การตัด DNA อัลตราโซนิก

ในระหว่างการตัด DNA และ RNA โมเลกุลของ DNA ที่ยาวจะถูกแยกส่วนออกเป็นชิ้นเล็กๆ ซึ่งเป็นขั้นตอนสําคัญในการเตรียมตัวอย่างสําหรับการสร้างห้องสมุดการจัดลําดับรุ่นต่อไป (NGS) การตัดดีเอ็นเออัลตราโซนิกใช้แรงโพรงอากาศอะคูสติกเพื่อแบ่ง DNA หรือ RNA ออกเป็นชิ้นเล็กชิ้นน้อยตั้งแต่ 100 bp ถึง 5 kb วิธีนี้ช่วยให้สามารถควบคุมขนาดชิ้นส่วนได้อย่างแม่นยํา อํานวยความสะดวกในการปรับแต่งความยาว DNA ที่ต้องการเพื่อผลลัพธ์การจัดลําดับที่เหมาะสมที่สุด

การตัด DNA โดยใช้อัลตราโซนิก

Hielscher Ultrasonics นําเสนอโซลูชั่นอัลตราซาวนด์ที่หลากหลายสําหรับการตัด DNA, RNA และโครมาติน เลือกระหว่างเครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบ (เช่น UP100H) สําหรับการ sonication โดยตรงโดยใช้ไมโครทิป หรือใช้ VialTweeeter หรือ cuphorn อัลตราโซนิกสําหรับการเตรียม DNA ทางอ้อมของตัวอย่างต่างๆ พร้อมกัน Hielscher นําเสนออุปกรณ์ในอุดมคติโดยคํานึงถึงความต้องการของคุณ: ไม่ว่าคุณจะมีตัวอย่าง 1 หรือสูงสุด 10 ตัวอย่างปริมาตรตั้งแต่ปริมาตรไมโครลิตรถึงลิตร – เครื่องสะท้อนเสียง Hielscher จะตอบสนองความต้องการของคุณในการเตรียม DNA, RNA และชิ้นส่วนโครมาตินที่มีความยาวที่เหมาะสม ความสามารถในการทําซ้ํา ใช้งานง่าย และการควบคุมที่แม่นยําช่วยให้มีไลบรารีที่เชื่อถือได้สําหรับการจัดลําดับรุ่นต่อไป
ในทางตรงกันข้ามกับการกระจายตัวของเอ็นไซม์ DNA การตัดอัลตราโซนิกใช้แรงเฉือนเชิงกลบริสุทธิ์โดยไม่ต้องเติมสารเคมีใด ๆ โดยการตั้งค่าพารามิเตอร์กระบวนการที่แม่นยําการตัดอัลตราโซนิกจะสร้างชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีน้ําหนักโมเลกุลสูง (พลาสมิดและจีโนมดีเอ็นเอ)
กรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์สามารถขยายได้ก่อนหรือหลังขั้นตอนการกระจายตัว
พารามิเตอร์ Sonication (กําลัง, รอบพัลส์ / ระเบิด, เวลาและอุณหภูมิ) สามารถควบคุมได้อย่างปลอดภัยผ่านการตั้งค่าซอฟต์แวร์

โปรโตคอลสําหรับการตัด DNA แบบอัลตราโซนิก

สําหรับการทดสอบการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันโครมาติน

โดยสังเขปเซลล์ถูกชุบในจานขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 60 มม. (400,000 ต่อจาน) และถ่ายด้วย RhoA siRNA (ตามที่อธิบายไว้) หลังจากผ่านไป 72 ชั่วโมง พวกมันถูกบ่มด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ (ความเข้มข้นสุดท้าย 1%) เป็นเวลา 10 นาทีที่ 37°C เพื่อเชื่อมขวางโปรตีนกับ DNA ปฏิกิริยาเชื่อมขวางถูกดับโดยการเติมปริมาตรหนึ่งในสิบของ 1.25 โมล/ลิตรไกลซีน ให้ความเข้มข้นสุดท้าย 125 มิลลิโมล/ลิตร เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS เย็นจัด แขวนลอยในบัฟเฟอร์การทดสอบการตกตะกอนด้วยรังสีภูมิคุ้มกัน [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)] ที่มี 1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 Ag/mL aprotinin และ 1 Ag/mL pepstatin A และเก็บไว้บนน้ําแข็งเป็นเวลา 30 นาที จากนั้นเซลล์ไลเสทจะถูก sonicated บนน้ําแข็งด้วย ฮิลสเชอร์ UP200S เครื่องอัลตราซาวนด์ (3 x 40 วินาที, แอมพลิจูด 40%, รอบที่ 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) จนกระทั่งโครมาตินแบบเชื่อมขวางถูกตัดเพื่อให้ได้ชิ้นส่วนดีเอ็นเอระหว่าง 200 ถึง 1,000 bp หนึ่งในสิบของไลเสททั้งหมดถูกใช้เพื่อหาปริมาณ DNA ที่มีอยู่ในตัวอย่างต่างๆ และถือว่าเป็น “DNA อินพุตทั้งหมด”. สารน้ําชั้นสูงถูกบ่มด้วยสารละลาย DNA / โปรตีนอะกาโรส - 50% ของสเปิร์มปลาแซลมอนเพื่อลดพื้นหลังที่ไม่จําเพาะ จากนั้นการทําภูมิคุ้มกันตกตะกอนข้ามคืนที่ 4°C โดยมี 5 Ag ของแอนตี้ NF-nB p65 (Upstate) หรือไม่มีแอนติบอดี (การควบคุมเชิงลบ) สารน้ําเหนือเหล่านี้เสริมด้วย NaCl 5 mol/L และอุ่นค้างคืนที่ 65°C เพื่อเปลี่ยนการเชื่อมขวางโปรตีน-DNA ภูมิคุ้มกันคอมเพล็กซ์ได้รับการบําบัดเพิ่มเติมด้วยโปรตีเนส K ที่ปราศจาก DNase และ RNase และ DNA ถูกทําให้บริสุทธิ์โดยการสกัดฟีนอล/คลอโรฟอร์มและการตกตะกอนเอทานอล PCR ทําด้วยไพรเมอร์เฉพาะที่สอดคล้องกับลําดับภายในบริเวณโปรโมเตอร์ของยีน iNOS ของมนุษย์ (ไพรเมอร์ p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; ไพรเมอร์ p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶) (Doublier et al., 2008)

การศึกษาการแสดงออกของ EGFP

สําหรับการศึกษาการแสดงออก สายพันธุ์รีคอมบิแนนท์ L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Germany) กับยีนสําหรับ EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) โครโมโซม ssu แบบบูรณาการ ได้รับการปลูกฝังในสื่อต่างๆ ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้และเสริมด้วย 100 มก. l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, เยอรมนี) ในระหว่างการเพาะปลูก เก็บตัวอย่าง 1 มล. หมุนเหวี่ยง (2000 × g, 20°C, 10 นาที) และล้างด้วยสารละลาย NaCl 0.9% เม็ดถูกระงับในบัฟเฟอร์ (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) และสลายตัวโดยการ sonification ด้วยโปรเซสเซอร์อัลตราโซนิก ยูพี 400 เอส (การใช้พลังงาน ∼ 400 Ws) เศษเซลล์ถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยง (6000 × g, 4°C, 5 นาที) และวิเคราะห์โดยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต – โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส (SDS-PAGE) ภายใต้สภาวะการลดตามวิธีการของ Laemmli (1970) ด้วยเจลโพลีอะคราไมด์ 12.5% ตรวจสอบการแสดงออกของ EGFP ในวัฒนธรรมที่กวนปั่นป่วน (Fritsche et al. 2007)

การตกตะกอนของภูมิคุ้มกันโครมาติน

การทดสอบการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันโครมาตินดําเนินการโดยใช้ ChIP-IT^{ทีเอ็ม} Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) ตามคําแนะนําของผู้ผลิตพร้อมการปรับเปลี่ยนบางอย่าง โดยสังเขป podocytes ของมนุษย์ที่แตกต่างได้ถูกเชื่อมขวางกับฟอร์มาลดีไฮด์ 1% เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ถูกล้างด้วย PBS เย็นจัดและหยุดปฏิกิริยาการตรึงโดยการเติมไกลซีน 0.125 M เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ถูกล้างอีกครั้งด้วย PBS เย็นจัดและขูดออกจากจาน เซลล์ถูกอัดเม็ดโดยการหมุนเหวี่ยงและแขวนลอยในบัฟเฟอร์การสลายตัว หลังจากการหมุนเหวี่ยงนิวเคลียสเม็ดจะถูกแขวนลอยในบัฟเฟอร์การตัดบ่มบนน้ําแข็งเป็นเวลา 30 นาทีและโครมาตินถูกตัดโดยการ sonication เช่น UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, เยอรมนี) ที่กําลัง 25% 5 พัลส์แต่ละพัลส์ 20 วินาทีบนน้ําแข็งเป็นชิ้นส่วนประมาณ 200–600 bp โครมาตินที่ตัดแล้วจะถูกหมุนเหวี่ยงและรวบรวมสารเหนือน้ํา สําหรับการตกตะกอนของภูมิคุ้มกัน โครมาติน 60 ไมโครลิตรถูกบ่มด้วย Sp1 1 ไมโครกรัม (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) หรือ NF-κB p50 (Abcam) แอนติบอดีหรือกับ IgG ของกระต่าย (Zymed Laboratories) เป็นตัวควบคุมเชิงลบ ค้างคืนที่ 4°C ด้วยการหมุนเบา ๆ อิมมูโนคอมเพล็กซ์ที่ผูกกับลูกปัดแม่เหล็กถูกรวบรวมโดยใช้ขาตั้งแม่เหล็กล้างอย่างกว้างขวางและย้อนกลับการเชื่อมขวางโปรตีน/ดีเอ็นเอและชะดีเอ็นเอสําหรับการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ (Ristola et al. 2009)

การเตรียม EHEC DNA สําหรับการวิเคราะห์อาร์เรย์ชิป

การจัดเรียงไลเสทของเซลล์และดีเอ็นเอที่สกัดออกมา
เม็ดแบคทีเรียที่แขวนลอยอยู่ใน PBS จนถึงความเข้มข้นสุดท้ายที่ต้องการได้รับการบําบัดด้วย เครื่องรบกวนอัลตราซาวนด์ UP100H (Hielscher GmbH, เยอรมนี) ติดตั้งไมโครทิป MS1 (เส้นผ่านศูนย์กลาง 1 มม.) ความถี่ในการทํางานคือ 30 kHz และกําลังขับที่มีประสิทธิภาพคือ 100 W ในระหว่างการผ่าตัดตัวอย่างจะถูกทําให้เย็นลงในอ่างน้ําแข็งผสมและหมุนเหวี่ยง ตัวอย่างถูกใช้สําหรับการศึกษาโฟลว์ไซโตเมทรี ในขณะที่สําหรับการจัดการในภายหลัง ตัวอย่างจะถูกอบชุบด้วยความร้อน (95°C, 5 นาที) ไลเสทเซลล์ดิบถูกแปรรูปด้วยส่วนผสมของฟีนอล:คลอโรฟอร์ม:ไอโซอะมิลแอลกอฮอล์ (25:24:1) สารละลายถูกหมุนวนอย่างแรงเป็นเวลา 15 วินาที และหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 x g เป็นเวลา 2 นาทีที่อุณหภูมิห้อง (RT) ประมาณ 22°C เฟสน้ําด้านบนที่มีดีเอ็นเอจีโนมถูกแยกอย่างระมัดระวังและรวบรวมในหลอด Eppendorf ที่ปลอดเชื้อใหม่
ต่อจากนั้นตัวอย่างถูก sonicized เพื่อแยกส่วน DNA ขั้นตอนการ sonication เกิดขึ้นในสภาวะเดียวกับที่อธิบายไว้ข้างต้น ในการประเมินผลกระทบการกระจายตัวต่อจีโนม DNA ตัวอย่างได้รับการวิเคราะห์โดยใช้อิเล็กโทรโฟรีซิสเจลอะกาโรส
(…) ตัวอย่างที่โซนิคก่อนหน้านี้เป็นเวลา 2.5 นาทีต้องผ่านขั้นตอนการสกัดหลังจากการอบชุบด้วยความร้อนและการหมุนเหวี่ยง ดีเอ็นเอที่ปล่อยออกมาถูกสกัดสองครั้งด้วยส่วนผสมของฟีนอล: คลอโรฟอร์ม: ไอโซอะมิลแอลกอฮอล์ และหลังจากนั้นก็ผ่านการ sonication ครั้งที่สองเป็นเวลา 0 - 15 นาที อิเล็กโทรโฟรีซิสเจลอะกาโรสถูกนํามาใช้เพื่อกําหนดการกระจายขนาดของดีเอ็นเอที่อยู่ภายใต้การกระจายตัวของอัลตราโซนิกหลังการสกัด (รูปที่ ที่ด้านขวาบน) ดีเอ็นเอที่กระจัดกระจายสูงนั้นเห็นได้ชัดจากการมีรอยเปื้อนดีเอ็นเอแทนที่จะเป็นแถบน้ําหนักโมเลกุลสูงที่ถูกกําจัดออกจากตัวอย่างที่โซนิกเป็นเวลา 2.5 นาทีหรือนานกว่านั้น การ sonication ที่ยาวนานขึ้นค่อยๆ ลดความยาวของชิ้นส่วนลงเหลือประมาณ 150 - 600 bp และ sonication เป็นเวลา 15 นาทีทําให้ชิ้นส่วนเหล่านี้เสื่อมโทรมลงไปอีกดังที่ส่วนใหญ่จะเห็นได้จากส่วนบนของรอยเปื้อน ดังนั้นขนาดชิ้นส่วน DNA เฉลี่ยจึงค่อยๆลดลงตามเวลาอัลตราโซนิกและการรักษา 5 นาทีทําให้ได้ขนาดของชิ้นส่วน DNA ที่เหมาะสมที่สุดสําหรับการทดสอบชิปอาร์เรย์ ในที่สุดขั้นตอนการเตรียมสารวิเคราะห์ดีเอ็นเอซึ่งประกอบด้วยการรักษาด้วยอัลตราโซนิก 2 นาทีแรกการสกัดดีเอ็นเอ (2×) และการ sonication 5 นาทีต่อมาก็ถูกสร้างขึ้น (Basselet et al. 2008)

การตกตะกอนของอิมมูโนโครมาติน (ChIP)

เซลล์ HEK293 ได้รับการเพาะเลี้ยงตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและยึดด้วย 2 mM disuccinimidyl-glutarate เป็นเวลา 45 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ต่อจากนั้นเซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS โครมาตินถูกเชื่อมขวางเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องโดยใช้ฟอร์มาลดีไฮด์ 1% (v/v) และล้างสองครั้งด้วย PBS เย็น ปฏิกิริยาเชื่อมขวางหยุดโดยการฟักตัวกับไกลซีนที่ความเข้มข้นสุดท้าย 0.125 ม. เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากฟักตัวด้วยทริปซินเซลล์จะถูกขูดออกจากจานเพาะเลี้ยงเซลล์และล้างสองครั้งด้วย PBS เม็ดเซลล์ถูกแขวนลอยอีกครั้งในบัฟเฟอร์การสลาย (5 mM Pipes, pH 8.0, 85 mM KCl และ 0.5% (v/v) Nonidet P-40) บ่มบนน้ําแข็งเป็นเวลา 10 นาที และทําให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วย Dounce homogenizer ต่อจากนั้นนิวเคลียสถูกอัดโดยการหมุนเหวี่ยง (3500 x g, 5 นาที, 4 °C) และแขวนลอยในบัฟเฟอร์นิวเคลียส (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA และ 1% (w/v) SDS) นิวเคลียสถูกขัดขวางโดย sonication ด้วยพัลส์ 20 วินาทีสามครั้งใน a เครื่องสะท้อนเสียง UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) ที่การตั้งค่าของรอบ 0.5 และแอมพลิจูด 30% ให้ชิ้นส่วน DNA ของจีโนมที่มีขนาดจํานวนมาก 200 – 1000 bp สําหรับ ChIP DNA 50 กรัมถูกเจือจาง 4 เท่าในบัฟเฟอร์การตกตะกอนของภูมิคุ้มกัน (16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1.1% (v/v) Triton X-100 และ 0.01% (w/v) SDS) (Weiske et al. 2006)

การวิเคราะห์การดัดแปลงฮิสโตนโดยการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันโครมาติน (ChIP)

สั้น ๆ 6 x 10⁶ เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS และเชื่อมขวางบนแผ่นเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องในที่ที่มีฟอร์มาลดีไฮด์ 0.5% ปฏิกิริยาการเชื่อมขวางหยุดลงโดยการเพิ่มไกลซีน 0.125 M ขั้นตอนที่ตามมาทั้งหมดดําเนินการที่อุณหภูมิ 48 องศาเซลเซียส บัฟเฟอร์ทั้งหมดถูกแช่เย็นล่วงหน้าและมีสารยับยั้งโปรตีเอส (Complete Mini, Roche) เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS แล้วขูด เม็ดที่เก็บได้ถูกละลายในบัฟเฟอร์การสลาย 1 มล. (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) และถูก sonicated ในอ่างเอทานอลเย็นเป็นเวลา 10 รอบที่แอมพลิจูด 100% โดยใช้ เครื่องสะท้อนเสียง UP50H (Hielscher, Teltow, เยอรมนี) การกระจายตัวของโครมาตินแสดงให้เห็นในเจลอะกาโรส 1% ชิ้นส่วนที่ได้รับอยู่ในช่วง 200–500pb โครมาตินที่ละลายน้ําได้มาจากการหมุนเหวี่ยงตัวอย่างที่โซนิคที่ 14,000 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่ 48 °C เศษส่วนที่ละลายน้ําได้ถูกเจือจาง 1/10 ในบัฟเฟอร์เจือจาง (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) จากนั้นแยกและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 80°C จนกว่าจะใช้งาน (Rodriguez et al. 2008)