การสลายตัวอย่าง Drosophila Melanogaster ด้วยอัลตราซาวนด์

Drosophila melanogaster ใช้กันอย่างแพร่หลายในห้องปฏิบัติการในฐานะสิ่งมีชีวิตต้นแบบ ดังนั้นจึงต้องดำเนินขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างก่อนการวิเคราะห์ เช่น การสลายเซลล์ การทำลายเซลล์ การสกัดโปรตีน และการตัดเฉือน DNA ของตัวอย่าง Drosophila melanogaster อยู่บ่อยครั้ง เครื่องสลายตัวอย่างด้วยอัลตราซาวนด์มีความน่าเชื่อถือและมีประสิทธิภาพ และสามารถใช้ปฏิบัติงานต่าง ๆ เช่น การสลายเซลล์ การสกัดโปรตีน หรือการทำให้ DNA แตกเป็นชิ้นได้อย่างสะดวก เพียงปรับพารามิเตอร์ของกระบวนการอัลตราซาวนด์ เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราซาวนด์จึงเป็นเครื่องมือที่ยืดหยุ่นและมีขอบเขตการใช้งานที่กว้างขวาง

การสลายเซลล์และการสกัดโปรตีนด้วยอัลตราซาวนด์

การสลายเซลล์ การทำให้เซลล์ละลาย การทำให้เนื้อเยื่อเป็นเนื้อเดียวกัน และการสกัดโปรตีนเป็นงานทั่วไปของเครื่องสลายตัวอย่างด้วยอัลตราซาวนด์ในห้องปฏิบัติการชีววิทยา เครื่องสลายตัวอย่างและเครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการทำให้เนื้อเยื่อสัตว์ แมลง (เช่น Drosophila melanogaster, C. elegans) หรือตัวอย่างพืชเป็นเนื้อเดียวกัน การใช้อัลตราซาวนด์ในขั้นตอนถัดไป ได้แก่ การสลายเซลล์ในสารแขวนลอยและตะกอนเซลล์ รวมถึงการสกัดโปรตีนภายในเซลล์
การสลายเซลล์และการสกัดโปรตีนด้วยอัลตราซาวนด์เป็นกระบวนการที่มีความน่าเชื่อถือสูงและให้ผลที่ทำซ้ำได้ โดยสามารถดำเนินการตามวิธีปฏิบัติที่กำหนดไว้แล้ว เนื่องจากสามารถปรับความเข้มของกระบวนการอัลตราซาวนด์ได้อย่างแม่นยำผ่านพารามิเตอร์การใช้อัลตราซาวนด์ เช่น แอมพลิจูด โหมดรอบ / พัลส์ อุณหภูมิ และปริมาตรตัวอย่าง วิธีปฏิบัติที่ผ่านการพิสูจน์แล้วจึงสามารถทำซ้ำได้ครั้งแล้วครั้งเล่าโดยให้ผลลัพธ์เหมือนเดิม

การทำให้ DNA และ RNA แตกเป็นชิ้นด้วยอัลตราซาวนด์

หลังจากการสลายเซลล์และการสกัดโปรตีน ขั้นตอนที่มักจำเป็นในการเตรียมตัวอย่างคือการตัดเฉือนและการทำให้ DNA, RNA และโครมาตินแตกเป็นชิ้น เช่น ก่อนการตกตะกอนโครมาตินด้วยภูมิคุ้มกัน (ChIP) สามารถทำให้ DNA และ RNA แตกเป็นชิ้นได้อย่างน่าเชื่อถือโดยใช้แรงทางกายภาพทำลายพันธะโคเวเลนต์ที่ยึด DNA ไว้ด้วยกัน เมื่อใช้การตัดเฉือนทางกายภาพ เช่น การใช้อัลตราซาวนด์ สาย DNA จะขาดในขั้นแรก จากนั้น DNA จะแตกเป็นชิ้นที่เล็กลง
การทำให้ DNA แตกเป็นชิ้นด้วยอัลตราซาวนด์มีความน่าเชื่อถือและมีประสิทธิภาพในการตัดเฉือน DNA ให้ได้ความยาวเป้าหมาย เช่น 500bp (คู่เบส) ข้อดีหลักของการทำให้ DNA แตกเป็นชิ้นด้วยอัลตราซาวนด์ ได้แก่ การควบคุมพารามิเตอร์และความเข้มของกระบวนการอัลตราซาวนด์ได้อย่างแม่นยำ สามารถปรับพารามิเตอร์ของกระบวนการอัลตราซาวนด์ได้โดยปรับความเข้ม รอบ และระยะเวลาของการใช้อัลตราซาวนด์อย่างแม่นยำ ซึ่งทำให้สามารถสร้าง DNA ที่มีขนาดตามต้องการ และผลิต DNA ที่มีความยาวเป้าหมายได้อย่างน่าเชื่อถือ รวมทั้งผลิตซ้ำได้ การตัดเฉือน DNA ด้วยอัลตราซาวนด์ยังเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการสร้างชิ้นส่วน DNA ที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูง

วิธีปฏิบัติสำหรับการสลาย Drosophila melanogaster ด้วยอัลตราซาวนด์

ด้านล่างนี้เป็นวิธีปฏิบัติต่าง ๆ สำหรับการสลายเซลล์ การสกัดโปรตีน และการทำให้ DNA หรือโครมาตินของตัวอย่าง Drosophila แตกเป็นชิ้นโดยใช้อัลตราซาวนด์ช่วย

การสลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์สำหรับการทดสอบการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันร่วมกับการเชื่อมขวาง (CLIP)

ดำเนินการทดสอบ CLIP ตามรายงานก่อนหน้านี้โดยมีการปรับเปลี่ยนบางประการ นำรังไข่ประมาณ 20 mg จากเพศเมียชนิดป่าอายุ 0 ถึง 1 วันมาเชื่อมขวางด้วยรังสี UV (3 × 2000 μJ/cm2) ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันบนน้ำแข็งในบัฟเฟอร์ RCB ปริมาตร 1 mL (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1× สารยับยั้งโปรตีเอส Complete ที่ปราศจาก EDTA, 1 mM PMSF) ซึ่งเติม 300 U RNAseOUT และวางบนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 min นำสารที่ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันแล้วมาใช้อัลตราซาวนด์บนน้ำแข็งที่กำลัง 80% จำนวนห้าครั้ง ครั้งละ 20 s โดยพัก 60 s ระหว่างแต่ละครั้ง ด้วยเครื่องประมวลผลอัลตราซาวนด์ Hielscher รุ่น UP100H (100 W, 30 kHz) แล้วปั่นเหวี่ยง (16,000 × g เป็นเวลา 5 min ที่ 4°C) กำจัดองค์ประกอบที่จับแบบไม่จำเพาะออกจากสารสกัดส่วนที่ละลายได้ล่วงหน้าด้วย Protein-G dynabeads ปริมาตร 20 μl เป็นเวลา 20 min ที่ 4°C หลังจากแยกตัวอย่างสำหรับอิมมูโนบล็อตและการวัดปริมาณ RNA ตั้งต้น (1%) แล้ว ทำให้ HP1 ตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันโดยใช้แอนติบอดี anti-HP1 9A9 จากสารสกัดที่ผ่านการกำจัดองค์ประกอบที่จับแบบไม่จำเพาะล่วงหน้าแล้วปริมาตร 450 μl โดยบ่มเป็นเวลา 4 h กับ Protein-G dynabeads ปริมาตร 50 μl ล้างตะกอนที่ได้จากการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกัน 4 ครั้งด้วย RCB เพื่อชะ RNA ที่ตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันออกมา นำเม็ดบีดที่ตกตะกอนแล้วมาต้มในน้ำ UltraPure ที่ผ่านการบำบัดด้วย DEPC ปริมาตร 100 μL เป็นเวลา 5 min เติมรีเอเจนต์ Qiazol ปริมาตร 900 μL ลงในส่วนใสเหนือตะกอนที่เก็บมาเพื่อเตรียม RNA ใช้ RNA ที่ทำให้บริสุทธิ์แล้วเป็นแม่แบบในการสังเคราะห์ cDNA โดยใช้ oligo dT, เฮกซาเมอร์แบบสุ่ม และ SuperScript reverse transcriptase III ตามวิธีปฏิบัติของผู้ผลิต
(Cassale et al. 2019)

การสลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์สำหรับการทดสอบการตกตะกอนโครมาตินด้วยภูมิคุ้มกัน

ดำเนินการตกตะกอนโครมาตินด้วยภูมิคุ้มกันตามวิธีที่ Menet อธิบายไว้ โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย นำรังไข่ประมาณ 20 mg จากเพศเมียชนิดป่าอายุ 0 ถึง 1 วันมาทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์ NEB ปริมาตร 1 mL (10 mM HEPES-Na ที่ pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA-Na ที่ pH 8, 0.5 mM EDTA-Na ที่ pH 8, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM Spermidine, 0.15 mM Spermine, 1× สารยับยั้งโปรตีเอส Complete ที่ปราศจาก EDTA) ด้วยเครื่องโฮโมจีไนเซอร์ / เครื่องกระจายตัวแบบจุ่มเป็นเวลา 1 min (ที่ 3000 rpm) ย้ายสารที่ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันแล้วไปยังเครื่องบดเนื้อเยื่อแก้วแบบ Dounce ที่ทำให้เย็นไว้ล่วงหน้า และบดเต็มช่วงชัก 15 ครั้งด้วยสากที่สวมพอดีแน่น จากนั้นปั่นเหวี่ยงนิวเคลียสอิสระที่ 6000xg เป็นเวลา 10 min ที่ 4°C นำตะกอนที่มีนิวเคลียสมาทำให้แขวนลอยอีกครั้งใน NEB ปริมาตร 1 mL และปั่นเหวี่ยงที่ 20,000 × g เป็นเวลา 20 min บนชั้นไล่ระดับความเข้มข้นของ sucrose (ปริมาตร 0.65 mL ของ 1.6 M sucrose ใน NEB, ปริมาตร 0.35 mL ของ 0.8 M sucrose ใน NEB) นำตะกอนมาทำให้แขวนลอยอีกครั้งใน NEB ปริมาตร 1 mL และเติม formaldehyde ให้มีความเข้มข้นสุดท้าย 1% เชื่อมขวางนิวเคลียสเป็นเวลา 10 min ที่อุณหภูมิห้อง และหยุดปฏิกิริยาโดยเติม glycine ปริมาตร 1/10 ของปริมาตรตัวอย่าง ที่ความเข้มข้น 1.375 M เก็บนิวเคลียสด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ 6000 × g เป็นเวลา 5 min ล้างนิวเคลียสสองครั้งใน NEB ปริมาตร 1 mL และทำให้แขวนลอยอีกครั้งในบัฟเฟอร์สลายเซลล์ปริมาตร 1 mL (15 mM HEPES-Na ที่ pH 7.6, 140 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, 1 mM EDTA ที่ pH 8, 1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.1% Na Deoxycholate, 0.1% SDS, 0.5% N-lauroylsarcosine และ 1× สารยับยั้งโปรตีเอส Complete ที่ปราศจาก EDTA) นำนิวเคลียสมาใช้อัลตราซาวนด์ด้วยเครื่องประมวลผลอัลตราซาวนด์ Hielscher รุ่น UP100H (100 W, 30 kHz) จำนวนหกครั้ง โดยเปิดอัลตราซาวนด์ครั้งละ 20 s และวางบนน้ำแข็ง 1 min ปั่นเหวี่ยงนิวเคลียสที่ผ่านการใช้อัลตราซาวนด์แล้วที่ 13,000 × g เป็นเวลา 4 min ที่ 4°C โครมาตินที่ผ่านการใช้อัลตราซาวนด์ส่วนใหญ่มีความยาว 500 ถึง 1000 คู่เบส (bp) สำหรับการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันแต่ละครั้ง บ่มโครมาติน 15 μg ร่วมกับโมโนโคลนอลแอนติบอดี HP1 9A9 ปริมาณ 10 μg (3 h ที่ 4°C บนล้อหมุน) จากนั้นเติม 50 μl ของ dynabeads protein G และบ่มต่อข้ามคืนที่ 4°C ทิ้งส่วนใสเหนือตะกอนและล้างตัวอย่างสองครั้งในบัฟเฟอร์สลายเซลล์ (ล้างแต่ละครั้งเป็นเวลา 15 min ที่ 4 °C) และสองครั้งในบัฟเฟอร์ TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl ที่ pH 8) ชะโครมาตินออกจากเม็ดบีดในสองขั้นตอน โดยขั้นแรกใช้ปริมาตร 100 μl ของบัฟเฟอร์ชะ 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl ที่ pH 8) ที่ 65°C เป็นเวลา 15 min แล้วปั่นเหวี่ยงและเก็บส่วนใสเหนือตะกอน สกัดวัสดุบนเม็ดบีดอีกครั้งด้วยปริมาตร 100 μl ของ TE + 0.67% SDS นำสารชะที่รวมกัน (200 μl) มาบ่มข้ามคืนที่ 65°C เพื่อย้อนกลับการเชื่อมขวาง และบำบัดด้วย 50 μg/ml RNaseA เป็นเวลา 15 min ที่ 65°C และด้วย 500 μg/ml Proteinase K เป็นเวลา 3 h ที่ 65°C สกัดตัวอย่างด้วย phenol–chloroform และตกตะกอนด้วย ethanol นำ DNA มาทำให้แขวนลอยอีกครั้งในน้ำปริมาตร 25 μl เพื่อให้การวิเคราะห์ระดับโมเลกุลด้วย DNA ที่ตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันเกิดประโยชน์สูงสุด เพิ่มปริมาณยีนเป้าหมายที่คัดเลือกไว้เป็นคู่ผ่านวิธีปฏิบัติ duplex-PCR ที่ปรับให้เหมาะสมแล้ว โดยใช้ไพรเมอร์สองชุดที่แตกต่างกันซึ่งมีอุณหภูมิหลอมเหลวใกล้เคียงกันในปฏิกิริยาเดียว
(Casale et al. 2019)
 

เครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์สมรรถนะสูงสำหรับตัวอย่างชีวภาพ

Hielscher Ultrasonics เป็นพันธมิตรที่มีประสบการณ์ยาวนานของคุณในด้านเครื่องอัลตราซาวนด์สมรรถนะสูงสำหรับการทำลายเซลล์ การสลายเซลล์ การสกัดโปรตีน การทำให้ DNA, RNA และโครมาตินแตกเป็นชิ้น รวมถึงขั้นตอนอื่น ๆ ของการเตรียมตัวอย่างก่อนการวิเคราะห์ ด้วยผลิตภัณฑ์เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราซาวนด์สำหรับห้องปฏิบัติการและชุดเตรียมตัวอย่างที่ครอบคลุม Hielscher จึงมีอุปกรณ์อัลตราซาวนด์ที่เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการใช้งานทางชีววิทยาและข้อกำหนดของคุณ
เครื่องอัลตราซาวนด์แบบโพรบมาตรฐานที่มีปลายโพรบขนาดเล็ก เช่น UP200St (200W; ดูภาพด้านซ้าย) หรือชุดเตรียมตัวอย่างด้วยอัลตราซาวนด์รุ่นใดรุ่นหนึ่ง ได้แก่ VialTweeter หรือ UP200ST_TD_CupHorn พร้อม VialHolder เป็นรุ่นที่นิยมใช้ในห้องปฏิบัติการวิจัยและวิเคราะห์ โพรบอัลตราซาวนด์มาตรฐานเหมาะอย่างยิ่งเมื่อต้องสลาย สกัด หรือทำให้ตัวอย่างจำนวนน้อยแตกเป็นชิ้น ชุดเตรียมตัวอย่าง VialTweeter และ UP200St_TD_CupHorn สามารถใช้อัลตราซาวนด์กับขวดตัวอย่างพร้อมกันได้สูงสุด 10 หรือ 5 ขวดตามลำดับ
หากต้องประมวลผลตัวอย่างจำนวนมาก (เช่น เพลต 96 หลุม เพลตไมโครไทเทอร์ เป็นต้น) UIP400MTP เป็นชุดอุปกรณ์สำหรับการใช้อัลตราซาวนด์ที่เหมาะอย่างยิ่ง UIP400MTP ทำงานคล้าย cuphorn ที่มีขนาดใหญ่กว่า ซึ่งเติมน้ำไว้และมีพื้นที่เพียงพอสำหรับวางเพลตไมโครเวลล์ ด้วยเครื่องประมวลผลอัลตราซาวนด์กำลังสูงขนาด 400 วัตต์ที่ใช้ขับเคลื่อน UIP400MTP จึงให้อัลตราซาวนด์ที่สม่ำเสมออย่างมากและมีความเข้มสูงแก่เพลตหลายหลุม เพื่อทำลายเซลล์ สลายตัวอย่าง ทำให้ตะกอนละลาย สกัดโปรตีน หรือตัดเฉือน DNA

การควบคุมอย่างแม่นยำผ่านซอฟต์แวร์อัจฉริยะ

โซลูชันการใช้อัลตราซาวนด์ทั้งหมดของ Hielscher ตั้งแต่ 200 วัตต์ขึ้นไปติดตั้งหน้าจอสัมผัสสีแบบดิจิทัลและซอฟต์แวร์อัจฉริยะ ด้วยระบบบันทึกข้อมูลอัจฉริยะ พารามิเตอร์ทั้งหมดของกระบวนการอัลตราซาวนด์จะถูกบันทึกโดยอัตโนมัติเป็นไฟล์ CSV บนการ์ด SD ที่ติดตั้งในตัวทันทีที่เริ่มใช้งานเครื่องอัลตราซาวนด์ ซึ่งทำให้การวิจัยและการบันทึกข้อมูลสะดวกยิ่งขึ้นมาก หลังจากการทดลองใช้อัลตราซาวนด์หรือการเตรียมตัวอย่าง คุณสามารถตรวจสอบพารามิเตอร์การใช้อัลตราซาวนด์ของการทำงานแต่ละรอบและเปรียบเทียบกันได้อย่างง่ายดาย
เมนูที่ใช้งานง่ายช่วยให้ตั้งค่าพารามิเตอร์จำนวนมากไว้ล่วงหน้าก่อนใช้อัลตราซาวนด์ได้ เช่น สามารถกำหนดขีดจำกัดบนของอุณหภูมิตัวอย่างเพื่อควบคุมอุณหภูมิภายในตัวอย่างและป้องกันการเสื่อมสภาพจากความร้อน เซ็นเซอร์อุณหภูมิแบบเสียบต่อที่มาพร้อมกับชุดอัลตราซาวนด์จะส่งข้อมูลย้อนกลับเกี่ยวกับอุณหภูมิจริงระหว่างการใช้อัลตราซาวนด์ให้เครื่องประมวลผลอัลตราซาวนด์ เมื่ออุณหภูมิถึงขีดจำกัดบน อุปกรณ์อัลตราซาวนด์จะหยุดชั่วคราวจนกระทั่งอุณหภูมิถึงขีดจำกัดล่างของ ∆T ที่ตั้งไว้ แล้วจึงเริ่มใช้อัลตราซาวนด์อีกครั้งโดยอัตโนมัติ
หากต้องการใช้อัลตราซาวนด์โดยให้พลังงานป้อนเข้าในปริมาณที่กำหนด คุณสามารถตั้งค่าพลังงานอัลตราซาวนด์สุดท้ายของรอบการทำงานไว้ล่วงหน้าได้ แน่นอนว่าพัลส์อัลตราซาวนด์และโหมดรอบก็สามารถตั้งค่าแยกกันได้เช่นกัน
เพื่อใช้พารามิเตอร์การใช้อัลตราซาวนด์ที่ให้ผลสำเร็จสูงสุดของคุณอีกครั้ง คุณสามารถบันทึกโหมดการใช้อัลตราซาวนด์ต่าง ๆ (เช่น ระยะเวลาการใช้อัลตราซาวนด์ ความเข้ม โหมดรอบ เป็นต้น) เป็นโหมดที่ตั้งค่าไว้ล่วงหน้า เพื่อให้เริ่มใช้งานอีกครั้งได้อย่างง่ายดายและรวดเร็ว
เพื่อเพิ่มความสะดวกในการใช้งาน ชุดอัลตราซาวนด์ดิจิทัลทั้งหมดสามารถควบคุมระยะไกลผ่านเบราว์เซอร์ทั่วไปได้ทุกชนิด (เช่น InternetExplorer, Safari, Chrome เป็นต้น) การเชื่อมต่อ LAN เป็นการติดตั้งแบบเสียบแล้วใช้งานได้ทันทีอย่างง่ายดาย และไม่ต้องติดตั้งซอฟต์แวร์เพิ่มเติม
เราที่ Hielscher ทราบดีว่าการใช้อัลตราซาวนด์กับตัวอย่างชีวภาพให้สำเร็จต้องอาศัยความแม่นยำและความสามารถในการทำซ้ำ ดังนั้นเราจึงออกแบบเครื่องอัลตราซาวนด์ของเราให้เป็นอุปกรณ์อัจฉริยะพร้อมคุณสมบัติทั้งหมดที่ช่วยให้การเตรียมตัวอย่างมีประสิทธิภาพ น่าเชื่อถือ ให้ผลที่ทำซ้ำได้ และสะดวก

ตารางด้านล่างแสดงกำลังการประมวลผลโดยประมาณของระบบอัลตราซาวนด์ของเรา ตั้งแต่ปลายโพรบอัลตราซาวนด์ขนาดเล็กและเครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราซาวนด์มาตรฐาน ไปจนถึงเครื่องอัลตราซาวนด์ MultiSample สำหรับการเตรียมตัวอย่างจำนวนมากอย่างสะดวกและน่าเชื่อถือ: