อัลตราโซนิกสลายของอีโคไล

  • อีแบคทีเรียเป็นเชื้อแบคทีเรียที่ใช้กันมากที่สุดในทางจุลชีววิทยาและเทคโนโลยีชีวภาพ
  • อัลตราโซนิกสารทำลายเซลล์ส่งผลที่เชื่อถือได้และทำซ้ำได้สำหรับสลายของเชื้อ E. coli
  • โพรงอากาศที่รุนแรงยังสามารถควบคุมได้อย่างแม่นยำและแรงเฉือนส่งผลให้เกิดการหยุดชะงักและการสกัดสูงอัตราผลตอบแทนฉบับสมบูรณ์ (เช่นโปรตีน DNA)

เหตุใดการหยุดชะงักของเซลล์อัลตราโซนิกของ. coli จึงเป็นวิธีการที่ต้องการ?

อัลตราโซนิก homogenizers หรือ ultrasonicators ชนิดโพรบมีข้อดีหลายประการสําหรับ. coli lysis เนื่องจากอัลตราซาวนด์ที่รุนแรงจะขัดขวางผนังเซลล์และเยื่อหุ้มเซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ultrasonicators ชนิดโพรบใช้กันอย่างแพร่หลายสําหรับ. coli lysis เนื่องจากสาเหตุต่อไปนี้:

  • การหยุดชะงักของผนังเซลล์อย่างมีประสิทธิภาพ: . coli มีผนังเซลล์กึ่งแข็งประกอบด้วย peptidoglycan ซึ่งอาจเป็นเรื่องยากที่จะทําลายโดยใช้วิธีการสลายแบบดั้งเดิม เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบสร้างคลื่นอัลตราโซนิกที่รุนแรงซึ่งสร้างฟองอากาศในของเหลวรอบเซลล์ เมื่อฟองอากาศเหล่านี้ยุบตัวพวกมันจะสร้างไอพ่นของเหลวความเร็วสูงและคลื่นกระแทกซึ่งส่งผลให้เกิดการหยุดชะงักทางกลของผนังเซลล์ปล่อยเนื้อหาของเซลล์เช่นชีวโมเลกุลได้อย่างมีประสิทธิภาพ
  • การเจาะที่เพิ่มขึ้น: คลื่นอัลตราโซนิกที่สร้างขึ้นโดยโพรบ / sonotrode สามารถเจาะลึกเข้าไปในตัวอย่างเข้าถึงเซลล์. coli จํานวนมากและรักษาอย่างสม่ําเสมอ สิ่งนี้ช่วยให้มั่นใจได้ว่าการสลายมีความสม่ําเสมอมากขึ้นทั่วทั้งตัวอย่างส่งผลให้ประสิทธิภาพการหยุดชะงักของเซลล์สูงขึ้น
  • ลดเวลาในการดําเนินการ: พลังงานที่ส่งโดยเครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบมีความเข้มข้นสูงและแปลเป็นภาษาท้องถิ่นซึ่งนําไปสู่การสลายเซลล์อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ เมื่อเทียบกับวิธีการอื่น ๆ เช่นการตีลูกปัดหรือการสลายเอนไซม์ sonication สามารถบรรลุ. coli lysis ภายในไม่กี่นาทีหรือไม่กี่วินาที ในขณะที่เทคนิคทางเลือกมากมายเช่นการละลายแบบเยือกแข็งต้องใช้การรักษาหลายรอบการสลายด้วยอัลตราโซนิกจะเปิดเซลล์ในขั้นตอนกระบวนการเดียว
  • การควบคุมอุณหภูมิ: เครื่องอัลตราโซนิกที่ล้ําสมัยติดตั้งเซ็นเซอร์อุณหภูมิและซอฟต์แวร์อัจฉริยะซึ่งช่วยให้สามารถตั้งอุณหภูมิกระบวนการสูงสุดได้ เครื่องอัลตราโซนิกจะหยุดชั่วคราวโดยอัตโนมัติเมื่อถึงขีด จํากัด อุณหภูมิและเริ่มกระบวนการ sonication เมื่อถึงจุดอุณหภูมิที่ตั้งไว้ การทําให้ตัวอย่างเย็นลงในอ่างน้ําแข็งเป็นวิธีง่ายๆ ในการรักษาอุณหภูมิตัวอย่างให้ต่ําและป้องกันการเสื่อมสภาพของตัวอย่างที่เกิดจากความร้อน
  • ความสามารถในการปรับขนาด: เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบมีให้เลือกหลายขนาดตั้งแต่อุปกรณ์พกพาไปจนถึงรุ่นอุตสาหกรรมขนาดใหญ่ สิ่งนี้ทําให้เหมาะสําหรับการประมวลผลปริมาณน้อยในห้องปฏิบัติการหรือขยายขนาดสําหรับการใช้งานกระบวนการทางชีวภาพที่ใหญ่ขึ้นเช่นการผลิตวัคซีนหรือการสังเคราะห์โมเลกุลทางชีวภาพ
  • ความเก่งกาจ: เครื่องอัลตราโซนิกสามารถใช้สําหรับการใช้งานที่หลากหลายนอกเหนือจากการสลายเซลล์เช่นการตัดดีเอ็นเอการสกัดโปรตีนการทําให้เป็นเนื้อเดียวกันของเนื้อเยื่อการกระจายตัวของอนุภาคนาโนและการทําให้เป็นสากล ดังนั้นการลงทุนในเครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบจึงให้ความคล่องตัวในการวิจัยหรือการตั้งค่าอุตสาหกรรม
  • ultrasonicators ชนิดโพรบเช่น UP200St เป็น homogenizers เนื้อเยื่อที่เชื่อถือได้และเครื่องบดเซลล์ดังนั้นจึงใช้กันอย่างแพร่หลายสําหรับการเตรียมตัวอย่างในพันธุศาสตร์เช่นสําหรับ E.coli lysis

    การสกัดโปรตีนจากเซลล์ E.coli ดําเนินการอย่างมีประสิทธิภาพด้วย โพรบอัลตราโซนิก UP200St

    เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบมีข้อดีหลายประการสําหรับ. coli lysis การควบคุมพารามิเตอร์กระบวนการอัลตราโซนิกที่เชื่อถือได้และแม่นยําช่วยให้สามารถปรับพารามิเตอร์การทํางานเช่นพลังงานระยะเวลาและการจัดการตัวอย่างเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ต้องการ
     

    ขอข้อมูล





     

    บทช่วยสอนนี้อธิบายว่า sonicator ประเภทใดดีที่สุดสําหรับงานเตรียมตัวอย่างของคุณเช่น lysis, การหยุดชะงักของเซลล์, การแยกโปรตีน, การกระจายตัวของ DNA และ RNA ในห้องปฏิบัติการการวิเคราะห์และการวิจัย เลือกประเภท sonicator ที่เหมาะสําหรับการใช้งานปริมาณตัวอย่างหมายเลขตัวอย่างและปริมาณงานของคุณ Hielscher Ultrasonics มี homogenizer อัลตราโซนิกที่เหมาะสําหรับคุณ!

    วิธีค้นหา sonicator ที่สมบูรณ์แบบสําหรับการหยุดชะงักของเซลล์และการสกัดโปรตีนในวิทยาศาสตร์และการวิเคราะห์

    ภาพขนาดย่อของวิดีโอ

    การกระจายตัวของดีเอ็นเออัลตราโซนิกมักใช้เป็นขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างในการจัดลําดับรุ่นต่อไป (NGS)

    การวิเคราะห์ด้วยไฟฟ้าของ DNA จีโนมของ. coli EDL933 ภายใต้ 0 - 15 นาที ultrasonication L หมายถึงบันไดดีเอ็นเอ
    (การศึกษาและภาพ: ©Basselet et al. 2008)

    Cell Disruption โดยใช้ Ultrasonic Cavitation

    โฮโมจีไนเซอร์ชนิดโพรบอัลตราโซนิกทํางานประมาณ 20,000 รอบต่อวินาที (ที่ 20kHz) และทําให้เกิดโพรงอากาศในของเหลวหรือสารแขวนลอย พื้นที่กล้องจุลทรรศน์โพรงอากาศอะคูสติกของความดันคล้ายสุญญากาศและอุณหภูมิสูงที่ฉีกเซลล์ออกจากกัน แม้ว่าอุณหภูมิอาจสูงถึงหลายพันองศาเซลเซียส แต่ปริมาตรโพรงอากาศมีขนาดเล็กมากจนไม่ทําให้กระบวนการร้อนอย่างมีนัยสําคัญ อัลตราซาวนด์สร้างโพรงอากาศอะคูสติกและแรงเฉือนทะลุหรือทําลายเยื่อหุ้มเซลล์ของเซลล์แบคทีเรียเช่น E.coli เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher ช่วยให้สามารถควบคุมพารามิเตอร์กระบวนการได้อย่างแม่นยําเช่นความเข้มของอัลตราโซนิกแอมพลิจูดอินพุตพลังงานและอุณหภูมิ ดังนั้นกระบวนการไลซิสอัลตราโซนิกสามารถปรับได้อย่างเหมาะสมกับชนิดของเซลล์การเพาะเลี้ยงเซลล์และเป้าหมายของกระบวนการ
     

    ข้อดีของการสลายอัลตราโซนิก

    • การควบคุมที่แม่นยำของการสลาย (ความเข้มความกว้างอุณหภูมิ)
    • ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้และทําซ้ําได้
    • การปรับตัวที่ดีที่สุดตัวอย่างที่เฉพาะเจาะจง
    • การควบคุมอุณหภูมิ
    • สำหรับตัวอย่างขนาดเล็กมากที่จะมีขนาดใหญ่มาก (ไมโครลิตรเพื่อลิตร)
    • การรักษาเชิงกลอย่างหมดจด
    • ใช้งานง่ายและปลอดภัย
    • เส้นตรงระดับขึ้นจากห้องปฏิบัติการเพื่อการผลิต
    อุปกรณ์อัลตราโซนิก VialTweeter ช่วยให้การเตรียมสารตัวอย่างพร้อมกันถึง 10 ขวดภายใต้เงื่อนไขกระบวนการเดียวกัน (คลิกเพื่อดูภาพขยาย)

    VialTweeter สำหรับการสลายอัลตราโซนิก

    ขอข้อมูล





    อัลตราโซนิก Homogenizer vs เทคนิค Lysis อื่น ๆ

    ในขณะที่การสลายตัวทางเคมีและเอนไซม์อาจเป็นปัญหาได้ – ตั้งแต่การสลายสารเคมีที่สามารถปรับเปลี่ยนโครงสร้างโปรตีนและแนะนำปัญหาบริสุทธิ์และการสลายเอนไซม์ต้องใช้เวลาบ่มนานและไม่สามารถทำซ้ำได้ – การหยุดชะงักอัลตราโซนิกคือมีความซับซ้อนเซลล์อย่างรวดเร็ววิธีการหยุดชะงัก
    การสลายตัวด้วยอัลตราโซนิกขึ้นอยู่กับแรงทางกลเท่านั้น ไม่มีการเติมสารเคมี sonication ทําลายผนังเซลล์ด้วยแรงเฉือน การสลายตัวทางเคมีสามารถเปลี่ยนโครงสร้างโปรตีนและแนะนําปัญหาการทําให้บริสุทธิ์ การหยุดชะงักของเอนไซม์ต้องใช้เวลาฟักตัวนานและไม่สามารถทําซ้ําได้ การหยุดชะงักของเซลล์อัลตราโซนิกของเซลล์แบคทีเรีย E.coli นั้นรวดเร็วง่ายเชื่อถือได้และทําซ้ําได้ นั่นคือเหตุผลที่ Hielscher ultrasonicators ใช้ในห้องปฏิบัติการทางชีวภาพและชีวเคมีทั่วโลกสําหรับการเตรียมตัวอย่าง pre-ananlytics เส้นทแยงมุมในหลอดทดลองและการทดสอบท่อร่วม

    คําแนะนําทั่วไปสําหรับการไลซิสอัลตราโซนิก

    sonication เป็นเทคนิคที่นิยมมากที่สุดสำหรับ lysing ปริมาณที่น้อยมากกลางและขนาดใหญ่ของเซลล์แขวนลอย – จากพิโคลิตรขึ้นไป 100L / ชม (โดยใช้เซลล์ไหลอัลตราโซนิก) เซลล์ lysed โดยเฉือนของเหลวและโพรงอากาศ ดีเอ็นเอยังตัดระหว่าง sonication ดังนั้นจึงไม่จำเป็นที่จะเพิ่ม DNase การระงับเซลล์
     

    การควบคุมอุณหภูมิในระหว่างการไลซิส E.coli อัลตราโซนิก
    อัลตราโซนิกเซลล์รบกวน UP100H (100W) สําหรับการหยุดชะงักของเซลล์และการสกัดสารประกอบพืชโดยการระบายความร้อนก่อนตัวอย่างและการเก็บรักษาตัวอย่างระหว่าง sonication บนน้ำแข็งลิ้มสลายตัวของกลุ่มตัวอย่างที่สามารถป้องกันได้อย่างง่ายดาย
    ตามหลักการแล้วตัวอย่างควรเก็บไว้ในที่เย็นในระหว่างการสลาย แต่สําหรับตัวอย่างส่วนใหญ่ก็เพียงพอแล้วหากอุณหภูมิไม่สูงกว่าอุณหภูมิของการเพาะเลี้ยงหรือแหล่งเนื้อเยื่อ ดังนั้นจึงขอแนะนําให้เก็บช่วงล่างไว้บนน้ําแข็งและโซนิคด้วยพัลส์ ultrasonics สั้น ๆ หลายตัว 5-10 วินาทีและหยุดชั่วคราว 10-30 วินาที ในระหว่างการหยุดชั่วคราวความร้อนสามารถกระจายตัวเพื่อสร้างอุณหภูมิต่ําอีกครั้ง สําหรับตัวอย่างเซลล์ขนาดใหญ่จะมีเครื่องปฏิกรณ์เซลล์ไหลต่างๆพร้อมแจ็คเก็ตระบายความร้อน
    อ่านเคล็ดลับโดยละเอียดและคําแนะนําสําหรับการสลายอัลตราโซนิกที่ประสบความสําเร็จ!

    โปรโตคอลสําหรับการเตรียมอัลตราโซนิกของ. Coli Lysates

    นักวิจัยใช้ homogenizers อัลตราโซนิก Hielscher สําหรับการหยุดชะงักของเซลล์ E.coli ด้านล่างนี้คุณสามารถค้นหาโปรโตคอลที่ผ่านการทดสอบและพิสูจน์แล้วสําหรับ E.coli lysis โดยใช้ Hielscher ultrasonic homogenizers สําหรับการใช้งานที่เกี่ยวข้องกับ. coli ต่างๆ
     

    คลิปวิดีโอนี้แสดง Hielscher homogenizer อัลตราโซนิก UP100H, ultrasonicator ใช้กันอย่างแพร่หลายสําหรับการเตรียมตัวอย่างในห้องปฏิบัติการ

    อัลตราโซนิกโฮโมจีไนเซอร์ UP100H

    ภาพขนาดย่อของวิดีโอ

    การเจริญเติบโตของเซลล์การเชื่อมโยงขวางและการเตรียมสารสกัดจากเซลล์. coli โดยใช้ Ultrasonics

    สำหรับ SeqA และ RNA โพลิเมอร์ชิปชิป E. coli หรือ MG1655 MG1655 ΔseqAเติบโตเป็นผู้ใหญ่ที่ 37 ° C ไปยัง OD๖๐๐ ประมาณ๐.๑๕ใน๕๐มล. ปอนด์ (+ ๐.๒% กลูโคส) ก่อน27μ l ของฟอร์ลดีไฮด์ (๓๗%) ต่อมิลลิลิตรเพิ่มขึ้น (ความเข้มข้นสุดท้าย 1%) การเชื่อมโยงมีการดำเนินการที่ช้าเขย่า (๑๐๐รอบต่อนาที) ที่อุณหภูมิห้องสำหรับ20นาทีตามด้วยการดับด้วย10มิลลิลิตรของ๒.๕ M glycine (ความเข้มข้นสุดท้าย๐.๕ M). สำหรับการทดลองการช็อกด้วยความร้อน,. coli MG1655 มีการเติบโตใน๖๕ ml ปอนด์ขนาดกลางที่30° c ถึง OD๖๐๐ ประมาณ 0.3 ต่อมาวัฒนธรรม 30 มล. ถูกถ่ายโอนไปยังขวดอุ่นล่วงหน้าที่ 43 ° C และส่วนที่เหลือเก็บไว้ที่ 30 ° C การเชื่อมโยงขวางและการดับเป็นไปตามที่อธิบายไว้ข้างต้นยกเว้นเซลล์จะถูกเก็บไว้ที่ 30 หรือ 43 ° C เป็นเวลา 5 นาทีก่อนที่จะสั่นช้าต่อไปที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ถูกรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงและล้างสองครั้งด้วย TBS เย็น (pH7.5) หลังจาก resuspension ในบัฟเฟอร์ lysis 1 มล. (10 mM Tris (pH 8.0), ซูโครส 20%, NaCl 50 mM, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lysozyme) และการบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 30 นาทีตามด้วยการเพิ่มบัฟเฟอร์ IP 4 มล. เซลล์จะถูกโซนิคบนน้ําแข็งด้วย 12 ครั้ง 30 วินาทีและ 30 วินาทีโดยใช้โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิก Hielscher UP400St ที่การตั้งค่าพลังงาน 100% หลังจากการหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 10 นาทีที่ 9000 กรัม ค่า aliquotes 800 ไมโครลิตรของสารเหนือธรรมชาติจะถูกเก็บไว้ที่ -20 ° C (Waldminghaus 2010)
     

    การผลิตมากเกินไปและการทําให้บริสุทธิ์ของเอนไซม์ด้วยโพรบอัลตราโซนิก

    Ultrasonicator UP100H เป็น homogeniser ห้องปฏิบัติการมักจะใช้สําหรับการเตรียมตัวอย่างของแผ่นเพาะเลี้ยงเซลล์สําหรับการผลิตโปรตีนที่ติดแท็ก decahistidine (His10) มากเกินไป. coli BL21 (DE3) ถูกเปลี่ยนด้วยโครงสร้าง pET19b วัฒนธรรมก่อนข้ามคืนถูกเก็บเกี่ยวโดยการปั่นเหวี่ยงและ 1% ถูกใช้เพื่อฉีดวัคซีนวัฒนธรรมการแสดงออก เซลล์ที่มี pET19mgtB เติบโตที่ 22 ° C จนกระทั่งความหนาแน่นของแสงที่ 600 นาโนเมตร (OD600) ที่ 0.7 วัฒนธรรมถูกถ่ายโอนไปที่ 17 ° C และเหนี่ยวนําโดย 100 μM IPTG หลังจาก 16 ชั่วโมงวัฒนธรรมถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 7,500 × กรัมที่ 4 ° C เซลล์ถูกนํากลับมาใช้ใหม่ในน้ําเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (PBS) 50 mM ด้วย 0.3 M NaCl ที่ pH 7.4 และถูกรบกวนโดย ultrasonication ด้วย sonotrode ปลายไมโคร S2 ที่ Hielscher ultrasonicator UP200St ที่รอบ 0.5 และแอมพลิจูด 75%
    ล้นเกินของ decahistidine ติดแท็ก GtfC ถูกชักนำที่ 37 ° C ที่ OD๖๐๐ 0.6 100 ไมครอน IPTG เซลล์ที่ถูกบ่มแล้วสำหรับ 4 ชั่วโมงเก็บเกี่ยวและ lysed ตามที่ระบุไว้ข้างต้นสำหรับ MgtB
    สารสกัดจากเซลล์ดิบถูกหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 × กรัมและ 4 °C เพื่อตะกอนเศษเซลล์ สารสกัดชี้แจงถูกโหลดบนคอลัมน์ HisTrap FF Crude ขนาด 1 มล. โดยใช้ระบบ ÄKTAprime Plus เอนไซม์ได้รับการทําให้บริสุทธิ์ตามโปรโตคอลของผู้ผลิตสําหรับการไล่ระดับสีของโปรตีนที่ติดแท็กของเขา สารละลายโปรตีน Eluted ถูกล้างสองครั้งเทียบกับ 1,000 ปริมาตรของ 50 mM PBS, pH 7.4 โดยมี 0.3 M NaCl ที่ 4 ° C การทําให้บริสุทธิ์ได้รับการวิเคราะห์โดย 12% SDS-PAGE ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกําหนดโดยวิธีแบรดฟอร์ดโดยใช้ Roti-Quant (Rabausch et al. 2013)
     

    การสกัดด้วยอัลตราโซนิกของโปรตีนจากแบคทีเรีย. coli
    โปรตีนเหยื่อที่น่าสนใจ (ในกรณีนี้ MTV1 ของ Arabidopsis thaliana) ผสมกับแท็ก GST และแสดงออกใน BL21 Escherichia coli ( E. coli) เซลล์

    1. ใช้ GST-MTV1 และ GST หนึ่งเม็ด (สอดคล้องกับการเพาะเลี้ยงแบคทีเรีย 50 มล.) และทําซ้ําในบัฟเฟอร์สกัดเย็น 2.5 มล.
    2. ใช้เครื่องอัลตราโซนิก UP100H (พร้อมกับ MS3 microtip-sonotrode สําหรับปริมาณเล็กน้อยประมาณ 2-5mL) เพื่อขัดขวางเซลล์แบคทีเรียจนกว่าจะถูก lysed ซึ่งบ่งชี้โดยความทึบแสงที่ลดลงและความหนืดที่เพิ่มขึ้น สิ่งนี้จะต้องดําเนินการบนน้ําแข็งและขอแนะนําให้ส่งเสียงเป็นระยะ ๆ (เช่น sonicating 10 วินาทีตามด้วยการหยุดชั่วคราว 10 วินาทีบนน้ําแข็งและอื่น ๆ ) ต้องใช้ความระมัดระวังไม่ให้ส่งเสียงด้วยความเข้มสูงเกินไป หากตรวจพบการเกิดฟองหรือการก่อตัวของตะกอนสีขาวความเข้มจะต้องลดลง
    3. ถ่ายโอนสารละลายแบคทีเรีย lysed ไปยังท่อ microcentrifuge ขนาด 1.5 มล. และเครื่องหมุนเหวี่ยงที่อุณหภูมิ 4°C, 16,000 x g เป็นเวลา 20 นาที

     

    โพรบอัลตราโซนิกใช้แรงของโพรงอากาศอะคูสติกเพื่อทําลายเซลล์และเพื่อสกัดโมเลกุลและดีเอ็นเอจากอีโคไล

    เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบเช่น UP400St ใช้หลักการทํางานของโพรงอากาศอะคูสติกสําหรับการสลายที่มีประสิทธิภาพของ E.coli

    การวิเคราะห์การแสดงออกและการทําให้บริสุทธิ์ของโปรตีน Recombinant โดยใช้ Sonication

    เม็ด. coli ถูก sonicated ด้วย Hielscher ultrasonicator UP100H เพื่อจุดประสงค์นี้เม็ดเซลล์ถูกนํากลับมาใช้ใหม่ในบัฟเฟอร์ไลซิสแช่เย็น (50 mM Tris-HCl pH = 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) และระบายความร้อนบนน้ําแข็งเป็นเวลา 10 นาที จากนั้นการระงับเซลล์ถูก sonicated ด้วย 10 ระเบิดสั้น ๆ ของ 10 วินาทีตามด้วยช่วงเวลา 30 วินาทีสําหรับการระบายความร้อน ในที่สุดเศษเซลล์ก็ถูกกําจัดออกโดย ultracentrifugation ที่ 4 ° C เป็นเวลา 15 นาทีที่ 14000 รอบต่อนาที สําหรับการยืนยันการแสดงออกของ rPR นั้นใช้เจลโพลีอะคริลาไมด์ 12% และวิเคราะห์โดย SDS-PAGE และซับตะวันตก การทําให้บริสุทธิ์ของ rPR ทําได้โดยใช้เรซิน Ni2 + -NTA (Invitrogen, USA) ตามคู่มือผู้ผลิต ในขั้นตอนนี้ใช้วิธีการทําให้บริสุทธิ์แบบดั้งเดิม ความบริสุทธิ์ของโปรตีนบริสุทธิ์ได้รับการประเมินโดยใช้อิเล็กโทรโฟรีซิสบนเจลโพลีอะคริลาไมด์ 12% และการย้อมสีสีน้ําเงิน Coomassie ที่ตามมา ความเข้มข้นของโปรตีนบริสุทธิ์วัดโดยชุดทดสอบโปรตีน Micro BCA (PIERCE, USA) (Azarnezhad et al. 2016)
     

    วิดีโอนี้แสดง cuphorn อัลตราโซนิก 200 วัตต์สําหรับการกระจายตัวเป็นเนื้อเดียวกันสกัดหรือ degassing ของตัวอย่างในห้องปฏิบัติการ

    อัลตราโซนิกคัพฮอร์น (200 วัตต์)

    ภาพขนาดย่อของวิดีโอ

    อัลตราโซนิก Homogenizers สําหรับ. coli Lysis

    Hielscher Ultrasonics ออกแบบผลิตและจัดหา homogenizers อัลตราโซนิกที่มีประสิทธิภาพสูงสําหรับการสลายที่เชื่อถือได้และมีประสิทธิภาพของแบคทีเรีย. coli และเซลล์ชนิดอื่น ๆ เนื้อเยื่อและการเพาะเลี้ยงเซลล์
    พอร์ตโฟลิโอที่กว้างขวางของโพรบอัลตราโซนิกและระบบ sonication ทางอ้อมช่วยให้เราสามารถเสนอ homogenizer เนื้อเยื่ออัลตราโซนิกในอุดมคติสําหรับการหยุดชะงักของเซลล์และการสกัดของคุณ

    ออกแบบ ผลิต และให้คําปรึกษา – คุณภาพผลิตในประเทศเยอรมนี

    เครื่อง ultrasonicators Hielscher สามารถควบคุมได้จากระยะไกลผ่านการควบคุมเบราว์เซอร์ พารามิเตอร์ Sonication สามารถตรวจสอบและปรับได้อย่างแม่นยําตามความต้องการของกระบวนการเครื่องอัลตราโซนิก Hielscher เป็นที่รู้จักกันดีในด้านคุณภาพและมาตรฐานการออกแบบสูงสุด ซอฟต์แวร์อัจฉริยะเมนูที่ใช้งานง่ายการตั้งค่าที่ตั้งโปรแกรมได้และโปรโตคอลข้อมูลอัตโนมัติเป็นเพียงคุณสมบัติบางประการของ Hielscher ultrasonicators ความทนทานและใช้งานง่ายช่วยให้สามารถรวมเครื่องอัลตราโซนิกของเราเข้ากับสิ่งอํานวยความสะดวกด้านการวิจัยและเทคโนโลยีชีวภาพได้อย่างราบรื่น แม้แต่สภาพที่หยาบกร้านและสภาพแวดล้อมที่มีความต้องการก็สามารถจัดการได้อย่างง่ายดายโดยเครื่องอัลตราโซนิก Hielscher

    Hielscher Ultrasonics เป็น บริษัท ที่ได้รับการรับรองมาตรฐาน ISO และให้ความสําคัญเป็นพิเศษกับเครื่องอัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงที่มีเทคโนโลยีล้ําสมัยและใช้งานง่าย แน่นอนเครื่องอัลตราโซนิก Hielscher เป็นไปตามมาตรฐาน CE และตรงตามข้อกําหนดของ UL, CSA และ RoHs

    ตารางด้านล่างนี้จะช่วยให้คุณมีข้อบ่งชี้ของความจุในการประมวลผลโดยประมาณของ ultrasonicators ของเรา:

    ปริมาณชุด อัตราการไหล อุปกรณ์ที่แนะนำ
    แผ่นหลายหลุม / ไมโครไทเตอร์ N.A. UIP400MTP
    CupHorn สําหรับขวดหรือบีกเกอร์ N.A. อัลตราโซนิก cuphorn
    เครื่องปฏิกรณ์ไมโครโฟลว์อัลตราโซนิก N.A. GDmini2
    มากถึง 10 ขวดที่มี 0.5 ถึง 1.5mL N.A. VialTweeter
    00.5 เพื่อ 1.5ml N.A. VialTweeter
    1 ถึง 500mL 10 ถึง 200mL / นาที UP100H
    10 ถึง 2000ml 20 ถึง 400ml / นาที Uf200 ःที, UP400St
    00.1 เพื่อ 20L 00.2 เพื่อ 4L / นาที UIP2000hdT
    10 100L 2 ถึง 10L / นาที UIP4000
    N.A. 10 100L / นาที UIP16000
    N.A. ที่มีขนาดใหญ่ กลุ่มของ UIP16000

    ติดต่อเรา! / ถามเรา!

    สอบถามข้อมูลเพิ่มเติม

    โปรดใช้แบบฟอร์มด้านล่างเพื่อขอข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับ homogenizers เนื้อเยื่ออัลตราโซนิกและเครื่องบดเซลล์การใช้งาน lysis และราคา เรายินดีที่จะหารือเกี่ยวกับกระบวนการของคุณกับคุณและเสนอเครื่องทําเสียงอัลตราโซนิกที่ตอบสนองความต้องการของคุณ!










    วิดีโอแสดงระบบเตรียมตัวอย่างอัลตราโซนิก UIP400MTP ซึ่งช่วยให้การเตรียมตัวอย่างที่เชื่อถือได้ของแผ่นหลายหลุมมาตรฐานใด ๆ โดยใช้อัลตราซาวนด์ความเข้มสูง การใช้งานทั่วไปของ UIP400MTP รวมถึงการสลายเซลล์ดีเอ็นเออาร์เอ็นเอและการตัดโครมาตินเช่นเดียวกับการสกัดโปรตีน

    Ultrasonicator UIP400MTP สําหรับ sonication แผ่นหลายดี

    ภาพขนาดย่อของวิดีโอ

    โปรโตคอลเพิ่มเติมสําหรับอัลตราโซนิก. coli Lysis

    โปรตีนดัดแปลงอัลลิซิในเชื้อ. coli โดยใช้ Ultrasonic VialTweeter

    VialTweeter ที่โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิก UP200STการกำหนดเนื้อหาโดย sulfhydryl 5,5'-Dithiobis (กรด 2 nitrobenzoic) (DTNB) Assay
    เชื้อ. coli MG1655 ในชั่วข้ามคืนถูกใช้เพื่อฉีดวัคซีน MOPS minimal medium (1:100) วัฒนธรรมนี้เติบโตขึ้นเรื่อย ๆ จนกระทั่งถึง A600 ที่ 0.4 วัฒนธรรมถูกแบ่งออกเป็นสามวัฒนธรรม 15 มล. สําหรับการรักษาความเครียด วัฒนธรรมที่ไม่ได้รับการรักษาทําหน้าที่เป็นการควบคุมเชิงลบ อัลลิซิ 0.79 mM (128 μg ml-1) หรือ 1 mM diamide ถูกเพิ่มเข้าไปในหนึ่งในสองวัฒนธรรมที่เหลือ วัฒนธรรมถูกบ่มเป็นเวลา 15 นาที 5 มล. ของแต่ละวัฒนธรรมถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยง (8,525 × กรัม, 4 °C, 10 นาที) เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS 1 มล. (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, เก็บไว้โดยไม่ใช้ออกซิเจนก่อนใช้งาน) และหมุนเหวี่ยง (13,000 × g, 4 °C, 10 นาที) เซลล์ถูกนํากลับมาใช้ใหม่ในบัฟเฟอร์ lysis (PBS ที่มี 6 mM guanidinium HCl, pH 7.4) ก่อนที่จะหยุดชะงักที่ 4 ° C โดย ultrasonication (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Germany) (3 × 1 นาที) เศษเซลล์ถูกอัดเม็ดโดยการหมุนเหวี่ยง (13,000 × g, 4 °C, 15 นาที) อภินิหารถูกถ่ายโอนไปยังคิวเวทท์ QS-macro ขนาด 3.5 มล. (10 มม.) พร้อมแถบกวนแม่เหล็กและผสมกับบัฟเฟอร์ lysis 1 มล. การสูญพันธุ์ของตัวอย่างถูกตรวจสอบที่ 412 นาโนเมตรด้วยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ Jasco V-650 ที่ติดตั้งตัวยึดเซลล์ควบคุมอุณหภูมิ PSC-718 ที่อุณหภูมิห้อง เพิ่มสารละลาย dithiobis (กรดไนโตรเบนโซอิก) ขนาด 3 mM ขนาด 3 mM 100μl การสูญพันธุ์ถูกตรวจสอบจนกว่าจะถึงจุดอิ่มตัว การคํานวณความเข้มข้นของไทออลดําเนินการโดยใช้ค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ ε๔๑๒ = ๑๓,๗๐๐ M-1 ซม.-1 สำหรับ thio-2-nitrobenzoic กรด (TNB) ความเข้มข้น thiol Cellular คำนวณขึ้นอยู่กับปริมาณของเชื้อ E. coli เซลล์ 6.7 × 10-15 ลิตรและความหนาแน่นของเซลล์ A600 = 0.5 (เทียบเท่ากับ 1 × 108 เซลล์มล.-1 วัฒนธรรม) (Müller et al. 2016)
     

    ในความมุ่งมั่นของ Vivo Glutathione โดยใช้เครื่องบดเซลล์อัลตราโซนิก

    E.coli MG1655 ปลูกใน MOPS minimal medium ในปริมาณรวม 200ml จนกระทั่งถึง A600 ที่ 0.5 วัฒนธรรมถูกแบ่งออกเป็นวัฒนธรรม 50 มล. สําหรับการรักษาความเครียด หลังจากฟักตัว 15 นาทีด้วยอัลลิซิ 0.79 mM, ไดอะไมด์ 1 mM หรือไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (ควบคุม) เซลล์จะถูกเก็บเกี่ยวที่ 4,000 กรัมที่ 4 ° C เป็นเวลา 10 นาที เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ KPE ก่อนที่จะนําเม็ดกลับมาใช้ใหม่ในบัฟเฟอร์ KPE 700μl สําหรับการ deproteination, 300l ของ 10% (w / v) กรดซัลโฟซาลิไซลิกถูกเพิ่มก่อนที่จะหยุดชะงักของเซลล์โดย ultrasonication (3 x 1 นาที; VialTweeter ultrasonicator) supernatants ถูกเก็บหลังจากการหมุนเหวี่ยง (30 นาที, 13,000g 4 ° C) Sulfosalicylic ความเข้มข้นของกรดลดลง 1% โดยนอกเหนือจาก 3 เล่มของ KPE บัฟเฟอร์ วัดของกลูตาไธโอนรวมและ GSSG ถูกดำเนินการตามที่กล่าวไว้ข้างต้น ความเข้มข้นของกลูตาไธโอน Cellular คำนวณขึ้นอยู่กับปริมาณของเชื้อ E. coli เซลล์ 6.7×10-15 ลิตรและความหนาแน่นของเซลล์ A600 0.5 (เทียบเท่ากับ 1×108 เซลล์มล.-1 วัฒนธรรม). ความเข้มข้นของ GSH ถูกคำนวณโดยการลบจาก 2 [GSSG] จากกลูตาไธโอนทั้งหมด (Müller et al. 2016)

    การแสดงออกของมนุษย์ mAspAT ใน. coli โดยใช้ Homogenizer อัลตราโซนิก

    อัลตราโซนิกเซลล์ disruptor UP400St (400W) สำหรับการสกัดของเรื่องเซลล์ (โปรตีนเช่น organelles ดีเอ็นเออาร์เอ็นเอและอื่น ๆ )อาณานิคมเดียวของเชื้อ E. coli BL21 (DE3) เก็บงำเวกเตอร์แสดงออกใน 30 มล Luria-Bertani (LB) ขนาดกลางที่มี100μg / mL ampicillin และจากนั้นได้รับการปลูกฝังที่37ºCจนความหนาแน่นของแสง (OD๖๐๐) ถึง 0.6 เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 4,000 ×กรัมเป็นเวลา 10 นาทีและ resuspended ใน 3L กลาง LB สดที่มี100μg / mL ampicillin
    ต่อจากนั้นการแสดงออกของโปรตีนถูกเหนี่ยวนําด้วยไอโซโพรพิล 1 mM β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) เป็นเวลา 20 ชั่วโมงที่ 16ºC เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 8,000 × กรัมเป็นเวลา 15 นาทีและล้างด้วยบัฟเฟอร์ A (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4) เซลล์ประมาณ 45 กรัม (น้ําหนักเปียก) ได้มาจากการเพาะเลี้ยง 3 ลิตร หลังจากการหมุนเหวี่ยงเม็ดเซลล์จะถูกนํากลับมาใช้ใหม่ใน 40 มล. (สําหรับวัฒนธรรม 1 ลิตร) บัฟเฟอร์สกัดเย็นน้ําแข็ง A และ lysed โดย ultrasonication ที่อุณหภูมิเย็นจัดโดยใช้เครื่องบดเซลล์อัลตราโซนิก Hielscher UP400St เซลล์ไลซิสถูกหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 15 นาทีเพื่อแยกเศษส่วนที่ละลายน้ําได้ (supernatant) และตกตะกอน (เม็ด) (เจียงและคณะ. 2015)
     



    ข้อเท็จจริงที่รู้

    . coli

    Escherichia coli (e. coli) เป็นแกรมลบแบบไม่มีการใช้ออกซิเจน, รูปทรงแกน, ของแบคทีเรียในรูปของสกุล Escherichia ที่มักพบในลำไส้ล่างของสิ่งมีชีวิตที่อบอุ่น (endotherms). มีจำนวนมากของสายพันธุ์. coli (หรือประเภทย่อย) ที่มีลักษณะที่มีความหลากหลาย สายพันธุ์. coli มากที่สุดจะไม่เป็นอันตรายต่อมนุษย์เช่น B และ K-12 สายพันธุ์ที่ใช้กันทั่วไปสำหรับการใช้งานวิจัยในห้องปฏิบัติการ อย่างไรก็ตาม, สายพันธุ์บางอย่างเป็นอันตรายและอาจทำให้เกิดโรคร้ายแรง.
    E. coli มีบทบาทสำคัญในด้านวิศวกรรมชีวภาพที่ทันสมัยและจุลชีววิทยาอุตสาหกรรมตั้งแต่เชื้อแบคทีเรียที่เป็นเรื่องง่ายที่จะจัดการ การใช้งานในห้องปฏิบัติการทั่วไปที่เกี่ยวข้องกับการมักจะใช้เชื้อ E. coli ไม่เช่น เพื่อสร้างดีเอ็นเอ recombinant (DNA) หรือทำหน้าที่เป็นแบบอินทรีย์
    E. coli เป็นเจ้าบ้านที่หลากหลายมากสำหรับการผลิตโปรตีน heterologous และนานาระบบการแสดงออกของโปรตีนที่มีอยู่ในการผลิตของโปรตีนใน E. coli การใช้พลาสมิดที่อนุญาตให้แสดงออกในระดับสูงของโปรตีนยีนสามารถนำเข้าสู่แบคทีเรียซึ่งจะช่วยให้การผลิตโปรตีนดังกล่าวในปริมาณที่สูงในกระบวนการอุตสาหกรรมการหมัก
    E.coli ถูกใช้เป็นโรงงานเซลล์เพื่อผลิตอินซูลิน การใช้งานเพิ่มเติมรวมถึงการใช้เซลล์. coli ดัดแปลงเพื่อพัฒนาและผลิตวัคซีนและเอนไซม์ตรึงเพื่อผลิตเชื้อเพลิงชีวภาพรวมถึงการบําบัดทางชีวภาพ
    สายพันธุ์ K-12 เป็นรูปแบบการกลายพันธุ์ของเชื้อ E. coli ที่มากกว่าเป็นการแสดงออกของเอนไซม์อัลคาไลน์ฟอสฟา (ALP) การกลายพันธุ์นี้เกิดขึ้นเนื่องจากข้อบกพร่องในยีนที่รหัสอย่างต่อเนื่องสำหรับเอนไซม์ หากยีนผลิตสินค้าโดยไม่มีการยับยั้งใด ๆ นี้เป็นที่รู้จักกันเป็นกิจกรรมที่เป็นส่วนประกอบ แบบฟอร์มการกลายพันธุ์นี้เฉพาะที่ใช้สำหรับการแยกและการทำให้บริสุทธิ์เอนไซม์ ALP
    แบคทีเรียอีโคไลยังใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นโรงงานเซลล์ จุลินทรีย์วิศวกรรม (เช่นแบคทีเรีย) และเซลล์พืชสามารถใช้เป็นโรงงานเซลล์ที่เรียกว่า เซลล์ดัดแปลงพันธุกรรมเหล่านี้ผลิตโมเลกุลสารเคมีโพลิเมอร์โปรตีนและสารอื่น ๆ ซึ่งใช้เช่นในอุตสาหกรรมยาอาหารและเคมี เพื่อที่จะปล่อยโมเลกุลที่ผลิตในการตกแต่งภายในของเซลล์ bioengineered ดังกล่าวการสลายอัลตราโซนิกเป็นวิธีการทั่วไปในการรบกวนผนังเซลล์และการถ่ายโอนสารเป้าหมายลงในของเหลวโดยรอบ อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับการสลายของเซลล์วิศวกรรมชีวภาพ!

    อัลตราโซนิกตัดดีเอ็นเอ

    แรงเฉือนอัลตราโซนิกเป็นวิธีที่ใช้กันทั่วไปในการปล่อยโมเลกุลออร์แกเนลล์และโปรตีนจากภายในเซลล์รวมทั้งแบ่งเส้นดีเอ็นเอออกเป็นชิ้น ๆ โพรงอากาศอะคูสติกทําลายผนังเซลล์และเยื่อหุ้มเซลล์เพื่อสกัดดีเอ็นเอออกจากเซลล์และสร้างชิ้นส่วนประมาณ 600 ชิ้น – 800 bp ยาวซึ่งเหมาะสำหรับการวิเคราะห์
    คลิกที่นี่เพื่อเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยว homogenizers ล้ำสำหรับการกระจายตัวของดีเอ็นเอ!

    วรรณกรรม / อ้างอิง


    อัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูง! ช่วงผลิตภัณฑ์ Hielscher ครอบคลุมสเปกตรัมเต็มรูปแบบจาก ultrasonicator ห้องปฏิบัติการขนาดกะทัดรัดมากกว่าหน่วยบนม้านั่งบนระบบอัลตราโซนิกอุตสาหกรรมเต็มรูปแบบ

    Hielscher Ultrasonics ผลิต homogenizers อัลตราโซนิกที่มีประสิทธิภาพสูงจาก ห้องปฏิบัติการ ไปยัง ขนาดอุตสาหกรรมของ


    เรายินดีที่จะหารือเกี่ยวกับกระบวนการของคุณ

    มาติดต่อกันเถอะ