การกำจัดพาราฟินและการสกัดโปรตีนจาก FFPE

ช่วยให้สกัดโปรตีนจากชิ้นตัดเนื้อเยื่อที่ตรึงด้วยฟอร์มาลินและฝังในพาราฟิน (FFPE) ได้สะดวกขึ้น โดยผสานการกำจัดพาราฟิน การทำให้ละลาย และการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ด้วยเครื่องอัลตราซาวนด์แบบหลายหลอด VialTweeter ในรูปแบบที่ปรับให้เหมาะสมแล้ว โพรโทคอลนี้รองรับการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ด้วยแมสสเปกโทรเมทรีในขั้นตอนถัดไป และเข้ากันได้กับกระบวนการกำจัดสิ่งปนเปื้อนด้วย SP3 และการย่อยด้วยเอนไซม์

ขั้นตอนการปฏิบัติงานมาตรฐาน (SOP) นี้มีไว้สำหรับบุคลากรห้องปฏิบัติการที่วิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ของตัวอย่างเนื้อเยื่อ FFPE โดยใช้การประมวลผลด้วยคลื่นอัลตราซาวนด์ประสิทธิภาพสูง โดยปรับให้เหมาะสมสำหรับการประมวลผลตัวอย่าง FFPE พร้อมกันสูงสุดสิบตัวอย่างด้วยเครื่องอัลตราซาวนด์แบบหลายหลอด VialTweeter

โพรโทคอล: การสกัดโปรตีนจากตัวอย่าง FFPE โดยใช้ VialTweeter

วัสดุและสารเคมี

สารเคมี

• ไซลีน (เกรดสำหรับงานจุลกายวิภาคศาสตร์)
• เอทานอล (ชนิดสัมบูรณ์ 96%)
• บัฟเฟอร์สลายเซลล์:

6 M Guanidine hydrochloride
50 mM Tris-HCl, pH 8.5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine)
40 mM CAA (2-Chloroacetamide)

• สารยับยั้งโปรตีเอส (เลือกใช้ได้ เช่น cOmplete™ mini EDTA-free)

อุปกรณ์

• เครื่องอัลตราซาวนด์แบบหลายหลอด VialTweeter
• หลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ชนิดจับกับสารต่ำ ขนาด 1.5 mL หรือ 2.0 mL
• บล็อกให้ความร้อนหรือตู้บ่ม (ตั้งค่าได้ที่ 95°C และ 80°C)
• เครื่องไมโครเซนตริฟิวจ์
• เครื่องผสมพร้อมควบคุมอุณหภูมิ (เลือกใช้ได้ แต่แนะนำให้ใช้)

ปริมาณตัวอย่างเริ่มต้น

• ชิ้นตัดเนื้อเยื่อ FFPE หนา 10 µm จำนวน 1–2 ชิ้นต่อตัวอย่าง (กล่าวคือ ต่อขวด)

หรือ

• เนื้อเยื่อรวม ~100 µg ต่อตัวอย่าง (กล่าวคือ ต่อขวด)

หมายเหตุ: ใช้ใบมีดใหม่ในการตัดเนื้อเยื่อด้วยไมโครโทม เพื่อลดการปนเปื้อนจากเศษพาราฟินให้เหลือน้อยที่สุด

วิธีดำเนินการ

1. การกำจัดพาราฟิน
   1. ย้ายชิ้นตัด FFPE ลงในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ชนิดจับกับสารต่ำ
   2. เติมไซลีน 1 mL แล้วผสมด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์เป็นเวลาสั้น ๆ
   3. บ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที
   4. ปั่นเหวี่ยงที่ 14,000 × g เป็นเวลา 2 นาที แล้วทิ้งส่วนใสเหนือตะกอน
   5. ล้างด้วยไซลีนซ้ำอีกหนึ่งครั้ง (ขั้นตอนที่ 2–4)
   6. ล้างตะกอนด้วยเอทานอล 96% ปริมาตร 1 mL ผสมด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์ แล้วปั่นเหวี่ยงที่ 14,000 × g เป็นเวลา 2 นาที ทิ้งส่วนใสเหนือตะกอน
   7. ล้างด้วยเอทานอลซ้ำอีกหนึ่งครั้ง (รวมการล้างด้วยเอทานอล 2 ครั้ง)
   8. เปิดฝาหลอดและผึ่งตะกอนให้แห้งที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที เพื่อให้เอทานอลที่เหลืออยู่ระเหยออก
2. การสกัดโปรตีนและการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์
   1. เติมบัฟเฟอร์สลายเซลล์ 200 µL ลงในตะกอนแห้งแต่ละหลอด

      หมายเหตุ: แม้เครื่องอัลตราซาวนด์จะรองรับปริมาตรได้สูงสุด 1 mL แต่ปริมาตร 200 µL เหมาะสมที่สุดสำหรับการประมวลผลในขั้นตอนถัดไป

   2. ผสมด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์ หรือดูดจ่ายด้วยปิเปตอย่างเบามือ
3. การบ่มด้วยความร้อนครั้งแรก
   1. บ่มหลอดที่ 95 °C เป็นเวลา 30 min พร้อมเขย่าที่ 400 rpm โดยใช้เครื่องผสมพร้อมควบคุมอุณหภูมิหรือบล็อกให้ความร้อน
   2. ปล่อยให้ตัวอย่างเย็นลงที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 min
4. การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ด้วย VialTweeter ครั้งแรก
   1. วางหลอดลงใน VialTweeter
   2. ตั้งค่า VialTweeter UP200St ตามค่าด้านล่าง แล้วใช้คลื่นอัลตราซาวนด์กับตัวอย่าง
การตั้งค่าเครื่องอัลตราซาวนด์
• ตั้งแอมพลิจูด (A) เป็น 100%
• ตั้งโหมดพัลส์ (C) เป็น 100%
• ตัวจับเวลารอบ: เปิด
• ระยะเวลาเปิด: 60s
• ระยะเวลาปิด: 30s
• ค่าขีดจำกัด: 15 min (เท่ากับ 10 รอบ)
(หมายเหตุการคำนวณ: (เปิด 60 s + ปิด 30 s) × 10 รอบ = 900 s = 15 min)
5. การบ่มด้วยความร้อนครั้งที่สอง
   นำหลอดออกและบ่มอีกครั้งที่ 95 °C เป็นเวลา 15 min โดยเขย่าที่ 400 rpm
6. การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ครั้งที่สอง
   ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ด้วย VialTweeter ซ้ำ โดยใช้การตั้งค่าเดิม (ตามด้านบน) อีก 10 รอบ (รวมเวลา 15 min)
7. การแยกตะกอนออกจากสารละลายที่ได้จากการสลายเซลล์
   1. ปั่นเหวี่ยงตัวอย่างที่ 13,000 × g เป็นเวลา 10 min ที่ 23°C (อุณหภูมิห้อง)
   2. เก็บส่วนใสเหนือตะกอนอย่างระมัดระวังลงในหลอด Eppendorf Safe-lock ขนาด 2.0 mL หลอดใหม่ หลีกเลี่ยงการรบกวนตะกอน
8. การประมวลผลในขั้นตอนถัดไป
   ขณะนี้สารละลายที่ได้จากการสลายเซลล์พร้อมสำหรับการกำจัดสิ่งปนเปื้อนด้วย SP3 และการย่อยด้วยเอนไซม์

หมายเหตุและแนวทางปฏิบัติที่แนะนำ

1. การตั้งโปรแกรมให้เปิด/ปิดเป็นรอบช่วยลดความเสี่ยงที่จะเกิดความร้อนสูงเกินไประหว่างการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์
2. หลีกเลี่ยงการผสมด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์หลังการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ เพื่อป้องกันการรวมตัวของโปรตีน

การกำจัดของเสียและความปลอดภัย

ตารางด้านล่างแสดงความสามารถในการประมวลผลโดยประมาณของเครื่องอัลตราซาวนด์ขนาดห้องปฏิบัติการของเรา: