การเตรียมตัวอย่างโดยใช้ตัวกรองช่วยร่วมกับอัลตราซาวนด์ (FASP): เพิ่มประสิทธิภาพกระบวนการทำงานด้านโปรตีโอมิกส์ด้วยการใช้คลื่นเสียงขั้นสูง

การเตรียมตัวอย่างโดยใช้ตัวกรองช่วยร่วมกับอัลตราซาวนด์ (FASP) กำลังเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพสูงและให้ผลที่ทำซ้ำได้ในงานโปรตีโอมิกส์สมัยใหม่ การผสานการใช้คลื่นเสียงที่ควบคุมได้เข้ากับกระบวนการ FASP ที่ใช้กันอยู่ช่วยให้นักวิจัยเพิ่มประสิทธิภาพการสกัดโปรตีน การย่อย และคุณภาพข้อมูลโดยรวมได้อย่างมีนัยสำคัญ เมื่อความต้องการการเตรียมตัวอย่างที่มีอัตราการประมวลผลสูงและให้ผลที่ทำซ้ำได้เพิ่มขึ้น เครื่องอัลตราซาวนด์ที่ส่งพลังงานแบบมุ่งเฉพาะจุด เช่น เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลต UIP400MTP จึงมีความสำคัญเพิ่มขึ้นทั้งในเชิงวิทยาศาสตร์และการใช้งานจริง

บริบททางวิทยาศาสตร์: เหตุใด FASP จึงมีความสำคัญต่อโปรตีโอมิกส์

การเตรียมตัวอย่างโดยใช้ตัวกรองช่วย (FASP) ได้กลายเป็นวิธีมาตรฐานอ้างอิงในโปรตีโอมิกส์แบบ bottom-up เนื่องจากสามารถกำจัดสารซักฟอก เกลือ และสารปนเปื้อนอื่น ๆ พร้อมทั้งช่วยให้การย่อยด้วยเอนไซม์มีประสิทธิภาพ อย่างไรก็ตาม วิธีปฏิบัติ FASP แบบดั้งเดิมมักมีข้อจำกัดเกี่ยวกับการสลายเซลล์ที่ไม่สมบูรณ์ การย่อยที่ไม่สม่ำเสมอ และความแปรปรวนของตัวอย่าง – โดยเฉพาะเมื่อต้องจัดการกับเซลล์หรือเนื้อเยื่อชีวภาพที่ซับซ้อนหรือทนต่อการสลาย
ในจุดนี้ พลังงานอัลตราซาวนด์แบบมุ่งเฉพาะจุด (การใช้คลื่นเสียง) ให้ข้อได้เปรียบที่ชัดเจน การใช้คลื่นเสียงทำให้เกิดแรงเฉือนเชิงกลและคาวิเทชัน จึงเพิ่มประสิทธิภาพขั้นตอนสำคัญหลายขั้นตอนในกระบวนการ FASP โดยไม่ลดทอนความสมบูรณ์ของโปรตีน

ผลเชิงบวกของการใช้คลื่นเสียงใน FASP ที่ใช้อัลตราซาวนด์

การใช้คลื่นเสียงทำให้เกิดคาวิเทชันทางเสียงที่ควบคุมได้ – การก่อตัวและยุบตัวของฟองขนาดจุลภาค – ซึ่งก่อให้เกิดแรงเฉือนเฉพาะบริเวณและการไหลระดับจุลภาค
การใช้คลื่นเสียงเพิ่มประสิทธิภาพทั้งขั้นตอนแอลคิเลชันและการย่อยใน FASP ที่ใช้อัลตราซาวนด์ โดยปรับปรุงการถ่ายเทมวลและเร่งจลนพลศาสตร์ของปฏิกิริยา การใช้พลังงานอัลตราซาวนด์ทำให้เกิดคาวิเทชัน ซึ่งนำไปสู่การไหลระดับจุลภาคเฉพาะบริเวณและแรงเฉือนชั่วขณะ ช่วยให้เกิดการผสมอย่างรวดเร็วและทำให้รีเอเจนต์แทรกซึมเข้าสู่เมทริกซ์โปรตีนหรือสภาพแวดล้อมภายในตัวกรองได้อย่างมีประสิทธิภาพ ในขั้นตอนแอลคิเลชัน ผลดังกล่าวทำให้การดัดแปลงหมู่ตกค้างของ cysteine ด้วย iodoacetamide สม่ำเสมอและรวดเร็วยิ่งขึ้น ในขั้นตอนการย่อย การใช้คลื่นเสียงเพิ่มความสามารถในการเข้าถึงตำแหน่งตัดพันธะของเอนไซม์ย่อยโปรตีน และปรับปรุงปฏิสัมพันธ์ระหว่างเอนไซม์กับสารตั้งต้น จึงเร่งการทำงานของ trypsin และเพิ่มประสิทธิภาพการย่อย โดยรวมแล้ว การใช้อัลตราซาวนด์ลดเวลาในการประมวลผล พร้อมทั้งรักษาหรือเพิ่มความสมบูรณ์ของปฏิกิริยาและความสามารถในการทำซ้ำของผลลัพธ์

ในการเตรียมตัวอย่างด้านโปรตีโอมิกส์ FASP ที่ใช้อัลตราซาวนด์ให้ผลดังนี้:

• การทำลายเซลล์และการสกัดโปรตีนมีประสิทธิภาพมากขึ้น แม้ในเนื้อเยื่อที่สลายได้ยากหรือตัวอย่างจุลินทรีย์
• เพิ่มการทำให้โปรตีนละลาย
• เพิ่มความสามารถของเอนไซม์ในการเข้าถึงสารตั้งต้นระหว่างการย่อย
• ลดเวลาในการประมวลผลและเพิ่มความสามารถในการทำซ้ำของผลลัพธ์

การประมวลผลด้วยอัลตราซาวนด์สามารถควบคุมและปรับขนาดได้สูง ต่างจากวิธีสลายเซลล์เชิงกลหรือทางเคมีแบบดั้งเดิม จึงเหมาะอย่างยิ่งสำหรับกระบวนการทำงานด้านโปรตีโอมิกส์ที่เป็นมาตรฐาน

ข้อดีของ FASP ที่ใช้อัลตราซาวนด์เมื่อเทียบกับแนวทางแบบดั้งเดิม

การผสานการใช้คลื่นเสียงเข้ากับวิธีปฏิบัติ FASP ให้ประโยชน์ที่วัดผลได้ ซึ่งส่งผลโดยตรงต่อผลการวิเคราะห์ด้วยแมสสเปกโทรเมทรีในขั้นตอนถัดไป
FASP ที่ใช้อัลตราซาวนด์ช่วยให้เก็บคืนโปรตีนได้ครบถ้วนยิ่งขึ้น โดยเฉพาะจากตัวอย่างที่จัดการได้ยาก เช่น เนื้อเยื่อที่มีเส้นใยหรือไบโอฟิล์ม การกระจายพลังงานอย่างสม่ำเสมอช่วยให้ตัวอย่างที่ทำซ้ำได้รับการประมวลผลอย่างสอดคล้องกัน ลดความแปรปรวน – ซึ่งเป็นข้อกำหนดสำคัญสำหรับโปรตีโอมิกส์เชิงปริมาณ
นอกจากนี้ การใช้คลื่นเสียงยังเร่งจลนพลศาสตร์ของการย่อยโดยปรับปรุงปฏิสัมพันธ์ระหว่างเอนไซม์กับสารตั้งต้น ซึ่งมักทำให้ใช้เวลาย่อยสั้นลงและได้ผลผลิตเปปไทด์สูงขึ้น ขณะเดียวกันยังคงความครอบคลุมของลำดับกรดอะมิโน
ในด้านกระบวนการทำงาน ระบบอัลตราซาวนด์ลดการดำเนินการด้วยมือและขจัดความจำเป็นในการใช้สารเคมีที่มีฤทธิ์รุนแรง ช่วยรักษาความสมบูรณ์ของตัวอย่างและทำให้การกำหนดวิธีปฏิบัติให้เป็นมาตรฐานง่ายขึ้น

แผนภาพเวนน์แสดงจำนวนโปรตีนที่ระบุได้เพิ่มขึ้นด้วย FASP ที่ใช้อัลตราซาวนด์ เมื่อเทียบกับ FASP แบบข้ามคืน
ภาพและงานวิจัย: ©Carvalho et al., 2020

วิธีปฏิบัติ: FASP ที่ใช้อัลตราซาวนด์และมีอัตราการประมวลผลตัวอย่างสูงด้วย UIP400MTP

สำหรับห้องปฏิบัติการที่ประมวลผลตัวอย่างกลุ่มใหญ่ เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลต UIP400MTP สามารถใช้คลื่นเสียงกับเพลตหลายหลุมมาตรฐานพร้อมกันได้ (เช่น เพลต 96 หลุม) ซึ่งเพิ่มอัตราการประมวลผลตัวอย่างและความสามารถในการทำซ้ำของผลลัพธ์อย่างมีนัยสำคัญ
ในรูปแบบนี้ ตัวอย่าง (โดยทั่วไป 50–200 µL ต่อหลุม) จะได้รับการเตรียมโดยตรงในไมโครเพลตที่รองรับการกรองระดับอัลตราฟิลเตรชันหรือการประมวลผลในขั้นตอนถัดไป บัฟเฟอร์สำหรับสลายเซลล์คล้ายกับที่ใช้ในวิธีปฏิบัติ FASP มาตรฐาน

UIP400MTP ส่งพลังงานอัลตราซาวนด์อย่างสม่ำเสมอไปยังทุกหลุม โดยทั่วไปใช้คลื่นเสียงที่แอมพลิจูด 60–80% เป็นเวลา 2–4 นาที ขึ้นอยู่กับประเภทตัวอย่าง ตรวจติดตามอุณหภูมิโดยใช้เซนเซอร์วัดอุณหภูมิแบบเสียบต่อ ใช้คลื่นเสียงแบบพัลส์และอาจใช้เครื่องทำความเย็นสำหรับห้องปฏิบัติการร่วมด้วย

ตัวอย่างวิธีปฏิบัติ:

1. สำหรับขั้นตอนแอลคิเลชัน ตัวอย่างจะได้รับคลื่นเสียงโดยใช้เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลต (UIP400MTP) ที่แอมพลิจูด 40% จำนวน 7 รอบ (เปิด 30 s, ปิด 15 s; เวลาการใช้คลื่นเสียงรวม: 5 min 45 s)
2. หลังการใช้คลื่นเสียง สารละลาย iodoacetamide (IAA) จะถูกกำจัดออกด้วยการปั่นเหวี่ยง ก่อนการย่อยด้วย trypsin ต้องล้างตัวอย่างเพื่อกำจัด urea ที่ตกค้าง ซึ่งเป็นสารเคโอโทรปิกที่มีฤทธิ์แรงและยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ ดังนั้น จึงล้างตัวอย่างสองครั้งด้วย ammonium bicarbonate (AmBic) ความเข้มข้น 25 mM ปริมาตร 200 μL
3. จากนั้นเติมสารละลาย trypsin ปริมาตร 100 μL (อัตราส่วนเอนไซม์ต่อโปรตีน 1:30) ที่เตรียมใน ammonium bicarbonate ความเข้มข้น 12.5 mM แล้วดำเนินการย่อยโปรตีนโดยใช้ UIP400MTP ภายใต้สภาวะการใช้คลื่นเสียงเดียวกัน (แอมพลิจูด 40%, 7 รอบ, เปิด 30 s / ปิด 15 s; เวลารวม: 5 min 45 s)
4. หลังการใช้คลื่นเสียง ย้ายตัวอย่างไปยังเพลตกรองหรือประมวลผลโดยใช้ระบบ FASP แบบเพลต ขั้นตอนรีดักชันและแอลคิเลชันดำเนินการภายในเพลต เพื่อรักษากระบวนการทำงานให้คล่องตัว
5. ดำเนินการย่อยด้วย trypsin ภายใต้สภาวะที่ควบคุม (เช่น 37°C, 4–16 ชั่วโมง) โดยอาจกระตุ้นด้วยอัลตราซาวนด์ช่วงสั้น ๆ เพื่อเร่งการทำงานของเอนไซม์และเพิ่มผลผลิตเปปไทด์
6. เก็บคืนเปปไทด์ด้วยการปั่นเหวี่ยง และพร้อมสำหรับการวิเคราะห์ LC-MS/MS

ข้อได้เปรียบสำคัญของระบบนี้คือความสามารถในการให้สภาวะการประมวลผลที่เหมือนกันในทุกหลุม ซึ่งลดผลกระทบจากความแตกต่างระหว่างชุดตัวอย่าง และช่วยให้เปรียบเทียบเชิงปริมาณได้อย่างน่าเชื่อถือในการศึกษาด้านโปรตีโอมิกส์ขนาดใหญ่

การออกแบบ การผลิต และการให้คำปรึกษา – คุณภาพจากการผลิตในเยอรมนี

เครื่องอัลตราซาวนด์ของ Hielscher เป็นที่รู้จักกันดีในด้านคุณภาพและมาตรฐานการออกแบบระดับสูงสุด ความแข็งแกร่งทนทานและการใช้งานที่ง่ายช่วยให้ผสานเครื่องอัลตราซาวนด์ของเราเข้ากับโรงงานอุตสาหกรรมได้อย่างราบรื่น เครื่องอัลตราซาวนด์ของ Hielscher รับมือกับสภาวะที่รุนแรงและสภาพแวดล้อมที่มีข้อกำหนดสูงได้อย่างง่ายดาย

Hielscher Ultrasonics เป็นบริษัทที่ได้รับการรับรอง ISO และให้ความสำคัญเป็นพิเศษกับเครื่องอัลตราซาวนด์สมรรถนะสูงที่ใช้เทคโนโลยีล้ำสมัยและใช้งานง่าย แน่นอนว่าเครื่องอัลตราซาวนด์ของ Hielscher เป็นไปตามข้อกำหนด CE และตรงตามข้อกำหนดของ UL, CSA และ RoHs

วรรณกรรม / เอกสารอ้างอิง

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).