Руйнування хроматину за допомогою ультразвукової обробки
Руйнування хроматину є критичним етапом у багатьох робочих процесах епігенетики та молекулярної біології, особливо в імунопреципітації хроматину (ChIP), ChIP-seq та пов’язаних аналізах. Мета полягає у фрагментації хроматину на відтворювані комплекси ДНК-білок із збереженням цілісності епітопів та мінімізацією втрат зразка. Серед доступних методів ультразвукова фрагментація хроматину стала широко використовуваним підходом, оскільки вона забезпечує надійну, безреагентну фрагментацію з чудовою відтворюваністю.
Що слід враховувати під час руйнування хроматину?
Ефективне руйнування хроматину вимагає ретельного контролю експериментальних параметрів. Неналежна фрагментація може погіршити результати подальших експериментів ChIP, створюючи фрагменти, які є або надто великими, або надмірно деградованими, або невідповідними між зразками.
Одним із найважливіших факторів є бажаний розподіл розмірів фрагментів. Для більшості застосувань ChIP та ChIP-seq оптимальними є фрагменти хроматину розміром від 100 до 600 пар основ. Цей діапазон розмірів забезпечує ефективну імунопреципітацію, надаючи достатню роздільну здатність для геномного картування.
Іншим ключовим фактором є ефективність зшивання перед ультразвуковою обробкою. Більшість робочих процесів ChIP включають фіксацію формальдегідом для стабілізації взаємодій білок-ДНК. Однак надмірне зшивання може зробити хроматин більш стійким до фрагментації, вимагаючи довших часів ультразвукової обробки та потенційно збільшуючи теплове навантаження.
Контроль температури також є важливим. Ультразвукова обробка генерує локальну енергію, яка може підвищити температуру зразка. Підвищені температури можуть пошкодити ДНК або денатурувати білки, впливаючи на розпізнавання антитілами під час ChIP. Тому багато дослідників виконують імпульсні цикли ультразвукової обробки в поєднанні з інтервалами охолодження для підтримки стабільності зразка.
Концентрація та об’єм зразка також впливають на ефективність фрагментації. Високі концентрації суспензій хроматину можуть вимагати довших часів ультразвукової обробки, тоді як малі об’єми зразків потребують точної подачі енергії для запобігання надмірній обробці.
Нарешті, вибір пристрою для ультразвукової обробки суттєво впливає на відтворюваність експерименту. Пристрої, розроблені для руйнування хроматину, зазвичай забезпечують контрольовану ультразвукову енергію та стандартизовану обробку зразків, що дозволяє досягти послідовної фрагментації в багатьох зразках.
Ультразвукове руйнування ДНК під час імунопреципітації хроматину (ChIP)
Який ультразвуковий гомогенізатор слід обрати для руйнування хроматину?
Різні лабораторні робочі процеси вимагають різних конфігурацій ультразвукової обробки. Оптимальна система значною мірою залежить від пропускної здатності зразків, об’єму та формату експерименту.
Ультразвуковий гомогенізатор зондового типу
Ультразвуковий гомогенізатор зондового типу подає ультразвукову енергію безпосередньо в зразок через титановий зонд. Ця конфігурація забезпечує дуже високу щільність енергії і тому підходить для надійного руйнування хроматину в індивідуальних зразках.
Зондові ультразвукові гомогенізатори особливо корисні для:
- Малої та середньої кількості зразків
- Хроматину, який важко фрагментувати
- Гнучких експериментальних протоколів
Багатотрубний ультразвуковий гомогенізатор – VialTweeter
Для лабораторій, які обробляють кілька зразків одночасно, багатотрубний ультразвуковий гомогенізатор VialTweeter забезпечує високовідтворюване рішення. Система передає ультразвукову енергію опосередковано через тримач для пробірок, дозволяючи фрагментувати кілька герметичних пробірок за ідентичних умов.
Ця конфігурація пропонує важливі переваги:
- Паралельне руйнування хроматину в кількох зразках
- Усунення забруднення зондом
- Висока відтворюваність між пробірками
- Спрощений робочий процес для підготовки зразків ChIP
Такі багатотрубні системи добре підходять для рутинних експериментів ChIP та досліджень із середньою пропускною здатністю.
Ультразвуковий гомогенізатор для мікропланшетів – UIP400MTP
Дослідження епігенетики з високою пропускною здатністю все частіше покладаються на обробку зразків у мікропланшетах. Ультразвуковий гомогенізатор для мікропланшетів UIP400MTP розроблений для фрагментації хроматину безпосередньо в стандартних мікропланшетах без перенесення зразків.
Цей підхід дозволяє:
- Одночасну обробку десятків або сотень зразків
- Робочі процеси, сумісні з автоматизацією
- Рівномірний розподіл ультразвукової енергії по лунках
- Суттєве скорочення етапів обробки зразків
Для великих проєктів скринінгу ChIP-seq або досліджень епігенетики з високою пропускною здатністю ультразвукова обробка мікропланшетів забезпечує виняткову масштабованість та ефективність. Багатолунковий ультразвуковий обробник UIP400MTP добре підходить для інтеграції в системи автоматизованого дозування рідин та автоматизовані лабораторні робочі процеси.
Чому варто обрати ультразвукову обробку замість інших технік подрібнення хроматину?
У порівнянні з ферментативними підходами, ультразвукова обробка для ChIP забезпечує неупереджене подрібнення, оскільки процес не залежить від активності ферментів, специфічних до послідовності. Це особливо важливо для епігенетичних досліджень у масштабі геному, де необхідне рівномірне покриття.
Ще одна велика перевага – масштабованість. Ультразвукові системи можуть обробляти один зразок, кілька пробірок або цілі мікропланшети, дозволяючи лабораторіям вибирати найбільш підходящу конфігурацію для їхньої експериментальної пропускної здатності.
Нарешті, ультразвукова обробка забезпечує чудовий контроль над параметрами подрібнення. Коригуючи імпульсні цикли, тривалість та рівні потужності, дослідники можуть надійно досягати бажаного розподілу розмірів фрагментів.
Подрібнення хроматину шляхом оптимізованої ультразвукової обробки зразків ChIP.
(a) відсутність подрібнення (довгі фрагменти на гелі);
(b) оптимальний профіль подрібнення (збагачення фрагментами розміром 200–600 bp);
(c) надмірне подрібнення ДНК (надмірна присутність фрагментів коротших за 200 bp)
© Jarillo et al., 2018
Порівняння технік подрібнення хроматину
| Метод подрібнення хроматину | Принцип | Переваги | Обмеження |
| Ультразвукова обробка | Акустична енергія високої частоти механічно подрібнює хроматин. | Подрібнення без реагентів, високоефективні відтворювані результати, регульований розподіл розмірів фрагментів, сумісність з крослінкованим хроматином, масштабованість від одиночних пробірок до форматів з багатьма зразками та мікропланшетів. | Потребує обладнання для ультразвукової обробки та оптимізації параметрів ультразвукової обробки. |
| Ферментативне травлення (MNase) | Мікрококова нуклеаза розщеплює ДНК між нуклеосомами. | М’яке подрібнення та корисність для аналізу нативного хроматину. | Ферментативне упередження, перевага щодо послідовності, складність контролю травлення, потенційна варіабельність між експериментами. |
| Механічне подрібнення (голка / шприц) | Хроматин руйнується шляхом повторного фізичного впливу. | Простий метод, що потребує мінімального обладнання. | Низька відтворюваність, обмежений контроль над розміром фрагментів, трудомісткість для кількох зразків. |
| Небулізація | Стиснене повітря примушує ДНК проходити через малі отвори, спричиняючи подрібнення. | Швидкий процес подрібнення. | Можлива втрата зразка, обмежена масштабованість, потребує спеціалізованого обладнання. |
Як кількісно та якісно оцінити вихід хроматину після ультразвукового подрібнення?
Після ультразвукової обробки для ChIP дослідники повинні оцінити як кількість, так і якість подрібненого хроматину. Цей крок верифікації гарантує, що подрібнення хроматину відповідає вимогам наступних етапів, таких як ChIP-qPCR або ChIP-seq.
Кількісне визначення зазвичай починається з вимірювання концентрації ДНК. Спектрофотометричні методи, такі як аналіз Nanodrop, або флуорометричні аналізи, як кількісне визначення ДНК за допомогою Qubit, забезпечують надійні оцінки виходу хроматину після зворотного крослінкування та очищення.
Однак сама по собі концентрація ДНК не показує, чи було подрібнення успішним. Тому дослідники оцінюють розподіл розмірів фрагментів, використовуючи електрофоретичні техніки. Агарозний гель-електрофорез залишається загальноприйнятим підходом для візуалізації фрагментів ДНК та перевірки того, що більшість з них потрапляє в цільовий діапазон розмірів.
Більш просунуті лабораторії часто використовують системи капілярного електрофорезу, такі як Agilent Bioanalyzer або TapeStation. Ці платформи забезпечують точні профілі розподілу розмірів і дозволяють дослідникам виявляти надмірне подрібнення або неповне розривання.
Під час оцінки якості хроматину після ультразвукового подрібнення дослідники зазвичай підтверджують:
- Більшість фрагментів ДНК потрапляють у діапазон 100–600 bp
- Розподіл фрагментів є послідовним між повторними зразками
- Деградація ДНК є мінімальною
- Загальний вихід хроматину є достатнім для запланованого аналізу ChIP
Надлежащий контроль якості гарантує, що етап ультразвукового подрібнення хроматину дає відтворювані та біологічно значущі результати.
Висновок: Ультразвукове подрібнення хроматину для надійних досліджень
Надійне подрібнення хроматину є фундаментальним для успішних досліджень ChIP та епігенетики. Ультразвукове фрагментування пропонує потужне рішення, оскільки воно забезпечує точне, відтворюване та безреагентне руйнування хроматину в широкому діапазоні експериментальних форматів.
Завдяки ретельній оптимізації параметрів ультразвукової обробки, перевірці розподілу розмірів фрагментів та вибору відповідної системи ультразвукової обробки – будь то ультразвуковий гомогенізатор зондового типу, VialTweeter для багатьох пробірок або високоефективний ультразвуковий гомогенізатор для мікропланшетів UIP400MTP – дослідники можуть досягти стабільного фрагментування хроматину, що підтримує високоякісні результати ChIP та ChIP-seq.
Оскільки дослідження в галузі епігенетики продовжують розширюватися в напрямку більшої пропускної здатності та вищої експериментальної відтворюваності, ультразвукове подрібнення хроматину залишається одним із найбільш універсальних та надійних методів, доступних для сучасних лабораторій молекулярної біології.
Розробка, виробництво та консалтинг – якість, зроблена в Німеччині
Ультразвукові гомогенізатори Hielscher відомі своїми найвищими стандартами якості та дизайну. Надійність та простота експлуатації дозволяють легко інтегрувати наші ультразвукові гомогенізатори в промислові об’єкти. Жорсткі умови та складні середовища легко витримуються ультразвуковими гомогенізаторами Hielscher.
Hielscher Ultrasonics – це компанія, сертифікована за стандартом ISO, яка приділяє особливу увагу високоефективним ультразвуковим гомогенізаторам, що характеризуються передовими технологіями та зручністю використання. Звичайно, ультразвукові гомогенізатори Hielscher відповідають вимогам CE та вимогам UL, CSA і RoHs.
Стійка для пробірок, оброблена ультразвуком у UIP400MTP для подрібнення хроматину
Література / Посилання
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
Часто задавані питання
Що таке хроматин?
Хроматин – це структурний комплекс ДНК та асоційованих білків, який організовує генетичний матеріал у ядрі еукаріотичних клітин. Основними білками хроматину є гістони, навколо яких намотана ДНК, утворюючи нуклеосоми. Така організація ущільнює ДНК, одночасно регулюючи доступ до генетичної інформації для таких процесів, як транскрипція, реплікація та репарація ДНК.
Які існують типи хроматину?
Хроматин зазвичай класифікують на дві основні форми: еухроматин та гетерохроматин. Еухроматин є слабо упакованим та транскрипційно активним, що дозволяє транскрипційному апарату легко отримувати доступ до генів. Гетерохроматин є більш щільно упакованим та транскрипційно неактивним, зазвичай містячи повторювані послідовності ДНК або гени, які є замовченими. Гетерохроматин можна поділити на конститутивний гетерохроматин, який залишається постійно конденсованим, та факультативний гетерохроматин, який може переходити між активним та неактивним станами залежно від клітинних умов.
Що таке крослінкінг?
Крослінкінг – це біохімічний процес, який використовується для стабілізації взаємодій між біомолекулами шляхом утворення ковалентних зв’язків між ними. У дослідженнях хроматину крослінкінг зазвичай використовується для збереження взаємодій білок–ДНК у хроматині перед аналізом. Хімічні агенти, такі як формальдегід, зазвичай використовуються для створення оборотних ковалентних зв’язків між ДНК та асоційованими білками, ефективно «заморожуючи» молекулярні взаємодії в конкретний момент часу. Така стабілізація дозволяє фрагментувати та обробляти комплекси хроматину без втрати нативних асоціацій між ДНК та регуляторними білками, що є важливим для таких методів, як імунопреципітація хроматину (ChIP).
Що таке ChIP?
Імунопреципітація хроматину (ChIP) – це метод молекулярної біології, який використовується для дослідження взаємодій між білками та ДНК у складі хроматину. У цьому методі комплекси ДНК-білок спочатку стабілізуються, зазвичай за допомогою зшивання, а потім хроматин фрагментується. Для імунопреципітації комплексів білок-ДНК використовуються антитіла, специфічні до цільового білка, що дозволяє ізолювати та аналізувати асоційовані послідовності ДНК.
Для чого використовується ChIP?
ChIP використовується для ідентифікації геномних ділянок, зв’язаних зі специфічними білками, асоційованими з ДНК, такими як транскрипційні фактори, модифікації гістонів або регуляторні білки, асоційовані з хроматином. Цей метод широко застосовується для вивчення регуляції генів, епігенетичних модифікацій, сайтів зв’язування транскрипційних факторів та структури хроматину. У поєднанні з наступними аналітичними методами, такими як кількісна ПЛР (ChIP-qPCR) або секвенування високої пропускної здатності (ChIP-seq), він дозволяє проводити картування взаємодій білок–ДНК у масштабі всього геному.
Які існують типи ChIP?
Існує кілька варіантів імунопреципітації хроматину залежно від експериментального дизайну та наступного аналізу. Найпоширеніші підходи включають ChIP-qPCR, який кількісно визначає збагачення специфічних геномних ділянок; ChIP-seq, який використовує секвенування наступного покоління для картування взаємодій білок-ДНК у масштабі всього геному; та ChIP-chip, який поєднує ChIP з аналізом ДНК-мікрочипів. Додаткові варіанти, такі як нативна ChIP (N-ChIP), яка аналізує не зшитий хроматин, та зшита ChIP (X-ChIP), яка використовує хімічне зшивання для стабілізації взаємодій білок-ДНК, також широко використовуються залежно від біологічного питання, що досліджується.
Фрагментування хроматину з високою пропускною здатністю за допомогою мікропланшетного сонікатора UIP400MTP
Hielscher Ultrasonics виробляє високоефективні ультразвукові гомогенізатори від лабораторного до промислового розміру.