อัลตราโซนิก Lysis ของ. Coli
- แบคทีเรีย. coli เป็นแบคทีเรียที่ใช้กันมากที่สุดในจุลชีววิทยาและเทคโนโลยีชีวภาพ
- เครื่องรบกวนเซลล์อัลตราโซนิกให้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้และทําซ้ําได้สําหรับการสลายเชื้อ. coli
- แรงเฉือนและโพรงอากาศที่เข้มข้นแต่ควบคุมได้อย่างแม่นยําส่งผลให้เกิดการหยุดชะงักอย่างสมบูรณ์และให้ผลผลิตการสกัดสูง (เช่น โปรตีน ดีเอ็นเอ)
เหตุใดการหยุดชะงักของเซลล์อัลตราโซนิกของ. coli จึงเป็นวิธีที่ต้องการ
โฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกหรือเครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบมีข้อดีหลายประการสําหรับการสลาย. coli เนื่องจากอัลตราซาวนด์ที่เข้มข้นจะทําลายผนังเซลล์และเยื่อหุ้มเซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบใช้กันอย่างแพร่หลายสําหรับการสลาย. coli เนื่องจากเหตุผลดังต่อไปนี้:
การสกัดโปรตีนจากเซลล์ E.coli ทําได้อย่างมีประสิทธิภาพด้วย โพรบอัลตราโซนิก UP200St
เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบมีข้อดีหลายประการสําหรับการสลาย. coli การควบคุมพารามิเตอร์กระบวนการอัลตราโซนิกที่เชื่อถือได้และแม่นยําช่วยให้สามารถปรับพารามิเตอร์การทํางานให้เหมาะสมเช่นกําลังระยะเวลาและการจัดการตัวอย่างเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ต้องการ
การวิเคราะห์อิเล็กโทรโฟเรติกของ DNA จีโนมของ. coli EDL933 ภายใต้อัลตราโซนิก 0 – 15 นาที L หมายถึงบันไดดีเอ็นเอ
(การศึกษาและภาพ: ©Basselet et al. 2008)
การหยุดชะงักของเซลล์โดยใช้ Ultrasonic Cavitation
โฮโมจีไนเซอร์ชนิดโพรบอัลตราโซนิกทํางานด้วยประมาณ 20,000 รอบต่อวินาที (ที่ 20kHz) และทําให้เกิดโพรงอากาศในของเหลวหรือสารแขวนลอย โพรงอากาศอะคูสติกพื้นที่จุลทรรศน์ของความดันคล้ายสุญญากาศและอุณหภูมิสูงที่ฉีกเซลล์ออกจากกัน แม้ว่าอุณหภูมิอาจสูงถึงหลายพันองศาเซลเซียส แต่ปริมาตรโพรงอากาศมีขนาดเล็กมากจนไม่ทําให้กระบวนการร้อนขึ้นอย่างมีนัยสําคัญ อัลตราซาวนด์สร้างโพรงอากาศอะคูสติกและแรงเฉือนเจาะหรือทําลายเยื่อหุ้มเซลล์ของเซลล์แบคทีเรีย เช่น E.coli เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher ช่วยให้สามารถควบคุมพารามิเตอร์ของกระบวนการได้อย่างแม่นยําเช่นความเข้มของอัลตราโซนิกแอมพลิจูดอินพุตพลังงานและอุณหภูมิ ด้วยเหตุนี้กระบวนการสลายอัลตราโซนิกจึงสามารถปรับได้อย่างเหมาะสมที่สุดกับประเภทเซลล์การเพาะเลี้ยงเซลล์และเป้าหมายของกระบวนการ
- การควบคุมการสลายที่แม่นยํา (ความเข้ม แอมพลิจูด อุณหภูมิ)
- ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้และทําซ้ําได้
- การปรับให้เข้ากับตัวอย่างเฉพาะที่เหมาะสมที่สุด
- การควบคุมอุณหภูมิ
- สําหรับตัวอย่างขนาดเล็กมากถึงขนาดใหญ่มาก (μL ถึงลิตร)
- การรักษาทางกลล้วนๆ
- ใช้งานง่ายและปลอดภัย
- การขยายขนาดเชิงเส้นจากห้องปฏิบัติการสู่การผลิต
ไวอัลทวีตเตอร์ สําหรับการสลายอัลตราโซนิก
Ultrasonic Homogenizer เทียบกับเทคนิคการสลายอื่น ๆ
ในขณะที่การสลายทางเคมีและเอนไซม์อาจเป็นปัญหาได้ – เนื่องจากการสลายทางเคมีสามารถเปลี่ยนแปลงโครงสร้างโปรตีนและทําให้เกิดปัญหาการทําให้บริสุทธิ์ และการสลายด้วยเอนไซม์ต้องใช้เวลาในการบ่มตัวนานและไม่สามารถทําซ้ําได้ – การหยุดชะงักของอัลตราโซนิกเป็นวิธีการหยุดชะงักของเซลล์ที่ซับซ้อนและรวดเร็ว
การสลายอัลตราโซนิกขึ้นอยู่กับแรงเชิงกลเท่านั้น ไม่มีการเพิ่มสารเคมี sonication ทําลายผนังเซลล์ด้วยแรงเฉือน การสลายทางเคมีสามารถเปลี่ยนแปลงโครงสร้างโปรตีนและทําให้เกิดปัญหาการทําให้บริสุทธิ์ได้ การหยุดชะงักของเอนไซม์ต้องใช้เวลาฟักตัวนานและไม่สามารถทําซ้ําได้ การหยุดชะงักของเซลล์อัลตราโซนิกของเซลล์แบคทีเรีย E.coli นั้นรวดเร็วง่ายเชื่อถือได้และทําซ้ําได้ นั่นคือเหตุผลที่เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher ถูกนํามาใช้ในห้องปฏิบัติการทางชีวภาพและชีวเคมีทั่วโลกสําหรับการเตรียมตัวอย่างก่อนการสอบ pre-ananlytics ไดแอกอนสติกในหลอดทดลองและการทดสอบท่อร่วม
คําแนะนําทั่วไปสําหรับ Ultrasonic Lysis
Sonication เป็นเทคนิคที่ได้รับความนิยมมากที่สุดสําหรับการสลายสารแขวนลอยเซลล์ขนาดเล็กขนาดกลางและปริมาณมาก – ตั้งแต่ pico-liters ถึง 100L/hr (โดยใช้เซลล์การไหลแบบอัลตราโซนิก) เซลล์ถูกสลายโดยการเฉือนของเหลวและโพรงอากาศ ดีเอ็นเอยังถูกตัดในระหว่างการ sonication ดังนั้นจึงไม่จําเป็นต้องเพิ่ม DNase ลงในสารแขวนลอยของเซลล์
การควบคุมอุณหภูมิระหว่างการสลายอัลตราโซนิก E.coli
โดยการทําให้ตัวอย่างเย็นลงล่วงหน้าและเก็บตัวอย่างไว้ระหว่างการ sonication บนน้ําแข็งสามารถป้องกันการเสื่อมสภาพความร้อนของตัวอย่างได้อย่างง่ายดาย
ตามหลักการแล้วควรเก็บตัวอย่างไว้ให้เย็นในระหว่างการสลาย แต่สําหรับตัวอย่างส่วนใหญ่ก็เพียงพอแล้วหากอุณหภูมิไม่สูงขึ้นเหนืออุณหภูมิของแหล่งเพาะเลี้ยงหรือเนื้อเยื่อ ดังนั้นจึงขอแนะนําให้เก็บสารแขวนลอยไว้บนน้ําแข็งและสะท้อนเสียงด้วยคลื่นอัลตราโซนิกสั้น ๆ หลายครั้งที่ 5-10 วินาทีและหยุดชั่วคราว 10-30 วินาที ในระหว่างการหยุดชั่วคราวความร้อนสามารถกระจายไปเพื่อสร้างอุณหภูมิต่ําอีกครั้ง สําหรับตัวอย่างเซลล์ขนาดใหญ่ มีเครื่องปฏิกรณ์เซลล์การไหลต่างๆ พร้อมแจ็คเก็ตทําความเย็น
อ่านเคล็ดลับโดยละเอียดและคําแนะนําสําหรับการสลายอัลตราโซนิกที่ประสบความสําเร็จที่นี่!
โปรโตคอลสําหรับการเตรียมอัลตราโซนิกของ. coli lysates
นักวิจัยใช้โฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิก Hielscher สําหรับการหยุดชะงักของเซลล์ E.coli ด้านล่างนี้คุณสามารถค้นหาโปรโตคอลที่ผ่านการทดสอบและพิสูจน์แล้วสําหรับการสลาย E.coli โดยใช้โฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิก Hielscher สําหรับการใช้งานที่เกี่ยวข้องกับ. coli ต่างๆ
การเจริญเติบโตของเซลล์ การเชื่อมขวาง และการเตรียมสารสกัดจากเซลล์. coli โดยใช้อัลตราโซนิก
สําหรับ SeqA และ RNA polymerase ChIP-Chip. coli MG1655 หรือ MG1655 ΔseqA เติบโตที่อุณหภูมิ 37°C เป็น OD600 ประมาณ 0.15 ใน 50 มล. LB (+ กลูโคส 0.2%) ก่อนเติมฟอร์มาลดีไฮด์ 27 ไมโครลิตร (37%) ต่อสื่อมล. (ความเข้มข้นสุดท้าย 1%) การเชื่อมขวางดําเนินการที่เขย่าช้า (100 รอบต่อนาที) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 นาที ตามด้วยการดับด้วยไกลซีน 2.5 M 10 มล. (ความเข้มข้นสุดท้าย 0.5 M) สําหรับการทดลองช็อตด้วยความร้อน. coli MG1655 ถูกปลูกในตัวกลาง LB ขนาด 65 มล. ที่ 30°C ถึง OD600 ประมาณ 0.3 ต่อจากนั้นการเพาะเลี้ยง 30 มล. ถูกถ่ายโอนไปยังขวดที่อุ่นไว้ล่วงหน้าที่ 43°C และส่วนที่เหลือเก็บไว้ที่ 30°C การเชื่อมขวางและการดับเป็นไปตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ยกเว้นว่าเซลล์จะถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 30 หรือ 43°C เป็นเวลา 5 นาทีก่อนที่จะเขย่าช้าๆ ที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ถูกรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงและล้างสองครั้งด้วย TBS เย็น (pH7.5) หลังจากการระงับในบัฟเฟอร์ไลซิส 1 มล. (10 mM Tris (pH 8.0), ซูโครส 20%, NaCl 50 mM, EDTA 10 mM, ไลโซไซม์ 10 มก./มล.) และการฟักตัวที่อุณหภูมิ 37 °C เป็นเวลา 30 นาที ตามด้วยการเติมบัฟเฟอร์ IP 4 มล. เซลล์จะถูกโซนิกบนน้ําแข็งด้วยการหยุดพัก 12 ครั้ง 30 วินาทีและ 30 วินาทีโดยใช้โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิก Hielscher UP400St ที่การตั้งค่าพลังงาน 100% หลังจากการหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 10 นาทีที่ 9000 กรัม ส่วนแบ่ง 800 ไมโครลิตรของส่วนเหนือน้ําถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20°C (วัลด์มิงเฮาส์ 2010)
การผลิตมากเกินไปและการทําให้บริสุทธิ์ของเอนไซม์ด้วยโพรบอัลตราโซนิก
สําหรับการผลิตโปรตีนที่ติดแท็ก decahistidine (His10) มากเกินไป. coli BL21(DE3) ถูกแปลงด้วยโครงสร้าง pET19b การเพาะเลี้ยงก่อนข้ามคืนถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงและ 1% ถูกนํามาใช้เพื่อฉีดวัคซีนเพาะเลี้ยงที่แสดงออก เซลล์ที่มี pET19mgtB เติบโตที่อุณหภูมิ 22°C จนกระทั่งความหนาแน่นของแสงที่ 600 นาโนเมตร (OD600) เท่ากับ 0.7 การเพาะเลี้ยงถูกถ่ายโอนไปที่ 17°C และเหนี่ยวนําโดย IPTG 100 μM หลังจากผ่านไป 16 ชั่วโมง เพาะเลี้ยงถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่อุณหภูมิ 7,500 × กรัมที่ 4°C เซลล์ถูกระงับในน้ําเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) 50 mM ที่มี 0.3 M NaCl ที่ค่า pH 7.4 และหยุดชะงักโดยอัลตราโซนิกด้วยโซโนโทรดไมโครทิป S2 ที่เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher UP200St ที่รอบ 0.5 และแอมพลิจูด 75%
การผลิต GtfC ที่ติดแท็ก decahistidine มากเกินไปถูกเหนี่ยวนําที่ 37°C ที่ OD600 จาก 0.6 กับ IPTG 100 μM จากนั้นเซลล์จะถูกบ่มเป็นเวลา 4 ชั่วโมง เก็บเกี่ยว และไลซิสตามที่ระบุไว้ข้างต้นสําหรับ MgtB
สารสกัดจากเซลล์ดิบถูกหมุนเหวี่ยงที่อุณหภูมิ 15,000 × กรัมและ 4°C เพื่อตกตะกอนเศษเซลล์ สารสกัดที่กระจ่างแล้วถูกโหลดลงในคอลัมน์ HisTrap FF Crude ขนาด 1 มล. โดยใช้ระบบ ÄKTAprime Plus เอนไซม์ได้รับการทําให้บริสุทธิ์ตามโปรโตคอลของผู้ผลิตสําหรับการชะไล่ระดับสีของโปรตีนที่ติดแท็ก His. สารละลายโปรตีนที่ชะล้างแล้วถูกไดอะไลซ์สองครั้งกับปริมาตร 1,000 ปริมาตรของ 50 mM PBS, pH 7.4 โดยมี 0.3 M NaCl ที่ 4°C การทําให้บริสุทธิ์ถูกวิเคราะห์โดย 12% SDS-PAGE ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกําหนดโดยวิธีแบรดฟอร์ดโดยใช้ Roti-Quant (Rabausch et al. 2013)
การสกัดโปรตีนด้วยอัลตราโซนิกจากแบคทีเรีย. coli
โปรตีนเหยื่อที่น่าสนใจ (ในกรณีนี้คือ MTV1 ของ Arabidopsis thaliana) ถูกหลอมรวมเข้ากับแท็ก GST และแสดงออกในเซลล์ BL21 Escherichia coli. coli)
- นํา GST-MTV1 และ GST หนึ่งเม็ด (สอดคล้องกับการเพาะเชื้อแบคทีเรีย 50 มล.) และระงับแต่ละเม็ดในบัฟเฟอร์การสกัดเย็น 2.5 มล.
- ใช้เครื่องอัลตราโซนิก UP100H (พร้อมกับ MS3 microtip-sonotrode สําหรับปริมาณเล็กน้อยประมาณ 2-5 มล.) เพื่อขัดขวางเซลล์แบคทีเรียจนกว่าจะสลาย ซึ่งบ่งชี้ด้วยความทึบแสงที่ลดลงและความหนืดที่เพิ่มขึ้น สิ่งนี้ต้องดําเนินการบนน้ําแข็ง และแนะนําให้ทํา sonicate เป็นระยะ ๆ (เช่น sonicating 10 วินาที ตามด้วยการหยุดชั่วคราว 10 วินาทีบนน้ําแข็ง เป็นต้น ต้องใช้ความระมัดระวังเพื่อไม่ให้ sonicate ด้วยความเข้มสูงเกินไป หากตรวจพบการเกิดฟองหรือการก่อตัวของตะกอนสีขาวความเข้มจะต้องลดลง
- ถ่ายโอนสารละลายแบคทีเรียที่สลายแล้วไปยังหลอดไมโครเซนตอริ่งเหวี่ยง 1.5 มล. และหมุนเหวี่ยงที่อุณหภูมิ 4°C, 16,000 x g เป็นเวลา 20 นาที
เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบเช่น UP400St ใช้หลักการทํางานของโพรงอากาศอะคูสติกเพื่อการสลาย E.coli อย่างมีประสิทธิภาพ
การวิเคราะห์การแสดงออกและการทําให้บริสุทธิ์ของโปรตีนรีคอมบิแนนท์โดยใช้ Sonication
เม็ด. coli ถูก sonicated ด้วยเครื่องอัลตราโซนิก Hielscher UP100H เพื่อจุดประสงค์นี้ เม็ดเซลล์ถูกแขวนลอยในบัฟเฟอร์การสลายที่แช่เย็น (50 mM Tris-HCl pH=7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) และเย็นลงบนน้ําแข็งเป็นเวลา 10 นาที จากนั้นการแขวนลอยของเซลล์จะถูก sonicated ด้วยการระเบิดสั้น ๆ 10 ครั้งของ 10 วินาทีตามด้วยช่วงเวลา 30 วินาทีเพื่อระบายความร้อน ในที่สุดเศษเซลล์ถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยงเป็นพิเศษที่ 4°C เป็นเวลา 15 นาทีที่ 14000 รอบต่อนาที สําหรับการยืนยันการแสดงออกของ rPR สารคัดหน้าถูกเรียกใช้บนเจลโพลีอะคริลาไมด์ 12% และวิเคราะห์โดย SDS-PAGE และ Western blotting การทําให้บริสุทธิ์ของ rPR ทําได้โดยใช้เรซิน Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) ตามคู่มือของผู้ผลิต ในขั้นตอนนี้ใช้วิธีการทําให้บริสุทธิ์แบบดั้งเดิม ความบริสุทธิ์ของโปรตีนบริสุทธิ์ได้รับการประเมินโดยใช้อิเล็กโทรโฟรีซิสบนเจลโพลีอะคริลาไมด์ 12% และการย้อมสีสีน้ําเงินคูแมสซีที่ตามมา วัดความเข้มข้นของโปรตีนบริสุทธิ์โดยชุดทดสอบโปรตีน Micro BCA (PIERCE, USA) (Azarnezhad et al. 2016)
อัลตราโซนิก Homogenizers สําหรับ. coli Lysis
Hielscher Ultrasonics ออกแบบผลิตและจัดหาโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงสําหรับการสลายแบคทีเรีย. coli และเซลล์ประเภทอื่น ๆ เนื้อเยื่อและการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่เชื่อถือได้และมีประสิทธิภาพ
กลุ่มผลิตภัณฑ์ที่กว้างขวางของโพรบอัลตราโซนิกรวมถึงระบบ sonication ทางอ้อมช่วยให้เราสามารถนําเสนอ homogenizer เนื้อเยื่ออัลตราโซนิกในอุดมคติสําหรับการหยุดชะงักของเซลล์และการสกัดของคุณ
การออกแบบ การผลิต และการให้คําปรึกษา – คุณภาพ ผลิตในประเทศเยอรมนี
เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher เป็นที่รู้จักกันดีในด้านคุณภาพและมาตรฐานการออกแบบสูงสุด ซอฟต์แวร์อัจฉริยะเมนูที่ใช้งานง่ายการตั้งค่าที่ตั้งโปรแกรมได้และโปรโตคอลข้อมูลอัตโนมัติเป็นเพียงคุณสมบัติบางประการของเครื่องอัลตราโซนิก Hielscher ความทนทานและใช้งานง่ายช่วยให้สามารถรวมเครื่องอัลตราโซนิกของเราเข้ากับสิ่งอํานวยความสะดวกด้านการวิจัยและเทคโนโลยีชีวภาพได้อย่างราบรื่น แม้แต่สภาพที่ขรุขระและสภาพแวดล้อมที่ต้องการก็สามารถจัดการได้อย่างง่ายดายโดยเครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher
Hielscher Ultrasonics เป็น บริษัท ที่ได้รับการรับรองมาตรฐาน ISO และให้ความสําคัญเป็นพิเศษกับเครื่องอัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงที่มีเทคโนโลยีล้ําสมัยและเป็นมิตรกับผู้ใช้ แน่นอนว่าเครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher เป็นไปตามมาตรฐาน CE และตรงตามข้อกําหนดของ UL, CSA และ RoHs
ตารางด้านล่างให้ข้อบ่งชี้ถึงความสามารถในการประมวลผลโดยประมาณของเครื่องอัลตราโซนิกของเรา:
| ปริมาณแบทช์ | อัตราการไหล | อุปกรณ์ที่แนะนํา |
|---|---|---|
| แผ่นมัลติเวล / ไมโครไทเตอร์ | ไม่ | UIP400MTP |
| CupHorn สําหรับขวดหรือบีกเกอร์ | ไม่ | อัลตราโซนิก CupHorn |
| เครื่องปฏิกรณ์ไมโครโฟลว์อัลตราโซนิก | ไม่ | จีดีมินิ 2 |
| สูงสุด 10 ขวด ขนาด 0.5 ถึง 1.5 มล. | ไม่ | ไวอัลทวีตเตอร์ |
| 0.5 ถึง 1.5 มล. | ไม่ | ไวอัลทวีตเตอร์ |
| 1 ถึง 500 มล. | 10 ถึง 200 มล. / นาที | UP100H |
| 10 ถึง 2000 มล. | 20 ถึง 400 มล. / นาที | UP200 ฮิต, UP400 เซนต์ |
| 0.1 ถึง 20L | 0.2 ถึง 4L / นาที | UIP2000hdT |
| 10 ถึง 100L | 2 ถึง 10L / นาที | UIP4000 |
| ไม่ | 10 ถึง 100L / นาที | UIP16000 |
| ไม่ | ขนาด ใหญ่ | คลัสเตอร์ของ UIP16000 |
ติดต่อเรา! / ถามเรา!
โปรโตคอลเพิ่มเติมสําหรับ Ultrasonic. coli Lysis
โปรตีนดัดแปลงอัลลิซินใน. coli โดยใช้ Ultrasonic VialTweeter
การหาปริมาณซัลฟิดริลโดยการทดสอบ 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB)
ใช้การเพาะเชื้อข้ามคืนของ. coli MG1655 เพื่อฉีดวัคซีนอาหารกลางขั้นต่ําของ MOPS (1:100) วัฒนธรรมนี้เติบโตแบบแอโรบิกจนกระทั่งถึง A600 ที่ 0.4 การเพาะเชื้อถูกแบ่งออกเป็นสามวัฒนธรรมขนาด 15 มล. เพื่อรักษาความเครียด วัฒนธรรมที่ไม่ได้รับการบําบัดทําหน้าที่เป็นการควบคุมเชิงลบ มีการเติมอัลลิซิน 0.79 มิลลิซิน (128 ไมโครกรัม มล.-1) หรือ 1 มิลลิเมตร ไดอะไมด์ลงในหนึ่งในสองวัฒนธรรมที่เหลือ การเพาะเลี้ยงถูกบ่มเป็นเวลา 15 นาที การเพาะเลี้ยงแต่ละชนิด 5 มล. ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยง (8,525 × g, 4°C, 10 นาที) เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS 1 มล. (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, เก็บไว้แบบไม่ใช้ออกซิเจนก่อนใช้) และหมุนเหวี่ยง (13,000 × g, 4°C, 10 นาที) เซลล์ถูกระงับในบัฟเฟอร์การสลาย (PBS ที่มี 6 mM guanidinium HCl, pH 7.4) ก่อนที่จะหยุดชะงักที่ 4 °C โดยอัลตราโซนิก (ไวอัลทวีตเตอร์ เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher GmbH ประเทศเยอรมนี) (3 × 1 นาที) เศษเซลล์ถูกอัดเม็ดโดยการหมุนเหวี่ยง (13,000 × g, 4 °C, 15 นาที) สารคัดน้ําถูกถ่ายโอนไปยังคิวเวตต์ QS-macro ขนาด 3.5 มล. (10 มม.) ด้วยแถบกวนแม่เหล็กและผสมกับบัฟเฟอร์การสลาย 1 มล. การสูญพันธุ์ของตัวอย่างได้รับการตรวจสอบที่ 412 นาโนเมตรด้วยเครื่องวัดสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ Jasco V-650 ที่ติดตั้งตัวยึดเซลล์ควบคุมอุณหภูมิ PSC-718 ที่อุณหภูมิห้อง เติมสารละลาย dithiobis (2-nitrobenzoic acid) 3 mM 100μl การสูญพันธุ์ได้รับการตรวจสอบจนกว่าจะอิ่มตัว การคํานวณความเข้มข้นของไทออลดําเนินการโดยใช้ค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ ε412 = 13,700 ล้าน-1 เซนติเมตร-1 สําหรับกรดไทโอ-2-ไนโตรเบนโซอิก (TNB) ความเข้มข้นของไทออลของเซลล์คํานวณจากปริมาตรของเซลล์. coli ที่ 6.7 × 10-15 ลิตรและความหนาแน่นของเซลล์ A600 = 0.5 (เทียบเท่า 1 × 108 เซลล์ ML-1 วัฒนธรรม) (Müller et al. 2016)
การตรวจวัดกลูตาไธโอนในร่างกายโดยใช้เครื่องบดเซลล์อัลตราโซนิก
E.coli MG1655 เติบโตในอาหารกลางขั้นต่ํา MOPS ในปริมาตรรวม 200 มล. จนกระทั่งถึง A600 0.5 การเพาะเชื้อถูกแบ่งออกเป็นการเพาะเชื้อขนาด 50 มล. เพื่อการรักษาความเครียด หลังจากการฟักตัว 15 นาทีด้วยอัลลิซิน 0.79 mM, ไดอะไมด์ 1 mM หรือไดเมทิลซัลฟออกไซด์ (กลุ่มควบคุม) เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวที่ 4,000 กรัมที่ 4°C เป็นเวลา 10 นาที เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ KPE ก่อนที่จะระงับเม็ดในบัฟเฟอร์ KPE 700μl สําหรับการ deproteination กรดซัลโฟซาลิไซลิก 300% (w / v) 10 ลิตรจะถูกเติมก่อนที่จะหยุดชะงักของเซลล์โดยอัลตราโซนิก (3 x 1 นาที; ไวอัลทวีตเตอร์ อัลตราโซนิก) ส่วนเหนือน้ําถูกรวบรวมหลังจากการหมุนเหวี่ยง (30 นาที, 13,000g, 4°C) ความเข้มข้นของกรดซัลโฟซาลิไซลิกลดลงเหลือ 1% โดยการเติมบัฟเฟอร์ KPE 3 ปริมาตร การวัดกลูตาไธโอนทั้งหมดและ GSSG ดําเนินการตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ความเข้มข้นของกลูตาไธโอนของเซลล์คํานวณจากปริมาตรของเซลล์. coli ที่ 6.7×10-15 ลิตรและความหนาแน่นของเซลล์ A600 0.5 (เทียบเท่า 1×108 เซลล์ ML-1 วัฒนธรรม) ความเข้มข้นของ GSH คํานวณโดยการลบ 2 [GSSG] จากกลูตาไธโอนทั้งหมด (Müller et al. 2016)
การแสดงออกของ mAspAT ของมนุษย์ใน. coli โดยใช้ Ultrasonic Homogenizer
โคโลนีเดี่ยวของ. coli BL21 (DE3) ที่มีเวกเตอร์การแสดงออกในตัวกลาง Luria-Bertani (LB) 30 มล. ที่มีแอมพิซิลลิน 100μg/mL จากนั้นเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37ºC จนกระทั่งความหนาแน่นของแสง (OD600) ถึง 0.6 เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 4,000 × กรัมเป็นเวลา 10 นาที และแขวนลอยใหม่ในตัวอาหาร LB สด 3 ลิตรที่มีแอมพิซิลลิน 100μg/mL
ต่อจากนั้นการแสดงออกของโปรตีนถูกเหนี่ยวนําด้วยไอโซโพรพิล 1 mM β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) เป็นเวลา 20 ชั่วโมงที่ 16ºC เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 8,000 × กรัมเป็นเวลา 15 นาที และล้างด้วยบัฟเฟอร์ A (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4) ได้เซลล์ประมาณ 45 กรัม (น้ําหนักเปียก) จากการเพาะเลี้ยง 3 ลิตร หลังจากการหมุนเหวี่ยงเม็ดเซลล์จะถูกระงับในบัฟเฟอร์การสกัดเย็น A ขนาด 40 มล. (สําหรับการเพาะเลี้ยง 1 ลิตร) และไลซิสโดยการอัลตราโซนิกที่อุณหภูมิเย็นจัดโดยใช้เครื่องบดเซลล์อัลตราโซนิก Hielscher UP400St การสลายเซลล์ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 15 นาทีเพื่อแยกเศษส่วนที่ละลายน้ําได้ (เหนือธรรมชาติ) และตกตะกอน (เม็ด) (Jiang et al. 2015)
ข้อเท็จจริงที่ควรค่าแก่การรู้
อีโคไล
Escherichia coli. coli) เป็นแบคทีเรียโคลิฟอร์มแกรมลบแบบไม่ใช้ออกซิเจนรูปแท่งในสกุล Escherichia ซึ่งพบได้ทั่วไปในลําไส้ส่วนล่างของสิ่งมีชีวิตเลือดอุ่น (เอนโดเทอร์ม) มีสายพันธุ์. coli (หรือชนิดย่อย) จํานวนมากที่มีลักษณะที่หลากหลาย สายพันธุ์. coli ส่วนใหญ่ไม่เป็นอันตรายต่อมนุษย์ เช่น สายพันธุ์ B และ K-12 ซึ่งใช้กันทั่วไปสําหรับการใช้งานวิจัยในห้องปฏิบัติการ อย่างไรก็ตาม บางสายพันธุ์เป็นอันตรายและอาจทําให้เกิดการเจ็บป่วยร้ายแรงได้
. coli มีบทบาทสําคัญในวิศวกรรมชีวภาพสมัยใหม่และจุลชีววิทยาอุตสาหกรรม เนื่องจากแบคทีเรียสามารถจัดการได้ง่าย การใช้งานในห้องปฏิบัติการทั่วไปซึ่งมักเกี่ยวข้องกับการใช้. coli เช่น เพื่อสร้างกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก (DNA) หรือทําหน้าที่เป็นสิ่งมีชีวิตแบบจําลอง
. coli เป็นโฮสต์อเนกประสงค์สําหรับการผลิตโปรตีนต่างชนิด และระบบการแสดงออกของโปรตีนที่หลากหลายมีให้ในการผลิตโปรตีนรีคอมบิแนนท์ใน. coli การใช้พลาสมิดที่อนุญาตให้แสดงออกของโปรตีนในระดับสูงยีนสามารถนําเข้าสู่แบคทีเรียซึ่งช่วยให้สามารถผลิตโปรตีนดังกล่าวในปริมาณมากในกระบวนการหมักทางอุตสาหกรรม
E.coli ใช้เป็นโรงงานเซลล์ในการผลิตอินซูลิน การใช้งานเพิ่มเติม ได้แก่ การใช้เซลล์. coli ที่ดัดแปลงเพื่อพัฒนาและผลิตวัคซีนและเอนไซม์ที่ตรึงไว้ เพื่อผลิตเชื้อเพลิงชีวภาพ ตลอดจนการบําบัดทางชีวภาพ
สายพันธุ์ K-12 เป็นรูปแบบกลายพันธุ์ของ. coli ที่แสดงออกของเอนไซม์อัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (ALP) มากเกินไป การกลายพันธุ์นี้เกิดขึ้นเนื่องจากข้อบกพร่องในยีนที่เข้ารหัสเอนไซม์อย่างต่อเนื่อง หากยีนผลิตผลิตภัณฑ์โดยไม่มีการยับยั้งใด ๆ สิ่งนี้เรียกว่ากิจกรรมที่เป็นส่วนประกอบ รูปแบบการกลายพันธุ์เฉพาะนี้ใช้สําหรับการแยกและทําให้เอนไซม์ ALP บริสุทธิ์
แบคทีเรีย. coli ยังใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นโรงงานเซลล์ จุลินทรีย์ที่ผ่านการวิศวกรรม (เช่น แบคทีเรีย) และเซลล์พืชสามารถใช้เป็นโรงงานเซลล์ได้ เซลล์ดัดแปลงพันธุกรรมเหล่านี้ผลิตโมเลกุล สารเคมี โพลีเมอร์ โปรตีน และสารอื่นๆ ซึ่งใช้ในอุตสาหกรรมยา อาหาร และเคมีภัณฑ์ ในการปลดปล่อยโมเลกุลที่ผลิตภายในเซลล์ทางวิศวกรรมชีวภาพดังกล่าวการสลายอัลตราโซนิกเป็นวิธีทั่วไปในการทําลายผนังเซลล์และถ่ายโอนสารเป้าหมายไปยังของเหลวโดยรอบ อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับการสลายตัวของเซลล์วิศวกรรมชีวภาพ!
การตัดดีเอ็นเออัลตราโซนิก
แรงเฉือนอัลตราโซนิกเป็นวิธีที่ใช้กันทั่วไปในการปล่อยโมเลกุลออร์แกเนลล์และโปรตีนออกจากภายในเซลล์รวมทั้งทําลายสาย DNA เป็นชิ้น ๆ โพรงอากาศอะคูสติกทําลายผนังเซลล์และเยื่อหุ้มเซลล์เพื่อสกัดดีเอ็นเอจากเซลล์และสร้างชิ้นส่วนประมาณ 600 ชิ้น – ความยาว 800 bp ซึ่งเหมาะสําหรับการวิเคราะห์
คลิกที่นี่เพื่อเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกสําหรับการกระจายตัวของดีเอ็นเอ!
วรรณกรรม / อ้างอิง
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics ผลิตโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงจาก ห้องทดลอง ถึง ขนาดอุตสาหกรรม