การสลายเซลล์ E. Coli ด้วยอัลตราโซนิก

แบคทีเรีย E. coli เป็นแบคทีเรียที่ใช้กันมากที่สุดในจุลชีววิทยาและเทคโนโลยีชีวภาพ
เครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกให้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้และทำซ้ำได้ในการสลายเซลล์ E. coli
คาวิเทชันและแรงเฉือนที่รุนแรงแต่ควบคุมได้อย่างแม่นยำทำให้เซลล์ถูกทำลายอย่างสมบูรณ์และให้ผลได้จากการสกัดสูง (เช่น โปรตีน, DNA)

เหตุใดการทำลายเซลล์ E. coli ด้วยอัลตราโซนิกจึงเป็นวิธีที่ได้รับความนิยม?

เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกหรือเครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบมีข้อดีหลายประการสำหรับการสลายเซลล์ E. coli เนื่องจากอัลตราซาวนด์ความเข้มสูงทำลายผนังเซลล์และเยื่อหุ้มเซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบใช้กันอย่างแพร่หลายในการสลายเซลล์ E. coli ด้วยเหตุผลต่อไปนี้:

การทำลายผนังเซลล์อย่างมีประสิทธิภาพ: E. coli มีผนังเซลล์กึ่งแข็งที่ประกอบด้วยเพปทิโดไกลแคน ซึ่งอาจทำลายได้ยากด้วยวิธีสลายเซลล์แบบดั้งเดิม เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบสร้างคลื่นอัลตราโซนิกความเข้มสูงที่ทำให้เกิดฟองคาวิเทชันในของเหลวรอบเซลล์ เมื่อฟองเหล่านี้ยุบตัว จะเกิดลำของเหลวความเร็วสูงและคลื่นกระแทกที่ทำให้ผนังเซลล์ถูกทำลายทางกล และปลดปล่อยสารภายในเซลล์ เช่น ชีวโมเลกุล ได้อย่างมีประสิทธิภาพ

การแทรกผ่านที่ดีขึ้น: คลื่นอัลตราโซนิกที่สร้างโดยโพรบ / โซโนโทรดสามารถแทรกผ่านลึกเข้าไปในตัวอย่าง เข้าถึงเซลล์ E. coli ได้มากขึ้นและกระทำต่อเซลล์อย่างทั่วถึง ซึ่งช่วยให้การสลายเซลล์สม่ำเสมอมากขึ้นทั่วทั้งตัวอย่าง ส่งผลให้ประสิทธิภาพการทำลายเซลล์สูงขึ้น

ลดเวลาในการประมวลผล: พลังงานที่ส่งผ่านจากเครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบมีความเข้มข้นสูงและจำกัดอยู่ในบริเวณเฉพาะ ทำให้สลายเซลล์ได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ เมื่อเทียบกับวิธีอื่น เช่น การใช้เม็ดบีดกระแทกหรือการสลายเซลล์ด้วยเอนไซม์ การใช้อัลตราโซนิกสามารถสลายเซลล์ E. coli ได้ภายในไม่กี่นาทีหรือแม้แต่ไม่กี่วินาที ขณะที่เทคนิคทางเลือกหลายวิธี เช่น การแช่แข็งแล้วละลาย ต้องดำเนินการหลายรอบ การสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกทำให้เซลล์เปิดออกได้ในขั้นตอนกระบวนการเดียว

การควบคุมอุณหภูมิ: เครื่องอัลตราโซนิกที่ใช้เทคโนโลยีล้ำสมัยติดตั้งเซนเซอร์อุณหภูมิและซอฟต์แวร์อัจฉริยะ ซึ่งช่วยให้กำหนดอุณหภูมิสูงสุดของกระบวนการได้ เครื่องอัลตราโซนิกจะหยุดทำงานชั่วคราวโดยอัตโนมัติเมื่ออุณหภูมิถึงขีดจำกัด และเริ่มกระบวนการใช้อัลตราโซนิกเมื่ออุณหภูมิถึงจุดที่ตั้งไว้ การทำให้ตัวอย่างเย็นในอ่างน้ำแข็งเป็นวิธีง่าย ๆ ในการรักษาอุณหภูมิตัวอย่างให้ต่ำและป้องกันการเสื่อมสภาพของตัวอย่างจากความร้อน

ความสามารถในการขยายขนาด: เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบมีหลายขนาด ตั้งแต่อุปกรณ์แบบมือถือจนถึงรุ่นอุตสาหกรรมขนาดใหญ่ จึงเหมาะสำหรับการประมวลผลตัวอย่างปริมาตรน้อยในห้องปฏิบัติการ หรือการขยายขนาดสำหรับงานกระบวนการชีวภาพที่ใหญ่ขึ้น เช่น การผลิตวัคซีนหรือการสังเคราะห์โมเลกุลทางชีวภาพ

ความหลากหลายในการใช้งาน: เครื่องอัลตราโซนิกใช้ในงานได้หลากหลายนอกเหนือจากการสลายเซลล์ เช่น การเฉือน DNA การสกัดโปรตีน การทำให้เนื้อเยื่อเป็นเนื้อเดียวกัน การกระจายอนุภาคนาโน และการทำอิมัลชัน ดังนั้น การลงทุนในเครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบจึงรองรับการใช้งานที่หลากหลายในงานวิจัยหรือภาคอุตสาหกรรม

เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบ เช่น UP200St เป็นเครื่องโฮโมจีไนเซอร์เนื้อเยื่อและเครื่องทำลายเซลล์ที่เชื่อถือได้ จึงใช้กันอย่างแพร่หลายในการเตรียมตัวอย่างทางพันธุศาสตร์ เช่น การสลายเซลล์ E.coli

การสกัดโปรตีนจากเซลล์ E.coli ทำได้อย่างมีประสิทธิภาพด้วย โพรบอัลตราโซนิก UP200St

เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบมีข้อดีหลายประการสำหรับการสลายเซลล์ E. coli การควบคุมพารามิเตอร์ของกระบวนการอัลตราโซนิกที่เชื่อถือได้และแม่นยำช่วยให้ปรับพารามิเตอร์การทำงาน เช่น กำลัง ระยะเวลา และการจัดการตัวอย่าง ให้เหมาะสมเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ต้องการ

วิดีโอสอนนี้อธิบายว่าเครื่องอัลตราโซนิกประเภทใดเหมาะสมที่สุดสำหรับงานเตรียมตัวอย่าง เช่น การสลายเซลล์ การทำลายเซลล์ การแยกโปรตีน และการทำให้ DNA และ RNA แตกเป็นชิ้น ในห้องปฏิบัติการ งานวิเคราะห์ และงานวิจัย เลือกประเภทเครื่องอัลตราโซนิกให้เหมาะกับการใช้งาน ปริมาตรตัวอย่าง จำนวนตัวอย่าง และอัตราการประมวลผล Hielscher Ultrasonics มีเครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกที่เหมาะสมสำหรับคุณ!

การตัด DNA เป็นชิ้นส่วนด้วยอัลตราโซนิกใช้บ่อยเป็นขั้นตอนเตรียมตัวอย่างในการหาลำดับเบสยุคใหม่ (NGS)

การวิเคราะห์ด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสของ DNA จีโนมจาก E. coli EDL933 ที่ผ่านการใช้อัลตราโซนิกเป็นเวลา 0 – 15 min โดย L แสดงบันไดมาตรฐาน DNA
(การศึกษาและภาพ: ©Basselet et al. 2008)

การทำลายเซลล์ด้วยคาวิเทชันจากอัลตราโซนิก

เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกชนิดโพรบทำงานประมาณ 20,000 รอบต่อวินาที (ที่ 20kHz) และทำให้เกิดคาวิเทชันในของเหลวหรือสารแขวนลอย คาวิเทชันเชิงเสียงสร้างบริเวณขนาดจุลภาคที่มีความดันคล้ายสุญญากาศและอุณหภูมิสูง ซึ่งฉีกเซลล์ให้แตกออก แม้อุณหภูมิอาจสูงถึงหลายพันองศาเซลเซียส แต่บริเวณคาวิเทชันมีปริมาตรเล็กมากจนไม่ทำให้กระบวนการร้อนขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ คาวิเทชันเชิงเสียงและแรงเฉือนที่เกิดจากอัลตราซาวนด์ทำให้เยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรีย เช่น E.coli เป็นรูหรือแตกออก เครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher ช่วยให้ควบคุมพารามิเตอร์ของกระบวนการ เช่น ความเข้มอัลตราโซนิก แอมพลิจูด พลังงานที่ป้อน และอุณหภูมิ ได้อย่างแม่นยำ จึงสามารถปรับกระบวนการสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกให้เหมาะสมที่สุดกับชนิดเซลล์ เซลล์เพาะเลี้ยง และเป้าหมายของกระบวนการ

ข้อดีของการสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิก

ควบคุมการสลายเซลล์ได้อย่างแม่นยำ (ความเข้ม แอมพลิจูด อุณหภูมิ)
ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้และทำซ้ำได้
ปรับให้เหมาะสมที่สุดกับตัวอย่างเฉพาะ
ควบคุมอุณหภูมิ
สำหรับตัวอย่างขนาดเล็กมากจนถึงขนาดใหญ่มาก (µL ถึงลิตร)
ดำเนินการด้วยกลไกทางกลล้วน ๆ
ใช้งานง่ายและปลอดภัย
ขยายขนาดแบบเชิงเส้นจากห้องปฏิบัติการสู่การผลิต

อุปกรณ์อัลตราโซนิก VialTweeter ช่วยให้เตรียมตัวอย่างในขวดไวแอลสูงสุด 10 ขวดพร้อมกันภายใต้สภาวะกระบวนการเดียวกัน (คลิกเพื่อขยายภาพ!)

VialTweeter สำหรับการสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิก

เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกเทียบกับเทคนิคการสลายเซลล์อื่น ๆ

แม้การสลายเซลล์ด้วยสารเคมีและเอนไซม์อาจมีปัญหา – เนื่องจากการสลายเซลล์ด้วยสารเคมีอาจเปลี่ยนโครงสร้างโปรตีนและก่อให้เกิดปัญหาในการทำให้บริสุทธิ์ ส่วนการสลายเซลล์ด้วยเอนไซม์ต้องใช้เวลาบ่มนานและไม่สามารถให้ผลซ้ำได้ – การทำลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกเป็นวิธีการทำลายเซลล์ที่ซับซ้อนและรวดเร็ว
การสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกอาศัยแรงทางกลเท่านั้น ไม่มีการเติมสารเคมี การใช้อัลตราโซนิกทำลายผนังเซลล์ด้วยแรงเฉือน การสลายเซลล์ด้วยสารเคมีอาจเปลี่ยนโครงสร้างโปรตีนและก่อให้เกิดปัญหาในการทำให้บริสุทธิ์ การทำลายเซลล์ด้วยเอนไซม์ต้องใช้เวลาบ่มนานและไม่สามารถให้ผลซ้ำได้ การทำลายเซลล์แบคทีเรีย E.coli ด้วยอัลตราโซนิกนั้นรวดเร็ว เรียบง่าย เชื่อถือได้ และทำซ้ำได้ ด้วยเหตุนี้ เครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher จึงใช้ในห้องปฏิบัติการชีววิทยาและชีวเคมีทั่วโลกสำหรับการเตรียมตัวอย่าง งานก่อนการวิเคราะห์ การวินิจฉัยภายนอกร่างกาย และการทดสอบที่หลากหลาย

คำแนะนำทั่วไปสำหรับการสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิก

การใช้อัลตราโซนิกเป็นเทคนิคที่ได้รับความนิยมมากที่สุดในการสลายเซลล์ในสารแขวนลอยปริมาณน้อยมาก ปานกลาง และมาก – ตั้งแต่พิโคลิตรจนถึง 100L/hr (โดยใช้โฟลว์เซลล์อัลตราโซนิก) เซลล์ถูกสลายด้วยแรงเฉือนของของเหลวและคาวิเทชัน DNA ก็ถูกเฉือนระหว่างการใช้อัลตราโซนิกด้วย จึงไม่จำเป็นต้องเติม DNase ลงในสารแขวนลอยเซลล์

การควบคุมอุณหภูมิระหว่างการสลายเซลล์ E.coli ด้วยอัลตราโซนิก
การทำให้ตัวอย่างเย็นล่วงหน้าและวางตัวอย่างบนน้ำแข็งระหว่างการใช้อัลตราโซนิกช่วยป้องกันการเสื่อมสภาพของตัวอย่างจากความร้อนได้อย่างง่ายดาย
ตามหลักแล้ว ควรรักษาตัวอย่างให้เย็นจัดระดับน้ำแข็งระหว่างการสลายเซลล์ แต่สำหรับตัวอย่างส่วนใหญ่ การรักษาอุณหภูมิไม่ให้สูงกว่าอุณหภูมิของแหล่งเพาะเลี้ยงหรือแหล่งเนื้อเยื่อก็เพียงพอ ดังนั้น จึงแนะนำให้วางสารแขวนลอยบนน้ำแข็งและใช้อัลตราโซนิกเป็นพัลส์สั้น ๆ หลายครั้ง ครั้งละ 5–10 sec โดยหยุดพัก 10–30 sec ระหว่างช่วงพัก ความร้อนสามารถระบายออกเพื่อให้อุณหภูมิกลับมาต่ำอีกครั้ง สำหรับตัวอย่างเซลล์ปริมาณมากขึ้น มีเครื่องปฏิกรณ์โฟลว์เซลล์หลายแบบที่ติดตั้งแจ็กเก็ตหล่อเย็นให้เลือกใช้
อ่านเคล็ดลับและคำแนะนำอย่างละเอียดสำหรับการสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกให้สำเร็จได้ที่นี่!

วิธีปฏิบัติสำหรับการเตรียมไลเสตของ E. Coli ด้วยอัลตราโซนิก

นักวิจัยใช้เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกของ Hielscher ในการทำลายเซลล์ E.coli ด้านล่างนี้เป็นวิธีปฏิบัติหลายแบบที่ผ่านการทดสอบและพิสูจน์แล้วสำหรับการสลายเซลล์ E.coli โดยใช้เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกของ Hielscher ในงานที่เกี่ยวข้องกับ E. coli หลากหลายประเภท

การเจริญของเซลล์ การเชื่อมขวาง และการเตรียมสารสกัดจากเซลล์ E. coli ด้วยอัลตราโซนิก

สำหรับ ChIP-Chip ของ SeqA และ RNA polymerase เพาะเลี้ยง E. coli MG1655 หรือ MG1655 ΔseqA ที่ 37°C จนได้ค่า OD₆₀₀ ประมาณ 0.15 ในอาหารเลี้ยงเชื้อ LB ปริมาตร 50 ml (+ glucose 0.2%) ก่อนเติม formaldehyde ปริมาตร 27 μl (37%) ต่ออาหารเลี้ยงเชื้อหนึ่ง ml (ความเข้มข้นสุดท้าย 1%) ทำการเชื่อมขวางโดยเขย่าช้า ๆ (100 rpm) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 min แล้วหยุดปฏิกิริยาด้วย glycine ปริมาตร 10 ml ความเข้มข้น 2.5 M (ความเข้มข้นสุดท้าย 0.5 M) สำหรับการทดลองฮีตช็อก เพาะเลี้ยง E. coli MG1655 ในอาหารเลี้ยงเชื้อ LB ปริมาตร 65 ml ที่ 30°C จนได้ค่า OD₆₀₀ ประมาณ 0.3 จากนั้นย้ายเชื้อเพาะเลี้ยงปริมาตร 30 ml ไปยังขวดที่อุ่นไว้ล่วงหน้าที่ 43°C และเก็บส่วนที่เหลือไว้ที่ 30°C ทำการเชื่อมขวางและหยุดปฏิกิริยาตามที่อธิบายข้างต้น ยกเว้นการเก็บเซลล์ไว้ที่ 30 หรือ 43°C เป็นเวลา 5 min ก่อนเขย่าช้า ๆ ต่อที่อุณหภูมิห้อง เก็บเซลล์ด้วยการปั่นเหวี่ยงและล้างสองครั้งด้วย TBS เย็น (pH7.5) หลังจากแขวนลอยเซลล์ใหม่ในบัฟเฟอร์สลายเซลล์ปริมาตร 1 ml (10 mM Tris (pH 8.0), 20% sucrose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lysozyme) และบ่มที่ 37°C เป็นเวลา 30 min แล้วเติมบัฟเฟอร์ IP ปริมาตร 4 ml ใช้อัลตราโซนิกกับเซลล์บนน้ำแข็ง 12 ครั้ง ครั้งละ 30 sec โดยหยุดพักครั้งละ 30 sec ด้วยเครื่องประมวลผลอัลตราโซนิก Hielscher UP400St ที่ตั้งค่ากำลัง 100% หลังปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 10 min ที่ 9000 g แบ่งส่วนใสเหนือตะกอนเป็นส่วนละ 800 μl แล้วเก็บไว้ที่ -20°C (Waldminghaus 2010)

การผลิตเอนไซม์ในปริมาณมากและการทำให้บริสุทธิ์ด้วยโพรบอัลตราโซนิก

สำหรับการผลิตโปรตีนที่ติดแท็ก decahistidine (His10) ในปริมาณมาก ทรานส์ฟอร์ม E. coli BL21(DE3) ด้วยคอนสตรักต์ pET19b เก็บเชื้อเพาะเลี้ยงเริ่มต้นที่เพาะข้ามคืนด้วยการปั่นเหวี่ยง และใช้ 1% เพื่อเริ่มเพาะเลี้ยงเชื้อสำหรับการแสดงออกของโปรตีน เพาะเลี้ยงเซลล์ที่มี pET19mgtB ที่ 22°C จนมีค่าความหนาแน่นเชิงแสงที่ 600 nm (OD600) เท่ากับ 0.7 ย้ายเชื้อเพาะเลี้ยงไปที่ 17°C และเหนี่ยวนำด้วย IPTG 100 μM หลังผ่านไป 16 h เก็บเชื้อเพาะเลี้ยงด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ 7,500 × g ที่ 4°C แขวนลอยเซลล์ใหม่ในสารละลายน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) 50 mM ที่มี NaCl 0.3 M ที่ pH 7.4 และทำลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกโดยใช้โซโนโทรดปลายไมโคร S2 กับเครื่องอัลตราโซนิก Hielscher UP200St ที่ค่ารอบ 0.5 และแอมพลิจูด 75%
เหนี่ยวนำการผลิต GtfC ที่ติดแท็ก decahistidine ในปริมาณมากที่ 37°C เมื่อค่า OD₆₀₀ เท่ากับ 0.6 ด้วย 100 μM IPTG จากนั้นบ่มเซลล์เป็นเวลา 4 h เก็บเซลล์ และสลายเซลล์ตามวิธีที่ระบุข้างต้นสำหรับ MgtB
ปั่นเหวี่ยงสารสกัดเซลล์ดิบที่ 15,000 × g และ 4°C เพื่อให้เศษเซลล์ตกตะกอน นำสารสกัดที่แยกตะกอนออกแล้วขึ้นคอลัมน์ HisTrap FF Crude ขนาด 1-ml โดยใช้ระบบ ÄKTAprime Plus ทำให้เอนไซม์บริสุทธิ์ตามวิธีปฏิบัติของผู้ผลิตสำหรับการชะโปรตีนที่ติดแท็ก His แบบเกรเดียนต์ ไดอะไลซ์สารละลายโปรตีนที่ชะออกมาสองครั้งกับสารละลายปริมาตร 1,000 เท่า ซึ่งประกอบด้วย 50 mM PBS ที่ pH 7.4 และมี 0.3 M NaCl ที่ 4°C วิเคราะห์การทำให้บริสุทธิ์ด้วย 12% SDS-PAGE หาความเข้มข้นของโปรตีนด้วยวิธี Bradford โดยใช้ Roti-Quant (Rabausch et al. 2013)

การสกัดโปรตีนจากแบคทีเรีย E. coli ด้วยอัลตราโซนิก
เชื่อมโปรตีนเหยื่อที่สนใจ (ในกรณีนี้คือ MTV1 ของ Arabidopsis thaliana) เข้ากับแท็ก GST และให้แสดงออกในเซลล์ Escherichia coli (E. coli) BL21

นำตะกอน GST-MTV1 และ GST อย่างละหนึ่งก้อน (เทียบเท่าเชื้อแบคทีเรียเพาะเลี้ยงปริมาตร 50 ml) และแขวนลอยแต่ละก้อนใหม่ในบัฟเฟอร์สกัดที่เย็นจัดระดับน้ำแข็งปริมาตร 2.5 mL
ใช้เครื่องอัลตราโซนิก UP100H (ติดตั้งโซโนโทรดปลายไมโคร MS3 สำหรับปริมาตรน้อยประมาณ 2–5mL) ทำลายเซลล์แบคทีเรียจนเซลล์สลาย ซึ่งสังเกตได้จากความขุ่นทึบที่ลดลงและความหนืดที่เพิ่มขึ้น ต้องดำเนินการบนน้ำแข็ง และแนะนำให้ใช้อัลตราโซนิกเป็นช่วง ๆ (เช่น ใช้อัลตราโซนิก 10 sec แล้วหยุดพักบนน้ำแข็ง 10 sec และทำเช่นนี้ต่อไป) ต้องระมัดระวังไม่ใช้อัลตราโซนิกที่ความเข้มสูงเกินไป หากตรวจพบฟองหรือการเกิดตะกอนสีขาว ต้องลดความเข้มลง
ย้ายสารละลายแบคทีเรียที่สลายแล้วไปยังหลอดไมโครเซนทริฟิวจ์ 1.5 mL และปั่นเหวี่ยงที่ 4°C, 16,000 x g เป็นเวลา 20 min

โพรบอัลตราโซนิกใช้แรงจากคาวิเทชันเชิงเสียงเพื่อทำลายเซลล์และสกัดโมเลกุลและ DNA จาก E.coli

เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบ เช่น UP400St ใช้หลักการทำงานของคาวิเทชันเชิงเสียงในการสลายเซลล์ E.coli อย่างมีประสิทธิภาพ

การวิเคราะห์การแสดงออกและการทำให้โปรตีนรีคอมบิแนนท์บริสุทธิ์ด้วยอัลตราโซนิก

ใช้อัลตราโซนิกกับตะกอน E. coli ด้วยเครื่องอัลตราโซนิก Hielscher UP100H โดยแขวนลอยตะกอนเซลล์ใหม่ในบัฟเฟอร์สลายเซลล์ที่แช่เย็น (Tris-HCl 50 mM pH=7.5, NaCl 100 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM) และทำให้เย็นบนน้ำแข็งเป็นเวลา 10 min จากนั้นใช้อัลตราโซนิกกับสารแขวนลอยเซลล์เป็นช่วงสั้น ๆ 10 ครั้ง ครั้งละ 10 s ตามด้วยช่วงพัก 30 s เพื่อระบายความร้อน สุดท้ายกำจัดเศษเซลล์ด้วยการปั่นเหวี่ยงความเร็วสูงพิเศษที่ 4°C เป็นเวลา 15 min ที่ 14,000 rpm เพื่อยืนยันการแสดงออกของ rPR นำส่วนใสเหนือตะกอนไปแยกบนเจลพอลิอะคริลาไมด์ 12% และวิเคราะห์ด้วย SDS-PAGE และ Western blotting ทำให้ rPR บริสุทธิ์โดยใช้เรซิน Ni2+-NTA (Invitrogen, สหรัฐอเมริกา) ตามคู่มือของผู้ผลิต ในขั้นตอนนี้ใช้วิธีทำให้บริสุทธิ์ภายใต้สภาวะคงสภาพธรรมชาติ ประเมินความบริสุทธิ์ของโปรตีนที่ทำให้บริสุทธิ์แล้วด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสบนเจลพอลิอะคริลาไมด์ 12% ตามด้วยการย้อม Coomassie blue วัดความเข้มข้นของโปรตีนที่ทำให้บริสุทธิ์แล้วด้วยชุดทดสอบโปรตีน Micro BCA (PIERCE, สหรัฐอเมริกา) (Azarnezhad et al. 2016)

วิดีโอนี้แสดงคัพฮอร์นอัลตราโซนิกกำลัง 200 วัตต์ สำหรับการกระจายสาร การทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน การสกัด หรือการไล่ก๊าซออกจากตัวอย่างในห้องปฏิบัติการ

เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกสำหรับการสลายเซลล์ E. coli

Hielscher Ultrasonics ออกแบบ ผลิต และจัดหาเครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกสมรรถนะสูงสำหรับการสลายเซลล์แบคทีเรีย E. coli รวมถึงเซลล์ชนิดอื่น เนื้อเยื่อ และเซลล์เพาะเลี้ยงอย่างเชื่อถือได้และมีประสิทธิภาพ
โพรบอัลตราโซนิกและระบบอัลตราโซนิกแบบอ้อมที่มีให้เลือกอย่างหลากหลายช่วยให้เรานำเสนอเครื่องโฮโมจีไนเซอร์เนื้อเยื่อด้วยอัลตราโซนิกที่เหมาะสมที่สุดสำหรับงานทำลายเซลล์และงานสกัดของคุณ

การออกแบบ การผลิต และการให้คำปรึกษา – คุณภาพที่ผลิตในเยอรมนี

เครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher มีชื่อเสียงในด้านมาตรฐานคุณภาพและการออกแบบสูงสุด ซอฟต์แวร์อัจฉริยะ เมนูที่ใช้งานได้อย่างเป็นธรรมชาติ การตั้งค่าที่ตั้งโปรแกรมได้ และการบันทึกข้อมูลโดยอัตโนมัติเป็นเพียงคุณสมบัติบางส่วนของเครื่องอัลตราโซนิก Hielscher ความทนทานและการใช้งานง่ายช่วยให้ผสานเครื่องอัลตราโซนิกของเราเข้ากับสถานที่วิจัยและเทคโนโลยีชีวภาพได้อย่างราบรื่น แม้ในสภาวะรุนแรงและสภาพแวดล้อมที่มีความต้องการสูง เครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher ก็สามารถทำงานได้อย่างง่ายดาย

Hielscher Ultrasonics เป็นบริษัทที่ได้รับการรับรอง ISO และให้ความสำคัญเป็นพิเศษกับเครื่องอัลตราโซนิกสมรรถนะสูงที่ใช้เทคโนโลยีล้ำสมัยและใช้งานง่าย แน่นอนว่าเครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher เป็นไปตามข้อกำหนด CE และตรงตามข้อกำหนดของ UL, CSA และ RoHs

ตารางด้านล่างแสดงขีดความสามารถในการประมวลผลโดยประมาณของเครื่องอัลตราโซนิกของเรา:

ปริมาตรต่อชุด	อัตราการไหล	อุปกรณ์ที่แนะนำ
เพลตหลายหลุม / เพลตไมโครไทเทอร์	ไม่เกี่ยวข้อง	UIP400MTP
CupHorn สำหรับขวดไวแอลหรือบีกเกอร์	ไม่เกี่ยวข้อง	CupHorn อัลตราโซนิก
เครื่องปฏิกรณ์อัลตราโซนิกแบบไหลระดับไมโคร	ไม่เกี่ยวข้อง	GDmini2
ขวดไวแอลสูงสุด 10 ขวด ปริมาตร 0.5 ถึง 1.5mL	ไม่เกี่ยวข้อง	VialTweeter
0.5 ถึง 1.5mL	ไม่เกี่ยวข้อง	VialTweeter
1 ถึง 500mL	10 ถึง 200mL/min	UP100H
10 ถึง 2000mL	20 ถึง 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0.1 ถึง 20L	0.2 ถึง 4L/min	UIP2000hdT
10 ถึง 100L	2 ถึง 10L/min	UIP4000
ไม่เกี่ยวข้อง	10 ถึง 100L/min	UIP16000
ไม่เกี่ยวข้อง	สูงกว่า	กลุ่มเครื่อง UIP16000

ติดต่อเรา! / สอบถามเรา!

ขอข้อมูลเพิ่มเติม

กรุณาใช้แบบฟอร์มด้านล่างเพื่อขอข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับเครื่องโฮโมจีไนซ์เนื้อเยื่อและเครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิก การใช้งานด้านการสลายเซลล์ และราคา เรายินดีหารือกับท่านเกี่ยวกับกระบวนการของท่าน และเสนอเครื่องโฮโมจีไนซ์อัลตราโซนิกที่ตรงตามความต้องการของท่าน!

ที่อยู่อีเมล (จำเป็น)

หมายเลขโทรศัพท์

ชื่อ

ความสนใจ

วิดีโอนี้แสดงระบบเตรียมตัวอย่างด้วยอัลตราโซนิก UIP400MTP ซึ่งช่วยให้เตรียมตัวอย่างในเพลตหลายหลุมมาตรฐานทุกชนิดได้อย่างเชื่อถือได้ด้วยคลื่นอัลตราโซนิกความเข้มสูง การใช้งานทั่วไปของ UIP400MTP ได้แก่ การสลายเซลล์ การตัดเฉือน DNA, RNA และโครมาติน รวมถึงการสกัดโปรตีน

วิธีปฏิบัติเพิ่มเติมสำหรับการสลายเซลล์ E. coli ด้วยอัลตราโซนิก

โปรตีนที่ดัดแปลงด้วย allicin ใน E. coli โดยใช้ VialTweeter อัลตราโซนิก

การหาปริมาณหมู่ซัลฟ์ไฮดริลด้วยการทดสอบ 5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)
ใช้เชื้อ E. coli MG1655 ที่เพาะเลี้ยงข้ามคืนเพื่อเริ่มเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อขั้นต่ำ MOPS (1:100) เพาะเลี้ยงเชื้อในสภาวะที่มีออกซิเจนจนได้ค่า A600 เท่ากับ 0.4 แบ่งเชื้อเพาะเลี้ยงเป็นสามส่วน ส่วนละ 15-ml สำหรับการให้สภาวะเครียด ใช้เชื้อเพาะเลี้ยงที่ไม่ได้รับการให้สภาวะเครียดเป็นชุดควบคุมเชิงลบ เติม 0.79 mM allicin (128 μg ml-1) หรือ 1 mM diamide ลงในเชื้อเพาะเลี้ยงอีกสองส่วนที่เหลือ โดยเติมสารแต่ละชนิดลงในเชื้อเพาะเลี้ยงคนละส่วน บ่มเชื้อเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 15 min เก็บเชื้อเพาะเลี้ยงแต่ละส่วนปริมาตร 5 ml ด้วยการปั่นเหวี่ยง (8,525 × g, 4°C, 10 min) ล้างเซลล์สองครั้งด้วย PBS ปริมาตร 1 ml (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, เก็บในสภาวะไร้ออกซิเจนก่อนใช้) และปั่นเหวี่ยง (13,000 × g, 4°C, 10 min) แขวนลอยเซลล์ใหม่ในบัฟเฟอร์สลายเซลล์ (PBS ที่มี 6 mM guanidinium HCl, pH 7.4) ก่อนทำลายเซลล์ที่ 4°C ด้วยอัลตราโซนิก (VialTweeter ซึ่งเป็นเครื่องอัลตราโซนิกจาก Hielscher GmbH, เยอรมนี) (3 × 1 min) ทำให้เศษเซลล์ตกตะกอนด้วยการปั่นเหวี่ยง (13,000 × g, 4 °C, 15 min) ย้ายส่วนใสเหนือตะกอนไปยังคิวเวต QS-macro ขนาด 3.5-ml (10 mm) ที่มีแท่งกวนแม่เหล็ก และผสมกับบัฟเฟอร์สลายเซลล์ 1 ml ติดตามค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่างที่ 412 nm ด้วยเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ Jasco V-650 ที่ติดตั้งแท่นยึดเซลล์วัดแบบควบคุมอุณหภูมิ PSC-718 ที่อุณหภูมิห้อง เติมสารละลาย dithiobis(2-nitrobenzoic acid) 3 mM ปริมาตร 100μl ติดตามค่าการดูดกลืนแสงจนถึงระดับอิ่มตัว คำนวณความเข้มข้นของไทออลโดยใช้สัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสง ϵ₄₁₂ = 13,700 M^-1 cm^-1 สำหรับ thio-2-nitrobenzoic acid (TNB) คำนวณความเข้มข้นของไทออลภายในเซลล์โดยอิงปริมาตรเซลล์ E. coli เท่ากับ 6.7 × 10^-15 ลิตร และความหนาแน่นของเซลล์ A600 = 0.5 (เทียบเท่า 1 × 10⁸ เซลล์ต่อ ml^-1 ของเชื้อเพาะเลี้ยง) (Müller et al. 2016)

การหาปริมาณกลูตาไธโอนในสิ่งมีชีวิตโดยใช้เครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิก

เพาะเลี้ยง E.coli MG1655 ในอาหารเลี้ยงเชื้อขั้นต่ำ MOPS ปริมาตรรวม 200ml จนได้ค่า A600 เท่ากับ 0.5 แบ่งเชื้อเพาะเลี้ยงเป็นส่วนละ 50-ml สำหรับการให้สภาวะเครียด หลังบ่มเป็นเวลา 15 min กับ 0.79 mM allicin, 1 mM diamide หรือ dimethyl sulfoxide (ชุดควบคุม) เก็บเซลล์ด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ 4,000g ที่ 4°C เป็นเวลา 10 min ล้างเซลล์สองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ KPE ก่อนแขวนลอยตะกอนใหม่ในบัฟเฟอร์ KPE ปริมาตร 700µl สำหรับการกำจัดโปรตีน เติม sulfosalicylic acid ปริมาตร 300l ความเข้มข้น 10% (w/v) ก่อนทำลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิก (3 x 1 min; VialTweeter ซึ่งเป็นเครื่องอัลตราโซนิก) เก็บส่วนใสเหนือตะกอนหลังปั่นเหวี่ยง (30 min, 13,000g, 4°C) ลดความเข้มข้นของ sulfosalicylic acid เหลือ 1% โดยเติมบัฟเฟอร์ KPE ปริมาตร 3 เท่า วัดกลูตาไธโอนทั้งหมดและ GSSG ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น คำนวณความเข้มข้นของกลูตาไธโอนภายในเซลล์โดยอิงปริมาตรเซลล์ E. coli เท่ากับ 6.7×10^-15 ลิตร และความหนาแน่นของเซลล์ A600 0.5 (เทียบเท่า 1×10⁸ เซลล์ต่อ ml^-1 ของเชื้อเพาะเลี้ยง) คำนวณความเข้มข้นของ GSH โดยหัก 2[GSSG] ออกจากกลูตาไธโอนทั้งหมด (Müller et al. 2016)

การแสดงออกของ mAspAT ของมนุษย์ใน E. coli โดยใช้เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิก

นำโคโลนีเดี่ยวของ E. coli BL21 (DE3) ที่มีเวกเตอร์สำหรับการแสดงออกใส่ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Luria-Bertani (LB) 30 mL ที่มี ampicillin 100μg/mL แล้วเพาะเลี้ยงที่ 37ºC จนค่าความหนาแน่นเชิงแสง (OD₆₀₀) ถึง 0.6 เก็บเซลล์ด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ 4,000 × g เป็นเวลา 10 min และแขวนลอยใหม่ในอาหารเลี้ยงเชื้อ LB ใหม่ 3L ที่มี ampicillin 100μg/mL
จากนั้นเหนี่ยวนำการแสดงออกของโปรตีนด้วย isopropyl β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 1 mM เป็นเวลา 20 h ที่ 16ºC เก็บเซลล์ด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ 8,000 × g เป็นเวลา 15 min และล้างด้วยบัฟเฟอร์ A (NaH2PO4 20 mM, NaCl 0.5 M, pH 7.4) ได้เซลล์ประมาณ 45g (น้ำหนักเปียก) จากเชื้อเพาะเลี้ยง 3 L หลังปั่นเหวี่ยง แขวนลอยตะกอนเซลล์ใหม่ในบัฟเฟอร์สกัด A ที่เย็นจัดระดับน้ำแข็ง 40 mL (สำหรับเชื้อเพาะเลี้ยง 1 L) และสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกที่อุณหภูมิเย็นจัดระดับน้ำแข็งโดยใช้เครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิก Hielscher UP400St ปั่นเหวี่ยงไลเสตของเซลล์ที่ 12,000 rpm เป็นเวลา 15 min เพื่อแยกส่วนที่ละลายได้ (ส่วนใสเหนือตะกอน) และส่วนที่ตกตะกอน (ตะกอน) (Jiang et al. 2015)

หัวข้อที่เกี่ยวข้อง

ข้อเท็จจริงที่ควรรู้

E.coli

Escherichia coli (E. coli) เป็นแบคทีเรียโคลิฟอร์มแกรมลบ รูปแท่ง ที่ดำรงชีวิตได้ทั้งในสภาวะมีและไม่มีออกซิเจน อยู่ในสกุล Escherichia และพบได้ทั่วไปในลำไส้ส่วนล่างของสิ่งมีชีวิตเลือดอุ่น (สิ่งมีชีวิตที่สร้างความร้อนภายในร่างกาย) E. coli มีสายพันธุ์ (หรือชนิดย่อย) จำนวนมากที่มีลักษณะหลากหลาย สายพันธุ์ E. coli ส่วนใหญ่ไม่เป็นอันตรายต่อมนุษย์ เช่น สายพันธุ์ B และ K-12 ซึ่งใช้กันทั่วไปในงานวิจัยในห้องปฏิบัติการ อย่างไรก็ตาม บางสายพันธุ์เป็นอันตรายและอาจทำให้เกิดการเจ็บป่วยรุนแรง
E. coli มีบทบาทสำคัญในวิศวกรรมชีวภาพสมัยใหม่และจุลชีววิทยาอุตสาหกรรม เนื่องจากจัดการแบคทีเรียชนิดนี้ได้ง่าย งานทั่วไปในห้องปฏิบัติการที่มักใช้ E. coli ได้แก่ การสร้างกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก (DNA) รีคอมบิแนนท์ หรือการใช้เป็นสิ่งมีชีวิตต้นแบบ
E. coli เป็นเซลล์เจ้าบ้านที่รองรับการผลิตโปรตีนต่างชนิดได้หลากหลาย และมีระบบการแสดงออกของโปรตีนหลายแบบสำหรับผลิตโปรตีนรีคอมบิแนนท์ใน E. coli การใช้พลาสมิดที่ทำให้โปรตีนแสดงออกในระดับสูงช่วยให้นำยีนเข้าสู่แบคทีเรียได้ และทำให้ผลิตโปรตีนดังกล่าวได้ในปริมาณมากในกระบวนการหมักระดับอุตสาหกรรม
ใช้ E.coli เป็นโรงงานเซลล์เพื่อผลิตอินซูลิน การใช้งานอื่น ๆ ได้แก่ การใช้เซลล์ E. coli ที่ดัดแปลงแล้วเพื่อพัฒนาและผลิตวัคซีนและเอนไซม์ตรึงรูป เพื่อผลิตเชื้อเพลิงชีวภาพ รวมถึงเพื่อการบำบัดทางชีวภาพ
สายพันธุ์ K-12 เป็นรูปแบบกลายพันธุ์ของ E. coli ที่แสดงออกเอนไซม์อัลคาไลน์ฟอสฟาเทส (ALP) มากเกินระดับปกติ การกลายพันธุ์นี้เกิดจากความบกพร่องของยีนที่กำหนดรหัสสำหรับเอนไซม์อย่างต่อเนื่อง หากยีนผลิตผลิตภัณฑ์โดยไม่มีการยับยั้งใด ๆ จะเรียกว่าการทำงานแบบต่อเนื่อง รูปแบบกลายพันธุ์เฉพาะนี้ใช้ในการแยกและทำให้เอนไซม์ ALP บริสุทธิ์
แบคทีเรีย E. coli ยังใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นโรงงานเซลล์ จุลินทรีย์ที่ผ่านการดัดแปลงทางวิศวกรรม (เช่น แบคทีเรีย) และเซลล์พืชสามารถใช้เป็นสิ่งที่เรียกว่าโรงงานเซลล์ได้ เซลล์ที่ดัดแปลงพันธุกรรมเหล่านี้ผลิตโมเลกุล สารเคมี พอลิเมอร์ โปรตีน และสารอื่น ๆ ซึ่งใช้ในอุตสาหกรรมต่าง ๆ เช่น อุตสาหกรรมยา อาหาร และเคมี เพื่อปลดปล่อยโมเลกุลที่ผลิตขึ้นภายในเซลล์ที่ผ่านวิศวกรรมชีวภาพเหล่านี้ การสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกเป็นวิธีที่ใช้กันทั่วไปในการทำลายผนังเซลล์และถ่ายโอนสารเป้าหมายเข้าสู่ของเหลวโดยรอบ อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับการสลายเซลล์ที่ผ่านวิศวกรรมชีวภาพ!

การเฉือน DNA ด้วยอัลตราโซนิก

แรงเฉือนจากอัลตราโซนิกเป็นวิธีที่ใช้กันทั่วไปในการปลดปล่อยโมเลกุล ออร์แกเนลล์ และโปรตีนจากภายในเซลล์ รวมถึงการตัดสาย DNA ให้เป็นชิ้นส่วน คาวิเทชันเชิงเสียงทำลายผนังเซลล์และเยื่อหุ้มเซลล์เพื่อสกัด DNA จากเซลล์และสร้างชิ้นส่วนที่มีความยาวประมาณ 600 – 800 bp ซึ่งเหมาะสมที่สุดสำหรับการวิเคราะห์
คลิกที่นี่เพื่อเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับเครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกสำหรับการตัด DNA เป็นชิ้นส่วน!

วรรณกรรม / เอกสารอ้างอิง

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

อัลตราโซนิกสมรรถนะสูง! กลุ่มผลิตภัณฑ์ Hielscher ครอบคลุมครบทุกระดับ ตั้งแต่เครื่องอัลตราโซนิกขนาดกะทัดรัดสำหรับห้องปฏิบัติการ ผ่านเครื่องแบบตั้งโต๊ะ ไปจนถึงระบบอัลตราโซนิกระดับอุตสาหกรรมเต็มรูปแบบ

Hielscher Ultrasonics ผลิตเครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกสมรรถนะสูงตั้งแต่ ขนาดห้องปฏิบัติการ ไปจนถึง ขนาดอุตสาหกรรม