โปรโตคอลสําหรับการยับยั้งการทํางานของ SARS-CoV-2 Coronavirus ด้วย Sonication

Hielscher VialTweeter เป็นหน่วยเตรียมตัวอย่างหลายตัวอย่างอัลตราโซนิกที่ไม่เหมือนใคร ซึ่งใช้เพื่อยับยั้งไวรัสโคโรนา SARS-COV-2 VialTweeter ช่วยให้สามารถเตรียมขวดตัวอย่างได้ถึง 10 ขวดพร้อมกัน และด้วยเหตุนี้จึงเป็นหน่วยที่เหมาะสําหรับการประมวลผลตัวอย่างจํานวนมาก

การยับยั้งการทํางานของ SARS-CoV-2 Coronavirus ด้วย VialTweeter

หลังจากเอาสารตรึงออกแล้วเลเยอร์เดียวจะถูกล้างสามครั้งด้วยน้ําเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ก่อนที่จะขูดเซลล์ลงใน MEM 1mL / 5% FBS และโซนิค (เปิด 3 × 10 วินาที ปิด 10 วินาทีที่กําลังไฟและแอมพลิจูด 100%) โดยใช้โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิก Hielscher UP200St พร้อม VialTweeter การผูกติด สารเหนือน้ําถูกชี้แจงโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 3000 × กรัมเป็นเวลา 10 นาที 

อ่านโปรโตคอลฉบับเต็มที่นี่สําหรับการยับยั้งการทํางานของไวรัสโคโรนา SARS-CoV-2 โดย Welch et al. (2020) ด้านล่าง:

เซลล์และไวรัส

เซลล์ Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) ได้รับการเพาะเลี้ยงในอาหารที่จําเป็นขั้นต่ําของ Eagle (MEM) ที่ดัดแปลงเสริมด้วยซีรั่มลูกวัวทารกในครรภ์ (FCS) 10% (v/v) ไวรัสที่ใช้คือ SARS-CoV-2 สายพันธุ์ hCOV-19/England/2/2020 ซึ่งแยกโดย PHE จากคลัสเตอร์ผู้ป่วยรายแรกในสหราชอาณาจักรเมื่อวันที่ 29/01/2020 ไวรัสนี้ได้ที่เนื้อเรื่องที่ 1 และใช้สําหรับการศึกษาการยับยั้งงานที่เนื้อเรื่องที่ 2 หรือ 3
สําหรับรีเอเจนต์และสารเคมีที่ใช้สําหรับการยับยั้งการทํางานของ SARS-CoV-2 ตลอดจนการกําจัดความเป็นพิษต่อเซลล์ของรีเอเจนต์ โปรดดูรายงานทางวิทยาศาสตร์ของ Welch et al. (2020)

การยับยั้งการทํางานของไวรัสด้วยผงซักฟอก – โปรโตคอลการปิดใช้งาน SARS-CoV-2 Coronavirus โดย Welch et al. 2020

การยับยั้งการทํางานของ SARS-CoV-2

สําหรับผลิตภัณฑ์เชิงพาณิชย์การเตรียมไวรัส (ของเหลวเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ไตเตอร์ตั้งแต่ 1 × 10⁶ ถึง 1 × 10⁸ PFU/ml) ได้รับการบําบัดเป็นสามเท่าด้วยรีเอเจนต์ที่ความเข้มข้นและเวลาสัมผัสที่แนะนําในคําแนะนําการใช้งานของผู้ผลิต (หากมี) หรือสําหรับความเข้มข้นและเวลาที่ห้องปฏิบัติการทดสอบร้องขอโดยเฉพาะ ในกรณีที่ผู้ผลิตกําหนดช่วงความเข้มข้น จะมีการทดสอบอัตราส่วนต่ําสุดของผลิตภัณฑ์ต่อตัวอย่าง (เช่น ความเข้มข้นต่ําสุดที่แนะนําของผลิตภัณฑ์ทดสอบ) รีเอเจนต์หลอดขนส่งตัวอย่างได้รับการทดสอบโดยใช้อัตราส่วนของของเหลวเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหนึ่งปริมาตรต่อรีเอเจนต์สิบปริมาตร เว้นแต่ผู้ผลิตจะระบุอัตราส่วนปริมาตรของของเหลวตัวอย่างต่อรีเอเจนต์ ผงซักฟอก สารตรึง และตัวทําละลายได้รับการทดสอบที่ความเข้มข้นที่ระบุตามเวลาที่ระบุ ขั้นตอนการปิดใช้งานทั้งหมดดําเนินการที่อุณหภูมิห้องโดยรอบ (18 – 25°C) สําหรับการทดสอบตัวอย่างประเภทอื่น ไวรัสจะถูกพุ่งเข้าไปในเมทริกซ์ตัวอย่างที่ระบุในอัตราส่วน 1:9 จากนั้นจึงบําบัดด้วยรีเอเจนต์ทดสอบข้างต้น การทดลองทั้งหมดรวมถึงตัวอย่างที่ผ่านการบําบัดแบบจําลองการควบคุมสามเท่าที่มี PBS ในปริมาตรเทียบเท่าแทนรีเอเจนต์ทดสอบ ทันทีหลังจากเวลาสัมผัสที่ต้องการ ตัวอย่างที่ผ่านการบําบัดแล้ว 1 มล. จะถูกประมวลผลโดยใช้เมทริกซ์การกรองที่เลือกอย่างเหมาะสม การกําจัดรีเอเจนต์สําหรับการทดสอบการยับยั้งงานดําเนินการในรูปแบบคอลัมน์สปินที่ใหญ่ขึ้นโดยใช้คอลัมน์สปินกําจัดผงซักฟอก Pierce 4mL (Thermo Fisher) หรือโดยการเติมคอลัมน์หมุนเหวี่ยงความจุ 10 มล. ของ Pierce (Thermo Fisher) ที่ว่างเปล่าด้วย SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR หรือ Sephadex LH-20 เพื่อให้ได้ลูกปัด/เรซินบรรจุ 4 มล. สําหรับการทําให้บริสุทธิ์โดยใช้ตัวกรอง Amicon ตัวอย่าง 2 × 500μl ถูกทําให้บริสุทธิ์โดยใช้ตัวกรองแรงเหวี่ยงสองตัวตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ สําหรับฟอร์มาลดีไฮด์และฟอร์มาลดีไฮด์ที่มีการกําจัดกลูตาราลดีไฮด์ จะใช้ตัวกรองหนึ่งตัวกับปริมาตรตัวอย่าง 1× 500μl แขวนลอยหลังจากการประมวลผลใน PBS 500μl และเติมลงใน 400ul MEM / 5% FBS สําหรับการปิดใช้งานผู้ติดเชื้อ ชั้นเดียว 12.5 ซม.² ขวดเซลล์ Vero E6 (2.5 × 10⁶ เซลล์/ขวดใน MEM 2.5mL/FBS 5%) ติดเชื้อที่ MOI 0.001 และบ่มที่อุณหภูมิ 37°C/5% CO₂ เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ส่วนเหนือน้ําถูกลบออก และเซลล์ได้รับการแก้ไขโดยใช้ฟอร์มาลดีไฮด์ 5 มล. หรือฟอร์มาลดีไฮด์และกลูตาราลดีไฮด์ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 หรือ 60 นาที สารตรึงถูกลบออก และล้างชั้นเดียวสามครั้งด้วย PBS ก่อนที่จะขูดเซลล์ลงใน 1mL MEM/5% FBS และโซนิก (เปิด 3 × 10 วินาที ปิด 10 วินาทีที่กําลังไฟและแอมพลิจูด 100%) โดยใช้ UP200St พร้อมสิ่งที่แนบมากับ VialTweeter (เทคโนโลยีอัลตร้าซาวด์ Hielscher) สารเหนือน้ําถูกชี้แจงโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 3000 × กรัมเป็นเวลา 10 นาที

รายละเอียดของรีเอเจนต์ที่ใช้สําหรับการยับยั้งการทํางานของไวรัสโคโรนา SARS-CoV-2 ด้วยไวอัลทวีตเตอร์อัลตราโซนิกตามโปรโตคอลโดย Welch et al. 2020

โปรโตคอลเต็มรูปแบบรวมถึงการใช้ Hielscher VialTweeter สามารถพบได้ที่นี่:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

เครื่องจดจําอัลตราโซนิกที่ซับซ้อนและตัวก่อกวนเซลล์

เครื่องอัลตราโซนิกหลายตัวอย่าง VialTweeter เป็นเพียงหนึ่งในหลายโซลูชั่นอัลตราโซนิกสําหรับการเตรียมตัวอย่างในห้องปฏิบัติการทางชีวภาพชีวเคมีและคลินิก Hielscher Ultrasonics นําเสนอเครื่องแยกอัลตราโซนิกที่เหมาะสําหรับการใช้งานของคุณเช่นการสลายเซลล์การสกัดเซลล์การทําให้เป็นเนื้อเดียวกันของเนื้อเยื่อการละลายการละลายการแยกตัวอย่าง
แจ้งให้เราทราบว่าคุณต้องประมวลผลตัวอย่างกี่ตัวอย่างต่อชั่วโมงและวันหากคุณต้องการ sonication โดยตรงหรือโดยอ้อมและเป้าหมายของการรักษาตัวอย่างอัลตราโซนิกคืออะไร เราจะแนะนําหน่วยอัลตราโซนิกที่เหมาะสมที่สุดสําหรับกิจวัตรการทํางานประจําวันของคุณ!
โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิกดิจิตอลของ Hielscher Ultrasonic มาพร้อมกับซอฟต์แวร์อัจฉริยะการบันทึกข้อมูลอัตโนมัติตัวเลือกการตั้งค่าล่วงหน้าที่ง่ายสําหรับการควบคุมอุณหภูมิระยะเวลา sonication โหมดรอบ / พัลส์ตลอดจนการส่องสว่างตัวอย่างและรีโมทคอนโทรลของเบราว์เซอร์ เรามุ่งมั่นที่จะทําให้อุปกรณ์อัลตราโซนิกของเราฉลาดที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้เพื่อให้การวิจัยและกิจวัตรการทํางานของคุณสะดวกและประสบความสําเร็จมากที่สุด
คลิกที่นี่เพื่อค้นหาการใช้งานเพิ่มเติมรวมถึงโปรโตคอลการเตรียมตัวอย่างอัลตราโซนิกด้วย VialTweeter!