อัลตราโซนิก Lysis ของ. Coli

แบคทีเรีย. coli เป็นแบคทีเรียที่ใช้กันมากที่สุดในจุลชีววิทยาและเทคโนโลยีชีวภาพ
เครื่องรบกวนเซลล์อัลตราโซนิกให้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้และทําซ้ําได้สําหรับการสลายเชื้อ. coli
แรงเฉือนและโพรงอากาศที่เข้มข้นแต่ควบคุมได้อย่างแม่นยําส่งผลให้เกิดการหยุดชะงักอย่างสมบูรณ์และให้ผลผลิตการสกัดสูง (เช่น โปรตีน ดีเอ็นเอ)

เหตุใดการหยุดชะงักของเซลล์อัลตราโซนิกของ. coli จึงเป็นวิธีที่ต้องการ

โฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกหรือเครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบมีข้อดีหลายประการสําหรับการสลาย. coli เนื่องจากอัลตราซาวนด์ที่เข้มข้นจะทําลายผนังเซลล์และเยื่อหุ้มเซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบใช้กันอย่างแพร่หลายสําหรับการสลาย. coli เนื่องจากเหตุผลดังต่อไปนี้:

การหยุดชะงักของผนังเซลล์อย่างมีประสิทธิภาพ: . coli มีผนังเซลล์กึ่งแข็งซึ่งประกอบด้วยเปปติโดไกลแคน ซึ่งอาจทําลายได้ยากโดยใช้วิธีการสลายแบบดั้งเดิม เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบสร้างคลื่นอัลตราโซนิกที่รุนแรงซึ่งสร้างฟองอากาศในของเหลวรอบเซลล์ เมื่อฟองอากาศเหล่านี้ยุบตัวจะสร้างไอพ่นของเหลวความเร็วสูงและคลื่นกระแทกที่ส่งผลให้ผนังเซลล์หยุดชะงักทางกลปล่อยเนื้อหาของเซลล์เช่นโมเลกุลชีวภาพได้อย่างมีประสิทธิภาพ

การเจาะที่เพิ่มขึ้น: คลื่นอัลตราโซนิกที่เกิดจากโพรบ / sonotrode สามารถเจาะลึกเข้าไปในตัวอย่างเข้าถึงเซลล์. coli จํานวนมากขึ้นและรักษาอย่างสม่ําเสมอ สิ่งนี้ช่วยให้แน่ใจว่าการสลายมีความสม่ําเสมอมากขึ้นทั่วทั้งตัวอย่างส่งผลให้ประสิทธิภาพการหยุดชะงักของเซลล์สูงขึ้น

ลดเวลาในการดําเนินการ: พลังงานที่ส่งโดยเครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบมีความเข้มข้นสูงและแปลเป็นภาษาท้องถิ่นซึ่งนําไปสู่การสลายเซลล์ที่รวดเร็วและมีประสิทธิภาพ เมื่อเทียบกับวิธีการอื่น ๆ เช่นการตีลูกปัดหรือการสลายด้วยเอนไซม์การ sonication สามารถบรรลุการสลาย. coli ได้ภายในไม่กี่นาทีหรือแม้กระทั่งไม่กี่วินาที ในขณะที่เทคนิคทางเลือกหลายอย่างเช่นการแช่แข็งละลายต้องมีการรักษาหลายรอบการสลายอัลตราโซนิกจะเปิดเซลล์ในขั้นตอนกระบวนการเดียว

การควบคุมอุณหภูมิ: เครื่องอัลตราโซนิกที่ล้ําสมัยมีเซ็นเซอร์อุณหภูมิและซอฟต์แวร์อัจฉริยะซึ่งช่วยให้สามารถตั้งอุณหภูมิกระบวนการสูงสุดได้ เครื่องอัลตราโซนิกจะหยุดชั่วคราวโดยอัตโนมัติเมื่อถึงขีด จํากัด อุณหภูมิและเริ่มกระบวนการ sonication เมื่อถึงจุดอุณหภูมิที่ตั้งไว้ การทําให้ตัวอย่างเย็นลงในอ่างน้ําแข็งเป็นวิธีง่ายๆ ในการรักษาอุณหภูมิตัวอย่างให้ต่ําและป้องกันการเสื่อมสภาพของตัวอย่างที่เกิดจากความร้อน

ความสามารถในการปรับขนาด: เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบมีให้เลือกหลายขนาดตั้งแต่อุปกรณ์พกพาไปจนถึงรุ่นอุตสาหกรรมขนาดใหญ่ ทําให้เหมาะสําหรับการแปรรูปปริมาณน้อยในห้องปฏิบัติการหรือขยายขนาดสําหรับการใช้งานทางชีวภาพขนาดใหญ่ เช่น การผลิตวัคซีนหรือการสังเคราะห์โมเลกุลทางชีวภาพ

ความเก่งกาจ: เครื่องอัลตราโซนิกสามารถใช้สําหรับการใช้งานต่างๆนอกเหนือจากการสลายเซลล์เช่นการตัดดีเอ็นเอการสกัดโปรตีนการทําให้เป็นเนื้อเดียวกันของเนื้อเยื่อการกระจายอนุภาคนาโนและการทําให้เป็นอิมัลชัน ดังนั้นการลงทุนในเครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบจึงให้ความเก่งกาจในการวิจัยหรือการตั้งค่าอุตสาหกรรม

เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบเช่น UP200St เป็นโฮโมจีไนเซอร์เนื้อเยื่อและเครื่องบดเซลล์ที่เชื่อถือได้ดังนั้นจึงใช้กันอย่างแพร่หลายสําหรับการเตรียมตัวอย่างในพันธุศาสตร์เช่นสําหรับการสลาย E.coli

การสกัดโปรตีนจากเซลล์ E.coli ทําได้อย่างมีประสิทธิภาพด้วย โพรบอัลตราโซนิก UP200St

เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบมีข้อดีหลายประการสําหรับการสลาย. coli การควบคุมพารามิเตอร์กระบวนการอัลตราโซนิกที่เชื่อถือได้และแม่นยําช่วยให้สามารถปรับพารามิเตอร์การทํางานให้เหมาะสมเช่นกําลังระยะเวลาและการจัดการตัวอย่างเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ต้องการ

บทช่วยสอนนี้อธิบายว่าเครื่อง sonicator ประเภทใดดีที่สุดสําหรับงานเตรียมตัวอย่างของคุณเช่นการสลายการหยุดชะงักของเซลล์การแยกโปรตีนการกระจายตัวของ DNA และ RNA ในห้องปฏิบัติการการวิเคราะห์และการวิจัย เลือกประเภทเครื่องโซนิคเตอร์ที่เหมาะกับการใช้งานปริมาตรตัวอย่างจํานวนตัวอย่างและปริมาณงานของคุณ Hielscher Ultrasonics มีโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกที่เหมาะสําหรับคุณ!

การกระจายตัวของดีเอ็นเออัลตราโซนิกมักใช้เป็นขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างในการจัดลําดับรุ่นต่อไป (NGS)

การวิเคราะห์อิเล็กโทรโฟเรติกของ DNA จีโนมของ. coli EDL933 ภายใต้อัลตราโซนิก 0 – 15 นาที L หมายถึงบันไดดีเอ็นเอ
(การศึกษาและภาพ: ©Basselet et al. 2008)

การหยุดชะงักของเซลล์โดยใช้ Ultrasonic Cavitation

โฮโมจีไนเซอร์ชนิดโพรบอัลตราโซนิกทํางานด้วยประมาณ 20,000 รอบต่อวินาที (ที่ 20kHz) และทําให้เกิดโพรงอากาศในของเหลวหรือสารแขวนลอย โพรงอากาศอะคูสติกพื้นที่จุลทรรศน์ของความดันคล้ายสุญญากาศและอุณหภูมิสูงที่ฉีกเซลล์ออกจากกัน แม้ว่าอุณหภูมิอาจสูงถึงหลายพันองศาเซลเซียส แต่ปริมาตรโพรงอากาศมีขนาดเล็กมากจนไม่ทําให้กระบวนการร้อนขึ้นอย่างมีนัยสําคัญ อัลตราซาวนด์สร้างโพรงอากาศอะคูสติกและแรงเฉือนเจาะหรือทําลายเยื่อหุ้มเซลล์ของเซลล์แบคทีเรีย เช่น E.coli เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher ช่วยให้สามารถควบคุมพารามิเตอร์ของกระบวนการได้อย่างแม่นยําเช่นความเข้มของอัลตราโซนิกแอมพลิจูดอินพุตพลังงานและอุณหภูมิ ด้วยเหตุนี้กระบวนการสลายอัลตราโซนิกจึงสามารถปรับได้อย่างเหมาะสมที่สุดกับประเภทเซลล์การเพาะเลี้ยงเซลล์และเป้าหมายของกระบวนการ

ข้อดีของอัลตราโซนิก Lysis

การควบคุมการสลายที่แม่นยํา (ความเข้ม แอมพลิจูด อุณหภูมิ)
ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้และทําซ้ําได้
การปรับให้เข้ากับตัวอย่างเฉพาะที่เหมาะสมที่สุด
การควบคุมอุณหภูมิ
สําหรับตัวอย่างขนาดเล็กมากถึงขนาดใหญ่มาก (μL ถึงลิตร)
การรักษาทางกลล้วนๆ
ใช้งานง่ายและปลอดภัย
การขยายขนาดเชิงเส้นจากห้องปฏิบัติการสู่การผลิต

อุปกรณ์อัลตราโซนิก VialTweeter ช่วยให้สามารถเตรียมตัวอย่างได้ถึง 10 ขวดพร้อมกันภายใต้สภาวะกระบวนการเดียวกัน (คลิกเพื่อขยาย!)

ไวอัลทวีตเตอร์ สําหรับการสลายอัลตราโซนิก

Ultrasonic Homogenizer เทียบกับเทคนิคการสลายอื่น ๆ

ในขณะที่การสลายทางเคมีและเอนไซม์อาจเป็นปัญหาได้ – เนื่องจากการสลายทางเคมีสามารถเปลี่ยนแปลงโครงสร้างโปรตีนและทําให้เกิดปัญหาการทําให้บริสุทธิ์ และการสลายด้วยเอนไซม์ต้องใช้เวลาในการบ่มตัวนานและไม่สามารถทําซ้ําได้ – การหยุดชะงักของอัลตราโซนิกเป็นวิธีการหยุดชะงักของเซลล์ที่ซับซ้อนและรวดเร็ว
การสลายอัลตราโซนิกขึ้นอยู่กับแรงเชิงกลเท่านั้น ไม่มีการเพิ่มสารเคมี sonication ทําลายผนังเซลล์ด้วยแรงเฉือน การสลายทางเคมีสามารถเปลี่ยนแปลงโครงสร้างโปรตีนและทําให้เกิดปัญหาการทําให้บริสุทธิ์ได้ การหยุดชะงักของเอนไซม์ต้องใช้เวลาฟักตัวนานและไม่สามารถทําซ้ําได้ การหยุดชะงักของเซลล์อัลตราโซนิกของเซลล์แบคทีเรีย E.coli นั้นรวดเร็วง่ายเชื่อถือได้และทําซ้ําได้ นั่นคือเหตุผลที่เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher ถูกนํามาใช้ในห้องปฏิบัติการทางชีวภาพและชีวเคมีทั่วโลกสําหรับการเตรียมตัวอย่างก่อนการสอบ pre-ananlytics ไดแอกอนสติกในหลอดทดลองและการทดสอบท่อร่วม

คําแนะนําทั่วไปสําหรับ Ultrasonic Lysis

Sonication เป็นเทคนิคที่ได้รับความนิยมมากที่สุดสําหรับการสลายสารแขวนลอยเซลล์ขนาดเล็กขนาดกลางและปริมาณมาก – ตั้งแต่ pico-liters ถึง 100L/hr (โดยใช้เซลล์การไหลแบบอัลตราโซนิก) เซลล์ถูกสลายโดยการเฉือนของเหลวและโพรงอากาศ ดีเอ็นเอยังถูกตัดในระหว่างการ sonication ดังนั้นจึงไม่จําเป็นต้องเพิ่ม DNase ลงในสารแขวนลอยของเซลล์

การควบคุมอุณหภูมิระหว่างการสลายอัลตราโซนิก E.coli
โดยการทําให้ตัวอย่างเย็นลงล่วงหน้าและเก็บตัวอย่างไว้ระหว่างการ sonication บนน้ําแข็งสามารถป้องกันการเสื่อมสภาพความร้อนของตัวอย่างได้อย่างง่ายดาย
ตามหลักการแล้วควรเก็บตัวอย่างไว้ให้เย็นในระหว่างการสลาย แต่สําหรับตัวอย่างส่วนใหญ่ก็เพียงพอแล้วหากอุณหภูมิไม่สูงขึ้นเหนืออุณหภูมิของแหล่งเพาะเลี้ยงหรือเนื้อเยื่อ ดังนั้นจึงขอแนะนําให้เก็บสารแขวนลอยไว้บนน้ําแข็งและสะท้อนเสียงด้วยคลื่นอัลตราโซนิกสั้น ๆ หลายครั้งที่ 5-10 วินาทีและหยุดชั่วคราว 10-30 วินาที ในระหว่างการหยุดชั่วคราวความร้อนสามารถกระจายไปเพื่อสร้างอุณหภูมิต่ําอีกครั้ง สําหรับตัวอย่างเซลล์ขนาดใหญ่ มีเครื่องปฏิกรณ์เซลล์การไหลต่างๆ พร้อมแจ็คเก็ตทําความเย็น
อ่านเคล็ดลับโดยละเอียดและคําแนะนําสําหรับการสลายอัลตราโซนิกที่ประสบความสําเร็จที่นี่!

โปรโตคอลสําหรับการเตรียมอัลตราโซนิกของ. coli lysates

นักวิจัยใช้โฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิก Hielscher สําหรับการหยุดชะงักของเซลล์ E.coli ด้านล่างนี้คุณสามารถค้นหาโปรโตคอลที่ผ่านการทดสอบและพิสูจน์แล้วสําหรับการสลาย E.coli โดยใช้โฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิก Hielscher สําหรับการใช้งานที่เกี่ยวข้องกับ. coli ต่างๆ

การเจริญเติบโตของเซลล์ การเชื่อมขวาง และการเตรียมสารสกัดจากเซลล์. coli โดยใช้อัลตราโซนิก

สําหรับ SeqA และ RNA polymerase ChIP-Chip. coli MG1655 หรือ MG1655 ΔseqA เติบโตที่อุณหภูมิ 37°C เป็น OD₆₀₀ ประมาณ 0.15 ใน 50 มล. LB (+ กลูโคส 0.2%) ก่อนเติมฟอร์มาลดีไฮด์ 27 ไมโครลิตร (37%) ต่อสื่อมล. (ความเข้มข้นสุดท้าย 1%) การเชื่อมขวางดําเนินการที่เขย่าช้า (100 รอบต่อนาที) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 นาที ตามด้วยการดับด้วยไกลซีน 2.5 M 10 มล. (ความเข้มข้นสุดท้าย 0.5 M) สําหรับการทดลองช็อตด้วยความร้อน. coli MG1655 ถูกปลูกในตัวกลาง LB ขนาด 65 มล. ที่ 30°C ถึง OD₆₀₀ ประมาณ 0.3 ต่อจากนั้นการเพาะเลี้ยง 30 มล. ถูกถ่ายโอนไปยังขวดที่อุ่นไว้ล่วงหน้าที่ 43°C และส่วนที่เหลือเก็บไว้ที่ 30°C การเชื่อมขวางและการดับเป็นไปตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ยกเว้นว่าเซลล์จะถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 30 หรือ 43°C เป็นเวลา 5 นาทีก่อนที่จะเขย่าช้าๆ ที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ถูกรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงและล้างสองครั้งด้วย TBS เย็น (pH7.5) หลังจากการระงับในบัฟเฟอร์ไลซิส 1 มล. (10 mM Tris (pH 8.0), ซูโครส 20%, NaCl 50 mM, EDTA 10 mM, ไลโซไซม์ 10 มก./มล.) และการฟักตัวที่อุณหภูมิ 37 °C เป็นเวลา 30 นาที ตามด้วยการเติมบัฟเฟอร์ IP 4 มล. เซลล์จะถูกโซนิกบนน้ําแข็งด้วยการหยุดพัก 12 ครั้ง 30 วินาทีและ 30 วินาทีโดยใช้โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิก Hielscher UP400St ที่การตั้งค่าพลังงาน 100% หลังจากการหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 10 นาทีที่ 9000 กรัม ส่วนแบ่ง 800 ไมโครลิตรของส่วนเหนือน้ําถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20°C (วัลด์มิงเฮาส์ 2010)

การผลิตมากเกินไปและการทําให้บริสุทธิ์ของเอนไซม์ด้วยโพรบอัลตราโซนิก

สําหรับการผลิตโปรตีนที่ติดแท็ก decahistidine (His10) มากเกินไป. coli BL21(DE3) ถูกแปลงด้วยโครงสร้าง pET19b การเพาะเลี้ยงก่อนข้ามคืนถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงและ 1% ถูกนํามาใช้เพื่อฉีดวัคซีนเพาะเลี้ยงที่แสดงออก เซลล์ที่มี pET19mgtB เติบโตที่อุณหภูมิ 22°C จนกระทั่งความหนาแน่นของแสงที่ 600 นาโนเมตร (OD600) เท่ากับ 0.7 การเพาะเลี้ยงถูกถ่ายโอนไปที่ 17°C และเหนี่ยวนําโดย IPTG 100 μM หลังจากผ่านไป 16 ชั่วโมง เพาะเลี้ยงถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่อุณหภูมิ 7,500 × กรัมที่ 4°C เซลล์ถูกระงับในน้ําเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) 50 mM ที่มี 0.3 M NaCl ที่ค่า pH 7.4 และหยุดชะงักโดยอัลตราโซนิกด้วยโซโนโทรดไมโครทิป S2 ที่เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher UP200St ที่รอบ 0.5 และแอมพลิจูด 75%
การผลิต GtfC ที่ติดแท็ก decahistidine มากเกินไปถูกเหนี่ยวนําที่ 37°C ที่ OD₆₀₀ จาก 0.6 กับ IPTG 100 μM จากนั้นเซลล์จะถูกบ่มเป็นเวลา 4 ชั่วโมง เก็บเกี่ยว และไลซิสตามที่ระบุไว้ข้างต้นสําหรับ MgtB
สารสกัดจากเซลล์ดิบถูกหมุนเหวี่ยงที่อุณหภูมิ 15,000 × กรัมและ 4°C เพื่อตกตะกอนเศษเซลล์ สารสกัดที่กระจ่างแล้วถูกโหลดลงในคอลัมน์ HisTrap FF Crude ขนาด 1 มล. โดยใช้ระบบ ÄKTAprime Plus เอนไซม์ได้รับการทําให้บริสุทธิ์ตามโปรโตคอลของผู้ผลิตสําหรับการชะไล่ระดับสีของโปรตีนที่ติดแท็ก His. สารละลายโปรตีนที่ชะล้างแล้วถูกไดอะไลซ์สองครั้งกับปริมาตร 1,000 ปริมาตรของ 50 mM PBS, pH 7.4 โดยมี 0.3 M NaCl ที่ 4°C การทําให้บริสุทธิ์ถูกวิเคราะห์โดย 12% SDS-PAGE ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกําหนดโดยวิธีแบรดฟอร์ดโดยใช้ Roti-Quant (Rabausch et al. 2013)

การสกัดโปรตีนด้วยอัลตราโซนิกจากแบคทีเรีย. coli
โปรตีนเหยื่อที่น่าสนใจ (ในกรณีนี้คือ MTV1 ของ Arabidopsis thaliana) ถูกหลอมรวมเข้ากับแท็ก GST และแสดงออกในเซลล์ BL21 Escherichia coli. coli)

นํา GST-MTV1 และ GST หนึ่งเม็ด (สอดคล้องกับการเพาะเชื้อแบคทีเรีย 50 มล.) และระงับแต่ละเม็ดในบัฟเฟอร์การสกัดเย็น 2.5 มล.
ใช้เครื่องอัลตราโซนิก UP100H (พร้อมกับ MS3 microtip-sonotrode สําหรับปริมาณเล็กน้อยประมาณ 2-5 มล.) เพื่อขัดขวางเซลล์แบคทีเรียจนกว่าจะสลาย ซึ่งบ่งชี้ด้วยความทึบแสงที่ลดลงและความหนืดที่เพิ่มขึ้น สิ่งนี้ต้องดําเนินการบนน้ําแข็ง และแนะนําให้ทํา sonicate เป็นระยะ ๆ (เช่น sonicating 10 วินาที ตามด้วยการหยุดชั่วคราว 10 วินาทีบนน้ําแข็ง เป็นต้น ต้องใช้ความระมัดระวังเพื่อไม่ให้ sonicate ด้วยความเข้มสูงเกินไป หากตรวจพบการเกิดฟองหรือการก่อตัวของตะกอนสีขาวความเข้มจะต้องลดลง
ถ่ายโอนสารละลายแบคทีเรียที่สลายแล้วไปยังหลอดไมโครเซนตอริ่งเหวี่ยง 1.5 มล. และหมุนเหวี่ยงที่อุณหภูมิ 4°C, 16,000 x g เป็นเวลา 20 นาที

โพรบอัลตราโซนิกใช้แรงของโพรงอากาศอะคูสติกเพื่อขัดขวางเซลล์และสกัดโมเลกุลและ DNA จาก E.coli

เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบเช่น UP400St ใช้หลักการทํางานของโพรงอากาศอะคูสติกเพื่อการสลาย E.coli อย่างมีประสิทธิภาพ

การวิเคราะห์การแสดงออกและการทําให้บริสุทธิ์ของโปรตีนรีคอมบิแนนท์โดยใช้ Sonication

เม็ด. coli ถูก sonicated ด้วยเครื่องอัลตราโซนิก Hielscher UP100H เพื่อจุดประสงค์นี้ เม็ดเซลล์ถูกแขวนลอยในบัฟเฟอร์การสลายที่แช่เย็น (50 mM Tris-HCl pH=7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) และเย็นลงบนน้ําแข็งเป็นเวลา 10 นาที จากนั้นการแขวนลอยของเซลล์จะถูก sonicated ด้วยการระเบิดสั้น ๆ 10 ครั้งของ 10 วินาทีตามด้วยช่วงเวลา 30 วินาทีเพื่อระบายความร้อน ในที่สุดเศษเซลล์ถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยงเป็นพิเศษที่ 4°C เป็นเวลา 15 นาทีที่ 14000 รอบต่อนาที สําหรับการยืนยันการแสดงออกของ rPR สารคัดหน้าถูกเรียกใช้บนเจลโพลีอะคริลาไมด์ 12% และวิเคราะห์โดย SDS-PAGE และ Western blotting การทําให้บริสุทธิ์ของ rPR ทําได้โดยใช้เรซิน Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) ตามคู่มือของผู้ผลิต ในขั้นตอนนี้ใช้วิธีการทําให้บริสุทธิ์แบบดั้งเดิม ความบริสุทธิ์ของโปรตีนบริสุทธิ์ได้รับการประเมินโดยใช้อิเล็กโทรโฟรีซิสบนเจลโพลีอะคริลาไมด์ 12% และการย้อมสีสีน้ําเงินคูแมสซีที่ตามมา วัดความเข้มข้นของโปรตีนบริสุทธิ์โดยชุดทดสอบโปรตีน Micro BCA (PIERCE, USA) (Azarnezhad et al. 2016)

วิดีโอนี้แสดง cuphorn อัลตราโซนิก 200 วัตต์สําหรับการกระจาย homogenizing การสกัดหรือการขจัดแก๊สของตัวอย่างในห้องปฏิบัติการ

อัลตราโซนิก Homogenizers สําหรับ. coli Lysis

Hielscher Ultrasonics ออกแบบผลิตและจัดหาโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงสําหรับการสลายแบคทีเรีย. coli และเซลล์ประเภทอื่น ๆ เนื้อเยื่อและการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่เชื่อถือได้และมีประสิทธิภาพ
กลุ่มผลิตภัณฑ์ที่กว้างขวางของโพรบอัลตราโซนิกรวมถึงระบบ sonication ทางอ้อมช่วยให้เราสามารถนําเสนอ homogenizer เนื้อเยื่ออัลตราโซนิกในอุดมคติสําหรับการหยุดชะงักของเซลล์และการสกัดของคุณ

การออกแบบ การผลิต และการให้คําปรึกษา – คุณภาพ ผลิตในประเทศเยอรมนี

เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher เป็นที่รู้จักกันดีในด้านคุณภาพและมาตรฐานการออกแบบสูงสุด ซอฟต์แวร์อัจฉริยะเมนูที่ใช้งานง่ายการตั้งค่าที่ตั้งโปรแกรมได้และโปรโตคอลข้อมูลอัตโนมัติเป็นเพียงคุณสมบัติบางประการของเครื่องอัลตราโซนิก Hielscher ความทนทานและใช้งานง่ายช่วยให้สามารถรวมเครื่องอัลตราโซนิกของเราเข้ากับสิ่งอํานวยความสะดวกด้านการวิจัยและเทคโนโลยีชีวภาพได้อย่างราบรื่น แม้แต่สภาพที่ขรุขระและสภาพแวดล้อมที่ต้องการก็สามารถจัดการได้อย่างง่ายดายโดยเครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher

Hielscher Ultrasonics เป็น บริษัท ที่ได้รับการรับรองมาตรฐาน ISO และให้ความสําคัญเป็นพิเศษกับเครื่องอัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงที่มีเทคโนโลยีล้ําสมัยและเป็นมิตรกับผู้ใช้ แน่นอนว่าเครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher เป็นไปตามมาตรฐาน CE และตรงตามข้อกําหนดของ UL, CSA และ RoHs

ตารางด้านล่างให้ข้อบ่งชี้ถึงความสามารถในการประมวลผลโดยประมาณของเครื่องอัลตราโซนิกของเรา:

ปริมาณแบทช์	อัตราการไหล	อุปกรณ์ที่แนะนํา
แผ่นมัลติเวล / ไมโครไทเตอร์	ไม่	UIP400MTP
CupHorn สําหรับขวดหรือบีกเกอร์	ไม่	อัลตราโซนิก CupHorn
เครื่องปฏิกรณ์ไมโครโฟลว์อัลตราโซนิก	ไม่	จีดีมินิ 2
สูงสุด 10 ขวด ขนาด 0.5 ถึง 1.5 มล.	ไม่	ไวอัลทวีตเตอร์
0.5 ถึง 1.5 มล.	ไม่	ไวอัลทวีตเตอร์
1 ถึง 500 มล.	10 ถึง 200 มล. / นาที	UP100H
10 ถึง 2000 มล.	20 ถึง 400 มล. / นาที	UP200 ฮิต, UP400ST
0.1 ถึง 20L	0.2 ถึง 4L / นาที	UIP2000hdt
10 ถึง 100L	2 ถึง 10L / นาที	ยูไอพี 4000
ไม่	10 ถึง 100L / นาที	UIP16000
ไม่	ขนาด ใหญ่	คลัสเตอร์ของ UIP16000

ติดต่อเรา! / ถามเรา!

สอบถามข้อมูลเพิ่มเติม

โปรดใช้แบบฟอร์มด้านล่างเพื่อขอข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับโฮโมจีไนเซอร์เนื้อเยื่ออัลตราโซนิกและเครื่องบดเซลล์การใช้งาน lysis และราคา เรายินดีที่จะหารือเกี่ยวกับกระบวนการของคุณกับคุณและเสนอโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกที่ตอบสนองความต้องการของคุณ!

ที่อยู่อีเมล (จําเป็น)

หมายเลขโทรศัพท์

ชื่อ

ดอกเบี้ย

วิดีโอแสดง UIP400MTP ระบบการเตรียมตัวอย่างอัลตราโซนิก ซึ่งช่วยให้สามารถเตรียมตัวอย่างของเพลตหลายหลุมมาตรฐานได้อย่างน่าเชื่อถือโดยใช้อัลตราซาวนด์ความเข้มสูง การใช้งานทั่วไปของ UIP400MTP ได้แก่ การสลายเซลล์ DNA, RNA และการตัดโครมาติน ตลอดจนการสกัดโปรตีน

โปรโตคอลเพิ่มเติมสําหรับ Ultrasonic. coli Lysis

โปรตีนดัดแปลงอัลลิซินใน. coli โดยใช้ Ultrasonic VialTweeter

การหาปริมาณซัลฟิดริลโดยการทดสอบ 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB)
ใช้การเพาะเชื้อข้ามคืนของ. coli MG1655 เพื่อฉีดวัคซีนอาหารกลางขั้นต่ําของ MOPS (1:100) วัฒนธรรมนี้เติบโตแบบแอโรบิกจนกระทั่งถึง A600 ที่ 0.4 การเพาะเชื้อถูกแบ่งออกเป็นสามวัฒนธรรมขนาด 15 มล. เพื่อรักษาความเครียด วัฒนธรรมที่ไม่ได้รับการบําบัดทําหน้าที่เป็นการควบคุมเชิงลบ มีการเติมอัลลิซิน 0.79 มิลลิซิน (128 ไมโครกรัม มล.-1) หรือ 1 มิลลิเมตร ไดอะไมด์ลงในหนึ่งในสองวัฒนธรรมที่เหลือ การเพาะเลี้ยงถูกบ่มเป็นเวลา 15 นาที การเพาะเลี้ยงแต่ละชนิด 5 มล. ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยง (8,525 × g, 4°C, 10 นาที) เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS 1 มล. (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, เก็บไว้แบบไม่ใช้ออกซิเจนก่อนใช้) และหมุนเหวี่ยง (13,000 × g, 4°C, 10 นาที) เซลล์ถูกระงับในบัฟเฟอร์การสลาย (PBS ที่มี 6 mM guanidinium HCl, pH 7.4) ก่อนที่จะหยุดชะงักที่ 4 °C โดยอัลตราโซนิก (ไวอัลทวีตเตอร์ เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher GmbH ประเทศเยอรมนี) (3 × 1 นาที) เศษเซลล์ถูกอัดเม็ดโดยการหมุนเหวี่ยง (13,000 × g, 4 °C, 15 นาที) สารคัดน้ําถูกถ่ายโอนไปยังคิวเวตต์ QS-macro ขนาด 3.5 มล. (10 มม.) ด้วยแถบกวนแม่เหล็กและผสมกับบัฟเฟอร์การสลาย 1 มล. การสูญพันธุ์ของตัวอย่างได้รับการตรวจสอบที่ 412 นาโนเมตรด้วยเครื่องวัดสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ Jasco V-650 ที่ติดตั้งตัวยึดเซลล์ควบคุมอุณหภูมิ PSC-718 ที่อุณหภูมิห้อง เติมสารละลาย dithiobis (2-nitrobenzoic acid) 3 mM 100μl การสูญพันธุ์ได้รับการตรวจสอบจนกว่าจะอิ่มตัว การคํานวณความเข้มข้นของไทออลดําเนินการโดยใช้ค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ ε₄₁₂ = 13,700 ล้าน^-1 เซนติเมตร^-1 สําหรับกรดไทโอ-2-ไนโตรเบนโซอิก (TNB) ความเข้มข้นของไทออลของเซลล์คํานวณจากปริมาตรของเซลล์. coli ที่ 6.7 × 10^-15 ลิตรและความหนาแน่นของเซลล์ A600 = 0.5 (เทียบเท่า 1 × 10⁸ เซลล์ ML^-1 วัฒนธรรม) (Müller et al. 2016)

การตรวจวัดกลูตาไธโอนในร่างกายโดยใช้เครื่องบดเซลล์อัลตราโซนิก

E.coli MG1655 เติบโตในอาหารกลางขั้นต่ํา MOPS ในปริมาตรรวม 200 มล. จนกระทั่งถึง A600 0.5 การเพาะเชื้อถูกแบ่งออกเป็นการเพาะเชื้อขนาด 50 มล. เพื่อการรักษาความเครียด หลังจากการฟักตัว 15 นาทีด้วยอัลลิซิน 0.79 mM, ไดอะไมด์ 1 mM หรือไดเมทิลซัลฟออกไซด์ (กลุ่มควบคุม) เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวที่ 4,000 กรัมที่ 4°C เป็นเวลา 10 นาที เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ KPE ก่อนที่จะระงับเม็ดในบัฟเฟอร์ KPE 700μl สําหรับการ deproteination กรดซัลโฟซาลิไซลิก 300% (w / v) 10 ลิตรจะถูกเติมก่อนที่จะหยุดชะงักของเซลล์โดยอัลตราโซนิก (3 x 1 นาที; ไวอัลทวีตเตอร์ อัลตราโซนิก) ส่วนเหนือน้ําถูกรวบรวมหลังจากการหมุนเหวี่ยง (30 นาที, 13,000g, 4°C) ความเข้มข้นของกรดซัลโฟซาลิไซลิกลดลงเหลือ 1% โดยการเติมบัฟเฟอร์ KPE 3 ปริมาตร การวัดกลูตาไธโอนทั้งหมดและ GSSG ดําเนินการตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ความเข้มข้นของกลูตาไธโอนของเซลล์คํานวณจากปริมาตรของเซลล์. coli ที่ 6.7×10^-15 ลิตรและความหนาแน่นของเซลล์ A600 0.5 (เทียบเท่า 1×10⁸ เซลล์ ML^-1 วัฒนธรรม) ความเข้มข้นของ GSH คํานวณโดยการลบ 2 [GSSG] จากกลูตาไธโอนทั้งหมด (Müller et al. 2016)

การแสดงออกของ mAspAT ของมนุษย์ใน. coli โดยใช้ Ultrasonic Homogenizer

โคโลนีเดี่ยวของ. coli BL21 (DE3) ที่มีเวกเตอร์การแสดงออกในตัวกลาง Luria-Bertani (LB) 30 มล. ที่มีแอมพิซิลลิน 100μg/mL จากนั้นเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37ºC จนกระทั่งความหนาแน่นของแสง (OD₆₀₀) ถึง 0.6 เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 4,000 × กรัมเป็นเวลา 10 นาที และแขวนลอยใหม่ในตัวอาหาร LB สด 3 ลิตรที่มีแอมพิซิลลิน 100μg/mL
ต่อจากนั้นการแสดงออกของโปรตีนถูกเหนี่ยวนําด้วยไอโซโพรพิล 1 mM β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) เป็นเวลา 20 ชั่วโมงที่ 16ºC เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 8,000 × กรัมเป็นเวลา 15 นาที และล้างด้วยบัฟเฟอร์ A (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4) ได้เซลล์ประมาณ 45 กรัม (น้ําหนักเปียก) จากการเพาะเลี้ยง 3 ลิตร หลังจากการหมุนเหวี่ยงเม็ดเซลล์จะถูกระงับในบัฟเฟอร์การสกัดเย็น A ขนาด 40 มล. (สําหรับการเพาะเลี้ยง 1 ลิตร) และไลซิสโดยการอัลตราโซนิกที่อุณหภูมิเย็นจัดโดยใช้เครื่องบดเซลล์อัลตราโซนิก Hielscher UP400St การสลายเซลล์ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 15 นาทีเพื่อแยกเศษส่วนที่ละลายน้ําได้ (เหนือธรรมชาติ) และตกตะกอน (เม็ด) (Jiang et al. 2015)

หัวข้อที่เกี่ยวข้อง

ข้อเท็จจริงที่ควรค่าแก่การรู้

อีโคไล

Escherichia coli. coli) เป็นแบคทีเรียโคลิฟอร์มแกรมลบแบบไม่ใช้ออกซิเจนรูปแท่งในสกุล Escherichia ซึ่งพบได้ทั่วไปในลําไส้ส่วนล่างของสิ่งมีชีวิตเลือดอุ่น (เอนโดเทอร์ม) มีสายพันธุ์. coli (หรือชนิดย่อย) จํานวนมากที่มีลักษณะที่หลากหลาย สายพันธุ์. coli ส่วนใหญ่ไม่เป็นอันตรายต่อมนุษย์ เช่น สายพันธุ์ B และ K-12 ซึ่งใช้กันทั่วไปสําหรับการใช้งานวิจัยในห้องปฏิบัติการ อย่างไรก็ตาม บางสายพันธุ์เป็นอันตรายและอาจทําให้เกิดการเจ็บป่วยร้ายแรงได้
. coli มีบทบาทสําคัญในวิศวกรรมชีวภาพสมัยใหม่และจุลชีววิทยาอุตสาหกรรม เนื่องจากแบคทีเรียสามารถจัดการได้ง่าย การใช้งานในห้องปฏิบัติการทั่วไปซึ่งมักเกี่ยวข้องกับการใช้. coli เช่น เพื่อสร้างกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก (DNA) หรือทําหน้าที่เป็นสิ่งมีชีวิตแบบจําลอง
. coli เป็นโฮสต์อเนกประสงค์สําหรับการผลิตโปรตีนต่างชนิด และระบบการแสดงออกของโปรตีนที่หลากหลายมีให้ในการผลิตโปรตีนรีคอมบิแนนท์ใน. coli การใช้พลาสมิดที่อนุญาตให้แสดงออกของโปรตีนในระดับสูงยีนสามารถนําเข้าสู่แบคทีเรียซึ่งช่วยให้สามารถผลิตโปรตีนดังกล่าวในปริมาณมากในกระบวนการหมักทางอุตสาหกรรม
E.coli ใช้เป็นโรงงานเซลล์ในการผลิตอินซูลิน การใช้งานเพิ่มเติม ได้แก่ การใช้เซลล์. coli ที่ดัดแปลงเพื่อพัฒนาและผลิตวัคซีนและเอนไซม์ที่ตรึงไว้ เพื่อผลิตเชื้อเพลิงชีวภาพ ตลอดจนการบําบัดทางชีวภาพ
สายพันธุ์ K-12 เป็นรูปแบบกลายพันธุ์ของ. coli ที่แสดงออกของเอนไซม์อัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (ALP) มากเกินไป การกลายพันธุ์นี้เกิดขึ้นเนื่องจากข้อบกพร่องในยีนที่เข้ารหัสเอนไซม์อย่างต่อเนื่อง หากยีนผลิตผลิตภัณฑ์โดยไม่มีการยับยั้งใด ๆ สิ่งนี้เรียกว่ากิจกรรมที่เป็นส่วนประกอบ รูปแบบการกลายพันธุ์เฉพาะนี้ใช้สําหรับการแยกและทําให้เอนไซม์ ALP บริสุทธิ์
แบคทีเรีย. coli ยังใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นโรงงานเซลล์ จุลินทรีย์ที่ผ่านการวิศวกรรม (เช่น แบคทีเรีย) และเซลล์พืชสามารถใช้เป็นโรงงานเซลล์ได้ เซลล์ดัดแปลงพันธุกรรมเหล่านี้ผลิตโมเลกุล สารเคมี โพลีเมอร์ โปรตีน และสารอื่นๆ ซึ่งใช้ในอุตสาหกรรมยา อาหาร และเคมีภัณฑ์ ในการปลดปล่อยโมเลกุลที่ผลิตภายในเซลล์ทางวิศวกรรมชีวภาพดังกล่าวการสลายอัลตราโซนิกเป็นวิธีทั่วไปในการทําลายผนังเซลล์และถ่ายโอนสารเป้าหมายไปยังของเหลวโดยรอบ อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับการสลายตัวของเซลล์วิศวกรรมชีวภาพ!

การตัด DNA อัลตราโซนิก

แรงเฉือนอัลตราโซนิกเป็นวิธีที่ใช้กันทั่วไปในการปล่อยโมเลกุลออร์แกเนลล์และโปรตีนออกจากภายในเซลล์รวมทั้งทําลายสาย DNA เป็นชิ้น ๆ โพรงอากาศอะคูสติกทําลายผนังเซลล์และเยื่อหุ้มเซลล์เพื่อสกัดดีเอ็นเอจากเซลล์และสร้างชิ้นส่วนประมาณ 600 ชิ้น – ความยาว 800 bp ซึ่งเหมาะสําหรับการวิเคราะห์
คลิกที่นี่เพื่อเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกสําหรับการกระจายตัวของดีเอ็นเอ!

วรรณกรรม / อ้างอิง

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

อัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูง! กลุ่มผลิตภัณฑ์ Hielscher ครอบคลุมสเปกตรัมเต็มรูปแบบตั้งแต่เครื่องอัลตราโซนิกในห้องปฏิบัติการขนาดกะทัดรัดบนหน่วยตั้งโต๊ะไปจนถึงระบบอัลตราโซนิกอุตสาหกรรมเต็มรูปแบบ

Hielscher Ultrasonics ผลิตโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงจาก ห้องทดลอง ถึง ขนาดอุตสาหกรรม