การสกัดโปรตีนโดยใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ช่วยสำหรับฟอสโฟโปรตีโอมิกส์

ในวิทยาศาสตร์ชีวภาพสมัยใหม่ ฟอสโฟโปรตีโอมิกส์ได้กลายเป็นเทคโนโลยีรากฐานสำหรับการถอดรหัสวิถีการส่งสัญญาณของเซลล์และการทำความเข้าใจกลไกของโรคในระดับระบบ เนื่องจากฟอสโฟรีเลชันควบคุมหน้าที่ทางชีวภาพที่สำคัญ – ตั้งแต่การทำงานของเอนไซม์ไปจนถึงปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีน – การวัดฟอสโฟรีเลชันอย่างแม่นยำจึงจำเป็นทั้งสำหรับการวิจัยพื้นฐานและเวชศาสตร์ปริวรรต ความก้าวหน้าล่าสุดของแมสสเปกโทรเมทรีทำให้สามารถระบุเหตุการณ์ฟอสโฟรีเลชันได้หลายหมื่นเหตุการณ์ในการทดลองครั้งเดียว ซึ่งเน้นย้ำถึงความจำเป็นของกระบวนงานเตรียมตัวอย่างที่มีความทนทาน ขยายขนาดได้ และให้ผลที่ทำซ้ำได้
หนึ่งในพัฒนาการที่ส่งผลอย่างมากในสาขานี้คือการนำการสกัดโปรตีนโดยใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ช่วยมาใช้ ซึ่งช่วยเพิ่มคุณภาพตัวอย่าง ปริมาณตัวอย่างที่ประมวลผลได้ และความสามารถในการทำซ้ำอย่างมีนัยสำคัญ ปัจจุบันเทคโนโลยีอัลตราซาวนด์ เช่น VialTweeter และ UIP400MTP กำลังกำหนดแนวทางใหม่ในการจัดการตัวอย่างกลุ่มใหญ่ของห้องปฏิบัติการ โดยเฉพาะในฟอสโฟโปรตีโอมิกส์ที่ประมวลผลตัวอย่างปริมาณสูง

ความสำคัญทางวิทยาศาสตร์ของการเตรียมตัวอย่างอย่างมีประสิทธิภาพในฟอสโฟโปรตีโอมิกส์

ฟอสโฟรีเลชันของโปรตีนเป็นการดัดแปลงหลังการแปลรหัสที่มีพลวัตสูงและย้อนกลับได้ ซึ่งส่งผลต่อโปรตีนส่วนใหญ่ในเซลล์มนุษย์ กระบวนการนี้ควบคุมโครงสร้าง ตำแหน่งภายในเซลล์ และเครือข่ายปฏิสัมพันธ์ของโปรตีน และความผิดปกติของการควบคุมนี้มีส่วนเกี่ยวข้องกับโรค เช่น มะเร็งและโรคที่เกิดจากการเสื่อมของระบบประสาท
อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ฟอสโฟโปรตีโอมิกส์มีความท้าทายทางเทคนิคเฉพาะตัว เปปไทด์ที่ผ่านฟอสโฟรีเลชันมักมีปริมาณน้อย และต้องอาศัยการเพิ่มความเข้มข้นอย่างระมัดระวังและการเตรียมตัวอย่างในขั้นต้นที่มีประสิทธิภาพสูง ความไม่มีประสิทธิภาพในขั้นตอนการสกัดหรือย่อยโปรตีนอาจทำให้สูญเสียสัญญาณ ความสามารถในการทำซ้ำต่ำ และครอบคลุมตำแหน่งฟอสโฟรีเลชันได้ไม่ครบถ้วน
นี่คือจุดที่การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์มีบทบาทสำคัญอย่างยิ่ง

เหตุใดการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์จึงกำลังเปลี่ยนแปลงการสกัดโปรตีน

การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์อาศัยคลื่นอัลตราซาวนด์ความเข้มสูงเพื่อทำให้เซลล์และเนื้อเยื่อแตกด้วยแรงเชิงกล ช่วยให้ปลดปล่อยโปรตีนจากเซลล์ เนื้อเยื่อ ของเหลวชีวภาพ และเวสิเคิลนอกเซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ เมื่อเทียบกับเทคนิคการสลายเซลล์แบบดั้งเดิม การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์มีข้อได้เปรียบที่โดดเด่นหลายประการ:

• ประการแรก วิธีนี้ทำให้เซลล์แตกได้อย่างรวดเร็วและสม่ำเสมอ ซึ่งสำคัญเป็นพิเศษต่อการรักษาสภาวะฟอสโฟรีเลชันที่คงอยู่เพียงชั่วคราว ในฟอสโฟโปรตีโอมิกส์ แม้ความล่าช้าเพียงเล็กน้อยหรือการสลายเซลล์ที่ไม่สมบูรณ์ก็อาจเปลี่ยนแปลงรูปแบบการส่งสัญญาณได้ จึงจำเป็นต้องสกัดอย่างรวดเร็วและให้ผลที่ทำซ้ำได้
• ประการที่สอง การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ช่วยเพิ่มผลได้ของโปรตีนและการทำให้โปรตีนละลาย โดยเฉพาะสำหรับตัวอย่างที่สลายได้ยาก เช่น เนื้อเยื่อที่มีความหนาแน่นสูงหรือเซลล์ที่มีเยื่อหุ้มจำนวนมาก ผลดังกล่าวส่งผลโดยตรงให้การย่อยในขั้นตอนถัดไปและการเก็บคืนฟอสโฟเปปไทด์ดีขึ้น
• ประการที่สาม การประมวลผลด้วยอัลตราซาวนด์มีความสามารถในการขยายขนาดโดยธรรมชาติ อุปกรณ์ เช่น VialTweeter ช่วยให้ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์กับหลอดที่ปิดผนึกหลายหลอดพร้อมกันได้ โดยรับประกันว่าตัวอย่างทุกตัวอย่างได้รับสภาวะการประมวลผลเหมือนกัน วิธีนี้ขจัดความแปรปรวนที่เกิดจากการจัดการด้วยมือ
• สำหรับความต้องการประมวลผลตัวอย่างในปริมาณที่สูงยิ่งขึ้น UIP400MTP ถือเป็นความก้าวหน้าครั้งใหญ่ทางเทคโนโลยี อุปกรณ์นี้ช่วยให้ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์โดยตรงกับไมโครเพลตทั้งแผ่นหรือชั้นวางหลอด รวมถึงขวดตัวอย่างสำหรับเครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติ จึงเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการประมวลผลตัวอย่างหลายร้อยตัวอย่างแบบขนาน ความสามารถนี้มีคุณค่าเป็นพิเศษในชีววิทยาระบบและการวิจัยทางคลินิก ซึ่งการใช้ตัวอย่างกลุ่มใหญ่เป็นแนวปฏิบัติมาตรฐาน

การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์เพื่อประมวลผลตัวอย่างปริมาณสูง: เจาะลึก VialTweeter และ UIP400MTP

การผสานอุปกรณ์อัลตราซาวนด์ขั้นสูงเข้ากับกระบวนงานฟอสโฟโปรตีโอมิกส์ไม่ได้เป็นเพียงความสะดวก – แต่เป็นการปรับปรุงระเบียบวิธี
VialTweeter ออกแบบมาเพื่อให้ตัวอย่างในขวดปิดหลายขวดได้รับการบำบัดด้วยอัลตราซาวนด์พร้อมกัน ลดการปนเปื้อนข้ามตัวอย่างให้น้อยที่สุดพร้อมทั้งรับประกันความสามารถในการทำซ้ำ อุปกรณ์นี้เหมาะเป็นพิเศษสำหรับงานที่ประมวลผลตัวอย่างปริมาณปานกลางและกระบวนงานที่เป็นมาตรฐาน
 

ในทางตรงกันข้าม UIP400MTP ได้รับการปรับให้เหมาะกับสภาพแวดล้อมที่ประมวลผลตัวอย่างปริมาณสูง โดยช่วยให้:

• ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์อย่างสม่ำเสมอทั่วทั้งไมโครเพลตมาตรฐาน เช่น เพลตชนิด 96 หลุมหรือ 384 หลุม
• ประมวลผลชั้นวางหลอดและขวดตัวอย่างสำหรับเครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติโดยตรง
• ลดเวลาที่ต้องลงมือปฏิบัติงานอย่างมีนัยสำคัญ
• เพิ่มความสามารถในการทำซ้ำในชุดข้อมูลขนาดใหญ่

ความสามารถในการขยายขนาดนี้สอดคล้องอย่างสมบูรณ์กับแนวทางฟอสโฟโปรตีโอมิกส์สมัยใหม่ ซึ่งกระบวนงานมักประมวลผลตัวอย่างหลายสิบถึงหลายร้อยตัวอย่างแบบขนานเป็นประจำ

ขั้นตอนปฏิบัติทั่วไปสำหรับการเตรียมตัวอย่างฟอสโฟโปรตีโอมิกส์โดยใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ช่วย

กระบวนงานฟอสโฟโปรตีโอมิกส์ที่มีความทนทานผสานการสกัดโปรตีนอย่างมีประสิทธิภาพ การย่อยด้วยเอนไซม์ และการเพิ่มความเข้มข้นของฟอสโฟเปปไทด์ โครงร่างต่อไปนี้สะท้อนแนวปฏิบัติที่ดีที่สุดซึ่งเป็นที่ยอมรับ โดยปรับให้เหมาะกับการเตรียมตัวอย่างด้วยคลื่นอัลตราซาวนด์:

1. การหยุดปฏิกิริยาในตัวอย่างอย่างรวดเร็วและการเก็บรวบรวมตัวอย่าง
   หยุดปฏิกิริยาในเซลล์หรือเนื้อเยื่ออย่างรวดเร็ว – โดยทั่วไปใช้การแช่แข็งอย่างฉับพลัน – เพื่อรักษาสภาวะฟอสโฟรีเลชัน ขั้นตอนนี้สำคัญอย่างยิ่งเนื่องจากเหตุการณ์ฟอสโฟรีเลชันคงอยู่เพียงชั่วคราว
2. การสลายเซลล์และสกัดโปรตีนด้วยอัลตราซาวนด์
   ละลายตัวอย่างที่แช่แข็งแล้วนำไปผ่านคลื่นอัลตราซาวนด์ โดยทั่วไปใช้รอบการทำงานสั้น ๆ พลังงานอัลตราซาวนด์ทำให้เยื่อหุ้มเซลล์แตกและปลดปล่อยโปรตีนอย่างมีประสิทธิภาพ ในกระบวนงานที่ผ่านการตรวจสอบความใช้ได้แล้ว จะใช้คลื่นอัลตราซาวนด์หลายรอบเพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์สลายอย่างสมบูรณ์
   ตัวอย่าง: หลังจากละลายตัวอย่างที่แช่แข็งบนน้ำแข็งแล้ว ทำให้เซลล์สลายด้วยคลื่นอัลตราซาวนด์ เช่น ใช้เครื่อง Vialtweeter จำนวน 2 รอบ รอบละ 1 min.
3. การทำให้ใสและการหาปริมาณโปรตีน
   หลังการสลายเซลล์ นำตัวอย่างไปปั่นเหวี่ยงเพื่อกำจัดเศษตกค้าง เก็บของเหลวส่วนบนที่มีโปรตีนละลายอยู่และหาปริมาณโปรตีน เพื่อให้แน่ใจว่าปริมาณโปรตีนตั้งต้นสม่ำเสมอระหว่างตัวอย่าง
4. การรีดิวซ์และการแอลคิเลชัน
   รีดิวซ์พันธะไดซัลไฟด์ (เช่น โดยใช้ DTT) และทำแอลคิเลชัน (เช่น โดยใช้ IAA) เพื่อทำให้โปรตีนมีเสถียรภาพและเพิ่มประสิทธิภาพการย่อย
5. การย่อยโปรตีน
   ย่อยโปรตีนด้วยเอนไซม์ โดยทั่วไปใช้ trypsin เพื่อสร้างเปปไทด์ที่เหมาะสำหรับการวิเคราะห์ด้วยแมสสเปกโทรเมทรี อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับการย่อยโปรตีนที่เร่งด้วยอัลตราซาวนด์!
6. การทำให้เปปไทด์บริสุทธิ์และการกำจัดเกลือ
   ทำให้เปปไทด์บริสุทธิ์ด้วยวิธีที่ใช้ C18 เพื่อกำจัดสารปนเปื้อนที่อาจรบกวนการวิเคราะห์ LC-MS
7. การเพิ่มความเข้มข้นของฟอสโฟเปปไทด์
   เนื่องจากเปปไทด์ที่ผ่านฟอสโฟรีเลชันมีปริมาณน้อย จึงใช้เทคนิคเพิ่มความเข้มข้น เช่น วิธีอาศัยสัมพรรคภาพด้วย Fe-NTA หรือ TiO₂ เพื่อแยกฟอสโฟเปปไทด์อย่างจำเพาะ
8. การวิเคราะห์ LC-MS/MS และการประมวลผลข้อมูล
   วิเคราะห์ตัวอย่างที่ผ่านการเพิ่มความเข้มข้นด้วยแมสสเปกโทรเมทรีความละเอียดสูง โดยมักใช้การเก็บข้อมูลแบบไม่ขึ้นกับข้อมูล (DIA) เพื่อปรับปรุงการหาปริมาณและความสามารถในการทำซ้ำ

ที่น่าสังเกตคือ สามารถปรับกระบวนงานขนาดใหญ่ให้ใช้รูปแบบเพลต 96 หลุมได้ ทำให้ประมวลผลตัวอย่างแบบขนานได้สูงสุดถึงหลายร้อยตัวอย่าง – เป็นแนวทางที่เข้ากันได้อย่างสมบูรณ์กับการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ด้วย UIP400MTP
 

ขั้นตอนปฏิบัติที่ปรับให้เหมาะสมสำหรับการหยุดปฏิกิริยาของฟอสโฟโปรตีโอมอย่างรวดเร็ว การเพิ่มความเข้มข้นของฟอสโฟเปปไทด์ และ Phos-DIA-MS.
ขั้นตอนปฏิบัติและภาพ: ©Die et al. 2023

การเพิ่มความสามารถในการทำซ้ำและคุณภาพข้อมูลด้วยคลื่นอัลตราซาวนด์

หนึ่งในความท้าทายหลักของฟอสโฟโปรตีโอมิกส์คือการหาปริมาณให้สม่ำเสมอในชุดข้อมูลขนาดใหญ่ ความแปรปรวนที่เกิดขึ้นระหว่างการเตรียมตัวอย่างอาจบดบังความแตกต่างที่มีความหมายทางชีวภาพ

การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์แก้ปัญหานี้โดยให้:

1. พลังงานที่ป้อนเข้าสู่ตัวอย่างแต่ละตัวอย่างตามมาตรฐานเดียวกัน
2. ความแปรปรวนจากการปฏิบัติงานด้วยมือที่ลดลง
3. ความสามารถในการทำซ้ำที่ดีขึ้นในการสกัดและย่อยโปรตีน

เมื่อใช้ร่วมกับแพลตฟอร์มที่ประมวลผลตัวอย่างปริมาณสูง เช่น UIP400MTP ห้องปฏิบัติการสามารถบรรลุระดับความสม่ำเสมอที่จำเป็นต่อการศึกษาชีววิทยาระบบและการค้นพบตัวบ่งชี้ทางชีวภาพทางคลินิก

อนาคตของฟอสโฟโปรตีโอมิกส์: ระบบอัตโนมัติและความสามารถในการขยายขนาด

เมื่อฟอสโฟโปรตีโอมิกส์ขยายตัวอย่างต่อเนื่องสู่การประยุกต์ใช้ในระดับใหญ่และทางคลินิก ความต้องการระบบอัตโนมัติและปริมาณตัวอย่างที่ประมวลผลได้จะมีแต่เพิ่มขึ้น การเตรียมตัวอย่างด้วยคลื่นอัลตราซาวนด์ โดยเฉพาะเมื่อผสานเข้ากับระบบที่รองรับไมโครเพลต ถือเป็นเทคโนโลยีสำคัญที่ช่วยให้บรรลุเป้าหมายดังกล่าว
ด้วยการผสานการสลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์อย่างมีประสิทธิภาพ การประมวลผลแบบขนาน และความเข้ากันได้กับกระบวนงานอัตโนมัติ อุปกรณ์ เช่น VialTweeter และ UIP400MTP กำลังกำหนดมาตรฐานใหม่ในการเตรียมตัวอย่างโปรตีโอมิกส์
อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับการผสาน UIP400MTP เข้ากับกระบวนงานห้องปฏิบัติการอัตโนมัติ!

ใช้ประโยชน์จากการเตรียมตัวอย่างโดยใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ช่วยในฟอสโฟโปรตีโอมิกส์!

การสกัดโปรตีนโดยใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ช่วยได้กลายเป็นองค์ประกอบสำคัญอย่างยิ่งของฟอสโฟโปรตีโอมิกส์สมัยใหม่ โดยให้ประสิทธิภาพ ความสามารถในการขยายขนาด และความสามารถในการทำซ้ำที่ไม่มีวิธีใดเทียบได้ เมื่อความต้องการวิเคราะห์ระบบชีวภาพที่ซับซ้อนในตัวอย่างกลุ่มใหญ่เพิ่มขึ้น เทคโนโลยีอัลตราซาวนด์จึงไม่ได้มีเพียงข้อได้เปรียบ – แต่เป็นสิ่งจำเป็น
ด้วยการรองรับกระบวนงานมาตรฐานที่ประมวลผลตัวอย่างปริมาณสูง โซลูชัน เช่น VialTweeter และ UIP400MTP กำลังเร่งการค้นพบด้านการส่งสัญญาณของเซลล์ กลไกของโรค และการแพทย์แม่นยำ

การออกแบบ การผลิต และการให้คำปรึกษา – คุณภาพที่ผลิตในประเทศเยอรมนี

เครื่องอัลตราซาวนด์ Hielscher เป็นที่รู้จักดีในด้านมาตรฐานคุณภาพและการออกแบบสูงสุด ความทนทานและการใช้งานที่ง่ายช่วยให้ผสานเครื่องอัลตราซาวนด์ของเราเข้ากับโรงงานอุตสาหกรรมได้อย่างราบรื่น เครื่องอัลตราซาวนด์ Hielscher รับมือกับสภาวะที่สมบุกสมบันและสภาพแวดล้อมที่มีข้อเรียกร้องสูงได้อย่างง่ายดาย

Hielscher Ultrasonics เป็นบริษัทที่ได้รับการรับรอง ISO และให้ความสำคัญเป็นพิเศษกับเครื่องอัลตราซาวนด์สมรรถนะสูงที่มีเทคโนโลยีล้ำสมัยและใช้งานง่าย แน่นอนว่าเครื่องอัลตราซาวนด์ Hielscher สอดคล้องกับ CE และเป็นไปตามข้อกำหนดของ UL, CSA และ RoHs

เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับหลายตัวอย่าง Hielscher รุ่น UIP400MTP สำหรับไมโครเพลต, VialTweeter และ CupHorn: การเตรียมตัวอย่างด้วยความเร็วสูงและรองรับตัวอย่างปริมาณสูง