Зсув хроматину за допомогою ультразвукової обробки
Розщеплення хроматину є важливим етапом у багатьох робочих процесах епігенетики та молекулярної біології, зокрема в імунопреципітації хроматину (ChIP), ChIP-seq та пов'язаних з ними аналізах. Мета полягає у фрагментації хроматину на відтворювані ДНК-білкові комплекси зі збереженням цілісності епітопів і мінімізацією втрат зразків. Серед доступних методів ультразвукова фрагментація хроматину стала широко використовуваним підходом, оскільки вона забезпечує надійну, безреагентну фрагментацію з відмінною відтворюваністю.
Що потрібно враховувати при стрижці хроматину?
Ефективне розщеплення хроматину вимагає ретельного контролю експериментальних параметрів. Неправильна фрагментація може поставити під загрозу подальші експерименти з ЧІП, генеруючи занадто великі, надмірно деградовані або неузгоджені між зразками фрагменти.
Одним з найважливіших факторів є бажаний розподіл фрагментів за розмірами. Для більшості застосувань ChIP та ChIP-seq оптимальними є фрагменти хроматину розміром від 100 до 600 пар основ. Цей діапазон розмірів дозволяє проводити ефективну імунопреципітацію, забезпечуючи при цьому достатню роздільну здатність для геномного картування.
Іншим ключовим фактором є ефективність зшивання перед обробкою ультразвуком. Більшість робочих процесів ЧІП включають фіксацію формальдегідом для стабілізації взаємодії білка з ДНК. Однак надмірне зшивання може зробити хроматин більш стійким до фрагментації, що вимагає більш тривалого часу обробки ультразвуком і потенційно збільшує тепловий вплив.
Контроль температури також має вирішальне значення. Ультразвукова обробка генерує локалізовану енергію, яка може підвищити температуру зразка. Підвищена температура може пошкодити ДНК або денатурувати білки, впливаючи на розпізнавання антитіл під час ЧІП. Тому багато дослідників виконують імпульсні цикли ультразвукової обробки в поєднанні з інтервалами охолодження для підтримки стабільності зразка.
Концентрація та об'єм зразка також впливають на ефективність фрагментації. Висококонцентровані суспензії хроматину можуть вимагати більш тривалого часу обробки ультразвуком, в той час як малі об'єми зразків вимагають точної подачі енергії для запобігання надмірної обробки.
Нарешті, вибір пристрою для обробки ультразвуком сильно впливає на відтворюваність експерименту. Прилади, призначені для зсуву хроматину, зазвичай забезпечують контрольовану ультразвукову енергію і стандартизовану обробку зразків, що дозволяє проводити послідовну фрагментацію декількох зразків.
Ультразвуковий зріз ДНК при ХІП – імунопреципітація хроматину
Який сокатор вибрати для стрижки хроматину?
Різні лабораторні робочі процеси вимагають різних конфігурацій ультразвукової обробки. Оптимальна система значною мірою залежить від пропускної здатності, об'єму та формату експерименту.
Зонд-сокатор зондового типу
Зондовий сокатор доставляє ультразвукову енергію безпосередньо в зразок через титановий зонд. Така конфігурація забезпечує дуже високу щільність енергії і тому підходить для надійного руйнування хроматину в окремих зразках.
Зондові сонатори особливо корисні для:
- Малі та середні вибірки
- Хроматин, що важко фрагментується
- Гнучкі експериментальні протоколи
Багатотрубний сокатор - VialTweeter
Для лабораторій, які обробляють кілька зразків одночасно, багатопробірковий сокатор VialTweeter забезпечує високу відтворюваність результатів. Система передає ультразвукову енергію опосередковано через тримач пробірки, що дозволяє фрагментувати кілька запаяних пробірок в ідентичних умовах.
Така конфігурація має важливі переваги:
- Паралельний зріз хроматину декількох зразків
- Усунення забруднення датчика
- Висока відтворюваність між пробірками
- Спрощений робочий процес для підготовки зразків чипів
Такі багатопробіркові системи добре підходять для рутинних експериментів з ЧІП і досліджень середньої пропускної здатності.
Мікропланшетний сокатор - UIP400MTP
Високопродуктивні епігенетичні дослідження все більше покладаються на обробку зразків на основі мікропланшетів. Ультразвуковий аналізатор мікропланшетів UIP400MTP призначений для фрагментації хроматину безпосередньо в стандартних мікропланшетах без перенесення зразків.
Такий підхід дозволяє:
- Одночасна обробка десятків і сотень зразків
- Робочі процеси, зручні для автоматизації
- Рівномірний розподіл ультразвукової енергії по свердловинах
- Значне скорочення етапів роботи зі зразками
Для великих проектів скринінгу ChIP-seq або високопродуктивних епігенетичних досліджень ультразвукова обробка мікропланшетів забезпечує виняткову масштабованість та ефективність. Багатолунковий ультразвуковий пристрій для мікропланшетів UIP400MTP добре підходить для інтеграція в системи роботи з рідинами та автоматизовані робочі процеси в лабораторіях.
Чому слід обирати ультразвукову обробку над іншими методами зсуву хроматину?
У порівнянні з ферментативними підходами, ультразвукова обробка для ChIP забезпечує неупереджену фрагментацію, оскільки процес не залежить від активності ферментів, специфічних для конкретної послідовності. Це особливо важливо для епігенетичних досліджень геному в цілому, де рівномірне покриття є важливим.
Ще однією важливою перевагою є масштабованість. Ультразвукові системи можуть працювати з окремими зразками, кількома пробірками або цілими мікропланшетами, що дозволяє лабораторіям вибирати найбільш підходящу конфігурацію для своїх експериментів.
Нарешті, ультразвукова обробка забезпечує чудовий контроль над параметрами фрагментації. Регулюючи цикли імпульсів, тривалість і рівень потужності, дослідники можуть надійно досягти бажаного розподілу фрагментів за розміром.
Фрагментація хроматину за допомогою оптимізованої ультразвукової обробки зразків ChIP.
(а) відсутність зсувів (довгих фрагментів у гелі);
(b) оптимальний профіль фрагментації (збагачення фрагментів на 200-600 п.н.);
(c) надлишкова фрагментація ДНК (надмірна представленість фрагментів, коротших за 200 п.н.)
© Jarillo та ін., 2018
Порівняння методів розщеплення хроматину
| Метод зсуву хроматину | Принцип | Переваги | Обмеження |
| ультразвукова хвороба, | Високочастотна акустична енергія механічно фрагментує хроматин. | Фрагментація без реагентів, висока відтворюваність результатів, можливість налаштування розподілу фрагментів за розміром, сумісність зі зшитим хроматином, масштабування від окремих пробірок до форматів з декількома зразками і мікропланшетів. | Потребує обладнання для ультразвукової обробки та оптимізації параметрів ультразвукової обробки. |
| Ферментативне травлення (MNase) | Мікрококова нуклеаза розщеплює ДНК між нуклеосомами. | М'яка фрагментація, корисна для аналізу нативного хроматину. | Упередженість ферментів, перевага послідовності, перетравлення важко контролювати, потенційна варіабельність між експериментами. |
| Механічний зріз (голка / шприц) | Хроматин руйнується під дією постійної фізичної сили. | Простий метод, що вимагає мінімального обладнання. | Погана відтворюваність, обмежений контроль над розміром фрагментів, трудомісткість для декількох зразків. |
| Небулізація | Стиснене повітря проштовхує ДНК через маленькі отвори, спричиняючи її фрагментацію. | Швидкий процес фрагментації. | Можлива втрата зразка, обмежена масштабованість, потребує спеціалізованого обладнання. |
Як кількісно та якісно визначити вихід хроматину після ультразвукової фрагментації?
Після обробки ультразвуком для ChIP дослідники повинні оцінити кількість і якість фрагментованого хроматину. Цей етап перевірки гарантує, що фрагментація хроматину відповідає вимогам наступних програм, таких як ChIP-qPCR або ChIP-seq.
Кількісне визначення зазвичай починається з вимірювання концентрації ДНК. Спектрофотометричні методи, такі як нанокрапельний аналіз або флуорометричні аналізи, такі як кількісне визначення ДНК Qubit, забезпечують надійну оцінку виходу хроматину після декросингування та очищення.
Однак концентрація ДНК сама по собі не показує, чи була фрагментація успішною. Тому дослідники оцінюють розподіл фрагментів за розміром за допомогою електрофоретичних методів. Електрофорез в агарозному гелі залишається загальновживаним підходом для візуалізації фрагментів ДНК і перевірки того, що більшість з них потрапляє в цільовий діапазон розмірів.
Більш просунуті лабораторії часто використовують системи капілярного електрофорезу, такі як Agilent Bioanalyzer або TapeStation. Ці платформи забезпечують точні профілі розподілу розмірів і дозволяють дослідникам виявляти надмірну фрагментацію або неповне зсув.
Оцінюючи якість хроматину після ультразвукової фрагментації, дослідники зазвичай підтверджують її:
- Більшість фрагментів ДНК знаходяться в діапазоні 100-600 п.н.
- Розподіл фрагментів узгоджується між реплікаційними зразками
- Деградація ДНК мінімальна
- Загальний вихід хроматину достатній для проведення запланованого ChIP-аналізу
Належний контроль якості гарантує, що етап ультразвукового розщеплення хроматину дає відтворювані та біологічно значущі результати.
Висновок: Ультразвуковий зріз хроматину для надійних досліджень
Надійне розщеплення хроматину має фундаментальне значення для успішного проведення досліджень у галузі ЧІП та епігенетики. Ультразвукова фрагментація пропонує потужне рішення, оскільки дозволяє точно, відтворювано і без реагентів руйнувати хроматин у широкому діапазоні експериментальних форматів.
Ретельно оптимізуючи параметри ультразвукової обробки, перевіряючи розподіл розмірів фрагментів і вибираючи відповідну систему ультразвукової обробки – будь то зондовий сокатор, багатокамерний VialTweeter або високопродуктивний мікропланшетний сокатор UIP400MTP. – дослідники можуть досягти послідовної фрагментації хроматину, яка підтримує високоякісні результати ChIP і ChIP-seq.
Оскільки епігенетичні дослідження продовжують розширюватися в напрямку підвищення пропускної здатності і більшої експериментальної відтворюваності, ультразвукове розщеплення хроматину залишається одним з найбільш універсальних і надійних методів, доступних для сучасних лабораторій молекулярної біології.
Проектування, виробництво та консалтинг – Якість зроблено в Німеччині
Ультразвукові апарати Hielscher добре відомі своїми найвищими стандартами якості та дизайну. Надійність і простота експлуатації дозволяють плавно інтегрувати наші ультразвукові апарати в промислові об'єкти. З важкими умовами та вимогливими умовами легко справляються ультразвукові апарати Hielscher.
Hielscher Ultrasonics є сертифікованою компанією ISO і приділяє особливу увагу високопродуктивним ультразвуковим апаратам, які відрізняються найсучаснішими технологіями та зручністю для використання. Звичайно, ультразвукові апарати Hielscher відповідають вимогам CE та відповідають вимогам UL, CSA та RoHs.
Tube rack sonified in the UIP400MTP for chromatin shearing
Література / Список літератури
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
Поширені запитання
Що таке хроматин?
Хроматин - це структурний комплекс ДНК і пов'язаних з нею білків, який організовує генетичний матеріал у ядрі еукаріотичних клітин. Основними білками хроматину є гістони, навколо яких обертається ДНК, утворюючи нуклеосоми. Ця організація ущільнює ДНК, одночасно регулюючи доступ до генетичної інформації для таких процесів, як транскрипція, реплікація та репарація ДНК.
Які існують типи хроматину?
Хроматин зазвичай поділяють на дві основні форми: еухроматин і гетерохроматин. Еухроматин нещільно упакований і транскрипційно активний, що дозволяє транскрипційному апарату легко отримувати доступ до генів. Гетерохроматин більш щільно упакований і транскрипційно неактивний, зазвичай містить повторювані послідовності ДНК або гени, які замовчуються. Гетерохроматин можна поділити на конститутивний гетерохроматин, який залишається постійно конденсованим, і факультативний гетерохроматин, який може перемикатися між активним і неактивним станами залежно від клітинних умов.
Що таке зшивання?
Зшивання - це біохімічний процес, який використовується для стабілізації взаємодії між біомолекулами шляхом утворення ковалентних зв'язків між ними. У дослідженнях хроматину зшивання зазвичай використовується для збереження білок-ДНК взаємодій у хроматині перед аналізом. Хімічні агенти, такі як формальдегід, зазвичай використовуються для створення оборотних ковалентних зв'язків між ДНК та асоційованими білками, що ефективно “Заморожування” молекулярних взаємодій у певний момент часу. Така стабілізація дозволяє фрагментувати та обробляти хроматинові комплекси без втрати нативних асоціацій між ДНК та регуляторними білками, що є важливим для таких методів, як імунопреципітація хроматину (ChIP).
Що таке чіп?
Імунопреципітація хроматину (Chromatin immunoprecipitation, ChIP) - це метод молекулярної біології, який використовується для дослідження взаємодії між білками та ДНК у хроматині. У цьому методі ДНК-білкові комплекси спочатку стабілізують, як правило, шляхом зшивання, а потім фрагментують хроматин. Антитіла, специфічні до білка-мішені, використовуються для імунопреципітації комплексів білок-ДНК, що дозволяє виділити та проаналізувати пов'язані з ними послідовності ДНК.
Для чого використовується ЧІП?
ЧІП використовується для ідентифікації ділянок геному, зв'язаних зі специфічними ДНК-асоційованими білками, такими як фактори транскрипції, модифікації гістонів або регуляторні білки, асоційовані з хроматином. Метод широко застосовується для вивчення регуляції генів, епігенетичних модифікацій, сайтів зв'язування факторів транскрипції та структури хроматину. У поєднанні з наступними аналітичними методами, такими як кількісна ПЛР (ChIP-qPCR) або високопродуктивне секвенування (ChIP-seq), він дозволяє картування білок-ДНК взаємодій на рівні всього геному.
Які існують типи чіпів?
Існує кілька варіантів імунопреципітації хроматину, залежно від плану експерименту та подальшого аналізу. Найпоширеніші підходи включають ChIP-qPCR, який кількісно оцінює збагачення певних ділянок геному; ChIP-seq, який використовує секвенування наступного покоління для картування білок-ДНК взаємодій в геномі; і ChIP-chip, який поєднує ChIP з аналізом ДНК-мікрочипів. Додаткові варіанти, такі як нативний ЧІП (N-ChIP), який аналізує незшитий хроматин, і зшитий ЧІП (X-ChIP), який використовує хімічне зшивання для стабілізації білок-ДНК взаємодій, також широко застосовуються в залежності від біологічного питання, яке досліджується.
Високопродуктивний зріз хроматину за допомогою мікропланшетного ультразвукового апарату UIP400MTP
Hielscher Ultrasonics виробляє високоефективні ультразвукові гомогенізатори з Лабораторії до промислові розміри.