การแยกไขมันและการสกัดโปรตีนจาก FFPE

อํานวยความสะดวกในการสกัดโปรตีนจากส่วนเนื้อเยื่อที่ฝังพาราฟินแบบฝังตัวของฟอร์มาลิน (FFPE) โดยใช้การผสมผสานที่เหมาะสมที่สุดของ deparaffinization, solubilization และ sonication ด้วยเครื่องอัลตราโซนิกหลายหลอด VialTweeter โปรโตคอลนี้รองรับโปรตีโอมิกส์ที่ใช้แมสสเปกโตรเมตรีดาวน์สตรีม และเข้ากันได้กับการทําความสะอาด SP3 และเวิร์กโฟลว์การย่อยเอนไซม์

SOP นี้มีไว้สําหรับบุคลากรในห้องปฏิบัติการที่เกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ของตัวอย่างเนื้อเยื่อ FFPE โดยใช้ sonication ประสิทธิภาพสูง ได้รับการปรับให้เหมาะสมสําหรับตัวอย่าง FFPE สูงสุดสิบตัวอย่างที่ประมวลผลแบบขนานโดยใช้ VialTweeter Multi-Tube Sonicator

โปรโตคอล: การสกัดโปรตีนจากตัวอย่าง FFPE โดยใช้ VialTweeter

วัสดุและรีเอเจนต์

รีเอเจนต์

• ไซลีน (เกรดเนื้อเยื่อวิทยา)
• เอทานอล (สัมบูรณ์ 96%)
• บัฟเฟอร์ Lysis:

6 ม. กัวนิดีนไฮโดรคลอไรด์
50 มิลลิเมตร Tris-HCl, pH 8.5
10 มิลลิเมตร TCEP (ทริส (2-คาร์บอกซีเอทิล) ฟอสฟีน)
40 มิลลิเมตร CAA (2-คลอโรอะซิเอไมด์)

• สารยับยั้งโปรตีเอส (อุปกรณ์เสริม เช่น cOmplete™ mini EDTA-free)

อุปกรณ์

• VialTweeter เครื่องอัลตราโซนิกหลายหลอด
• หลอด microcentrifuge ที่มีฤทธิ์จับต่ํา 1.5 มล. หรือ 2.0 มล.
• บล็อกความร้อนหรือตู้ฟักไข่ (การตั้งค่า 95°C และ 80°C)
• เครื่องหมุนเหวี่ยงขนาดเล็ก
• เทอร์โมมิกเซอร์ (อุปกรณ์เสริม แต่แนะนํา)

Samp อินพุต

• เนื้อเยื่อ FFPE หนา 10 μm 1-2 ส่วนต่อตัวอย่าง (เช่น ต่อขวด)

หรือ

• เนื้อเยื่อทั้งหมด ~100 ไมโครกรัมต่อตัวอย่าง (เช่น ต่อขวด)

หมายเหตุ ใช้ใบมีดใหม่สําหรับไมโครโทมีเพื่อลดการปนเปื้อนของเศษพาราฟิน

ขั้นตอน

1. การแยกพาราฟิน
   1. ถ่ายโอนส่วน FFPE ลงในหลอดไมโครเซ่นเหวี่ยงที่มีฤทธิ์ผูกพันต่ํา
   2. เติมไซลีน 1 มล. หมุนวนชั่วครู่
   3. ฟักไข่ 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง
   4. หมุนเหวี่ยงที่ 14,000 × กรัมเป็นเวลา 2 นาที ทิ้งเหนือน้ํา
   5. ล้างไซลีนซ้ําอีกครั้ง (ขั้นตอนที่ 2–4)
   6. ล้างเม็ดด้วยเอทานอล 96% 1 มล. น้ําวน จากนั้นหมุนเหวี่ยงที่ 14,000 × กรัมเป็นเวลา 2 นาที ทิ้ง supranatant
   7. ล้างเอทานอลซ้ําอีกครั้ง (ล้างเอทานอลทั้งหมด 2 ครั้ง)
   8. เม็ดลมแห้งเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องโดยเปิดฝาเพื่อระเหยเอทานอลที่ตกค้าง
2. การสกัดโปรตีนและ Sonication
   1. เติมบัฟเฟอร์การสลาย 200 μL ลงในเม็ดแห้งแต่ละเม็ด
      หมายเหตุ: แม้ว่าเครื่องโซนิคเตอร์จะรองรับได้ถึง 1 มล. แต่ 200 μL ก็เหมาะสมที่สุดสําหรับการประมวลผลปลายน้ํา

   2. ผสมโดยการหมุนวนหรือการปิเปตอย่างอ่อนโยน
3. การฟักไข่ด้วยความร้อนครั้งแรก
   1. บ่มหลอดที่อุณหภูมิ 95 °C เป็นเวลา 30 นาที โดยกวนที่ 400 รอบต่อนาทีโดยใช้เทอร์โมมิกเซอร์หรือบล็อกความร้อน
   2. ปล่อยให้ตัวอย่างเย็นลงที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที
4. Sonication ครั้งแรกด้วย VialTweeter
   1. วางหลอดลงใน VialTweeter
   2. ตั้งค่า VialTweeter UP200St เป็นค่าด้านล่างและส่งสัญญาณ
การตั้งค่าเครื่องโซนิคเตอร์
• ตั้งค่า Amplitude (A) เป็น 100%
• ตั้งค่าโหมดการเต้นเป็นจังหวะ (C) เป็น 100%
• นาฬิกาช่วงเวลา: เปิด
• ตรงเวลา: 60 วินาที
• เวลาปิด: 30 วินาที
• ค่าจํากัด : 15 นาที (สอดคล้องกับ 10 รอบ)
(หมายเหตุการคํานวณ: (เปิด 60 วินาที + ปิด 30 วินาที) × 10 รอบ = 900 วินาที = 15 นาที)
5. การฟักตัวด้วยความร้อนครั้งที่สอง
   นําหลอดออกและบ่มอีกครั้งที่อุณหภูมิ 95 °C เป็นเวลา 15 นาที 400 รอบต่อนาที
6. Sonication ครั้งที่สอง
   ทําซ้ํา sonication บน VialTweeter โดยใช้การตั้งค่าเดียวกัน (ดังด้านบน) อีก 10 รอบ (รวม 15 นาที)
7. การชี้แจงของ Lysate
   1. หมุนเหวี่ยงตัวอย่างที่ 13,000 × กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่ 23°C (อุณหภูมิห้อง)
   2. รวบรวมสารน้ําชั้นบนอย่างระมัดระวังลงในหลอด Safe-lock Eppendorf ขนาด 2.0 มล. ใหม่ หลีกเลี่ยงการรบกวนเม็ด
8. การประมวลผลปลายน้ํา
   ตอนนี้ไลเสทพร้อมสําหรับการทําความสะอาด SP3 และการย่อยเอนไซม์

หมายเหตุและแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุด

1. ความเสี่ยงจากความร้อนสูงเกินไประหว่างการ sonication จะบรรเทาได้โดยการปั่นจักรยานเปิด / ปิดที่ตั้งโปรแกรมไว้
2. หลีกเลี่ยงการหมุนเวียนหลังการ sonication เพื่อป้องกันการรวมตัวของโปรตีน

การกําจัดขยะและความปลอดภัย

ตารางด้านล่างให้ข้อบ่งชี้เกี่ยวกับความสามารถในการประมวลผลโดยประมาณของเครื่องอัลตราโซนิกขนาดห้องปฏิบัติการของเรา: