатори, ультразвукове лізування послідовно забезпечує ефективне руйнування, гарантуючи оптимальне відновлення клітинних компонентів.
- Високий вихід і якість: Ультразвукове лізування сприяє високому виходу цілісних клітинних компонентів завдяки здатності рівномірно руйнувати зафіксовані клітини та тканини. Це дозволяє отримувати надійні та відтворювані результати в подальших застосуваннях, таких як аналіз білків, екстракція нуклеїнових кислот та ферментативні аналізи.
- Сумісність з автоматизацією: Ультразвукове лізування можна легко інтегрувати в автоматизовані системи, що дозволяє здійснювати високопродуктивну обробку зразків. Ця сумісність дозволяє дослідникам оптимізувати свій робочий процес і підвищити продуктивність, особливо в масштабних дослідженнях.
Соникатор для 96-луночних планшетів UIP400MTP для ультразвукової обробки мікротитр- і багатолуночних планшетів
Ультразвукове лізування здійснило революцію в руйнуванні зафіксованих клітин і тканин, пропонуючи численні переваги порівняно з традиційними методами лізування. Його швидкість, ефективність, селективність, універсальність, високий вихід і сумісність з автоматизацією роблять його незамінним інструментом у дослідженнях молекулярної біології та біотехнологій. Пропонуючи безконтактні соникатори, а також соникатори зондового типу, Hielscher Ultrasonics пропонує найбільш підходящий ультразвуковий гомогенізатор для вашого застосування в науках про життя. Чи хочете ви обробляти окремі зразки, кілька зразків або дуже велику кількість зразків одночасно, ми запропонуємо вам найкращий соникатор, що відповідає вашим дослідницьким і діагностичним вимогам.
Дізнайтеся більше про безконтактні соникатори Hielscher для підготовки зразків із кількома зразками та високою пропускною здатністю!
- інвестиція одноразового характеру
- використовуйте власні витратні матеріали
- відсутність повторюваних витрат на пропрієтарні аксесуари та витратні матеріали
- висока пропускна здатність
- точне керування
- передові технології
- надійність та міцність
- регульоване, точне керування процесом
- промисловий клас: може працювати безперервно 24/7
- простий і безпечний в експлуатації
- низькі вимоги до обслуговування
Дізнайтеся більше про застосування соникаторів у науках про життя!
Планшетний соникатор UIP400MTP для будь-яких 96-луночних планшетів, мікротитр- і багатолуночних планшетів.
Дизайн, виробництво та консалтинг – якість, зроблена в Німеччині
Ультразвукові гомогенізатори Hielscher відомі своїми найвищими стандартами якості та дизайну. Міцність і простота експлуатації дозволяють легко інтегрувати наші ультразвукові гомогенізатори в промислові об’єкти. Жорсткі умови та складні середовища легко витримуються ультразвуковими гомогенізаторами Hielscher.
Hielscher Ultrasonics – це компанія, сертифікована за ISO, яка приділяє особливу увагу високоефективним ультразвуковим гомогенізаторам, що мають передові технології та зручність у використанні. Звичайно, ультразвукові гомогенізатори Hielscher відповідають вимогам CE та вимогам UL, CSA і RoHs.
Зв’яжіться з нами! / Запитайте нас!
Ультразвуковий гомогенізатор UIP400MTP: Підготовка зразків FFPE з високою пропускною здатністю в багатолуночних планшетах
FAQ
Нижче ми відповідаємо на часто задавані питання, які стосуються підготовки тканин FFPE та ультразвукової обробки зразків FFPE.
Як готують тканини FFPE?
Етапи підготовки тканини FFPE: Ретельне поводження та обробка свіжої тканини є критично важливими для отримання зразків FFPE високої якості. Забезпечення збереження клітинної архітектури, нуклеїнових кислот та білків є необхідним для точного аналізу на наступних етапах. Кожен крок – від збору до заливки – вимагає точності для підтримки цілісності зразка для різних аналізів, включаючи гістологічне дослідження, імуногістохімію та молекулярні дослідження. Належно виконаний процес фіксації та заливки гарантує, що збережена тканина точно відображає стан in vivo, забезпечуючи надійні діагностичні та наукові результати.
Ми проведемо вас через 6 основних етапів процесу заливки зразків тканини FFPE.
- Збір тканини
Біопсії від живих ссавців та культури тканин є придатними джерелами для отримання свіжої тканини для підготовки зразків FFPE.
Важливо використовувати асептичну техніку: Використовуйте стерильні інструменти та рукавички, щоб уникнути контамінації. Ідеально збирайте тканини в стерильному середовищі, наприклад, у хірургічному кабінеті або під ламінарним потоком.
Оскільки зразок є дуже крихким, його делікатне поводження є необхідним: Зменшіть затримки в обробці та негайно починайте подальшу обробку тканини після ексцизії. Це важливо для запобігання автолізу та деградації. Тримайте тканину при кімнатній температурі; уникайте заморожування, оскільки воно може спричинити утворення кристалів льоду та пошкодження тканини. - Фіксація тканини
Спершу тканину обробляють розчином фіксатора: Використовуйте 10% нейтральний буферований формалін (NBF), що еквівалентно 4% формальдегіду у воді, буферизованому до нейтрального pH.
Повністю занурте тканину у формалін. Забезпечте співвідношення об’єму фіксатора до тканини не менше 10:1. Час фіксації зазвичай коливається від 6 до 24 годин, залежно від типу та розміру тканини. Важливо, щоб фіксатор міг ретельно проникнути в тканину. Однак надмірна фіксація може призвести до перехресного зв’язування, що ускладнює елюцію антигенів, тоді як недостатня фіксація може призвести до поганого збереження тканини. - Тримінг тканини
По-друге, обріжте тканину до товщини приблизно 3–5 mm, щоб забезпечити адекватне проникнення фіксатора. Забезпечте правильну орієнтацію тканини для захоплення відповідних гістологічних структур. Це сприяє процесу екстракції, коли тканина пізніше використовується для аналізу. - Обробка зафіксованого зразка
Тепер зафіксовану тканину необхідно дегідратувати: Після фіксації тканину потрібно дегідратувати, щоб забезпечити ретельне проникнення парафінового воску. Пропустіть тканину через градієнтну серію етанолу (70%, 80%, 90% та 100%), щоб видалити воду.
Освітлення ксилолом: Парафіновий віск нерозчинний у воді, але розчинний у ксилолі. Тому воду в тканині необхідно замінити на ксилол. Однак сам ксилол нерозчинний у воді, але розчинний в алкоголі, що потребує проміжного етапу, де вода спочатку замінюється на алкоголь. Занурте тканину в ксилол або замінник ксилолу, щоб видалити етанол і підготувати тканину для інфільтрації парафіном.
Інфільтрація з використанням парафіну: Залийте тканину розплавленим парафіновим воском, забезпечуючи повну інфільтрацію. Цей етап зазвичай включає кілька змін парафіну для забезпечення ретельного насичення. - Заливка тканини
На цьому етапі тканину формують у тканинний блок: Помістіть тканину в форму з бажаною орієнтацією та налийте розплавлений парафін поверх неї. Дайте парафіну затвердіти, охолоджуючи при кімнатній температурі або на холодній плитці. - Розрізання та монтування
Мікротомія: Щоб нарізати залиту тканину, використовуйте мікротом для нарізання тонких зрізів (зазвичай 4-5 мікрометрів) з парафінового блоку. Потім зразок монтують, розміщуючи зрізи на скляних предметних стеклах для подальшого фарбування та мікроскопічного аналізу.
Нарешті, перевірте якість гістології: Оцініть перші зрізи під мікроскопом, щоб забезпечити належну фіксацію та обробку. Коригуйте протоколи за потреби, виходячи з типу тканини та спостережуваної якості.
Тканини FFPE можна використовувати для отримання РНК, ДНК та білків, а також для виявлення ознак раку або інших захворювань. Їх можна зберігати протягом багатьох років, і вони є невід’ємною частиною того, як дослідники та лікарі використовують зразки тканин для діагностики та досліджень.
Які є поширені проблеми та виклики, пов’язані з тканинами FFPE?
Зразки тканин, зафіксовані формаліном та залиті парафіном (FFPE), широко використовуються в дослідженнях та діагностиці, але вони створюють кілька проблем і поширених труднощів:
- Деградація біомолекул: Тривала фіксація може призвести до деградації ДНК, РНК та білків, що ускладнює виділення високоякісних нуклеїнових кислот або білків для подальших застосувань. Правильна фіксація (уникнення недостатньої та надмірної фіксації) є важливою для збереження тканин.
- Маскування антигенів: Процес фіксації може маскувати антигенні сайти, знижуючи ефективність зв’язування антитіл в імуногістохімії та інших імунологічних аналізах. Це часто потребує демаскування антигенів, процедури, за допомогою якої усувається маскування епітопу, а зв’язування епітоп-антитіло відновлюється. Однак повна антигенність не завжди може бути відновлена.
- Змінна якість фіксації: Різниця в часі та умовах фіксації може призвести до нестабільної якості зразків, що впливає на відтворюваність та порівнянність результатів. Використовуйте надійні протоколи фіксації та уникайте недостатньої та надмірної фіксації.
- Пошкодження та фрагментація ДНК: Фіксація формаліном зразків FFPE може спричинити різні типи пошкоджень ДНК, включаючи дезамінування цитозину (мутації C у T), оксидативне пошкодження (наприклад, 8-оксо-гуанін, що призводить до мутацій G у T), а також фізичні порушення, такі як розриви, пропуски та аберичні сайти, які перешкоджають активності ДНК-полімерази. Процес фіксації формаліном може спричинити фрагментацію ДНК, ускладнюючи генетичні та геномні аналізи, такі як ПЛР та секвенування.
- Якість РНК: РНК, виділена з тканин FFPE, часто є фрагментованою та хімічно модифікованою, що ускладнює проведення високоякісних транскриптомних аналізів.
- Модифікації білків: Формалін може індукувати хімічні модифікації в білках, впливаючи на їхню структуру та функцію, що може заважати протеомним аналізам.
- Артефакти обробки зразків: Під час процесу заливки та розрізання механічний стрес і тепло можуть вносити артефакти та спричиняти подальше пошкодження тканини.
- Варіабельність між партіями: Відмінності в протоколах фіксації та заливки між різними партіями можуть призвести до значної варіабельності результатів, ускладнюючи порівняння між дослідженнями.
- Проблеми зі зберіганням: Довготривале зберігання блоків FFPE може призвести до додаткової деградації та втрати цілісності нуклеїнових кислот з часом, впливаючи на придатність архівних зразків для ретроспективних досліджень.
Зшивання: Фіксація формаліном спричиняє зшивання білків і нуклеїнових кислот, що може перешкоджати молекулярному аналізу та впливати на точність імуногістохімії та інших аналізів.
Використання оптимізованих протоколів, ретельне поводження зі зразками та застосування передових методик допомагають покращити якість і надійність даних, отриманих із тканин FFPE.
Яка різниця між тканинами FFPE та замороженими тканинами?
Тканини FFPE (зафіксовані формаліном, залиті парафіном) зберігаються за допомогою формаліну для фіксації тканини, а потім заливаються у парафіновий віск, що дозволяє довготривале зберігання при кімнатній температурі зі збереженням морфології тканини. Натомість заморожені тканини швидко зберігаються шляхом заморожування, що краще підтримує цілісність нуклеїнових кислот і білків, але потребує зберігання при дуже низьких температурах.
Які хімічні речовини використовуються для заливки FFPE?
Хімічні речовини, що використовуються для заливки в парафін (FFPE), зазвичай включають формалін для фіксації та парафіновий віск для заливки. Для заливки в парафін (FFPE) тканини зазвичай фіксують, використовуючи або 10% (v/v) нейтральний буферований формалін (FA), або щойно приготований 4% (w/v) розчин формальдегіду (PFA), виготовлений з порошку параформальдегіду. Формалін, який є розчином формальдегіду у воді, буферизований до нейтрального pH для збереження морфології тканини та запобігання надмірному зшиванню. Розчин на основі параформальдегіду також забезпечує ефективну фіксацію шляхом зшивання білків, thereby стабілізуючи структуру тканини для подальшої заливки в парафіновий віск. Ці хімічні речовини є важливими для підтримки цілісності та морфології тканини під час процесу фіксації та заливки.
Як видаляється парафін із зразків FFPE?
Щоб видалити парафін із зразків FFPE, зрізи тканини зазвичай піддають серії промивань ксилолом, а потім регідратації через градаційну серію спиртів і нарешті води. Оскільки ксилол є високотоксичним, становлячи ризики для здоров’я, такі як проблеми з диханням, подразнення шкіри та потенційні довгострокові ефекти при повторюваному впливі, ультразвукове видалення парафіну стає перспективною альтернативою у багатьох лабораторіях. Цей метод використовує інтенсивні ультразвукові хвилі для ефективного та безпечного видалення парафіну без потреби в токсичних розчинниках, таких як ксилол, thereby зменшуючи ризик для персоналу лабораторії та створюючи безпечніше робоче середовище.
Скільки часу слід фіксувати мої тканини для хорошої якості зразків FFPE?
Загальні рекомендації щодо тривалості фіксації зазвичай пропонують фіксувати зразки тканини у формаліні протягом 24–48 годин. Ця тривалість загалом є достатньою для збереження морфології тканини та клітинних структур, мінімізуючи надмірну фіксацію, яка може призвести до надмірного зшивання та деградації нуклеїнових кислот і білків. Однак оптимальний час фіксації може варіюватися залежно від розміру та типу тканини, причому менші або більш делікатні зразки потребують коротшого часу фіксації. Важливо знайти баланс між достатньою фіксацією для запобігання автолізу та деградації тканини, уникаючи тривалої фіксації, яка могла б ускладнити подальші молекулярні аналізи.