โปรโตคอลสําหรับ SARS-CoV-2 Coronavirus การกระตุ้นกับ Sonication

Hielscher VialTweeter เป็นหน่วยเตรียมหลายตัวอย่างอัลตราโซนิกที่ไม่ซ้ํากันซึ่งใช้ในการยกเลิกการ coronavirus SARS-COV-2 ขวดแก้วสามารถเตรียมขวดตัวอย่างได้ 10 ขวดพร้อมกัน และจึงเป็นหน่วยที่เหมาะสําหรับการประมวลผลตัวอย่างมวล

การไม่เปิดใช้งานของ SARS-CoV-2 Coronavirus กับ VialTweeter

หลังจากถอดซ่อม, monolayers ถูกล้างสามครั้งด้วยเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ก่อนที่จะขูดเซลล์เป็น 1mL MEM / 5% FBS และ sonicated (3 × 10 วินาทีบน, 10 วินาทีปิดที่ 100% พลังงานและ amplitude) โดยใช้หน่วยประมวลผลอัลตราโซนิก Hielscher UP200St กับ VialTweeter เอกสาร แนบ 3000 × กรัมเป็นเวลา 10 นาที 

อ่านโปรโตคอลเต็มรูปแบบที่นี่สําหรับ SARS - CoV - 2 coronavirus ไม่ได้ใช้งานโดย Welch et al. (2020) ด้านล่าง :

เซลล์และไวรัส

เซลล์ Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) ได้รับการเพาะเลี้ยงในการปรับเปลี่ยนสื่อที่จําเป็นขั้นต่ําของอินทรี (MEM) เสริมด้วย 10% (v/v) เซรั่มทารกในครรภ์น่อง (FCS) ไวรัสที่ใช้เป็น SARS- CoV- 2 สายพันธุ์ hCOV-19/England/2/2020, แยกโดย PHE จากกลุ่มผู้ป่วยครั้งแรกในสหราชอาณาจักรใน 29/01/2020 ไวรัสนี้ได้รับที่ทาง 1 และใช้สําหรับการศึกษาการยกเลิกการเรียกใช้ที่ทาง 2 หรือ 3.
สําหรับน้ํายาและสารเคมีที่ใช้สําหรับ SARS-CoV-2 การไม่ใช้งานเช่นเดียวกับการกําจัดของพิษสารโปรดดูรายงานทางวิทยาศาสตร์ของ Welch et al. (2020).

การยับยั้งไวรัสโดยผงซักฟอก – โปรโตคอลการยกเลิกการเรียกใช้ Coronavirus SARS-Cov-2 โดย Welch et al. 2020

การไม่เปิดใช้งาน SARS-Cov-2

สําหรับผลิตภัณฑ์เชิงพาณิชย์การเตรียมไวรัส (ของเหลววัฒนธรรมเนื้อเยื่อ titers ตั้งแต่ 1 × 10⁶ ถึง 1 × 10⁸ PFU/ml) ได้รับการปฏิบัติในไตร่ตมด้วยน้ํายาที่ความเข้มข้นและสําหรับเวลาติดต่อที่แนะนําในคําแนะนําของผู้ผลิตสําหรับการใช้งาน, ที่มีอยู่, หรือสําหรับความเข้มข้นและครั้งที่ร้องขอโดยเฉพาะโดยห้องปฏิบัติการทดสอบของ ซึ่งช่วงของความเข้มข้นที่ได้รับจากผู้ผลิต, อัตราส่วนต่ําสุดของผลิตภัณฑ์เพื่อตัวอย่างได้รับการทดสอบ (เช่นความเข้มข้นต่ําสุดที่แนะนําของผลิตภัณฑ์ทดสอบ). ตัวอย่างการขนส่งหลอดน้ํายาได้รับการทดสอบโดยใช้อัตราส่วนของปริมาตรของของเหลวเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อถึงสิบปริมาณของน้ํายาเว้นแต่เป็นอัตราส่วนปริมาณของของเหลวตัวอย่างเพื่อน้ํายาถูกกําหนดโดยผู้ผลิต ผงซักฟอก, น้ํายาตรึงและตัวทําละลายได้รับการทดสอบที่ความเข้มข้นที่ระบุไว้สําหรับเวลาที่ระบุ ขั้นตอนยกเลิกการเรียกใช้ทั้งหมดได้ดําเนินการที่อุณหภูมิห้อง (18 - 25 ° C) สําหรับการทดสอบประเภทตัวอย่างทางเลือก, ไวรัสถูกแทงเข้าไปในเมทริกซ์ตัวอย่างที่ระบุที่อัตราส่วน 1:9, แล้วรับการรักษาด้วยการทดสอบสารดังกล่าวข้างต้น. การทดลองทั้งหมดรวมตัวอย่างที่ผ่านการตรวจสอบการควบคุมการจําลองแบบ triplicate ที่มีปริมาณเทียบเท่าของ PBS แทนน้ํายาทดสอบ ทันทีหลังจากเวลาติดต่อที่จําเป็น, 1mL ของการรักษาตัวอย่างได้รับการประมวลผลโดยใช้เมทริกซ์การกรองที่เลือกอย่างเหมาะสม. การกําจัดสารสําหรับการทดสอบการไม่มีการใช้งานได้ดําเนินการในรูปแบบคอลัมน์หมุนขนาดใหญ่โดยใช้ Pierce 4mL กําจัดผงซักฟอกคอลัมน์สปิน (Thermo Fisher) หรือโดยการกรอกว่างเจาะ 10mL คอลัมน์หมุนเหวี่ยงความจุ (Thermo Fisher) กับ SM2 ไบโอ-ลูกปัด, Sephacryl S-400HR หรือ Sephadex LH-20 เพื่อให้ 4mL บรรจุลูกปัด / เรซิน. สําหรับการกรองโดยใช้ตัวกรอง Amicon ตัวอย่าง 2 × 500μl ถูกกรองโดยใช้ตัวกรองแบบแรงเหวี่ยงสองตัวโดยวิธีการก่อนหน้านี้แล้วรวมเข้าด้วยกัน สําหรับฟอร์มาลดีไฮด์และฟอร์มาลดีไฮด์ที่มีการกําจัด glutaraldehyde, หนึ่งตัวกรองถูกนํามาใช้กับปริมาณตัวอย่าง 1× 500μl, resuspended หลังจากการประมวลผลใน 500 ไมโครลิตร PBS, และเพิ่ม 400ul MEM / 5% FBS. สําหรับการยับยั้งการติดเชื้อ โมโนเลเยอร์ 12.5 ซม.² ขวดของเซลล์ Vero E6 (2.5 × 10⁶ เซลล์ / ขวดใน 2.5mL MEM / 5% FBS) ติดเชื้อที่ MOI 0.001 และบ่มที่ 37 ° C / 5% CO₂ เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ซูเปอร์เนทถูกถอดออกและเซลล์คงที่โดยใช้ 5mL ของฟอร์มาลดีไฮด์หรือฟอร์มาลดีไฮด์และ glutaraldehyde ที่อุณหภูมิห้องสําหรับ 15 หรือ 60 นาที ฟิสชันได้ถูกลบออกและ monolayers ล้างสามครั้งด้วย PBS ก่อนที่จะขูดเซลล์เป็น 1mL MEM / 5% FBS และ sonicated (3 × 10 วินาทีใน 10 วินาทีออกที่ 100% พลังงานและ amplitude) โดยใช้ UP200St กับสิ่งที่แนบมา Vialtweeter (Hielscher อัลตราซาวด์เทคโนโลยี) 3000 × กรัมเป็นเวลา 10 นาที

รายละเอียดของสารที่ใช้สําหรับ SARS-CoV-2 coronavirus ใช้งานกับ VialTweeter อัลตราโซนิกตามโปรโตคอลโดย Welch et al. 2020

โปรโตคอลเต็มรูปแบบรวมทั้งการใช้ของ Hielscher VialTweeter สามารถพบได้ที่นี่:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

เครื่องกําจัดของอัลตราโซนิกและเซลล์ที่รบกวนที่ซับซ้อน

หลายตัวอย่างเครื่องอัลตราโซนิก VialTweeter เป็นเพียงหนึ่งในโซลูชั่นอัลตราโซนิกจํานวนมากสําหรับการเตรียมตัวอย่างในห้องปฏิบัติการทางชีวเคมีและทางคลินิก Hielscher Ultrasonics มี dismembrator อัลตราโซนิกเหมาะสําหรับโปรแกรมประยุกต์ของคุณ เช่นสลายเซลล์, การสกัดเซลล์, การทําให้เป็นเนื้อเดียวกันเนื้อเยื่อ, ไลเสท solubilization, ละลาย, degassing
แจ้งให้เราทราบจํานวนตัวอย่างที่คุณต้องดําเนินการต่อชั่วโมงและวันถ้าคุณต้องการ sonication โดยตรงหรือโดยอ้อมและสิ่งที่เป้าหมายของการรักษาตัวอย่างอัลตราโซนิกเป็น เราจะแนะนําให้คุณหน่วยอัลตราโซนิกที่เหมาะสมที่สุดสําหรับกิจวัตรประจําวันของคุณ!
โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิกดิจิตอล Hielscher Ultrasonics 'มีการติดตั้งซอฟต์แวร์สมาร์ท, บันทึกข้อมูลอัตโนมัติ, ตัวเลือกการตั้งค่าพื้นฐานที่ง่ายสําหรับการควบคุมอุณหภูมิ, ระยะเวลา sonication, วงจร / โหมดชีพจรเช่นเดียวกับการส่องสว่างตัวอย่างและเบราว์เซอร์การควบคุมระยะไกล เรามุ่งมั่นที่จะทําให้อุปกรณ์อัลตราโซนิกของเราเป็นสมาร์ทที่สุดเพื่อให้การวิจัยและกิจวัตรการทํางานของคุณกลายเป็นที่สะดวกและประสบความสําเร็จที่สุด
คลิกที่นี่เพื่อหาการใช้งานเพิ่มเติมรวมทั้งโปรโตคอลของการเตรียมตัวอย่างอัลตราโซนิกกับ VialTweeter!