การเตรียมตัวอย่าง FFPE จำนวนมาก: การสกัดโปรตีนและการตัดกรดนิวคลีอิกด้วยแรงเฉือน

คำถามที่พบบ่อย
ด้านล่างนี้ เราตอบคำถามที่พบบ่อยเกี่ยวกับการเตรียมเนื้อเยื่อ FFPE และการใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับตัวอย่าง FFPE

เตรียมเนื้อเยื่อ FFPE อย่างไร?

ขั้นตอนการเตรียมเนื้อเยื่อ FFPE: การจัดการและการประมวลผลเนื้อเยื่อสดอย่างพิถีพิถันมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการสร้างตัวอย่าง FFPE คุณภาพสูง การรักษาโครงสร้างเซลล์ กรดนิวคลีอิก และโปรตีนไว้เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการวิเคราะห์ในขั้นตอนถัดไปอย่างแม่นยำ แต่ละขั้นตอน – ตั้งแต่การเก็บจนถึงการฝัง – ต้องอาศัยความแม่นยำเพื่อรักษาความสมบูรณ์ของตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์ต่าง ๆ รวมถึงการตรวจทางจุลกายวิภาคศาสตร์ อิมมูโนฮิสโตเคมี และการศึกษาระดับโมเลกุล เมื่อดำเนินการอย่างถูกต้อง กระบวนการตรึงและการฝังนี้ทำให้เนื้อเยื่อที่เก็บรักษาไว้สะท้อนสภาวะภายในสิ่งมีชีวิตได้อย่างแม่นยำ ส่งผลให้ได้ผลการวินิจฉัยและการวิจัยที่เชื่อถือได้
เราจะแนะนำคุณผ่าน 6 ขั้นตอนหลักของกระบวนการฝังตัวอย่างเนื้อเยื่อ FFPE

• การเก็บเนื้อเยื่อ
  ชิ้นเนื้อที่เก็บจากสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีชีวิตและเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงต่างเป็นแหล่งที่ใช้ได้ในการจัดหาเนื้อเยื่อสดสำหรับการเตรียมตัวอย่าง FFPE
  การใช้เทคนิคปลอดเชื้อเป็นสิ่งสำคัญ: ใช้เครื่องมือและถุงมือที่ปราศจากเชื้อเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน หากเป็นไปได้ ควรเก็บเนื้อเยื่อในสภาพแวดล้อมที่ปราศจากเชื้อ เช่น ห้องผ่าตัดหรือตู้ลมสะอาดแบบไหลเป็นชั้น
  เนื่องจากสิ่งส่งตรวจเปราะบางมาก การจัดการอย่างระมัดระวังจึงเป็นสิ่งจำเป็น: ลดความล่าช้าในการประมวลผลให้เหลือน้อยที่สุด และเริ่มกระบวนการเนื้อเยื่อขั้นถัดไปทันทีหลังตัดเนื้อเยื่อออก สิ่งนี้มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการป้องกันการย่อยสลายตัวเองและการเสื่อมสลาย เก็บเนื้อเยื่อไว้ที่อุณหภูมิห้อง หลีกเลี่ยงการแช่แข็งเนื่องจากอาจทำให้เกิดผลึกน้ำแข็งและความเสียหายต่อเนื้อเยื่อ
• การตรึงเนื้อเยื่อ
  ขั้นแรก นำเนื้อเยื่อไปผ่านการตรึงด้วยสารละลายสารตรึง: ใช้ฟอร์มาลินบัฟเฟอร์เป็นกลาง 10% (NBF) ซึ่งเทียบเท่ากับฟอร์มาลดีไฮด์ 4% ในน้ำที่ปรับด้วยบัฟเฟอร์ให้มี pH เป็นกลาง
  จุ่มเนื้อเยื่อให้จมอยู่ในฟอร์มาลินทั้งหมด ตรวจสอบให้แน่ใจว่าอัตราส่วนปริมาตรสารตรึงต่อเนื้อเยื่ออย่างน้อย 10:1 ระยะเวลาตรึงโดยทั่วไปอยู่ในช่วง 6 ถึง 24 ชั่วโมง ขึ้นอยู่กับชนิดและขนาดของเนื้อเยื่อ สิ่งสำคัญคือสารตรึงต้องแทรกซึมเข้าเนื้อเยื่อได้อย่างทั่วถึง อย่างไรก็ตาม การตรึงมากเกินไปอาจทำให้เกิดการเชื่อมขวางที่ทำให้การคืนสภาพแอนติเจนยุ่งยาก ขณะที่การตรึงไม่เพียงพออาจทำให้เก็บรักษาเนื้อเยื่อได้ไม่ดี
• การตัดแต่งเนื้อเยื่อ
  ขั้นที่สอง ตัดแต่งเนื้อเยื่อให้มีความหนาประมาณ 3–5 mm เพื่อให้สารตรึงแทรกซึมได้อย่างเพียงพอ จัดวางแนวเนื้อเยื่อให้เหมาะสมเพื่อให้ได้โครงสร้างทางจุลกายวิภาคศาสตร์ที่เกี่ยวข้อง ซึ่งช่วยให้กระบวนการสกัดง่ายขึ้นเมื่อนำเนื้อเยื่อไปใช้วิเคราะห์ในภายหลัง
• การประมวลผลตัวอย่างที่ผ่านการตรึง
  ขณะนี้ต้องกำจัดน้ำออกจากเนื้อเยื่อที่ผ่านการตรึง: หลังการตรึง ต้องกำจัดน้ำออกจากเนื้อเยื่อเพื่อให้พาราฟินแทรกซึมได้อย่างทั่วถึง นำเนื้อเยื่อผ่านเอทานอลที่มีความเข้มข้นเพิ่มขึ้นตามลำดับ (70%, 80%, 90% และ 100%) เพื่อกำจัดน้ำ
  การทำให้ใสด้วยไซลีน: พาราฟินไม่ละลายในน้ำ แต่ละลายในไซลีน ดังนั้นจึงต้องแทนที่น้ำในเนื้อเยื่อด้วยไซลีน อย่างไรก็ตาม ไซลีนเองไม่ละลายในน้ำ แต่ละลายในแอลกอฮอล์ จึงจำเป็นต้องมีขั้นตอนกลางที่แทนที่น้ำด้วยแอลกอฮอล์ก่อน จุ่มเนื้อเยื่อในไซลีนหรือสารทดแทนไซลีนเพื่อกำจัดเอทานอลและเตรียมเนื้อเยื่อสำหรับให้พาราฟินแทรกซึม
  การแทรกซึมด้วยพาราฟิน: ฝังเนื้อเยื่อในพาราฟินหลอมเหลว โดยให้แน่ใจว่าพาราฟินแทรกซึมอย่างสมบูรณ์ โดยทั่วไปขั้นตอนนี้ต้องเปลี่ยนพาราฟินหลายครั้งเพื่อให้แทรกซึมได้อย่างทั่วถึง
• การฝังเนื้อเยื่อ
  ในขั้นตอนนี้ เนื้อเยื่อจะถูกขึ้นรูปเป็นบล็อกเนื้อเยื่อ: วางเนื้อเยื่อในแม่พิมพ์ตามแนวที่ต้องการ แล้วเทพาราฟินหลอมเหลวลงไป ปล่อยให้พาราฟินแข็งตัวโดยทำให้เย็นที่อุณหภูมิห้องหรือบนแผ่นทำความเย็น
• การตัดชิ้นเนื้อและการติดบนสไลด์
  การตัดด้วยไมโครโทม: ใช้ไมโครโทมตัดเนื้อเยื่อที่ฝังไว้จากบล็อกพาราฟินให้เป็นชิ้นบาง ๆ (โดยทั่วไป 4–5 ไมโครเมตร) จากนั้นติดตัวอย่างโดยวางชิ้นเนื้อบนสไลด์แก้วเพื่อย้อมสีและวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ในขั้นตอนถัดไป
  สุดท้าย ตรวจสอบคุณภาพทางจุลกายวิภาคศาสตร์: ประเมินชิ้นเนื้อชุดแรกด้วยกล้องจุลทรรศน์เพื่อให้แน่ใจว่าการตรึงและการประมวลผลเหมาะสม ปรับขั้นตอนปฏิบัติตามความจำเป็นโดยพิจารณาจากชนิดเนื้อเยื่อและคุณภาพที่สังเกตได้

 
เนื้อเยื่อ FFPE สามารถใช้เก็บกู้ RNA, DNA และโปรตีน รวมถึงตรวจหาสัญญาณของมะเร็งหรือโรคอื่น ๆ ได้ สามารถเก็บไว้ได้หลายปี และเป็นส่วนสำคัญในการที่นักวิจัยและแพทย์ใช้ประโยชน์จากตัวอย่างเนื้อเยื่อเพื่อการวินิจฉัยและการวิจัย

ปัญหาและความท้าทายที่พบบ่อยของเนื้อเยื่อ FFPE คืออะไร?

ตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ตรึงด้วยฟอร์มาลินและฝังในพาราฟิน (FFPE) ใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิจัยและการวินิจฉัย แต่มีความท้าทายและปัญหาที่พบบ่อยหลายประการ:

• การเสื่อมสลายของชีวโมเลกุล: การตรึงเป็นเวลานานอาจทำให้ DNA, RNA และโปรตีนเสื่อมสลาย ทำให้สกัดกรดนิวคลีอิกหรือโปรตีนคุณภาพสูงสำหรับการใช้งานในขั้นตอนถัดไปได้ยาก การตรึงอย่างถูกต้อง (หลีกเลี่ยงการตรึงไม่เพียงพอและการตรึงมากเกินไป) เป็นสิ่งจำเป็นต่อการเก็บรักษาเนื้อเยื่อ

การเชื่อมขวาง: การตรึงด้วยฟอร์มาลินทำให้โปรตีนและกรดนิวคลีอิกเกิดการเชื่อมขวาง ซึ่งอาจขัดขวางการวิเคราะห์ระดับโมเลกุลและส่งผลต่อความแม่นยำของอิมมูโนฮิสโตเคมีและการทดสอบอื่น ๆ

• การบดบังแอนติเจน: กระบวนการตรึงอาจบดบังตำแหน่งแอนติเจน ทำให้ประสิทธิภาพการจับของแอนติบอดีในอิมมูโนฮิสโตเคมีและการทดสอบทางภูมิคุ้มกันวิทยาอื่น ๆ ลดลง จึงมักต้องคืนสภาพแอนติเจน ซึ่งเป็นกระบวนการที่ยกเลิกการบดบังเอพิโทปและคืนการจับระหว่างเอพิโทปกับแอนติบอดี อย่างไรก็ตาม อาจไม่สามารถคืนความสามารถในการเป็นแอนติเจนได้อย่างสมบูรณ์เสมอไป
• คุณภาพการตรึงที่แปรผัน: ความแตกต่างของเวลาและสภาวะการตรึงอาจทำให้คุณภาพตัวอย่างไม่สม่ำเสมอ ส่งผลต่อความสามารถในการทำซ้ำและการเปรียบเทียบผลลัพธ์ ใช้ขั้นตอนปฏิบัติการตรึงที่เชื่อถือได้ และหลีกเลี่ยงการตรึงไม่เพียงพอและการตรึงมากเกินไป
• ความเสียหายและการแตกเป็นชิ้นส่วนของ DNA: การตรึงตัวอย่าง FFPE ด้วยฟอร์มาลินอาจทำให้ DNA เสียหายหลายประเภท รวมถึงการดีอะมิเนชันของ cytosine (การกลายพันธุ์จาก C เป็น T) ความเสียหายจากออกซิเดชัน (เช่น 8-oxo-guanine ที่นำไปสู่การกลายพันธุ์จาก G เป็น T) รวมถึงความเสียหายทางกายภาพ เช่น รอยขาดในสาย DNA ช่องว่าง และตำแหน่งที่ไม่มีเบส ซึ่งขัดขวางการทำงานของ DNA พอลิเมอเรส กระบวนการตรึงด้วยฟอร์มาลินอาจทำให้ DNA แตกเป็นชิ้นส่วน ทำให้การวิเคราะห์ทางพันธุศาสตร์และจีโนมิกส์ เช่น PCR และการหาลำดับเบส ยุ่งยากขึ้น
• คุณภาพ RNA: RNA ที่สกัดจากเนื้อเยื่อ FFPE มักแตกเป็นชิ้นส่วนและถูกดัดแปลงทางเคมี ทำให้การวิเคราะห์ทรานสคริปโตมิกส์คุณภาพสูงเป็นเรื่องท้าทาย
• การดัดแปลงโปรตีน: ฟอร์มาลินสามารถทำให้โปรตีนเกิดการดัดแปลงทางเคมี ส่งผลต่อโครงสร้างและหน้าที่ของโปรตีน ซึ่งอาจรบกวนการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์
• สิ่งแปลกปลอมที่เกิดจากการประมวลผลตัวอย่าง: ระหว่างกระบวนการฝังและการตัดชิ้นเนื้อ ความเค้นเชิงกลและความร้อนอาจก่อให้เกิดสิ่งแปลกปลอมและทำให้เนื้อเยื่อเสียหายเพิ่มเติม
• ความแปรปรวนระหว่างชุดตัวอย่าง: ความแตกต่างของขั้นตอนปฏิบัติในการตรึงและการฝังระหว่างชุดตัวอย่างต่าง ๆ อาจทำให้ผลลัพธ์แปรปรวนอย่างมาก ทำให้การเปรียบเทียบระหว่างการศึกษายุ่งยากขึ้น
• ปัญหาการจัดเก็บ: การจัดเก็บบล็อก FFPE เป็นเวลานานอาจทำให้เกิดการเสื่อมสลายเพิ่มเติมและสูญเสียความสมบูรณ์ของกรดนิวคลีอิกเมื่อเวลาผ่านไป ส่งผลต่อความเหมาะสมในการใช้งานของตัวอย่างที่จัดเก็บไว้สำหรับการศึกษาย้อนหลัง

การใช้ขั้นตอนปฏิบัติที่ปรับให้เหมาะสม การจัดการตัวอย่างอย่างระมัดระวัง และการประยุกต์ใช้เทคนิคขั้นสูง ช่วยปรับปรุงคุณภาพและความเชื่อถือได้ของข้อมูลที่ได้จากเนื้อเยื่อ FFPE

เนื้อเยื่อ FFPE กับเนื้อเยื่อแช่แข็งแตกต่างกันอย่างไร?

เนื้อเยื่อ FFPE (เนื้อเยื่อที่ตรึงด้วยฟอร์มาลินและฝังในพาราฟิน) เก็บรักษาโดยใช้ฟอร์มาลินตรึงเนื้อเยื่อแล้วฝังในพาราฟิน ทำให้จัดเก็บระยะยาวที่อุณหภูมิห้องได้ พร้อมทั้งรักษาสัณฐานวิทยาของเนื้อเยื่อไว้ ในทางตรงกันข้าม เนื้อเยื่อแช่แข็งเก็บรักษาอย่างรวดเร็วด้วยการแช่แข็ง ซึ่งรักษาความสมบูรณ์ของกรดนิวคลีอิกและโปรตีนได้ดีกว่า แต่ต้องจัดเก็บที่อุณหภูมิต่ำมาก

ใช้สารเคมีใดในการฝังเนื้อเยื่อ FFPE?

สารเคมีที่ใช้ในการฝังเนื้อเยื่อ FFPE โดยปกติได้แก่ฟอร์มาลินสำหรับการตรึงและพาราฟินสำหรับการฝัง ในการฝังเนื้อเยื่อ FFPE โดยทั่วไปจะตรึงเนื้อเยื่อด้วยฟอร์มาลินบัฟเฟอร์เป็นกลาง 10% (v/v) (FA) หรือสารละลายฟอร์มาลดีไฮด์ 4% (w/v) (PFA) ที่เตรียมใหม่จากผงพาราฟอร์มาลดีไฮด์ ฟอร์มาลินซึ่งเป็นสารละลายฟอร์มาลดีไฮด์ในน้ำจะปรับด้วยบัฟเฟอร์ให้มี pH เป็นกลาง เพื่อรักษาสัณฐานวิทยาของเนื้อเยื่อและป้องกันการเชื่อมขวางมากเกินไป สารละลายที่เตรียมจากพาราฟอร์มาลดีไฮด์ยังให้การตรึงอย่างมีประสิทธิภาพโดยทำให้โปรตีนเกิดการเชื่อมขวาง จึงทำให้โครงสร้างเนื้อเยื่อคงตัวสำหรับการฝังในพาราฟินในขั้นตอนถัดไป สารเคมีเหล่านี้จำเป็นต่อการรักษาความสมบูรณ์และสัณฐานวิทยาของเนื้อเยื่อระหว่างกระบวนการตรึงและการฝัง

กำจัดพาราฟินออกจากตัวอย่าง FFPE อย่างไร?

ในการกำจัดพาราฟินออกจากตัวอย่าง FFPE โดยทั่วไปจะล้างชิ้นเนื้อด้วยไซลีนหลายครั้ง ตามด้วยการคืนสภาพน้ำโดยผ่านแอลกอฮอล์ที่มีความเข้มข้นลดลงตามลำดับ และสุดท้ายคือน้ำ เนื่องจากไซลีนมีความเป็นพิษสูง ก่อให้เกิดความเสี่ยงต่อสุขภาพ เช่น ปัญหาระบบทางเดินหายใจ การระคายเคืองผิวหนัง และผลกระทบระยะยาวที่อาจเกิดขึ้นจากการสัมผัสซ้ำ การกำจัดพาราฟินด้วยคลื่นอัลตราโซนิกจึงกำลังเป็นทางเลือกที่มีศักยภาพในห้องปฏิบัติการหลายแห่ง วิธีนี้ใช้คลื่นอัลตราโซนิกความเข้มสูงเพื่อกำจัดพาราฟินอย่างมีประสิทธิภาพและปลอดภัย โดยไม่ต้องใช้ตัวทำละลายที่เป็นพิษ เช่น ไซลีน จึงช่วยลดความเสี่ยงต่อบุคลากรในห้องปฏิบัติการและสร้างสภาพแวดล้อมการทำงานที่ปลอดภัยยิ่งขึ้น

ควรตรึงเนื้อเยื่อนานเท่าใดเพื่อให้ได้ตัวอย่าง FFPE คุณภาพดี?

คำแนะนำทั่วไปเกี่ยวกับระยะเวลาตรึงมักแนะนำให้ตรึงตัวอย่างเนื้อเยื่อในฟอร์มาลินเป็นเวลา 24 ถึง 48 ชั่วโมง โดยทั่วไป ระยะเวลานี้เพียงพอที่จะรักษาสัณฐานวิทยาของเนื้อเยื่อและโครงสร้างเซลล์ไว้ พร้อมทั้งลดการตรึงมากเกินไป ซึ่งอาจทำให้เกิดการเชื่อมขวางมากเกินไปและการเสื่อมสลายของกรดนิวคลีอิกและโปรตีน อย่างไรก็ตาม ระยะเวลาตรึงที่เหมาะสมที่สุดอาจแตกต่างกันตามขนาดและชนิดของเนื้อเยื่อ โดยตัวอย่างที่เล็กกว่าหรือบอบบางกว่าต้องการระยะเวลาตรึงสั้นกว่า สิ่งสำคัญอย่างยิ่งคือการสร้างสมดุลให้ตรึงได้เพียงพอเพื่อป้องกันการย่อยสลายตัวเองและการเสื่อมสลายของเนื้อเยื่อ พร้อมทั้งหลีกเลี่ยงการตรึงเป็นเวลานานซึ่งอาจทำให้การวิเคราะห์ระดับโมเลกุลในขั้นตอนถัดไปยุ่งยากขึ้น