การตัดเฉือน DNA ด้วยอัลตราซาวนด์

ในการตัดเฉือน DNA และ RNA โมเลกุล DNA ที่ยาวจะถูกทำให้แตกเป็นชิ้นส่วนเล็กลง ซึ่งเป็นขั้นตอนสำคัญในการเตรียมตัวอย่างสำหรับการสร้างไลบรารีเพื่อการหาลำดับเบสยุคใหม่ (NGS) การตัดเฉือน DNA ด้วยอัลตราซาวนด์ใช้แรงจากคาวิเทชันเชิงเสียงเพื่อทำให้ DNA หรือ RNA แตกเป็นชิ้นส่วนที่มีขนาดตั้งแต่ 100 bp ถึง 5 kb วิธีนี้ช่วยให้ควบคุมขนาดชิ้นส่วนได้อย่างแม่นยำ ทำให้ปรับความยาว DNA ตามที่ต้องการได้เพื่อให้ได้ผลการหาลำดับเบสที่เหมาะสมที่สุด

การตัดเฉือน DNA โดยใช้การให้อัลตราซาวนด์

Hielscher Ultrasonics นำเสนอโซลูชันที่ใช้อัลตราซาวนด์หลากหลายรูปแบบสำหรับการตัดเฉือน DNA, RNA และโครมาติน เลือกใช้เครื่องอัลตราโซนิกแบบโพรบ (เช่น UP100H) สำหรับการให้อัลตราซาวนด์โดยตรงด้วยปลายโพรบขนาดเล็ก หรือใช้ VialTweeeter หรือ cuphorn อัลตราโซนิกสำหรับการเตรียม DNA แบบอ้อมจากตัวอย่างหลายชนิดพร้อมกัน Hielscher นำเสนออุปกรณ์ที่เหมาะสมที่สุดโดยคำนึงถึงความต้องการของคุณ: ไม่ว่าคุณจะมีตัวอย่าง 1 ตัวอย่างหรือมากถึง 10 ตัวอย่าง และมีปริมาตรตั้งแต่ไมโครลิตรถึงลิตร – เครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher จะตอบสนองข้อกำหนดของคุณในการเตรียมชิ้นส่วน DNA, RNA และโครมาตินให้มีความยาวที่เหมาะสม ความสามารถในการทำซ้ำ การใช้งานที่ง่าย และการควบคุมที่แม่นยำช่วยให้ได้ไลบรารีที่เชื่อถือได้สำหรับการหาลำดับเบสยุคใหม่
การตัดเฉือนด้วยอัลตราซาวนด์ใช้แรงเฉือนเชิงกลเพียงอย่างเดียวโดยไม่เติมสารเคมีใด ๆ ซึ่งแตกต่างจากการทำให้ DNA แตกเป็นชิ้นส่วนด้วยเอนไซม์ การตั้งค่าพารามิเตอร์กระบวนการอย่างแม่นยำทำให้การตัดเฉือนด้วยอัลตราซาวนด์สร้างชิ้นส่วน DNA ที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงได้ (DNA พลาสมิดและ DNA จีโนม)
กรดนิวคลีอิกที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์สามารถเพิ่มปริมาณได้ก่อนหรือหลังขั้นตอนการทำให้แตกเป็นชิ้นส่วน
พารามิเตอร์การให้อัลตราซาวนด์ (กำลัง รอบพัลส์ / ชุดพัลส์ เวลา และอุณหภูมิ) สามารถควบคุมได้อย่างปลอดภัยผ่านการตั้งค่าซอฟต์แวร์

โพรโทคอลสำหรับการตัดเฉือน DNA ด้วยอัลตราซาวนด์

สำหรับการทดสอบการตกตะกอนโครมาตินด้วยภูมิคุ้มกัน

โดยสรุป เซลล์ถูกเพาะลงในจานที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 60mm (400,000 เซลล์ต่อจาน) และนำ RhoA siRNA เข้าเซลล์ (ตามที่อธิบายไว้); หลังจาก 72 h เซลล์ถูกบ่มกับ formaldehyde (ความเข้มข้นสุดท้าย 1%) เป็นเวลา 10 min ที่ 37°C เพื่อเชื่อมขวางโปรตีนกับ DNA ปฏิกิริยาการเชื่อมขวางถูกหยุดโดยเติม glycine 1.25 mol/L ในปริมาตรหนึ่งในสิบของปริมาตรเดิม ทำให้ได้ความเข้มข้นสุดท้าย 125 mmol/L เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS ที่เย็นจัด แล้วแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์สำหรับการทดสอบการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันรังสี [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)] ซึ่งมี 1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 Ag/mL aprotinin และ 1 Ag/mL pepstatin A และเก็บไว้บนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 min จากนั้นไลเสตของเซลล์ถูกให้อัลตราซาวนด์บนน้ำแข็งด้วย Hielscher UP200S ซึ่งเป็นเครื่องให้อัลตราซาวนด์ (3 x 40 s, แอมพลิจูด 40%, รอบ 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) จนโครมาตินที่เชื่อมขวางถูกตัดเฉือนให้ได้ชิ้นส่วน DNA ขนาดระหว่าง 200 ถึง 1,000 bp ไลเสตทั้งหมดในสัดส่วนหนึ่งในสิบถูกใช้เพื่อวัดปริมาณ DNA ที่มีอยู่ในตัวอย่างต่าง ๆ และถือเป็น “DNA ตั้งต้นทั้งหมด” ส่วนใสเหนือตะกอนถูกบ่มกับสารแขวนลอยข้น 50% ของ DNA จากอสุจิปลาแซลมอน/โปรตีนอะกาโรส เพื่อลดสัญญาณพื้นหลังที่ไม่จำเพาะ จากนั้นทำการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันข้ามคืนที่ 4°C ด้วย anti-NF-nB p65 (Upstate) ปริมาณ 5 Ag หรือโดยไม่ใช้แอนติบอดี (ชุดควบคุมเชิงลบ) ส่วนใสเหนือตะกอนเหล่านี้ถูกเติม NaCl 5 mol/L และให้ความร้อนข้ามคืนที่ 65°C เพื่อย้อนกลับการเชื่อมขวางระหว่างโปรตีนกับ DNA คอมเพล็กซ์ภูมิคุ้มกันถูกนำไปทำปฏิกิริยาต่อกับ proteinase K ที่ปราศจาก DNase และ RNase และ DNA ถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยการสกัดด้วย phenol/chloroform และการตกตะกอนด้วย ethanol ทำ PCR ด้วยไพรเมอร์จำเพาะที่สอดคล้องกับลำดับภายในบริเวณโปรโมเตอร์ของยีน iNOS ของมนุษย์ (ไพรเมอร์ p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; ไพรเมอร์ p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

การศึกษาการแสดงออกของ EGFP

สำหรับการศึกษาการแสดงออก สายพันธุ์รีคอมบิแนนท์ L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, เยอรมนี) ซึ่งมียีน EGFP (โปรตีนเรืองแสงสีเขียวที่เพิ่มประสิทธิภาพ) แทรกอยู่ในตำแหน่ง ssu บนโครโมโซม ถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดต่าง ๆ ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ และเติมเพิ่มด้วย 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, เยอรมนี) ระหว่างการเพาะเลี้ยง มีการเก็บตัวอย่างปริมาตร 1 ml นำไปปั่นเหวี่ยง (2000 × g, 20°C, 10 min) และล้างด้วยสารละลาย NaCl 0.9% ตะกอนถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) และทำให้แตกด้วยการให้อัลตราซาวนด์โดยใช้เครื่องประมวลผลอัลตราโซนิก UP400S (ใช้พลังงาน ∼ 400 Ws) เศษเซลล์ถูกกำจัดด้วยการปั่นเหวี่ยง (6000 × g, 4°C, 5 min) และวิเคราะห์ด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสบนเจลพอลิอะคริลาไมด์ร่วมกับ sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) ภายใต้สภาวะรีดิวซ์ตามวิธีของ Laemmli (1970) โดยใช้เจลพอลิอะคริลาไมด์ 12.5% ตรวจสอบการแสดงออกของ EGFP ในการเพาะเลี้ยงแบบเขย่า (Fritsche et al. 2007)

การตกตะกอนโครมาตินด้วยภูมิคุ้มกัน

การทดสอบการตกตะกอนโครมาตินด้วยภูมิคุ้มกันดำเนินการโดยใช้ ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตโดยมีการปรับเปลี่ยนบางส่วน โดยสรุป พอโดไซต์ของมนุษย์ที่ผ่านการเปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์เฉพาะทางถูกเชื่อมขวางด้วย formaldehyde 1% เป็นเวลา 10 min ที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ถูกล้างด้วย PBS ที่เย็นจัด และหยุดปฏิกิริยาการตรึงโดยเติม glycine 0.125 M เป็นเวลา 5 min ที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ถูกล้างอีกครั้งด้วย PBS ที่เย็นจัดและขูดออกจากจาน เซลล์ถูกปั่นเหวี่ยงให้ตกตะกอนและแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์สำหรับการสลายเซลล์ หลังการปั่นเหวี่ยง นิวเคลียสที่ตกตะกอนถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์สำหรับการตัดเฉือน บ่มบนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 min และโครมาตินถูกตัดเฉือนด้วยการให้อัลตราซาวนด์ เช่น ใช้ UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, เยอรมนี) ที่กำลัง 25% จำนวน 5 พัลส์ พัลส์ละ 20 sec บนน้ำแข็ง ให้ได้ชิ้นส่วนขนาดประมาณ 200–600 bp จากนั้นโครมาตินที่ถูกตัดเฉือนถูกปั่นเหวี่ยงและเก็บส่วนใสเหนือตะกอน สำหรับการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกัน โครมาตินปริมาตร 60 μl ถูกบ่มกับแอนติบอดีต่อ Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, สหรัฐอเมริกา), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, สหราชอาณาจักร) หรือ NF-κB p50 (Abcam) ปริมาณ 1 μg หรือกับ IgG จากกระต่าย (Zymed Laboratories) เพื่อเป็นชุดควบคุมเชิงลบ ข้ามคืนที่ 4°C พร้อมหมุนอย่างนุ่มนวล คอมเพล็กซ์ภูมิคุ้มกันที่จับกับเม็ดบีดแม่เหล็กถูกเก็บโดยใช้แท่นแม่เหล็ก ล้างอย่างทั่วถึง แล้วย้อนกลับการเชื่อมขวางระหว่างโปรตีน/DNA และชะ DNA ออกเพื่อวิเคราะห์ด้วย real-time PCR (Ristola et al. 2009)

การเตรียม DNA ของ EHEC สำหรับการวิเคราะห์ด้วยชิปอาร์เรย์

การเตรียมไลเสตของเซลล์และ DNA ที่สกัดได้
ตะกอนแบคทีเรียที่แขวนลอยใน PBS จนได้ความเข้มข้นสุดท้ายที่ต้องการถูกนำไปผ่านกระบวนการด้วย เครื่องทำให้เซลล์แตกด้วยอัลตราซาวนด์ UP100H (Hielscher GmbH, เยอรมนี) ซึ่งติดตั้งปลายโพรบขนาดเล็ก MS1 (เส้นผ่านศูนย์กลาง 1mm) ความถี่ในการทำงานเท่ากับ 30 kHz และกำลังขาออกที่มีผลจริงเท่ากับ 100 W ระหว่างการทำงาน ตัวอย่างถูกทำให้เย็นในอ่างน้ำผสมน้ำแข็ง ผสม และปั่นเหวี่ยง ตัวอย่างถูกใช้สำหรับการศึกษาด้วยโฟลว์ไซโตเมทรี ส่วนตัวอย่างสำหรับการดำเนินการในภายหลังถูกนำไปผ่านการให้ความร้อน (95°C, 5 min) ไลเสตของเซลล์แบบหยาบถูกนำไปผ่านกระบวนการด้วยส่วนผสม phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) เติมส่วนผสมนี้ในปริมาตรเท่ากับตัวอย่างไลเสต ผสมสารละลายอย่างแรงด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์เป็นเวลา 15 s และปั่นเหวี่ยงที่ 15,000 x g เป็นเวลา 2 min ที่อุณหภูมิห้อง (RT) ประมาณ 22°C เฟสน้ำชั้นบนที่มี DNA จีโนมถูกแยกอย่างระมัดระวังและเก็บในหลอด Eppendorf ปลอดเชื้อหลอดใหม่
จากนั้นตัวอย่างถูกให้อัลตราซาวนด์เพื่อทำให้ DNA แตกเป็นชิ้นส่วน ขั้นตอนการให้อัลตราซาวนด์ดำเนินการภายใต้สภาวะเดียวกับที่อธิบายไว้ข้างต้น เพื่อประเมินผลของการทำให้ DNA จีโนมแตกเป็นชิ้นส่วน ตัวอย่างถูกวิเคราะห์ด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสบนเจลอะกาโรส
(…) ตัวอย่างที่เคยผ่านการให้อัลตราซาวนด์เป็นเวลา 2.5 min ถูกนำเข้าสู่ขั้นตอนการสกัดหลังจากให้ความร้อนและปั่นเหวี่ยง DNA ที่ปลดปล่อยออกมาถูกสกัดสองครั้งด้วยส่วนผสม phenol:chloroform:isoamyl alcohol และจากนั้นผ่านการให้อัลตราซาวนด์ครั้งที่สองเป็นเวลา 0 – 15 min ใช้อิเล็กโทรโฟรีซิสบนเจลอะกาโรสเพื่อหาการกระจายขนาดของ DNA ที่ผ่านการทำให้แตกเป็นชิ้นส่วนด้วยอัลตราซาวนด์หลังการสกัด (รูปด้านขวาบน) การแตกเป็นชิ้นส่วนอย่างมากของ DNA เห็นได้ชัดจากการปรากฏของแถบ DNA ที่กระจายเป็นปื้น แทนแถบที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูง ซึ่งหายไปจากตัวอย่างที่ผ่านการให้อัลตราซาวนด์เป็นเวลา 2.5 min หรือนานกว่า การให้อัลตราซาวนด์นานขึ้นค่อย ๆ ลดความยาวของชิ้นส่วนลงเหลือประมาณ 150 – 600 bp และการให้อัลตราซาวนด์เป็นเวลา 15 min ทำให้ชิ้นส่วนเหล่านี้สลายลงต่อไป ดังที่เห็นได้ส่วนใหญ่จากบริเวณด้านบนของแถบที่กระจายเป็นปื้น ดังนั้น ขนาดเฉลี่ยของชิ้นส่วน DNA จึงค่อย ๆ ลดลงตามเวลาในการให้อัลตราซาวนด์ และการให้อัลตราซาวนด์เป็นเวลา 5 min ทำให้ได้ชิ้นส่วน DNA ที่มีขนาดเหมาะสมที่สุดสำหรับการทดสอบด้วยชิปอาร์เรย์ ในที่สุด จึงกำหนดขั้นตอนการเตรียม DNA สำหรับการวิเคราะห์ ซึ่งประกอบด้วยการให้อัลตราซาวนด์ครั้งแรกเป็นเวลา 2 min การสกัด DNA (2×) และการให้อัลตราซาวนด์ต่อมาเป็นเวลา 5 min (Basselet et al. 2008)

การตกตะกอนโครมาตินด้วยภูมิคุ้มกัน (ChIP)

เซลล์ HEK293 ถูกเพาะเลี้ยงตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและตรึงด้วย disuccinimidyl-glutarate 2 mM เป็นเวลา 45 min ที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นเซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS โครมาตินถูกเชื่อมขวางเป็นเวลา 10 min ที่อุณหภูมิห้องโดยใช้ formaldehyde 1% (v/v) และล้างสองครั้งด้วย PBS ที่เย็นจัด ปฏิกิริยาการเชื่อมขวางถูกหยุดโดยบ่มกับ glycine ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 0.125 M เป็นเวลา 5 min ที่อุณหภูมิห้อง หลังจากบ่มกับ trypsin เซลล์ถูกขูดออกจากจานเพาะเลี้ยงเซลล์และล้างสองครั้งด้วย PBS ตะกอนเซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์สำหรับการสลายเซลล์ (5 mM Pipes, pH 8.0, 85 mM KCl และ 0.5% (v/v) Nonidet P-40) บ่มบนน้ำแข็งเป็นเวลา 10 min และทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยเครื่องโฮโมจีไนเซอร์แบบ Dounce จากนั้นนิวเคลียสถูกปั่นเหวี่ยงให้ตกตะกอน (3500 x g, 5 min, 4 °C) และแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์สำหรับนิวเคลียส (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA และ 1% (w/v) SDS) นิวเคลียสถูกทำให้แตกด้วยการให้อัลตราซาวนด์จำนวนสามพัลส์ พัลส์ละ 20 s โดยใช้ เครื่องให้อัลตราซาวนด์ UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) ที่การตั้งค่ารอบ 0.5 และแอมพลิจูด 30% ทำให้ได้ชิ้นส่วน DNA จีโนมซึ่งส่วนใหญ่มีขนาด 200 – 1000 bp สำหรับ ChIP นำ DNA ปริมาณ 50g มาเจือจาง 4 เท่าในบัฟเฟอร์สำหรับการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกัน (16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1.1% (v/v) Triton X-100 และ 0.01% (w/v) SDS) (Weiske et al. 2006)

การวิเคราะห์การดัดแปลงฮิสโตนด้วยการตกตะกอนโครมาตินด้วยภูมิคุ้มกัน (ChIP)

โดยสรุป เซลล์จำนวน 6 x 10⁶ ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS และเชื่อมขวางบนจานเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 15 min ที่อุณหภูมิห้องโดยมี formaldehyde 0.5% ปฏิกิริยาการเชื่อมขวางถูกหยุดโดยเติม glycine 0.125 M ขั้นตอนทั้งหมดหลังจากนี้ดำเนินการที่ 48°C บัฟเฟอร์ทั้งหมดถูกทำให้เย็นล่วงหน้าและมีสารยับยั้งโปรตีเอส (Complete Mini, Roche) เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS แล้วขูดออก ตะกอนที่เก็บได้ถูกละลายในบัฟเฟอร์สำหรับการสลายเซลล์ปริมาตร 1 ml (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) และให้อัลตราซาวนด์ในอ่าง ethanol เย็นจำนวน 10 รอบ ที่แอมพลิจูด 100% โดยใช้ เครื่องให้อัลตราซาวนด์ UP50H (Hielscher, Teltow, เยอรมนี) ตรวจดูการแตกเป็นชิ้นส่วนของโครมาตินในเจลอะกาโรส 1% ชิ้นส่วนที่ได้มีขนาดอยู่ในช่วง 200–500pb โครมาตินที่ละลายได้ถูกแยกโดยปั่นเหวี่ยงตัวอย่างที่ผ่านการให้อัลตราซาวนด์ที่ 14,000g เป็นเวลา 10 min ที่ 48°C ส่วนที่ละลายได้ถูกเจือจาง 1/10 ในบัฟเฟอร์เจือจาง (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) จากนั้นแบ่งเป็นส่วนย่อยและเก็บที่ 80°C จนกว่าจะใช้งาน (Rodriguez et al. 2008)