อัลตราโซนิกตัดดีเอ็นเอ

• ในระหว่างการตัดดีเอ็นเอและ RNA โมเลกุลดีเอ็นเอจะถูกแบ่งออกเป็นชิ้นเล็ก ๆ การกระจายตัวของ DNA / RNA เป็นหนึ่งในขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างที่สําคัญที่จําเป็นในการสร้างห้องสมุดสําหรับการจัดลําดับรุ่นต่อไป (NGS)
• อัลตราโซนิกดีเอ็นเอตัดใช้กองกำลังของโพรงอากาศอะคูสติกที่จะทำลายดีเอ็นเอหรืออาร์เอ็นเอเป็นชิ้น 100 – bp 5KB
• ตัดอัลตราโซนิกช่วยให้การกระจายตัวของดีเอ็นเอที่แม่นยำและเหมาะสมกับความยาวของดีเอ็นเอที่ต้องการ

ตัดดีเอ็นเอโดยใช้ Ultrasonication

Hielscher Ultrasonics นำเสนอโซลูชั่นการอัลตราซาวนด์ต่างๆสำหรับดีเอ็นเออาร์เอ็นเอและโครมาตัด เลือกระหว่างการสอบสวนชนิด ultrasonicators (เช่น UP100H) สำหรับ sonication โดยตรงโดยใช้ microtip หรือใช้ VialTweeeter หรือ cuphorn ล้ำสำหรับการเตรียมดีเอ็นเอทางอ้อมของตัวอย่างต่าง ๆ ไปพร้อม ๆ กัน Hielscher มีอุปกรณ์ที่เหมาะพิจารณาความต้องการของคุณ: อากาศคุณมี 1 หรือเพิ่มขึ้นถึง 10 ตัวอย่าง, ไดรฟ์จากไมโครลิตรปริมาณลิตร – โปรเซสเซอร์ล้ำเสียง Hielscher พร้อมที่จะตอบสนองความต้องการของคุณเพื่อเตรียมความพร้อมดีเอ็นเออาร์เอ็นเอและโครมาชิ้นส่วนที่มีความยาวที่เหมาะสม การทำสำเนางานง่ายและการควบคุมที่แม่นยำอนุญาตให้มีห้องสมุดที่เชื่อถือได้สำหรับการจัดลำดับรุ่นต่อไป
ในทางตรงกันข้ามกับดีเอ็นเอเอนไซม์ตัดอัลตราโซนิกใช้บริสุทธิ์แรงเฉือนกลโดยไม่ต้องเพิ่มสารเคมีใด ๆ โดยการตั้งค่าที่แม่นยำของพารามิเตอร์กระบวนการตัดล้ำผลิตโมเลกุลดีเอ็นเอน้ำหนักสูง (พลาสมิดดีเอ็นเอและจีโนม)
กรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์สามารถขยายก่อนหรือหลังจากขั้นตอนการกระจายตัวของ
พารามิเตอร์ sonication (อำนาจวงจรพัลส์ / ระเบิด, เวลาและอุณหภูมิ) สามารถควบคุมได้อย่างปลอดภัยผ่านการตั้งค่าซอฟต์แวร์

โปรโตคอลสำหรับการอัลตราโซนิกตัดดีเอ็นเอ

สำหรับ Chromatin immunoprecipitation Assay

สั้นๆเซลล์ได้รับการชุบในอาหารขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง60มม. (๔๐๐,๐๐๐ต่อจาน) และการส่งผ่านกับ RhoA siRNA (ตามที่อธิบายไว้); หลังจาก๗๒ h พวกเขาถูก incubated กับฟอร์ลดีไฮด์ (ความเข้มข้นสุดท้าย 1%) สำหรับ10นาทีที่37° c ไปยังโปรตีนข้ามการเชื่อมโยงไปยัง DNA ปฏิกิริยาข้ามการเชื่อมโยงถูกดับด้วยนอกเหนือจากปริมาณหนึ่งในสิบของ๑.๒๕ mol/L glycine, ให้๑๒๕ mmol/L ความเข้มข้นสุดท้าย. เซลล์ได้รับการล้างสองครั้งด้วย PBS น้ำแข็ง, resuspended ในบัฟเฟอร์การทดสอบ radioimmunoprecipitation [๑๕๐ mmol/L NaCl, 1% NP40, ๐.๕% deoxycholate, ๐.๑% SDS, 5 mmol/L EDTA, ๕๐ mmol/L Tris-HCl (pH ๘.๐)] ที่ประกอบด้วย 1 mmol/L phenylmethylsulfonyl, 1 Ag/mL aprotinin, และ 1 Ag/mL pepstatin A, และเก็บไว้บนน้ำแข็ง30นาที. จากนั้น lysates เซลล์ถูกน้ำแข็งด้วย Hielscher UP200S อัลตราซาวนด์คลื่นเสียง (3 x 40 s กว้าง 40% รอบ 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) จนกระทั่ง chromatins cross-linked ถูกตัดให้ผลผลิตดีเอ็นเอระหว่าง 200 และ 1,000 bp หนึ่งในสิบของ lysate ทั้งหมดถูกนำมาใช้เพื่อ quantitate ปริมาณของปัจจุบันดีเอ็นเอในตัวอย่างที่แตกต่างกันและถือว่าเป็น “ดีเอ็นเอเข้าทั้งหมด”. supernatants ถูกบ่มกับดีเอ็นเอของปลาแซลมอนสเปิร์ม / โปรตีน agarose-50% สารละลายเพื่อลดพื้นหลังที่ไม่เฉพาะเจาะจง immunoprecipitation ได้ทำแล้วค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียส 5 Ag ของการต่อต้าน NF-NB P65 (เหนือ) หรือไม่มีแอนติบอดี (ควบคุมลบ) supernatants เหล่านี้ถูกเสริมด้วย 5 mol / L โซเดียมคลอไรด์และให้ความร้อนในชั่วข้ามคืนที่ 65 ° C เพื่อกลับโปรตีนดีเอ็นเอข้ามการเชื่อมโยง immunocomplexes ได้รับการรักษาต่อไปด้วย DNase- และโปร RNase ฟรี K และดีเอ็นเอบริสุทธิ์โดยฟีนอล / สกัดคลอโรฟอร์มและฝนเอทานอล PCR ทำด้วยไพรเมอร์เฉพาะที่สอดคล้องกับลำดับภายในภูมิภาคโปรโมเตอร์ของยีน iNOS มนุษย์ (p1 ไพรเมอร์: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 ไพรเมอร์: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶) (Doublier et al., 2008)

การศึกษา EGFP แสดงออก

สำหรับการศึกษาการแสดงออกของ recombinant p10 ความเครียดลิตร tarentolae :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (เจ Bioscience, เยอรมนี) กับยีนสำหรับ EGFP (Enhanced สีเขียวเรืองแสงโปรตีน) โครโมโซมซุแบบบูรณาการได้รับการปลูกฝังในสื่อต่าง ๆ ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้และ เสริมนอกจากนี้ยังมี 100 มิลลิกรัมต่อลิตร^-1 Nourseothricin (เจ Bioscience, เยอรมนี) ในช่วงการเพาะปลูก 1 มิลลิลิตรตัวอย่างถูกนำหมุนเหวี่ยง (2000 ×กรัม 20 ° C, 10 นาที) และล้างด้วย 0.9% วิธีการแก้ปัญหาโซเดียมคลอไรด์ เม็ดถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ (20 มิลลิเมตร HEPES 5 มิลลิ EDTA, 2 มิลลิ DTT) และชำรุดทรุดโทรมโดย sonification กับหน่วยประมวลผลอัลตราโซนิก UP400S (การประยุกต์ใช้พลังงาน ~ 400 Ws) เศษซากมือถือถูกถอดออกโดยการหมุนเหวี่ยง (6000 ×กรัม 4 ° C, 5 นาที) และวิเคราะห์โดยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต - polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) ภายใต้เงื่อนไขการลดการตามวิธีการของ Laemmli นี้ (1970) 12.5% ​​เจล polyacralamide . EGFP แสดงออกถูกตรวจสอบในวัฒนธรรมรัญจวน (Fritsche et al. 2007)

immunoprecipitation โครมาติ

การทดสอบโครมาติ immunoprecipitation ถูกดำเนินการโดยใช้ชิป-IT^Tm เอ็กซ์เพรส (Motif ที่ใช้งาน, Carlsbad, CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตมีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง สั้น ๆ , podocytes มนุษย์ที่แตกต่างก็เชื่อมโยงกับ 1% ไฮด์เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ที่ถูกล้างด้วยเย็นพีบีเอสและปฏิกิริยาการตรึงก็หยุดโดยการเพิ่ม 0.125 M glycine เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ที่ถูกล้างอีกครั้งกับเย็นพีบีเอสและคัดลอกมาจากจาน เซลล์ที่ถูกเม็ดโดยการหมุนเหวี่ยงและ resuspended ในบัฟเฟอร์สลาย หลังจากการหมุนเหวี่ยงนิวเคลียสเม็ดถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ตัดบ่มบนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 นาทีและโครมาติที่ถูกตัดโดย sonication เช่น UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, เยอรมนี) ที่25% พลังงาน5พัลส์ของ20วินาทีแต่ละในน้ำแข็งเป็นชิ้นส่วนของประมาณ200– 600 bp. โครเมียมถูกหมุนแล้วปั่นและมีการเก็บรวบรวมซุปเปอร์ สำหรับ immunoprecipitations, ๖๐μ l ของโครเมียมถูก incubated กับ1μ g ของ Sp1 (ซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพ, ซานตาครูซ, CA, สหรัฐอเมริกา), NF-E κB (Abcam, เคมบริดจ์, สหราชอาณาจักร) หรือ NF-E (Abcam) แอนติบอดีหรือกับกระต่าย IgG (ห้องปฏิบัติการ Zymed, เซาท์ซานฟรานซิสโก, CA, สหรัฐอเมริกา), การควบคุมที่เป็นลบค้างคืนที่4° c ด้วยการหมุนอย่างอ่อนโยน ภูมิคุ้มกันที่ถูกผูกไว้กับลูกปัดแม่เหล็กถูกเก็บรวบรวมโดยใช้ขาตั้งแม่เหล็ก, ล้างอย่างกว้างขวาง, และโปรตีน/ดีเอ็นเอลิงค์ไขว้ถูกย้อนกลับและ dna ชะสำหรับการวิเคราะห์ PCR เรียลไทม์. (Ristola et al. ๒๐๐๙)

การเตรียมดีเอ็นเอ EHEC สำหรับการวิเคราะห์ชิปอาร์เรย์

การจัด lysates เซลล์และดีเอ็นเอที่สกัด
เม็ดแบคทีเรียที่ลอยอยู่ในพีบีเอสกับความเข้มข้นสุดท้ายที่ต้องการได้รับการรักษาด้วย อัลตราซาวนด์ disruptor UP100H (Hielscher GmbH, เยอรมนี) พร้อมกับ microtip MS1 (เส้นผ่าศูนย์กลาง1มม.) ความถี่ในการทำงานคือ 30 kHz และกำลังขับที่มีประสิทธิภาพ๑๐๐ W ในระหว่างการดำเนินการตัวอย่างถูกระบายความร้อนในอ่างน้ำแข็งผสมและปั่น ตัวอย่างที่ถูกนำมาใช้สำหรับการศึกษาการไหลเวียนของ cytometry ในขณะที่การจัดการในภายหลังตัวอย่างถูกใช้ในการรักษาความร้อน (95 ° c, 5 นาที) Lysates เซลล์หยาบถูกประมวลผลด้วยส่วนผสมของฟีนอล: คลอโรฟอร์ม: เครื่องดื่มแอลกอฮอล์ isoamyl (25:24:1). ปริมาณที่เท่ากันของการผสมนี้ถูกเพิ่มเข้าไปในตัวอย่าง lysate, วิธีการแก้ปัญหาถูก vortexed ที่จริงจังสำหรับ 15 s และหมุนเหวี่ยงที่๑๕,๐๐๐ x g สำหรับ2นาทีที่อุณหภูมิห้อง (RT) รอบ22° c. เฟสน้ำด้านบนที่ประกอบด้วยดีเอ็นเอ genomic ถูกแยกออกอย่างระมัดระวังและเก็บรวบรวมในท่อ Eppendorf เชื้อใหม่
ต่อมาตัวอย่างถูก sonicated จะแยกชิ้นส่วนดีเอ็นเอ ขั้นตอน sonication ได้รับการตระหนักในเงื่อนไขเดียวกันตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ในการประเมินผลกระทบของการกระจายตัวของดีเอ็นเอ genomic ตัวอย่างถูกวิเคราะห์โดยใช้เจ electrophoresis
(…) ตัวอย่าง sonicated ใช้ก่อนหน้านี้สำหรับ๒.๕นาทีถูกนำไปสู่ขั้นตอนการสกัดหลังจากการรักษาความร้อนและการหมุนเหวี่ยง ดีเอ็นเอที่ปล่อยออกมาสองครั้งด้วยฟีนอล: คลอโรฟอร์ม: ผสมแอลกอฮอล์ isoamyl, และหลังจากนั้นอยู่ภายใต้ sonication ที่สองสำหรับ0–15นาที. Agarose เจลที่ถูกใช้ในการกำหนดขนาดการกระจายของ DNA ภายใต้การสกัดหลัง การกระจายตัวของอัลตราโซนิก (รูป ที่ด้านขวาบน) ดีเอ็นเอที่ถูกแยกส่วนสูงได้รับการเห็นชัดเจนจากการปรากฏตัวของดีเอ็นเอที่มีความสำคัญมากกว่าคลื่นน้ำหนักโมเลกุลที่ถูกตัดออกจากตัวอย่าง sonicated นาทีหรือนานกว่านั้น. Sonication อีกต่อไปค่อยๆลดความยาวแฟรกเมนต์ประมาณ๑๕๐–๖๐๐ bp, และ sonication สำหรับ15นาทีต่อไปย่อยสลายชิ้นส่วนเหล่านี้, ตามที่สามารถมองเห็นส่วนใหญ่โดยด้านบนของรอยป้าย. ดังนั้นขนาดชิ้นส่วนดีเอ็นเอเฉลี่ยจะค่อยๆลดลงด้วยเวลา ultrasonication และการรักษา5นาทีได้รับอนุญาตให้มีขนาดของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการ assays ชิป ในที่สุด, ขั้นตอนการเตรียมการวิเคราะห์ DNA ประกอบด้วยครั้งแรก2นาทีของการรักษาล้ำ, การสกัดดีเอ็นเอ (2 ×), และต่อมา5นาที sonication, ได้ก่อตั้งขึ้น. (Basselet et al. ๒๐๐๘)

โครมาติ immunoprecipitation (ชิป)

เซลล์ HEK293 ได้รับการเพาะเลี้ยงตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและคงที่ด้วย 2 mM disuccinimidyl-glutarate สำหรับ๔๕นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากนั้นเซลล์ถูกล้างด้วย PBS สองครั้ง โครเมียมมีการเชื่อมโยงข้ามสำหรับ10นาทีที่อุณหภูมิห้องโดยใช้ 1% (v/v) ฟอร์มาลดีไฮด์และล้างสองครั้งด้วย PBS น้ำแข็งเย็น. ปฏิกิริยาข้ามการเชื่อมโยงถูกหยุดโดยการบ่มด้วย glycine ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ๐.๑๒๕ M สำหรับ5นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากการบ่มด้วยความผิดบาป, เซลล์ถูกขูดออกจากวัฒนธรรมของเซลล์และล้างสองครั้งด้วย PBS. เม็ดเซลล์ถูก resuspended ในบัฟเฟอร์สลาย (5 มม. ท่อ, pH ๘.๐, ๘๕ mM KCl, และ๐.๕% (v/v) Nonidet P-๔๐), incubated บนน้ำแข็งเป็นเวลา10นาที, และการผสมยางกับเครื่องผสมยาง Dounce. ต่อจากนั้นนิวเคลียส pelleted โดยการหมุนเหวี่ยง (๓๕๐๐ x g, 5 นาที, 4 ° c) และ resuspended ในบัฟเฟอร์นิวเคลียส (๕๐ mM Tris-HCl, pH ๘.๑, 10 mM EDTA และ 1% (w/v) SDS) นิวเคลียสถูกหยุดชะงักโดย sonication ๓๒๐-s พัลส์ใน UP50H คลื่นเสียง (Hielscher Ultraschall Technologie) ในการตั้งค่าของวงจร 0.5 และความกว้าง 30% ยอมจีโนมดีเอ็นเอที่มีขนาดใหญ่ของ 200-1000 bp สำหรับชิป 50g ดีเอ็นเอถูกเจือจาง 4 เท่าในบัฟเฟอร์ immunoprecipitation (16.7 มิลลิ Tris-HCl พีเอช 8.1, 167 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 1.2 มิลลิ EDTA 1.1% (v / v) Triton X-100 และ 0.01% (w / โวลต์) SDS) (Weiske et al. 2006)

การวิเคราะห์การปรับเปลี่ยนสโตนโดยโครมาติ immunoprecipitation (ชิป)

สั้น ๆ , 6 x 10⁶ เซลล์ถูกล้างครั้งที่สองกับพีบีเอสและ cross-linked บนจานเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องในการปรากฏตัว 0.5% ฟอร์มาลดีไฮด์ ปฏิกิริยาการเชื่อมโยงข้ามก็หยุดโดยการเพิ่ม 0.125 M glycine ขั้นตอนต่อมาทั้งหมดถูกดำเนินการที่ 48 ° C บัฟเฟอร์ทุกคนก่อนการแช่เย็นและมีน้ำย่อย (สินค้าขนาดเล็ก, Roche) เซลล์ที่ถูกล้างครั้งที่สองกับพีบีเอสและจากนั้นคัดลอก เม็ดรวบรวมถูกกลืนหายไปใน 1 มิลลิลิตรบัฟเฟอร์สลาย (1% SDS 5 มิลลิ EDTA, 50 mM Tris ค่า pH 8) และได้รับการ sonicated ในห้องอาบน้ำเย็นเอทานอล 10 รอบที่ 100% กว้างใช้ UP50H คลื่นเสียง (Hielscher, Teltow, เยอรมนี) การกระจายตัวของโครมาติได้รับการมองเห็นในเจล agarose 1% ชิ้นส่วนที่ได้รับอยู่ในช่วง 200-500pb โครมาละลายน้ำได้มาจากการเหวี่ยงตัวอย่าง sonicated ที่ 14,000g เป็นเวลา 10 นาทีที่ 48 ° C ส่วนที่ละลายน้ำได้ถูกเจือจาง 1/10 ในบัฟเฟอร์เจือจาง (1% Triton X-100, 2 มิลลิ EDTA, 20 มิลลิเมตร Tris ค่า pH 8, 150 มิลลิเมตรโซเดียมคลอไรด์) แล้ว aliquoted และเก็บไว้ที่ 80 องศาเซลเซียสจนการใช้งาน (Rodriguez et al. 2008)