การสกัดโปรตีนด้วยคลื่นเสียงช่วยสำหรับการวิเคราะห์ฟอสโฟโพรตีโอมิกส์

ในชีวิตวิทยาศาสตร์สมัยใหม่ ฟอสโฟโพรตีโอมิกส์ได้กลายเป็นเทคโนโลยีหลักในการถอดรหัสเส้นทางสัญญาณของเซลล์และทำความเข้าใจกลไกของโรคในระดับระบบ เนื่องจากฟอสโฟอริเลชันควบคุมการทำงานทางชีวภาพที่สำคัญ – จากกิจกรรมของเอนไซม์สู่ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับโปรตีน – การวัดอย่างแม่นยำเป็นสิ่งจำเป็นทั้งสำหรับการวิจัยพื้นฐานและการแพทย์เชิงแปล ความก้าวหน้าล่าสุดในเทคนิคแมสสเปกโตรเมทรีได้เปิดโอกาสให้สามารถระบุเหตุการณ์การเติมหมู่ฟอสเฟตได้หลายหมื่นครั้งในการทดลองเพียงครั้งเดียว ซึ่งเน้นย้ำถึงความจำเป็นในการมีกระบวนการเตรียมตัวอย่างที่มีความแข็งแกร่ง สามารถปรับขนาดได้ และทำซ้ำได้
หนึ่งในพัฒนาการที่มีผลกระทบมากที่สุดในสาขานี้คือการนำการสกัดโปรตีนด้วยคลื่นเสียงมาใช้ ซึ่งช่วยเพิ่มคุณภาพของตัวอย่าง ปริมาณงาน และความสามารถในการทำซ้ำได้อย่างมีนัยสำคัญ เทคโนโลยีอัลตราโซนิก เช่น VialTweeter และ UIP400MTP กำลังนิยามใหม่ว่าห้องปฏิบัติการจัดการกับกลุ่มตัวอย่างขนาดใหญ่ได้อย่างไร โดยเฉพาะในงานฟอสโฟโพรตีโอมิกส์ที่ต้องการปริมาณงานสูง

ความสำคัญทางวิทยาศาสตร์ของการเตรียมตัวอย่างที่มีประสิทธิภาพในฟอสโฟโพรตีโอมิกส์

การฟอสโฟรีเลชันของโปรตีนเป็นการปรับเปลี่ยนหลังการแปลรหัสที่มีพลวัตสูงและสามารถย้อนกลับได้ ซึ่งส่งผลกระทบต่อโปรตีนส่วนใหญ่ในเซลล์มนุษย์ การฟอสโฟรีเลชันควบคุมโครงสร้างของโปรตีน การกระจายตัว และเครือข่ายปฏิสัมพันธ์ของโปรตีน และการทำงานที่ผิดปกติของการฟอสโฟรีเลชันมีความเกี่ยวข้องกับโรคต่างๆ เช่น มะเร็งและการเสื่อมของระบบประสาท
อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ฟอสโฟโปรตีโอมิกส์มีความท้าทายทางเทคนิคที่เป็นเอกลักษณ์เฉพาะตัว เปปไทด์ที่ถูกฟอสโฟรีเลตมักมีปริมาณน้อยและต้องการการเพิ่มความเข้มข้นอย่างระมัดระวังและการเตรียมตัวอย่างที่มีประสิทธิภาพสูงในขั้นตอนต้น หากมีประสิทธิภาพต่ำในระหว่างการสกัดหรือการย่อยโปรตีน อาจนำไปสู่การสูญเสียสัญญาณ การทำซ้ำที่ไม่ดี และการครอบคลุมตำแหน่งฟอสโฟรีเลตที่ไม่สมบูรณ์
นี่คือจุดที่การสั่นด้วยคลื่นเสียงมีความสำคัญอย่างยิ่ง

ทำไมการโซนิเคชันจึงเปลี่ยนแปลงการสกัดโปรตีน

การโซนิเคชันใช้คลื่นเสียงความเข้มสูงเพื่อทำลายเซลล์และเนื้อเยื่อทางกลไก ทำให้สามารถปลดปล่อยโปรตีนออกจากเซลล์ เนื้อเยื่อ ของเหลวชีวภาพ และถุงหุ้มเซลล์นอกเซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ เมื่อเปรียบเทียบกับเทคนิคการแตกเซลล์แบบดั้งเดิม การโซนิเคชันมีข้อได้เปรียบที่โดดเด่นหลายประการ:

• ประการแรก มันช่วยให้มั่นใจในการทำลายเซลล์อย่างรวดเร็วและสม่ำเสมอ ซึ่งเป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่งสำหรับการรักษาสถานะการฟอสโฟรีเลชันชั่วคราว ในด้านฟอสโฟโปรตีโอมิกส์ แม้แต่ความล่าช้าเพียงเล็กน้อยหรือการแตกตัวที่ไม่สมบูรณ์ก็สามารถเปลี่ยนแปลงโปรไฟล์การส่งสัญญาณได้ ทำให้การสกัดที่รวดเร็วและทำซ้ำได้เป็นสิ่งจำเป็น
• ประการที่สอง การโซนิเคชันช่วยเพิ่มปริมาณโปรตีนและอัตราการละลาย โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับตัวอย่างที่ย่อยสลายได้ยาก เช่น เนื้อเยื่อที่มีความหนาแน่นสูงหรือเซลล์ที่มีเยื่อหุ้มเซลล์มาก ซึ่งส่งผลโดยตรงต่อการย่อยโปรตีนในขั้นตอนถัดไปและการกู้คืนฟอสโฟเปปไทด์ที่ดีขึ้น
• ประการที่สาม การประมวลผลด้วยคลื่นเสียงความถี่สูงสามารถปรับขนาดได้โดยธรรมชาติ อุปกรณ์อย่าง VialTweeter ช่วยให้สามารถทำการโซนิคชันหลอดทดลองที่ปิดผนึกหลายหลอดพร้อมกันได้ ซึ่งช่วยให้มั่นใจได้ว่าสภาวะการประมวลผลจะเหมือนกันในทุกตัวอย่าง การทำเช่นนี้ช่วยขจัดความแปรปรวนที่เกิดจากการจัดการด้วยมือ
• สำหรับความต้องการในการประมวลผลที่สูงยิ่งขึ้น UIP400MTP ถือเป็นก้าวกระโดดทางเทคโนโลยีครั้งสำคัญ โดยสามารถส่งคลื่นเสียงความถี่สูงไปยังไมโครเพลทหรือแท่นหลอดทดลองทั้งชุดได้โดยตรง รวมถึงหลอดตัวอย่างในออโตซัมเพลอร์ ทำให้เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการประมวลผลตัวอย่างหลายร้อยตัวอย่างพร้อมกัน ความสามารถนี้มีความสำคัญอย่างยิ่งในระบบชีววิทยาระดับระบบและงานวิจัยทางคลินิก ซึ่งมักต้องใช้ตัวอย่างจำนวนมาก

การสั่นด้วยคลื่นเสียงความถี่สูงแบบผ่านปริมาณมาก: VialTweeter และ UIP400MTP ในจุดสนใจ

การผสานรวมอุปกรณ์อัลตราโซนิกขั้นสูงเข้ากับกระบวนการทำงานของฟอสโฟโพรตีโอมิกส์ไม่ใช่เพียงแค่ความสะดวกเท่านั้น – มันคือการปรับปรุงทางวิธีวิทยา
VialTweeter ได้รับการออกแบบมาเพื่อการรักษาด้วยคลื่นเสียงความถี่สูงแบบซิงโครไนซ์สำหรับขวดปิดหลายขวด ลดการปนเปื้อนข้ามขวดในขณะที่ยังคงความแม่นยำในการทำซ้ำได้ เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการใช้งานที่มีปริมาณปานกลางและกระบวนการทำงานที่เป็นมาตรฐาน
 

ในทางตรงกันข้าม UIP400MTP ได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับสภาพแวดล้อมที่ต้องการปริมาณงานสูง ทำให้สามารถ:

• การสั่นด้วยคลื่นเสียงสม่ำเสมอทั่วทั้งไมโครเพลทมาตรฐาน เช่น ไมโครเพลทแบบ 96 หลุม หรือ 384 หลุม
• การประมวลผลโดยตรงของชั้นวางหลอดและขวดตัวอย่างอัตโนมัติ
• ลดเวลาที่ต้องทำงานด้วยตนเองอย่างมีนัยสำคัญ
• การเพิ่มความสามารถในการทำซ้ำได้ของข้อมูลขนาดใหญ่

ความสามารถในการปรับขนาดนี้สอดคล้องอย่างสมบูรณ์กับแนวทางฟอสโฟโปรตีโอมิกส์สมัยใหม่ ซึ่งกระบวนการทำงานสามารถจัดการตัวอย่างได้หลายสิบถึงหลายร้อยตัวอย่างพร้อมกันเป็นประจำ

ระเบียบปฏิบัติทั่วไปสำหรับการเตรียมตัวอย่างทางโฟสโฟโพรตีโอมิกส์โดยใช้การโซนิเคชันเป็นตัวช่วย

กระบวนการทำงานทางฟอสโฟโพรตีโอมิกส์ที่แข็งแกร่งผสานการสกัดโปรตีนที่มีประสิทธิภาพ การย่อยด้วยเอนไซม์ และการเพิ่มความเข้มข้นของฟอสโฟเปปไทด์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ โครงร่างต่อไปนี้สะท้อนถึงแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุดที่ได้รับการยอมรับและปรับให้เหมาะสมกับการเตรียมตัวอย่างโดยใช้การโซนิเคชัน:

1. การทำให้ตัวอย่างเย็นตัวอย่างรวดเร็วและการเก็บรวบรวม
   เซลล์หรือเนื้อเยื่อถูกทำให้เย็นลงอย่างรวดเร็ว – โดยทั่วไปผ่านการแช่แข็งอย่างรวดเร็ว – เพื่อรักษาสถานะของการฟอสโฟรีเลชัน ขั้นตอนนี้มีความสำคัญอย่างยิ่งเนื่องจากลักษณะชั่วคราวของเหตุการณ์การฟอสโฟรีเลชัน
2. การแตกเซลล์ด้วยคลื่นเสียงความถี่สูงและการสกัดโปรตีน
   ตัวอย่างถูกทำให้ละลายและนำไปผ่านกระบวนการโซนิคเคชัน โดยทั่วไปจะทำในรอบสั้นๆ พลังงานอัลตราโซนิกจะทำลายเยื่อหุ้มเซลล์และปล่อยโปรตีนออกมาอย่างมีประสิทธิภาพ ในกระบวนการทำงานที่ได้รับการตรวจสอบแล้ว การโซนิคเคชันจะดำเนินการในหลายรอบเพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์ถูกทำลายอย่างสมบูรณ์
   ตัวอย่าง: หลังจากละลายตัวอย่างบนน้ำแข็งแล้ว การแตกตัวของเซลล์ทำได้โดยการใช้อัลตราซาวนด์ เช่น เครื่อง Vialtweeter เป็นเวลา 2 รอบ โดยแต่ละรอบใช้เวลา 1 นาที
3. การชี้แจงและการวัดปริมาณโปรตีน
   หลังจากการสลายตัวอย่างแล้ว จะทำการปั่นเหวี่ยงเพื่อกำจัดเศษสิ่งสกปรก จากนั้นจะเก็บส่วนใสที่ลอยอยู่ด้านบนซึ่งมีโปรตีนที่ละลายได้อยู่ และทำการวัดปริมาณเพื่อให้แน่ใจว่ามีการใส่ตัวอย่างในปริมาณที่สม่ำเสมอในแต่ละชุด
4. การลดและการเติมหมู่แอลคิล
   พันธะไดซัลไฟด์ถูกทำให้ลดลง (เช่น โดยใช้ DTT) และถูกเติมหมู่แอลคิล (เช่น โดยใช้ IAA) เพื่อทำให้โปรตีนมีเสถียรภาพและเพิ่มประสิทธิภาพในการย่อยสลาย
5. การย่อยโปรตีน
   โปรตีนถูกย่อยด้วยเอนไซม์ โดยทั่วไปคือทริปซิน ซึ่งสร้างเปปไทด์ที่เหมาะสมสำหรับการวิเคราะห์ด้วยแมสสเปกโตรเมตรี อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับการย่อยโปรตีนที่เร่งด้วยคลื่นเสียงความถี่สูง!
6. การทำให้บริสุทธิ์และกำจัดเกลือของเปปไทด์
   เปปไทด์ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้วิธีการที่มีฐาน C18 เพื่อกำจัดสิ่งปนเปื้อนที่อาจรบกวนการวิเคราะห์ LC-MS
7. การเพิ่มความเข้มข้นของฟอสโฟเปปไทด์
   เนื่องจากความเข้มข้นต่ำของเปปไทด์ที่ถูกฟอสโฟรีเลต เทคนิคการเพิ่มความเข้มข้น เช่น Fe-NTA หรือวิธีเชิงความชอบของ TiO₂ จึงถูกนำมาใช้เพื่อแยกเปปไทด์ที่ถูกฟอสโฟรีเลตอย่างเฉพาะเจาะจง
8. การวิเคราะห์ LC-MS/MS และการประมวลผลข้อมูล
   ตัวอย่างที่ได้รับการเสริมคุณภาพจะถูกวิเคราะห์โดยใช้เทคนิคแมสสเปกโตรเมทรีความละเอียดสูง โดยมักใช้การเก็บข้อมูลแบบไม่ขึ้นกับข้อมูลที่ตรวจพบ (Data-Independent Acquisition: DIA) เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการวัดปริมาณและความสามารถในการทำซ้ำ

โดยเฉพาะอย่างยิ่ง กระบวนการทำงานขนาดใหญ่สามารถปรับให้เข้ากับรูปแบบจาน 96 หลุมได้ ทำให้สามารถประมวลผลขนานกันได้มากถึงหลายร้อยตัวอย่าง – วิธีการที่เข้ากันได้อย่างสมบูรณ์กับการโซนิเคชันที่ใช้ UIP400MTP
 

โปรโตคอลที่ได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับการยับยั้งฟอสโฟโปรตีโอมอย่างรวดเร็ว การเพิ่มความเข้มข้นของฟอสโฟเปปไทด์ และการวิเคราะห์ด้วย Phos-DIA-MS
ระเบียบวิธีและภาพ: ©Die et al. 2023

การเพิ่มความสามารถในการทำซ้ำและคุณภาพของข้อมูลผ่านการสั่นด้วยคลื่นเสียง

หนึ่งในความท้าทายหลักในฟอสโฟโปรตีโอมิกส์คือการบรรลุการวัดปริมาณที่สม่ำเสมอในชุดข้อมูลขนาดใหญ่ ความแปรปรวนที่เกิดขึ้นระหว่างการเตรียมตัวอย่างอาจทำให้ความแตกต่างที่มีความหมายทางชีววิทยาถูกบดบัง

การโซนิเคชันแก้ไขปัญหานี้โดยการให้:

1. การป้อนพลังงานมาตรฐานในตัวอย่าง
2. ลดความแปรปรวนจากการทำงานด้วยมือ
3. การปรับปรุงความสามารถในการทำซ้ำได้ในการสกัดและย่อยโปรตีน

เมื่อรวมกับแพลตฟอร์มที่มีประสิทธิภาพสูงเช่น UIP400MTP ห้องปฏิบัติการสามารถบรรลุระดับความสม่ำเสมอที่จำเป็นสำหรับการศึกษาชีววิทยาระบบและการค้นพบตัวบ่งชี้ทางชีวภาพทางคลินิก

อนาคตของฟอสโฟโพรตีโอมิกส์: การทำงานอัตโนมัติและการขยายขนาด

เมื่อการวิเคราะห์โปรตีนฟอสโฟรีเลชั่นขยายตัวไปสู่การใช้งานในขนาดใหญ่และทางคลินิก ความต้องการในด้านการอัตโนมัติและการผลิตในปริมาณมากจะเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่อง การเตรียมตัวอย่างโดยใช้การสั่นสะเทือน (sonication) โดยเฉพาะเมื่อผสานกับระบบที่สามารถใช้งานร่วมกับไมโครเพลต (microplate-compatible systems) ถือเป็นเทคโนโลยีที่สำคัญซึ่งช่วยให้เป็นไปได้
ด้วยการผสมผสานการสลายด้วยคลื่นเสียงความถี่สูงที่มีประสิทธิภาพ การประมวลผลแบบขนาน และความเข้ากันได้กับกระบวนการอัตโนมัติ อุปกรณ์เช่น VialTweeter และ UIP400MTP กำลังกำหนดมาตรฐานใหม่ในการเตรียมตัวอย่างโปรตีโอมิกส์
อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับการผสานรวม UIP400MTP ในกระบวนการทำงานอัตโนมัติในห้องปฏิบัติการ!

ใช้ประโยชน์จากการเตรียมตัวอย่างด้วยคลื่นเสียงในฟอสโฟโปรตีโอมิกส์!

การสกัดโปรตีนด้วยคลื่นเสียงความถี่สูงได้กลายเป็นองค์ประกอบสำคัญของการศึกษาฟอสโฟโพรตีโอมิกส์สมัยใหม่ โดยมอบประสิทธิภาพ ความสามารถในการขยายขนาด และความน่าเชื่อถือที่ไม่มีใครเทียบได้ ด้วยความจำเป็นที่เพิ่มขึ้นในการวิเคราะห์ระบบชีวภาพที่ซับซ้อนในตัวอย่างจำนวนมาก เทคโนโลยีอัลตราโซนิกจึงไม่ได้เป็นเพียงข้อได้เปรียบ – พวกเขาเป็นสิ่งจำเป็น
ด้วยการเปิดใช้งานกระบวนการทำงานที่มีประสิทธิภาพสูงและเป็นมาตรฐาน โซลูชันอย่าง VialTweeter และ UIP400MTP กำลังเร่งการค้นพบในด้านการส่งสัญญาณของเซลล์ กลไกของโรค และการแพทย์แม่นยำ

การออกแบบ การผลิต และการให้คําปรึกษา – คุณภาพ ผลิตในประเทศเยอรมนี

เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher เป็นที่รู้จักกันดีในด้านคุณภาพและมาตรฐานการออกแบบสูงสุด ความทนทานและใช้งานง่ายช่วยให้สามารถรวมเครื่องอัลตราโซนิกของเราเข้ากับโรงงานอุตสาหกรรมได้อย่างราบรื่น สภาพที่ขรุขระและสภาพแวดล้อมที่ต้องการสามารถจัดการได้ง่ายโดยเครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher

Hielscher Ultrasonics เป็น บริษัท ที่ได้รับการรับรองมาตรฐาน ISO และให้ความสําคัญเป็นพิเศษกับเครื่องอัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงที่มีเทคโนโลยีล้ําสมัยและเป็นมิตรกับผู้ใช้ แน่นอนว่าเครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher เป็นไปตามมาตรฐาน CE และตรงตามข้อกําหนดของ UL, CSA และ RoHs

เครื่องโซนิเคเตอร์แบบหลายตัวอย่าง Hielscher รุ่น UIP400MTP สำหรับไมโครเพลท, VialTweeter และ CupHorn: การเตรียมตัวอย่างความเร็วสูงและปริมาณมาก