การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อเนื้องอกโดยใช้คลื่นเสียง – พิธีสาร

โปรโตคอลนี้อธิบายวิธีการสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อเนื้องอกโดยใช้การโซนิเคชันร่วม ซึ่งเป็นการพัฒนาต่อจากกระบวนการมาตรฐาน CPTAC urea lysis โดยเพิ่มขั้นตอนการควบคุมการโซนิเคชันด้วยโพรบระหว่างกระบวนการทำลายเนื้อเยื่อการปรับปรุงนี้พัฒนาขึ้นจากกลยุทธ์การเตรียมโปรตีโอมและฟอสโฟโปรตีโอมในระดับลึกที่ CPTAC ได้วางรากฐานไว้ โดยช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการทำลายโครงสร้างของเซลล์และโครงสร้างย่อยภายในเซลล์ ลดความหนืดของตัวอย่าง และส่งเสริมการปลดปล่อยโปรตีนที่โดยปกติแล้วยากต่อการสกัดด้วยวิธียูเรียไลซิสเพียงอย่างเดียว โดยเฉพาะโปรตีนที่จับกับเยื่อหุ้มเซลล์ โปรตีนที่จับกับดีเอ็นเอ หรือโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับนิวเคลียสในการศึกษาพื้นฐาน กระบวนการทำงานที่ช่วยด้วยคลื่นเสียงช่วยเพิ่มการตรวจจับโปรตีนและฟอสโฟเปปไทด์ในขณะที่ยังคงความเข้ากันได้กับกระบวนการย่อยแบบ CPTAC การติดฉลาก TMT การแบ่งส่วน การเพิ่มความเข้มข้นของฟอสโฟเปปไทด์ และการวิเคราะห์ LC-MS/MS

การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อเนื้องอกด้วยวิธีโซนิเคชันเพื่อการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์และฟอสโฟโปรตีโอมิกส์เชิงลึก

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

พื้นที่การใช้งานสำหรับโปรโตคอล

ใช้ขั้นตอนนี้สำหรับ:

• เนื้อเยื่อเนื้องอกที่แช่แข็งสดและบดละเอียดด้วยวิธีแช่แข็ง
• เซลล์เพล็ตหรือตัวอย่างชีวภาพอื่น ๆ ที่มีการสกัดด้วยสารที่มียูเรียเป็นฐานอยู่แล้ว
• กระบวนการทำงานด้านโปรตีโอมิกส์และฟอสโฟโปรตีโอมิกส์ระดับโลกโดยใช้การย่อยด้วยเอนไซม์ทริปซินและการติดฉลาก TMT (ตามต้องการ)

การศึกษาโดย Li และคณะ (2025) ระบุว่ากระบวนการทำงานนี้สามารถนำไปใช้กับตัวอย่างประเภทอื่นได้เช่นกัน เช่น สายเซลล์, เลือด, และปัสสาวะ อย่างไรก็ตาม อาจจำเป็นต้องมีการปรับให้เหมาะสมตามประเภทของตัวอย่าง

การเตรียมตัวอย่างที่มีประสิทธิภาพสูงสุดด้วยขั้นตอนการโซนิคที่นำมาใช้จริง ขั้นตอนการทำงานที่ได้รับการปรับปรุงและการออกแบบการทดลองนี้อ้างอิงจากโปรโตคอลการเตรียมตัวอย่างของ CPTAC สำหรับการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์และฟอสโฟโปรตีโอมิกส์ในระดับโลก
การศึกษาและแผนงาน: ©Li et al., 2025

หลักการทํางาน

การศึกษาต้นฉบับได้เพิ่มการใช้โซนิเคชันเข้าไปในกระบวนการมาตรฐานของ CPTAC urea lysis และพบว่าการตรวจจับโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเมมเบรนและนิวเคลียสดีขึ้น ผู้เขียนระบุว่าพารามิเตอร์ของโซนิเคชันต้องได้รับการปรับแต่งอย่างละเอียดเกี่ยวกับขนาดตัวอย่าง/ความเข้มข้น – โดยการเลือกขนาดของโซโนโทรด, ปริมาณพลังงานที่ป้อนเข้า, และเวลาของพัลส์

ตัวอย่างเช่น สำหรับ Hielscher UP200Ht และ UP200St หมายถึง:

• ใช้แอมพลิจูดและโหมดพัลส์เป็นตัวแปรควบคุมหลัก
• เก็บตัวอย่างให้เย็นตลอดเวลา (เช่น วางบนน้ำแข็ง)
• เริ่มต้นด้วยการตั้งค่าแบบอนุรักษ์นิยม
• ปรับให้เหมาะสมกับความชัดเจนของตัวอย่าง, อุณหภูมิ, ผลผลิตโปรตีน, และคุณภาพของเพปไทด์ในขั้นตอนต่อไป

 
เครื่องโซนิเคเตอร์ Hielscher 200 วัตต์ รุ่น UP200Ht และ UP200St ทั้งสองรุ่นได้รับการออกแบบมาสำหรับปริมาณตัวอย่างขนาดเล็กถึงขนาดกลาง พร้อมการปรับแอมพลิจูดและการตั้งค่าพัลส์ได้ ทั้งสองเครื่องผสมเนื้อเดียวกันด้วยคลื่นเสียงความถี่สูงนี้มาพร้อมหน้าจอสัมผัสดิจิทัลสำหรับการปรับพารามิเตอร์อย่างแม่นยำ การบันทึกข้อมูลอัตโนมัติ เซ็นเซอร์วัดอุณหภูมิแบบถอดเปลี่ยนได้ การควบคุมระยะไกล และการส่องสว่างตัวอย่าง
 

สารรีเอเจนต์สำหรับการสกัดโปรตีนด้วยวิธีโซนิเคชัน

บัฟเฟอร์การสลายยูเรีย

เตรียมความสดใหม่ทันที ก่อนใช้งาน:

• 8 มิลลิกรัม ยูเรีย
• 75 มิลลิโมลาร์ โซเดียมคลอไรด์
• 50 มิลลิโมลาร์ ทริส, pH 8.0
• 1 มิลลิโมลาร์ EDTA
• อะโปรตินิน 2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร
• 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ลูอีเพปติน
• 1 มิลลิโมลาร์ PMSF
• 10 มิลลิโมลาร์ NaF
• 20 ไมโครโมลาร์ PUGNAc
• ค็อกเทลยับยั้งฟอสฟาเตส 2, 1:100 (ว/ว)
• ค็อกเทลยับยั้งฟอสฟาเตส 3, 1:100 (ว/ว)

ยูเรียต้องละลายหมดก่อนเติมสารเติมแต่ง; ควรเติมสารยับยั้งทันทีก่อนใช้งาน; ควรเก็บสารบัฟเฟอร์ไว้ในน้ำแข็ง; และแนะนำให้หมุนวนเบาๆ แทนการปั่นแรงหลังจากเติมสารเติมแต่ง
 

สารรีเอเจนต์เพิ่มเติม:

• สารตรวจวัดโปรตีน BCA
• 50 มิลลิโมลาร์ ทริส-เอชซีแอล, pH 8.0
• DTT
• ไอโอโดอะซีตามายด์
• ไลเอสซี
• ทริปซิน
• กรดฟอร์มิก
• สารเคมี TMT, หากใช้การวิเคราะห์โปรตีนเชิงปริมาณแบบมัลติเพล็กซ์
• IMAC reagents, หากทำการเพิ่มความเข้มข้นของฟอสโฟเปปไทด์

อุปกรณ์สำหรับการสกัดโปรตีนด้วยวิธีโซนิเคชัน

จำเป็น

การเลือกโพรบที่แนะนำ

สำหรับตัวอย่างประมาณ 200–1000 µL ให้ใช้โซโนโทรดที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางเล็กซึ่งเหมาะสมสำหรับการประมวลผลโดยตรงที่มีความเข้มสูงในปริมาณน้อย Hielscher มีโซโนโทรดหลายขนาดให้เลือก และขนาดปลายที่เล็กกว่าจะให้ค่าความเข้มสูงกว่าที่ปลาย

หมายเหตุการใช้งาน: ใช้โพรบขนาดเล็กที่สุดที่สามารถผสมได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยไม่ทำให้เกิดฟองมากเกินไปหรือสัมผัสกับผนังภาชนะ

หากคุณทำงานกับตัวอย่างหลายชิ้นพร้อมกัน คุณอาจพิจารณา มัลติ-ทิวบ์ โซนิเคเตอร์ ไวอัลทวิตเตอร์ หรือ ไมโครเพลทโซนิเคเตอร์ UIP400MTP!

คำแนะนำแบบขั้นตอน: ขั้นตอนการสกัดโปรตีนด้วยวิธีโซนิเคชัน

ก. เตรียมความเย็นล่วงหน้าและเตรียมความพร้อม

1. ทำให้เครื่องปั่นเหวี่ยงเย็นลงถึง 4°C
2. เตรียมบัฟเฟอร์ยูเรียลิสใหม่และเก็บไว้ในน้ำแข็ง
3. ติดตั้งเครื่อง UP200Ht หรือ UP200St บนขาตั้งภายในตู้เก็บเสียง
4. เตรียมอ่างน้ำแข็งที่มีขนาดใหญ่เพียงพอสำหรับวางหลอดตัวอย่างให้ตั้งตรงและมั่นคง

การเตรียมบัฟเฟอร์ใหม่และการจัดการในอุณหภูมิต่ำเป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่ง

B. การสกัดยูเรียเบื้องต้น

1. เก็บเนื้อเยื่อที่ถูกบดเย็นในน้ำแข็ง
2. เติม 200 µL ของบัฟเฟอร์ยูเรียละลายเย็นต่อเนื้อเยื่อสด 50 มก.
3. หมุนวน 5–10 วินาทีด้วยความเร็วสูง
4. บ่ม 15 นาที ที่ 4°C
5. ทำซ้ำขั้นตอนการหมุนวนร่วมกับขั้นตอนการบ่มอีกครั้งหนึ่ง
6. ปั่นเหวี่ยงที่ 20,000g เป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิ 4°C
7. ถ่ายโอนไลเสต/ซูเปอร์นาแนนท์ไปยังหลอดที่มีแรงยึดเกาะต่ำที่สะอาด

C. การสั่นด้วยคลื่นเสียงด้วยการใช้ UP200Ht หรือ UP200St

เงื่อนไขเริ่มต้นสำหรับการโซนิเคชัน

• แอมพลิจูด: เริ่มที่ 20–30%
• ความยาวพัลส์: 5 วินาที เปิด
• การทำให้เย็น: 2 นาทีบนน้ำแข็งระหว่างการปั่น
• จำนวนรอบ: 4 รอบ
• เวลาการสั่นสะเทือนที่ใช้งานทั้งหมด: 20 วินาที
• เวลาทั้งหมดของกระบวนการรวมถึงการระบายความร้อน: ประมาณ 8–10 นาที

ขั้นตอนการโซนิเคชัน

1. ถ่ายไลเสตไปยังหลอดที่เหมาะสมสำหรับการโซนิเคชัน ใช้หลอดที่แคบและมีผนังบางซึ่งช่วยให้การแลกเปลี่ยนความร้อนดีและสามารถจุ่มโพรบได้อย่างปลอดภัย
2. วางหลอดในอ่างน้ำแข็ง กระดาษระบุว่า การทำให้เย็นระหว่างการสั่นสะเทือนด้วยคลื่นเสียงมีความสำคัญอย่างยิ่งเพื่อป้องกันความเสียหายจากความร้อน
3. จุ่มปลายโพรบลงในตัวอย่างให้เพียงพอเพื่อให้เกิดการเกิดโพรงอากาศที่เสถียร แต่ไม่ให้ปลายโพรบสัมผัสกับผนังหรือก้นหลอด
4. ให้ทำงานหนึ่งพัลส์ 5 วินาที ที่แอมพลิจูดเริ่มต้น
5. นำตัวอย่างกลับไปที่น้ำแข็งทันทีและแช่ไว้เป็นเวลา 2 นาที
6. ทำซ้ำจนกว่าจะครบ 4 รอบ
7. ตรวจสอบไลเสตหลังจากรอบ
8. ดำเนินการต่อเฉพาะเมื่อจำเป็น โดยใช้พัลส์เพิ่มเติมครั้งละ 5 วินาทีเท่านั้น และต้องมีการระบายความร้อนเต็มที่ทุกครั้ง
9. หยุดเมื่อสารละลายมีความสม่ำเสมอมากขึ้นและไม่เป็นเส้นหรือหนืด
   จุดสิ้นสุดคือไลเสตที่มีความโปร่งแสงมากขึ้นซึ่งก่อตัวเป็นหยดแทนที่จะเป็นของไหลหนืดต่อเนื่อง
10. หมุนเหวี่ยงที่ประมาณ 16,000g เป็นเวลา 15 นาที ที่อุณหภูมิ 4°C
11. ถ่ายส่วนใสที่แยกได้ไปยังหลอดใหม่และวัดความเข้มข้นของโปรตีน

การเปรียบเทียบโปรตีโอมิกส์และฟอสโฟโปรตีโอมิกส์ระดับโลกระหว่างตัวอย่างที่ผ่านการโซนิคและตัวอย่างที่ไม่ผ่านการโซนิค
ก. จำนวนโปรตีนที่ระบุได้ (โพรตีโอมิกส์แบบครอบคลุม) ในเนื้อเยื่อเนื้องอก PDX ทั้งหมดที่มีการหรือไม่มีโซนิเคชัน ข. จำนวนฟอสโฟเปปไทด์ที่ระบุได้ (การเพิ่มความเข้มข้นด้วย IMAC) ในเนื้อเยื่อเนื้องอก PDX ทั้งหมดที่มีการหรือไม่มีโซนิเคชัน นับเฉพาะโปรตีนและฟอสโฟเปปไทด์ที่มีอัตราส่วนความอุดมสมบูรณ์มากกว่าหรือเท่ากับเปอร์เซ็นไทล์ที่ 25 เท่านั้น อัตราส่วนความอุดมสมบูรณ์คำนวณระหว่างตัวอย่างประเภทเดียวกัน
การศึกษาและกราฟ: ©Li และคณะ, 2025

การย่อยและการวิเคราะห์ข้อมูลปลายน้ำ

หลังจากการโซนิเคชันและการทำให้ใส ให้ดำเนินการตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ในกระบวนการทำงานแบบ CPTAC ดั้งเดิม:

1. เจือจางไลเสต 1:3 (ว/ว) ด้วย 50 mM Tris-HCl pH 8.0 เพื่อลดยูเรียเป็น <2 M.
2. เติม LysC ที่ 1 mAU ต่อโปรตีน 50 µg และบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 25°C
3. เติมทริปซินในอัตราส่วน 1:49 เอนไซม์ต่อสารตั้งต้น (น้ำหนักต่อน้ำหนัก) และย่อยข้ามคืนที่อุณหภูมิ 25°C
4. ทำให้เย็นลงด้วยกรดฟอร์มิกจนได้ความเข้มข้นสุดท้าย 1%
5. ดำเนินการต่อไปยังขั้นตอนการล้างเกลือ, การติดฉลาก TMT, การแยกส่วน, การเพิ่มความเข้มข้นของฟอสโฟเปปไทด์, และการวิเคราะห์ด้วย LC-MS/MS ตามความจำเป็น

การแสดงออกที่แตกต่างกันของฟอสโฟเปปไทด์จากการวิเคราะห์ด้วย TMT-labeled MS
ก. ชนิดย่อยพื้นฐาน โดยเน้นที่ฟอสโฟเปปไทด์ของมนุษย์บางชนิด (จุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของลำดับโปรตีน) ที่มีการเพิ่มขึ้นของระดับการแสดงออกในตัวอย่างที่ผ่านการโซนิคเมื่อเทียบกับตัวอย่างที่ไม่ผ่านการโซนิคข. ลูมินัลซับไทป์ โดยเน้นฟอสโฟเปปไทด์ของมนุษย์บางชนิด (protein_sequence begin และ end) ที่เพิ่มขึ้นในตัวอย่างที่ผ่านการโซนิคเมื่อเทียบกับตัวอย่างที่ไม่ผ่านการโซนิค ค. เส้นทาง KEGG ที่มีความเข้มข้นสูงตามโปรตีนของฟอสโฟเปปไทด์ที่เพิ่มขึ้นในซับไทป์ลูมินัลของเนื้องอกที่ผ่านการโซนิค ง. เส้นทาง KEGG ที่มีความเข้มข้นสูงตามโปรตีนของฟอสโฟเปปไทด์ที่เพิ่มขึ้นในซับไทป์ลูมินัลของเนื้องอกที่ผ่านการโซนิค
การศึกษาและกราฟ: ©Li และคณะ, 2025

การออกแบบ การผลิต และการให้คําปรึกษา – คุณภาพ ผลิตในประเทศเยอรมนี

เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher เป็นที่รู้จักกันดีในด้านคุณภาพและมาตรฐานการออกแบบสูงสุด ความทนทานและใช้งานง่ายช่วยให้สามารถรวมเครื่องอัลตราโซนิกของเราเข้ากับโรงงานอุตสาหกรรมได้อย่างราบรื่น สภาพที่ขรุขระและสภาพแวดล้อมที่ต้องการสามารถจัดการได้ง่ายโดยเครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher

Hielscher Ultrasonics เป็น บริษัท ที่ได้รับการรับรองมาตรฐาน ISO และให้ความสําคัญเป็นพิเศษกับเครื่องอัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงที่มีเทคโนโลยีล้ําสมัยและเป็นมิตรกับผู้ใช้ แน่นอนว่าเครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher เป็นไปตามมาตรฐาน CE และตรงตามข้อกําหนดของ UL, CSA และ RoHs

วรรณกรรม / อ้างอิง