การเตรียมตัวอย่างปริมาณงานสูง FFPE: การสกัดโปรตีนและการตัดกรดนิวคลีอิก

คำถามที่ถามบ่อย
ด้านล่างนี้เราตอบคําถามที่พบบ่อยซึ่งเกี่ยวข้องกับการเตรียมเนื้อเยื่อ FFPE และอัลตราโซนิกของตัวอย่าง FFPE

เนื้อเยื่อ FFPE เตรียมอย่างไร?

ขั้นตอนในการเตรียมเนื้อเยื่อ FFPE: การจัดการและการแปรรูปเนื้อเยื่อสดอย่างพิถีพิถันมีความสําคัญต่อการสร้างตัวอย่าง FFPE คุณภาพสูง การรับรองการเก็บรักษาสถาปัตยกรรมของเซลล์ กรดนิวคลีอิก และโปรตีนเป็นสิ่งสําคัญสําหรับการวิเคราะห์ปลายน้ําที่แม่นยํา แต่ละขั้นตอนตั้งแต่การเก็บรวบรวมไปจนถึงการฝังต้องใช้ความแม่นยําเพื่อรักษาความสมบูรณ์ของตัวอย่างสําหรับการวิเคราะห์ต่างๆ รวมถึงการตรวจทางเนื้อเยื่อวิทยา อิมมูโนฮิสโตเคมี และการศึกษาระดับโมเลกุล กระบวนการตรึงและการฝังตัวนี้ดําเนินการอย่างถูกต้องช่วยให้มั่นใจได้ว่าเนื้อเยื่อที่เก็บรักษาไว้จะสะท้อนถึงสถานะในร่างกายได้อย่างแม่นยําทําให้สามารถวินิจฉัยและวิจัยได้อย่างน่าเชื่อถือ
เราจะแนะนําคุณตลอด 6 ขั้นตอนหลักของกระบวนการฝังตัวอย่างเนื้อเยื่อ FFPE

• คอลเลกชันทิชชู่
  การตรวจชิ้นเนื้อจากสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีชีวิตและการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเป็นแหล่งข้อมูลที่ใช้งานได้ในการรับเนื้อเยื่อสดสําหรับการเตรียมตัวอย่าง FFPE
  สิ่งสําคัญคือต้องใช้เทคนิคปลอดเชื้อ: ใช้เครื่องมือและถุงมือที่ปลอดเชื้อเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน ตามหลักการแล้ว ควรรวบรวมเนื้อเยื่อในสภาพแวดล้อมที่ปลอดเชื้อ เช่น ห้องผ่าตัดหรือเครื่องดูดควันแบบลามินาร์
  เนื่องจากตัวอย่างมีความเปราะบางมาก การจัดการที่ละเอียดอ่อนจึงเป็นสิ่งสําคัญ: ลดความล่าช้าในการประมวลผลและเริ่มการประมวลผลเนื้อเยื่อทันทีหลังจากการตัดออก นี่เป็นสิ่งสําคัญในการป้องกันการสลายตัวและการเสื่อมสภาพ เก็บเนื้อเยื่อไว้ที่อุณหภูมิห้อง หลีกเลี่ยงการแช่แข็งเพราะอาจทําให้เกิดการก่อตัวของผลึกน้ําแข็งและเนื้อเยื่อเสียหายได้
• การตรึงเนื้อเยื่อ
  ขั้นแรก ให้รักษาเนื้อเยื่อด้วยสารละลายตรึง: ใช้ฟอร์มาลินบัฟเฟอร์ที่เป็นกลาง (NBF) 10% ซึ่งเทียบเท่ากับฟอร์มาลดีไฮด์ 4% ในน้ํา บัฟเฟอร์ที่ค่า pH ที่เป็นกลาง
  จุ่มเนื้อเยื่อลงในฟอร์มาลินให้หมด ตรวจสอบให้แน่ใจว่าอัตราส่วนปริมาตรการตรึงต่อเนื้อเยื่ออย่างน้อย 10:1 โดยทั่วไปเวลาในการตรึงอยู่ในช่วง 6 ถึง 24 ชั่วโมง ขึ้นอยู่กับประเภทและขนาดของเนื้อเยื่อ สิ่งสําคัญคือสารตรึงสามารถแทรกซึมเนื้อเยื่อได้อย่างทั่วถึง อย่างไรก็ตาม การตรึงมากเกินไปอาจนําไปสู่การเชื่อมโยงข้ามที่ทําให้การดึงแอนติเจนซับซ้อน ในขณะที่การตรึงน้อยเกินไปอาจส่งผลให้การเก็บรักษาเนื้อเยื่อไม่ดี
• การตัดแต่งเนื้อเยื่อ
  ประการที่สอง ตัดแต่งเนื้อเยื่อให้มีความหนาประมาณ 3-5 มม. เพื่อให้การตรึงซึมผ่านได้เพียงพอ ตรวจสอบให้แน่ใจว่าการวางแนวเนื้อเยื่อที่เหมาะสมเพื่อจับโครงสร้างเนื้อเยื่อที่เกี่ยวข้อง สิ่งนี้ช่วยอํานวยความสะดวกในกระบวนการสกัดเมื่อใช้เนื้อเยื่อในการวิเคราะห์ในภายหลัง
• การประมวลผลตัวอย่างที่ตรึงไว้
  ตอนนี้เนื้อเยื่อคงที่จะต้องขาดน้ํา: หลังจากการตรึง เนื้อเยื่อจะต้องถูกทําให้แห้งเพื่อให้แน่ใจว่าขี้ผึ้งพาราฟินแทรกซึมอย่างทั่วถึง ส่งเนื้อเยื่อผ่านเอทานอลที่จัดระดับ (70%, 80%, 90% และ 100%) เพื่อเอาน้ําออก
  การล้างด้วยไซลีน: ขี้ผึ้งพาราฟินไม่ละลายในน้ํา แต่ละลายได้ในไซลีน ดังนั้นต้องแทนที่น้ําในเนื้อเยื่อด้วยไซลีน อย่างไรก็ตาม ไซลีนเองไม่ละลายในน้ํา แต่ละลายได้ในแอลกอฮอล์ จําเป็นต้องมีขั้นตอนกลางที่น้ําจะถูกแทนที่ด้วยแอลกอฮอล์ก่อน จุ่มเนื้อเยื่อลงในไซลีนหรือสารทดแทนไซลีนเพื่อขจัดเอทานอลและเตรียมเนื้อเยื่อสําหรับการแทรกซึมของพาราฟิน
  การแทรกซึมโดยใช้พาราฟิน: ฝังเนื้อเยื่อในขี้ผึ้งพาราฟินหลอมเหลวเพื่อให้แน่ใจว่ามีการแทรกซึมอย่างสมบูรณ์ ขั้นตอนนี้มักเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงพาราฟินหลายครั้งเพื่อให้แน่ใจว่ามีการทําให้ชุ่มอย่างทั่วถึง
• การฝังเนื้อเยื่อ
  ในขั้นตอนนี้ เนื้อเยื่อจะถูกปั้นเป็นบล็อกเนื้อเยื่อ: วางเนื้อเยื่อลงในแม่พิมพ์ตามทิศทางที่ต้องการแล้วเทพาราฟินหลอมเหลวลงไป ปล่อยให้พาราฟินแข็งตัวโดยการทําความเย็นที่อุณหภูมิห้องหรือบนจานเย็น
• การแบ่งส่วนและการติดตั้ง
  ไมโครโทมี: ในการหั่นเนื้อเยื่อที่ฝังอยู่ ให้ใช้ไมโครโทมเพื่อตัดส่วนบาง ๆ (โดยทั่วไป 4-5 ไมโครเมตร) จากบล็อกพาราฟิน จากนั้นติดตั้งตัวอย่างโดยวางส่วนบนสไลด์แก้วเพื่อการย้อมสีและการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ในภายหลัง
  สุดท้าย ตรวจสอบคุณภาพของเนื้อเยื่อวิทยา: ประเมินส่วนแรกภายใต้กล้องจุลทรรศน์เพื่อให้แน่ใจว่ามีการตรึงและการประมวลผลที่เหมาะสม ปรับโปรโตคอลตามความจําเป็นตามประเภทของเนื้อเยื่อและคุณภาพที่สังเกตได้

 
เนื้อเยื่อ FFPE สามารถใช้เพื่อกู้คืน RNA, DNA และโปรตีน ตลอดจนค้นหาสัญญาณของมะเร็งหรือโรคอื่นๆ สามารถเก็บไว้ได้นานหลายปี และเป็นส่วนสําคัญของวิธีที่นักวิจัยและแพทย์ใช้ประโยชน์จากตัวอย่างเนื้อเยื่อเพื่อการวินิจฉัยและการวิจัย

ปัญหาและความท้าทายทั่วไปเกี่ยวกับเนื้อเยื่อ FFPE คืออะไร?

ตัวอย่างเนื้อเยื่อ Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) ใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิจัยและการวินิจฉัย แต่มีความท้าทายและปัญหาทั่วไปหลายประการ:

• การย่อยสลายของชีวโมเลกุล: การตรึงเป็นเวลานานอาจนําไปสู่การย่อยสลายของ DNA, RNA และโปรตีน ทําให้ยากต่อการสกัดกรดนิวคลีอิกหรือโปรตีนคุณภาพสูงสําหรับการใช้งานปลายน้ํา การตรึงที่ถูกต้อง (หลีกเลี่ยงการตรึงน้อยเกินไปและมากเกินไป) เป็นสิ่งสําคัญสําหรับการเก็บรักษาเนื้อเยื่อ

การเชื่อมโยงข้าม: การตรึงฟอร์มาลินทําให้เกิดการเชื่อมโยงข้ามของโปรตีนและกรดนิวคลีอิก ซึ่งอาจขัดขวางการวิเคราะห์ระดับโมเลกุลและส่งผลต่อความแม่นยําของอิมมูโนฮิสโตเคมีและการทดสอบอื่นๆ

• การมาสก์แอนติเจน: กระบวนการตรึงสามารถปกปิดตําแหน่งแอนติเจน ลดประสิทธิผลของการจับแอนติบอดีในอิมมูโนฮิสโตเคมีและการทดสอบภูมิคุ้มกันวิทยาอื่นๆ สิ่งนี้มักต้องมีการดึงแอนติเจนซึ่งเป็นขั้นตอนที่การปิดบังของเอพิโทปจะถูกย้อนกลับและการจับแอนติบอดีของเอพิโทปจะได้รับการฟื้นฟู อย่างไรก็ตาม แอนติเจนเต็มรูปแบบอาจไม่ได้รับการฟื้นฟูเสมอไป
• คุณภาพการตรึงตัวแปร: ความแตกต่างของเวลาและเงื่อนไขการตรึงอาจนําไปสู่คุณภาพของตัวอย่างที่ไม่สอดคล้องกัน ซึ่งส่งผลต่อความสามารถในการทําซ้ําและการเปรียบเทียบผลลัพธ์ ใช้โปรโตคอลการตรึงที่เชื่อถือได้และหลีกเลี่ยงการตรึงน้อยเกินไปและมากเกินไป
• ความเสียหายของดีเอ็นเอและการกระจายตัว: การตรึงฟอร์มาลินของตัวอย่าง FFPE อาจทําให้เกิดความเสียหายของ DNA ประเภทต่างๆ รวมถึงการดีอะมิเนชันไซโตซีน (การกลายพันธุ์ของ C เป็น T) ความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน (เช่น 8-oxo-guanine ที่นําไปสู่การกลายพันธุ์ของ G เป็น T) ตลอดจนการหยุดชะงักทางกายภาพ เช่น รอยแยก ช่องว่าง และไซต์พื้นฐานที่ขัดขวางการทํางานของดีเอ็นเอโพลีเมอเรส กระบวนการตรึงฟอร์มาลินอาจทําให้เกิดการแยกส่วนของ DNA ทําให้การวิเคราะห์ทางพันธุกรรมและจีโนมซับซ้อนขึ้น เช่น PCR และการจัดลําดับ
• คุณภาพ RNA: RNA ที่สกัดจากเนื้อเยื่อ FFPE มักจะถูกแยกส่วนและดัดแปลงทางเคมี ทําให้ยากต่อการวิเคราะห์การถอดเสียงคุณภาพสูง
• การดัดแปลงโปรตีน: ฟอร์มาลินสามารถกระตุ้นการดัดแปลงทางเคมีในโปรตีน ซึ่งส่งผลต่อโครงสร้างและการทํางานของโปรตีน ซึ่งอาจรบกวนการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์
• สิ่งประดิษฐ์การประมวลผลตัวอย่าง: ในระหว่างกระบวนการฝังและแบ่งส่วนความเครียดเชิงกลและความร้อนอาจทําให้เกิดสิ่งประดิษฐ์และทําให้เนื้อเยื่อเสียหายเพิ่มเติม
• ความแปรปรวนของแบทช์ต่อแบทช์: ความแปรปรวนในการตรึงและการฝังโปรโตคอลระหว่างแบทช์ต่างๆ อาจนําไปสู่ความแปรปรวนอย่างมีนัยสําคัญในผลลัพธ์ ซึ่งทําให้การเปรียบเทียบระหว่างการศึกษาซับซ้อนขึ้น
• ปัญหาการจัดเก็บ: การจัดเก็บบล็อก FFPE ในระยะยาวอาจนําไปสู่การเสื่อมสภาพเพิ่มเติมและการสูญเสียความสมบูรณ์ของกรดนิวคลีอิกเมื่อเวลาผ่านไป ซึ่งส่งผลต่อความมีชีวิตของตัวอย่างที่เก็บถาวรสําหรับการศึกษาย้อนหลัง

การใช้โปรโตคอลที่ปรับให้เหมาะสมการจัดการตัวอย่างอย่างระมัดระวังและการใช้เทคนิคขั้นสูงช่วยปรับปรุงคุณภาพและความน่าเชื่อถือของข้อมูลที่ได้จากเนื้อเยื่อ FFPE

FFPE และเนื้อเยื่อแช่แข็งต่างกันอย่างไร?

เนื้อเยื่อ FFPE (Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) จะถูกเก็บรักษาโดยใช้ฟอร์มาลินเพื่อยึดเนื้อเยื่อแล้วฝังอยู่ในขี้ผึ้งพาราฟิน ทําให้สามารถเก็บไว้ได้นานที่อุณหภูมิห้องในขณะที่ยังคงสัณฐานวิทยาของเนื้อเยื่อ ในทางตรงกันข้ามเนื้อเยื่อแช่แข็งจะถูกเก็บรักษาไว้อย่างรวดเร็วโดยการแช่แข็งซึ่งรักษาความสมบูรณ์ของกรดนิวคลีอิกและโปรตีนได้ดีกว่า แต่ต้องเก็บไว้ที่อุณหภูมิต่ํามาก

สารเคมีอะไรที่ใช้ในการฝัง FFPE?

สารเคมีที่ใช้สําหรับการฝัง FFPE โดยปกติ ได้แก่ ฟอร์มาลินสําหรับการตรึงและขี้ผึ้งพาราฟินสําหรับการฝัง สําหรับการฝัง FFPE โดยทั่วไปแล้วเนื้อเยื่อจะได้รับการแก้ไขโดยใช้ฟอร์มาลินบัฟเฟอร์ที่เป็นกลาง (FA) 10% (v/v) หรือสารละลายฟอร์มาลดีไฮด์ (PFA) 4% (w/v) ที่เตรียมใหม่ซึ่งทําจากผงพาราฟอร์มาลดีไฮด์ ฟอร์มาลินซึ่งเป็นสารละลายฟอร์มาลดีไฮด์ในน้ําถูกบัฟเฟอร์ให้มีค่า pH เป็นกลางเพื่อรักษาสัณฐานวิทยาของเนื้อเยื่อและป้องกันการเชื่อมขวางมากเกินไป สารละลายที่ใช้พาราฟอร์มาลดีไฮด์ยังให้การตรึงที่มีประสิทธิภาพโดยการเชื่อมขวางโปรตีน ซึ่งจะทําให้โครงสร้างเนื้อเยื่อมีเสถียรภาพสําหรับการฝังในขี้ผึ้งพาราฟินในภายหลัง สารเคมีเหล่านี้จําเป็นต่อการรักษาความสมบูรณ์ของเนื้อเยื่อและสัณฐานวิทยาในระหว่างกระบวนการตรึงและการฝัง

พาราฟินถูกลบออกจากตัวอย่าง FFPE ได้อย่างไร?

ในการขจัดพาราฟินออกจากตัวอย่าง FFPE โดยทั่วไปแล้วส่วนของเนื้อเยื่อจะต้องผ่านการล้างไซลีนหลายชุดตามด้วยการเติมน้ําผ่านชุดแอลกอฮอล์ที่ไล่ระดับและสุดท้ายเป็นน้ํา เนื่องจากไซลีนเป็นพิษสูงจึงก่อให้เกิดความเสี่ยงต่อสุขภาพเช่นปัญหาระบบทางเดินหายใจการระคายเคืองผิวหนังและผลกระทบระยะยาวที่อาจเกิดขึ้นจากการสัมผัสซ้ํา ๆ การกําจัดพาราฟินด้วยอัลตราโซนิกจึงกลายเป็นทางเลือกที่มีแนวโน้มในห้องปฏิบัติการหลายแห่ง วิธีนี้ใช้คลื่นอัลตราโซนิกที่เข้มข้นเพื่อกําจัดพาราฟินอย่างมีประสิทธิภาพและปลอดภัยโดยไม่ต้องใช้ตัวทําละลายที่เป็นพิษเช่นไซลีนซึ่งจะช่วยลดความเสี่ยงต่อบุคลากรในห้องปฏิบัติการและสร้างสภาพแวดล้อมการทํางานที่ปลอดภัยยิ่งขึ้น

ฉันควรตรึงเนื้อเยื่อของฉันนานแค่ไหนเพื่อให้ได้คุณภาพของตัวอย่าง FFPE ที่ดี?

คําแนะนําทั่วไปสําหรับระยะเวลาการตรึงโดยทั่วไปแนะนําให้ตรึงตัวอย่างเนื้อเยื่อในฟอร์มาลินเป็นเวลา 24 ถึง 48 ชั่วโมง โดยทั่วไประยะเวลานี้เพียงพอที่จะรักษาสัณฐานวิทยาของเนื้อเยื่อและโครงสร้างเซลล์ในขณะที่ลดการตรึงมากเกินไป ซึ่งอาจนําไปสู่การเชื่อมขวางและการย่อยสลายของกรดนิวคลีอิกและโปรตีนมากเกินไป อย่างไรก็ตาม เวลาในการตรึงที่เหมาะสมที่สุดอาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับขนาดและประเภทของเนื้อเยื่อ โดยตัวอย่างที่มีขนาดเล็กหรือบอบบางกว่าต้องใช้เวลาในการตรึงที่สั้นลง สิ่งสําคัญคือต้องสร้างสมดุลระหว่างการตรึงที่เพียงพอเพื่อป้องกันการสลายตัวของเนื้อเยื่อและการเสื่อมสภาพโดยอัตโนมัติในขณะที่หลีกเลี่ยงการตรึงเป็นเวลานานซึ่งอาจทําให้การวิเคราะห์โมเลกุลปลายน้ําซับซ้อนขึ้น