การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อเนื้องอกโดยใช้คลื่นอัลตราโซนิกช่วย – วิธีปฏิบัติ

วิธีปฏิบัตินี้อธิบายวิธีสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อเนื้องอกโดยใช้คลื่นอัลตราโซนิกช่วย ซึ่งพัฒนากระบวนการสลายเซลล์ด้วยยูเรียมาตรฐานของ CPTAC โดยเพิ่มขั้นตอนการใช้คลื่นอัลตราโซนิกแบบโพรบที่ควบคุมได้ระหว่างการทำลายเนื้อเยื่อ การปรับปรุงนี้ต่อยอดจากกลยุทธ์การเตรียมโปรตีโอมและฟอสโฟโปรตีโอมของ CPTAC สำหรับการวิเคราะห์เชิงลึกที่มีอยู่แล้ว โดยช่วยให้การทำลายเซลล์และโครงสร้างภายในเซลล์ดีขึ้น ลดความหนืดของตัวอย่าง และเพิ่มการปลดปล่อยโปรตีนที่โดยทั่วไปสกัดได้ยากกว่าด้วยการสลายเซลล์ด้วยยูเรียเพียงอย่างเดียว โดยเฉพาะโปรตีนที่ยึดกับเยื่อหุ้ม และโปรตีนที่จับกับ DNA หรือสัมพันธ์กับนิวเคลียส ในการศึกษาที่เป็นพื้นฐานของวิธีนี้ กระบวนการที่ใช้คลื่นอัลตราโซนิกช่วยเพิ่มการตรวจพบทั้งโปรตีนและฟอสโฟเปปไทด์ โดยยังคงเข้ากันได้กับกระบวนการขั้นถัดไปตามแนวทาง CPTAC ซึ่งประกอบด้วยการย่อย การติดฉลาก TMT การแยกส่วน การเพิ่มความเข้มข้นของฟอสโฟเปปไทด์ และการวิเคราะห์ LC-MS/MS

การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อเนื้องอกโดยใช้คลื่นอัลตราโซนิกช่วยสำหรับการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์และฟอสโฟโปรตีโอมิกส์เชิงลึก

วิธีปฏิบัติต่อไปนี้ได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับการสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อเนื้องอกที่บดเป็นผงภายใต้สภาวะเย็นจัดในบัฟเฟอร์สลายเซลล์ที่มียูเรีย 8 M: ขั้นตอนการใช้คลื่นอัลตราโซนิกแบบโพรบที่เพิ่มเข้ามาช่วยให้สกัดโปรตีนกลุ่มที่สกัดได้ยากได้ดีขึ้น โดยเฉพาะโปรตีนที่สัมพันธ์กับเยื่อหุ้มและโปรตีนที่สัมพันธ์กับ DNA/นิวเคลียส ก่อนการย่อยและการวิเคราะห์ LC-MS/MS ในขั้นถัดไป ในการศึกษาที่เป็นพื้นฐานของวิธีนี้โดย Li et al. (2025) การเพิ่มขั้นตอนการใช้คลื่นอัลตราโซนิกช่วยเพิ่มการตรวจพบโปรตีนที่สัมพันธ์กับเยื่อหุ้มและนิวเคลียส และสนับสนุนการวิเคราะห์เชิงลึกที่ครอบคลุมโปรตีน >12,000 ชนิดและฟอสโฟเปปไทด์ >25,000 ชนิดภายใต้กระบวนการของผู้วิจัย

ขอบเขตการประยุกต์ใช้วิธีปฏิบัติ

ใช้วิธีนี้สำหรับ:

• เนื้อเยื่อเนื้องอกสดแช่แข็งที่บดเป็นผงภายใต้สภาวะเย็นจัด
• ตะกอนเซลล์หรือสิ่งส่งตรวจทางชีวภาพอื่น ๆ ที่มีวิธีสกัดด้วยยูเรียซึ่งใช้อยู่แล้ว
• กระบวนการโปรตีโอมิกส์และฟอสโฟโปรตีโอมิกส์แบบองค์รวมที่ใช้การย่อยด้วยทริปซิน และอาจเลือกใช้การติดฉลาก TMT

การศึกษาโดย Li et al. (2025) ระบุว่ากระบวนการนี้ใช้ได้กับสิ่งส่งตรวจชนิดอื่นด้วย เช่น สายเซลล์ เลือด และปัสสาวะ อย่างไรก็ตาม อาจจำเป็นต้องปรับให้เหมาะสมตามชนิดของตัวอย่าง

กระบวนการเตรียมตัวอย่างที่ปรับให้เหมาะสมโดยเพิ่มขั้นตอนการใช้คลื่นอัลตราโซนิก กระบวนการที่ปรับให้เหมาะสมและการออกแบบการทดลองอ้างอิงวิธีปฏิบัติการเตรียมตัวอย่างของ CPTAC สำหรับการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์และฟอสโฟโปรตีโอมิกส์แบบองค์รวม
การศึกษาและแผนผัง: ©Li et al., 2025

หลักการทำงาน

การศึกษาต้นฉบับเพิ่มการใช้คลื่นอัลตราโซนิกในกระบวนการสลายเซลล์ด้วยยูเรียมาตรฐานของ CPTAC และพบว่าการตรวจพบโปรตีนที่สัมพันธ์กับเยื่อหุ้มและนิวเคลียสดีขึ้น ผู้เขียนระบุว่าต้องปรับพารามิเตอร์การใช้คลื่นอัลตราโซนิกอย่างละเอียดให้เหมาะกับขนาด/ความเข้มข้นของตัวอย่าง – โดยเลือกขนาดโซโนโทรด พลังงานที่ป้อน และจังหวะเวลาของพัลส์

ตัวอย่างเช่น สำหรับ Hielscher UP200Ht และ UP200St หมายถึง:

• ใช้แอมพลิจูดและโหมดพัลส์เป็นตัวแปรควบคุมหลัก
• รักษาตัวอย่างให้เย็นตลอดกระบวนการ (เช่น วางบนน้ำแข็ง)
• เริ่มต้นด้วยการตั้งค่าที่ระมัดระวัง
• ปรับให้เหมาะสมโดยพิจารณาความใสของตัวอย่าง อุณหภูมิ ปริมาณโปรตีนที่ได้ และคุณภาพของเปปไทด์ในขั้นถัดไป

 
เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher ขนาด 200 วัตต์ทั้งสองรุ่น ได้แก่ UP200Ht และ UP200St ออกแบบมาสำหรับตัวอย่างปริมาตรน้อยและปานกลาง โดยปรับค่าแอมพลิจูดและพัลส์ได้ เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกทั้งสองรุ่นมีระบบควบคุมผ่านหน้าจอสัมผัสดิจิทัลเพื่อปรับพารามิเตอร์ได้อย่างแม่นยำ การบันทึกข้อมูลอัตโนมัติ เซนเซอร์อุณหภูมิแบบเสียบต่อ การควบคุมระยะไกล และไฟส่องตัวอย่าง
 

สารเคมีสำหรับการสกัดโปรตีนโดยใช้คลื่นอัลตราโซนิกช่วย

บัฟเฟอร์สลายเซลล์ด้วยยูเรีย

เตรียมใหม่ทันที ก่อนใช้งาน:

• ยูเรีย 8 M
• NaCl 75 mM
• Tris 50 mM, pH 8.0
• EDTA 1 mM
• aprotinin 2 µg/mL
• leupeptin 10 µg/mL
• PMSF 1 mM
• NaF 10 mM
• PUGNAc 20 µM
• สารผสมยับยั้งฟอสฟาเทส 2, 1:100 (v/v)
• สารผสมยับยั้งฟอสฟาเทส 3, 1:100 (v/v)

ต้องละลายยูเรียให้หมดก่อนเติมสารเติมแต่ง ควรเติมสารยับยั้งทันทีก่อนใช้งาน ควรเก็บบัฟเฟอร์บนน้ำแข็ง และหลังเติมสารเติมแต่ง แนะนำให้แกว่งภาชนะเป็นวงแทนการผสมด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์อย่างรุนแรง
 

สารเคมีเพิ่มเติม:

• สารเคมีสำหรับการวิเคราะห์ปริมาณโปรตีนด้วยวิธี BCA
• Tris-HCl 50 mM, pH 8.0
• DTT
• Iodoacetamide
• LysC
• ทริปซิน
• กรดฟอร์มิก
• สารเคมี TMT หากใช้โปรตีโอมิกส์เชิงปริมาณแบบมัลติเพล็กซ์
• สารเคมี IMAC หากดำเนินการเพิ่มความเข้มข้นของฟอสโฟเปปไทด์

อุปกรณ์สำหรับการสกัดโปรตีนโดยใช้คลื่นอัลตราโซนิกช่วย

อุปกรณ์ที่จำเป็น

คำแนะนำในการเลือกโพรบ

สำหรับตัวอย่างประมาณ 200–1000 µL ให้ใช้โซโนโทรดเส้นผ่านศูนย์กลางเล็กที่เหมาะกับการใช้คลื่นอัลตราโซนิกความเข้มสูงโดยตรงกับตัวอย่างปริมาตรน้อย Hielscher มีโซโนโทรดให้เลือกหลายขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง และปลายที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางเล็กกว่าจะให้ความเข้มที่ปลายสูงกว่า

ข้อแนะนำในการใช้งาน: ใช้โพรบขนาดเล็กที่สุดที่ผสมได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยไม่เกิดฟองมากเกินไปหรือสัมผัสผนังภาชนะ

หากทำงานกับหลายตัวอย่างพร้อมกัน อาจพิจารณาใช้ เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับหลายหลอด VialTweeter หรือ เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับไมโครเพลต UIP400MTP!

คำแนะนำทีละขั้นตอน: วิธีสกัดโปรตีนโดยใช้คลื่นอัลตราโซนิกช่วย

A. ทำให้เย็นล่วงหน้าและเตรียมการ

1. ทำให้เครื่องหมุนเหวี่ยงเย็นลงถึง 4°C
2. เตรียมบัฟเฟอร์สลายเซลล์ด้วยยูเรียใหม่และเก็บบนน้ำแข็ง
3. ติดตั้ง UP200Ht หรือ UP200St บนขาตั้งภายในตู้ครอบกันเสียง
4. เตรียมอ่างน้ำแข็งที่มีขนาดใหญ่พอสำหรับวางหลอดตัวอย่างในแนวตั้งได้อย่างมั่นคง

การเตรียมบัฟเฟอร์ใหม่และการรักษาความเย็นขณะปฏิบัติงานมีความสำคัญอย่างยิ่ง

B. การสกัดเบื้องต้นด้วยยูเรีย

1. เก็บเนื้อเยื่อที่บดเป็นผงภายใต้สภาวะเย็นจัดไว้บนน้ำแข็ง
2. เติมบัฟเฟอร์สลายเซลล์ด้วยยูเรียที่แช่เย็นแล้ว 200 µL ต่อเนื้อเยื่อเปียก 50 mg
3. ผสมด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์ที่ความเร็วสูงเป็นเวลา 5–10 s
4. บ่มเป็นเวลา 15 min ที่ 4°C
5. ทำขั้นตอนการผสมด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์และการบ่มซ้ำอีกหนึ่งครั้ง
6. หมุนเหวี่ยงที่ 20,000g เป็นเวลา 10 min ที่ 4°C
7. ย้ายไลเสต/ของเหลวส่วนใสเหนือตะกอนไปยังหลอดสะอาดที่มีการจับยึดสารกับผิวหลอดต่ำ

C. การใช้คลื่นอัลตราโซนิกด้วย UP200Ht หรือ UP200St

สภาวะเริ่มต้นสำหรับการใช้คลื่นอัลตราโซนิก

• แอมพลิจูด: เริ่มที่ 20–30%
• ระยะเวลาพัลส์: เปิดทำงาน 5 s
• การทำให้เย็น: วางบนน้ำแข็ง 2 min ระหว่างพัลส์
• จำนวนรอบ: 4 รอบ
• เวลารวมที่ปล่อยคลื่นอัลตราโซนิกจริง: 20 s
• เวลาดำเนินกระบวนการทั้งหมดรวมการทำให้เย็น: ประมาณ 8–10 min

ขั้นตอนการใช้คลื่นอัลตราโซนิก

1. ย้ายไลเสตไปยังหลอดที่เหมาะกับการใช้คลื่นอัลตราโซนิก ใช้หลอดแคบที่มีผนังบาง ซึ่งช่วยให้แลกเปลี่ยนความร้อนได้ดีและจุ่มโพรบได้อย่างปลอดภัย
2. วางหลอดในอ่างน้ำแข็ง บทความระบุว่าการทำให้เย็นระหว่างใช้คลื่นอัลตราโซนิกมีความสำคัญอย่างยิ่งในการป้องกันความเสียหายจากความร้อน
3. จุ่มปลายโพรบลงในตัวอย่าง ให้ปลายโพรบจมลึกเพียงพอเพื่อให้เกิดคาวิเทชันอย่างเสถียร แต่อย่าให้สัมผัสผนังหรือก้นหลอด
4. ปล่อยพัลส์หนึ่งครั้งเป็นเวลา 5 s ที่แอมพลิจูดเริ่มต้น
5. นำตัวอย่างกลับไปวางบนน้ำแข็งทันที โดยให้ตัวอย่างได้รับความเย็นอย่างทั่วถึงเป็นเวลา 2 min
6. ทำซ้ำจนครบ 4 รอบ
7. ตรวจสอบไลเสตหลังจบรอบ
8. ดำเนินการต่อเฉพาะเมื่อจำเป็น โดยเพิ่มพัลส์ครั้งละหนึ่งครั้งเป็นเวลา 5 s และตามด้วยการทำให้เย็นอย่างทั่วถึงทุกครั้ง
9. หยุดเมื่อไลเสตมีความสม่ำเสมอมากขึ้นและมีลักษณะยืดเป็นสาย/มีความหนืดลดลง
   จุดสิ้นสุดคือไลเสตที่โปร่งแสงมากขึ้นและหยดเป็นหยดแทนการไหลเป็นสายหนืดต่อเนื่อง
10. หมุนเหวี่ยงที่ประมาณ 16,000g เป็นเวลา 15 min ที่ 4°C
11. ย้ายของเหลวส่วนใสเหนือตะกอนที่ผ่านการแยกสิ่งแขวนลอยแล้วไปยังหลอดใหม่ และวัดความเข้มข้นของโปรตีน

การเปรียบเทียบโปรตีโอมิกส์และฟอสโฟโปรตีโอมิกส์แบบองค์รวมระหว่างตัวอย่างที่ใช้และไม่ใช้คลื่นอัลตราโซนิก
a. จำนวนโปรตีนที่ระบุได้ (โปรตีโอมิกส์แบบองค์รวม) ในเนื้อเยื่อเนื้องอก PDX ทั้งหมดที่ใช้หรือไม่ใช้คลื่นอัลตราโซนิก b. จำนวนฟอสโฟเปปไทด์ที่ระบุได้ (การเพิ่มความเข้มข้นด้วย IMAC) ในเนื้อเยื่อเนื้องอก PDX ทั้งหมดที่ใช้หรือไม่ใช้คลื่นอัลตราโซนิก นับเฉพาะโปรตีนและฟอสโฟเปปไทด์ที่มีอัตราส่วนปริมาณมากกว่าหรือเท่ากับเปอร์เซ็นไทล์ที่ 25 โดยคำนวณอัตราส่วนปริมาณระหว่างตัวอย่างชนิดเดียวกัน
การศึกษาและกราฟ: ©Li et al., 2025

การย่อยและการวิเคราะห์ในขั้นถัดไป

หลังการใช้คลื่นอัลตราโซนิกและการแยกสิ่งแขวนลอย ให้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ในกระบวนการต้นฉบับตามแนวทาง CPTAC:

1. เจือจางไลเสตในอัตราส่วน 1:3 (v/v) ด้วย Tris-HCl 50 mM pH 8.0 เพื่อลดความเข้มข้นของยูเรียให้เหลือ <2 M
2. เติม LysC 1 mAU ต่อโปรตีน 50 µg และบ่มเป็นเวลา 2 h ที่ 25°C
3. เติมทริปซินในอัตราส่วนเอนไซม์:สารตั้งต้น 1:49 (w/w) และย่อยข้ามคืนที่ 25°C
4. หยุดปฏิกิริยาด้วยกรดฟอร์มิกให้มีความเข้มข้นสุดท้าย 1%
5. ดำเนินการต่อด้วยการกำจัดเกลือ การติดฉลาก TMT การแยกส่วน การเพิ่มความเข้มข้นของฟอสโฟเปปไทด์ และ LC-MS/MS ตามความจำเป็น

การแสดงออกที่แตกต่างกันของฟอสโฟเปปไทด์จากการวิเคราะห์ MS ที่ใช้การติดฉลาก TMT
a. ชนิดย่อย basal โดยเน้นฟอสโฟเปปไทด์บางชนิดของมนุษย์ (ตำแหน่งเริ่มต้นและสิ้นสุดของลำดับโปรตีน) ที่มีการแสดงออกเพิ่มขึ้นในตัวอย่างที่ใช้คลื่นอัลตราโซนิกเมื่อเทียบกับตัวอย่างที่ไม่ใช้คลื่นอัลตราโซนิก b. ชนิดย่อย luminal โดยเน้นฟอสโฟเปปไทด์บางชนิดของมนุษย์ (ตำแหน่งเริ่มต้นและสิ้นสุดของ protein_sequence) ที่มีการแสดงออกเพิ่มขึ้นในตัวอย่างที่ใช้คลื่นอัลตราโซนิกเมื่อเทียบกับตัวอย่างที่ไม่ใช้คลื่นอัลตราโซนิก c. วิถี KEGG ที่พบเพิ่มขึ้นจากการวิเคราะห์โปรตีนของฟอสโฟเปปไทด์ที่มีการแสดงออกเพิ่มขึ้นในเนื้องอกชนิดย่อย basal ที่ใช้คลื่นอัลตราโซนิก d. วิถี KEGG ที่พบเพิ่มขึ้นจากการวิเคราะห์โปรตีนของฟอสโฟเปปไทด์ที่มีการแสดงออกเพิ่มขึ้นในเนื้องอกชนิดย่อย luminal ที่ใช้คลื่นอัลตราโซนิก
การศึกษาและกราฟ: ©Li et al., 2025

การออกแบบ การผลิต และการให้คำปรึกษา – คุณภาพจากการผลิตในเยอรมนี

เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher เป็นที่รู้จักในด้านมาตรฐานคุณภาพและการออกแบบที่สูงที่สุด ความทนทานและการใช้งานที่ง่ายช่วยให้ติดตั้งเครื่องอัลตราโซนิกของเราเข้ากับโรงงานอุตสาหกรรมได้อย่างราบรื่น เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher รับมือกับสภาวะที่รุนแรงและสภาพแวดล้อมที่มีข้อกำหนดสูงได้อย่างง่ายดาย

Hielscher Ultrasonics เป็นบริษัทที่ได้รับการรับรอง ISO และให้ความสำคัญเป็นพิเศษกับเครื่องอัลตราโซนิกสมรรถนะสูงที่มีเทคโนโลยีล้ำสมัยและใช้งานง่าย แน่นอนว่าเครื่องอัลตราโซนิก Hielscher เป็นไปตามข้อกำหนด CE และตรงตามข้อกำหนดของ UL, CSA และ RoHs

เอกสารวิชาการ / เอกสารอ้างอิง

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.