Drosophila melanogaster ใช้กันอย่างแพร่หลายในห้องปฏิบัติการเป็นสิ่งมีชีวิตแบบจําลอง ดังนั้นขั้นตอนการเตรียมการวิเคราะห์ล่วงหน้าเช่นสลายการหยุดชะงักของเซลล์การสกัดโปรตีนและการแยกดีเอ็นเอของตัวอย่าง Drosophila melanogaster จะต้องดําเนินการบ่อยครั้ง อัลตราโซนิก dismembrators มีความน่าเชื่อถือและมีประสิทธิภาพและสามารถใช้ในการทํางานต่าง ๆ เช่นไลซิสการสกัดโปรตีนหรือการกระจายตัวของดีเอ็นเอได้อย่างง่ายดายโดยการปรับพารามิเตอร์กระบวนการอัลตราโซนิกเท่านั้น อัลตราโซนิก homogenizers จึงเป็นเครื่องมือที่มีความยืดหยุ่นกับการใช้งานที่หลากหลาย

อัลตราโซนิกไลซิสและการสกัดโปรตีน

ไลซิส, การละลายของเซลล์, การทําให้เป็นเนื้อเดียวกันของเนื้อเยื่อและการสกัดโปรตีนเป็นงานทั่วไปสําหรับ dismembrators ล้ําในห้องปฏิบัติการชีวภาพ. อัลตราโซนิก dismembrators และ disruptors เซลล์มีความเหมาะสมกับการทําให้เป็นเนื้อเดียวกันเนื้อเยื่อของสัตว์แมลง (เช่น Drosophila melanogaster, C. elegans) หรือตัวอย่างพืช การใช้งานที่ตามมาของ ultrasonication คือ lysis ของเซลล์แขวนและเม็ดเช่นเดียวกับการสกัดโปรตีนภายในเซลล์
อัลตราโซนิก lysis และการสกัดโปรตีนเป็นกระบวนการที่เชื่อถือได้สูงและทําซ้ําซึ่งสามารถดําเนินการบนพื้นฐานของโปรโตคอลที่จัดตั้งขึ้น เนื่องจากความเข้มของกระบวนการอัลตราโซนิกสามารถปรับได้อย่างแน่นอนผ่านพารามิเตอร์ sonication เช่นความกว้างวงจร / โหมดชีพจรอุณหภูมิและปริมาณตัวอย่างเมื่อโปรโตคอลที่พิสูจน์แล้วสามารถทําซ้ําด้วยผลลัพธ์เดียวกันซ้ําแล้วซ้ําอีก

อัลตราโซนิกดีเอ็นเอและการกระจายตัวของ RNA

หลังจากการสลายเซลล์และการสกัดโปรตีนขั้นตอนที่จําเป็นทั่วไปในการเตรียมตัวอย่างคือแรงเฉือนและการกระจายตัวของดีเอ็นเอ RNA และโครมาตินเช่นก่อนการเตรียมความพร้อมของ chromatin (ChIP) การกระจายตัวของดีเอ็นเอและ RNA สามารถทําได้อย่างน่าเชื่อถือโดยการทําลายพันธะโควาเลนต์ที่ยึดดีเอ็นเอเข้าด้วยกันโดยกองกําลังทางกายภาพ การใช้แรงเฉือนทางกายภาพเช่น sonication ในตอนแรกเส้นดีเอ็นเอจะแตกจากนั้นดีเอ็นเอจะถูกแยกเป็นชิ้นเล็ก ๆ
การกระจายตัวของดีเอ็นเออัลตราโซนิกมีความน่าเชื่อถือและมีประสิทธิภาพในการตัดดีเอ็นเอให้มีความยาวเป้าหมายเช่น 500bp (คู่ฐาน) ข้อได้เปรียบที่สําคัญของการกระจายตัวของดีเอ็นเออัลตราโซนิกรวมถึงการควบคุมที่แม่นยําของพารามิเตอร์กระบวนการอัลตราโซนิกและความเข้ม พารามิเตอร์กระบวนการอัลตราโซนิกสามารถปรับได้โดยการปรับความเข้ม sonication รอบและเวลาอย่างแม่นยํา สิ่งนี้ทําให้สามารถสร้างขนาดดีเอ็นเอที่ต้องการและความยาวดีเอ็นเอเป้าหมายสามารถผลิตได้อย่างน่าเชื่อถือเช่นเดียวกับการทําซ้ํา อัลตราโซนิก DNA ตัดยังเหมาะที่จะสร้างชิ้นส่วนดีเอ็นเอน้ําหนักโมเลกุลสูง

โปรโตคอลสําหรับอัลตราโซนิกไลซิสของ Drosophila melanogaster

ด้านล่างนี้คุณสามารถค้นหาโปรโตคอลต่าง ๆ สําหรับสลายที่ช่วย ultrasonically การสกัดโปรตีนและดีเอ็นเอหรือการกระจายตัวของ chromatin ของตัวอย่าง Drosophila

อัลตราโซนิกไลซิสสําหรับการเชื่อมโยงข้าม Immunoprecipitation (CLIP) Assay

มีการดําเนินการวิเคราะห์ CLIP ตามที่รายงานก่อนหน้านี้ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง รังไข่ประมาณ 20 มก. จาก 0- ถึง 1 วันหญิงประเภทป่าถูก UV crosslinked (3 × 2000 μJ / cm2) เป็นเนื้อเดียวกันบนน้ําแข็งในบัฟเฟอร์ 1 mL RCB (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM ซูโครส, 1 mM DTT, 1× EDTA ฟรีสารยับยั้งโปรตีเอสที่สมบูรณ์, 1 mM PMSF) เสริมด้วย 300 U RNAseOUT และวางบนน้ําแข็งเป็นเวลา 30 นาที. เนื้อเดียวกันถูก sonicated บนน้ําแข็งที่ 80% อํานาจห้าครั้งใน 20 s ระเบิดกับส่วนที่เหลือ 60 ระหว่างการใช้ Hielscher โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิก UP100H (100 W, 30 kHz) และแรงเหวี่ยง (16000 × กรัมเป็นเวลา 5 นาทีที่ 4°C) สารสกัดที่ละลายน้ําได้ถูก precleared กับ 20 μl โปรตีน G dynabeads สําหรับ 20 นาทีที่ 4 °C. หลังจากการกําจัดตัวอย่างสําหรับ immunoblotting และปริมาณการป้อนข้อมูล RNA (1%), HP1 ถูกภูมิคุ้มกันด้วยแอนติบอดีต่อต้าน HP1 9A9 จาก 450 μl สารสกัด precleared โดยการฟักไข่สําหรับ 4 ชั่วโมงกับ 50 μl โปรตีน G dynabeads. Immunoprecipitates ถูกล้าง 4 ครั้งด้วย RCB เพื่อ elute RNAs immunoprecipitated, ลูกปัดเม็ดถูกต้มใน 100 μL ของ UltraPure DEPC น้ําที่ผ่านการบําบัดเป็นเวลา 5 นาที 900 μL Qiazol Reagent ถูกเพิ่มเข้าไปใน supernatant กู้คืนสําหรับการเตรียม RNA RNA บริสุทธิ์ถูกใช้เป็นแม่แบบในการสังเคราะห์ cDNA โดยใช้ oligo dT, hexamers สุ่มและ SuperScript ย้อนกลับ transcriptase III ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต
(Cassale et al. 2019)

อัลตราโซนิกไลซิสสําหรับ Chromatin Immunoprecipitation Assay

การคิดค่าเสื่อมราคาด้วยภูมิคุ้มกันของ Chromatin ดําเนินการตามวิธีการที่ Menet อธิบายไว้ด้วยการดัดแปลงเล็กน้อย รังไข่ประมาณ 20 มก. จาก 0- ถึง 1 วันหญิงประเภทป่าเป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์ NEB 1 mL (10 mM HEPES-Na ที่ pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA-Na ที่ pH 8, 0.5 mM EDTA-Na ที่ค่า pH 8, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM Spermidine, 0.15 mM Spermine, 1× EDTA- ฟรี Protease ยับยั้ง) กับ homogenizer / immersion disperser 1 นาที (ที่ 3000 รอบต่อนาที) เนื้อเดียวกันถูกถ่ายโอนไปยัง dounce แก้วแช่เย็นก่อนและ 15 จังหวะเต็มถูกนําไปใช้กับศัตรูพืชแน่น นิวเคลียสฟรีถูกหมุนที่ 6000xg เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส เม็ดที่มีนิวเคลียสถูกเปิดออกใน 1 mL ของ NEB และหมุนเหวี่ยงที่ 20000 × กรัมเป็นเวลา 20 นาทีในการไล่ระดับสีซูโครส (0.65 mL ของ 1.6 M ซูโครสใน NEB, 0.35 mL ของ 0.8 Mucrose ใน NEB) เม็ดถูก resuspended ใน 1 mL ของ NEB และฟอร์มาลดีไฮด์เพื่อความเข้มข้นสุดท้ายของ 1% นิวเคลียสถูกเชื่อมโยงข้ามเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องและดับโดยการเพิ่ม 1/10 vol ของ 1.375 M ไกลซีน. นิวเคลียสถูกรวบรวมโดยเครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 6000 × กรัมเป็นเวลา 5 นาที นิวเคลียสถูกล้างสองครั้งใน 1 mL ของ NEB และ resuspended ใน 1 mL ของไลซิสบัฟเฟอร์ (15 mM HEPES-Na ที่ค่า pH 7.6, 140 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, 1 mM EDTA ที่ค่า pH 8, 1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.1% Na Deoxycholate, 0.1% SDS, 0.5% N-lauroylsarcosine และ 1× EDTA-ฟรี Protease ยับยั้ง) นิวเคลียสถูก sonicated โดยใช้โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิก Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) หกครั้งสําหรับ 20 s บนและ 1 นาทีบนน้ําแข็ง นิวเคลียสโซนิคถูกหมุนเหวี่ยงที่ 13000 × กรัมเป็นเวลา 4 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส ส่วนใหญ่ของโครมาติน sonicated เป็น 500 ถึง 1,000 คู่ฐาน (bp) ความยาว. สําหรับแต่ละภูมิคุ้มกัน, 15 ไมโครกรัมของโครมาตินถูกฟักในการปรากฏตัวของ 10 μg ของ HP1 9A9 โมโนโคลนัลแอนติบอดี (3 ชั่วโมงที่ 4 ° C ในล้อหมุน) จากนั้นมีการเพิ่มโปรตีน dynabeads 50 μl และฟักตัวอย่างต่อเนื่องในชั่วข้ามคืนที่ 4 ° C supernatants ถูกทิ้งและตัวอย่างถูกล้างสองครั้งในไลซิสบัฟเฟอร์ (ล้างแต่ละครั้ง 15 นาทีที่ 4 °C) และสองครั้งในบัฟเฟอร์ TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl ที่ค่า pH 8) โครมาตินถูก eluted จากลูกปัดในสองขั้นตอน; ครั้งแรกใน 100 μl ของบัฟเฟอร์ Eluition 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl ที่ pH 8) ที่ 65 ° C เป็นเวลา 15 นาทีตามด้วยแรงเหวี่ยงและการฟื้นตัวของ supernatant วัสดุลูกปัดถูกสกัดอีกครั้งใน 100 μl ของ TE + 0.67% SDS eluate รวม (200 μl) ถูกบ่มในชั่วข้ามคืนที่ 65 ° C เพื่อย้อนกลับการเชื่อมโยงข้ามและได้รับการรักษาโดย 50 μg / ml RNaseA เป็นเวลา 15 นาทีที่ 65 ° C และโดย 500 μg / ml Proteinase K สําหรับ 3 ชั่วโมงที่ 65 ° C ตัวอย่างถูกสกัดฟีนอลคลอโรฟอร์มและเอทานอลตกตะกอน ดีเอ็นเอถูกนํากลับมาใช้ใหม่ในน้ํา 25 μl เพื่อเพิ่มการวิเคราะห์โมเลกุลด้วยดีเอ็นเอ immunoprecipitated ยีนผู้สมัครถูกขยายเป็นคู่ผ่านโปรโตคอล duplex-PCR ที่ดีที่สุดโดยใช้ไพรเมอร์สองชุดที่แตกต่างกันที่มีอุณหภูมิหลอมเหลวที่คล้ายกันในปฏิกิริยาเดียว
(Casale et al. 2019)
 

Disruptors เซลล์อัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงสําหรับตัวอย่างทางชีวภาพ

Hielscher Ultrasonics เป็นพันธมิตรที่มีประสบการณ์มานานของคุณเมื่อมันมาถึง ultrasonicators ประสิทธิภาพสูงสําหรับการหยุดชะงักของเซลล์, ไลซิส, สกัดโปรตีน, ดีเอ็นเอ, RNA, และการกระจายตัวของโครมาตินเช่นเดียวกับขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างก่อนการวิเคราะห์อื่น ๆ นําเสนอพอร์ตโฟลิโอที่ครอบคลุมของ homogenizers ห้องปฏิบัติการอัลตราโซนิกและหน่วยเตรียมตัวอย่าง Hielscher มีอุปกรณ์อัลตราโซนิกที่เหมาะสําหรับการประยุกต์ใช้ทางชีวภาพและความต้องการของคุณ
คลาสสิกโพรบ- ประเภท ultrasonicator ที่มีไมโคร- เคล็ดลับเช่น UP200St (200W; ดูภาพซ้าย) หรือหนึ่งในหน่วยเตรียมตัวอย่างอัลตราโซนิก VialTweeter หรือ UP200St_TD_CupHorn ด้วย VialHolder เป็นรุ่นที่ชื่นชอบในห้องปฏิบัติการวิจัยและวิเคราะห์ หัววัดอัลตราโซนิกคลาสสิกเหมาะอย่างยิ่งเมื่อเตรียมตัวอย่างน้อยลงจะต้องถูกสลายตัวสกัดหรือแยกส่วน หน่วยเตรียมตัวอย่าง VialTweeter UP200St_TD_CupHornอนุญาตให้มี sonication พร้อมกันได้ถึง 10 หรือ 5 ขวดตามลําดับ
หากตัวเลขตัวอย่างสูง (เช่นแผ่น 96-well แผ่นไมโครทิกเตอร์ ฯลฯ ) จะต้องดําเนินการ UIP400MTP เป็นการตั้งค่า sonication ในอุดมคติ ฟังก์ชัน UIP400MTP เช่น cuphorn ขนาดใหญ่ซึ่งเต็มไปด้วยน้ําและมีพื้นที่เพียงพอที่จะเก็บแผ่นไมโครดี ขับเคลื่อนโดยหน่วยประมวลผลอัลตราโซนิกที่มีประสิทธิภาพ 400 วัตต์ UIP400MTP ให้ sonication ที่สม่ําเสมอและรุนแรงมากของแผ่นหลายดีเพื่อรบกวนเซลล์ตัวอย่าง lyse, solubilize เม็ดสกัดโปรตีนหรือดีเอ็นเอเฉือน

การควบคุมที่แม่นยําผ่านซอฟต์แวร์อัจฉริยะ

โซลูชัน sonication Hielscher ทั้งหมดจาก 200 วัตต์ขึ้นไปมีหน้าจอสัมผัสสีดิจิตอลและซอฟต์แวร์อัจฉริยะ ผ่านข้อมูลอัจฉริยะที่โปรโตคอลพารามิเตอร์กระบวนการอัลตราโซนิกทั้งหมดจะถูกบันทึกโดยอัตโนมัติเป็นไฟล์ CSV บนการ์ด SD ในตัวทันทีที่เริ่มต้น ultrasonicator สิ่งนี้ทําให้การวิจัยและโปรโตคอลสะดวกยิ่งขึ้น หลังจากการทดลอง sonication หรือการเตรียมตัวอย่างคุณสามารถตรวจสอบพารามิเตอร์ sonication ของแต่ละ sonication ทํางานและเปรียบเทียบพวกเขา
ผ่านเมนูที่ใช้งานง่ายพารามิเตอร์จํานวนมากสามารถตั้งค่าไว้ล่วงหน้าก่อน sonication: ตัวอย่างเช่นเพื่อควบคุมอุณหภูมิในตัวอย่างและเพื่อป้องกันการย่อยสลายความร้อนสามารถตั้งค่าขีด จํากัด บนของอุณหภูมิตัวอย่างได้ เซ็นเซอร์วัดอุณหภูมิแบบเสียบได้ซึ่งมาพร้อมกับหน่วยอัลตราโซนิกให้ข้อเสนอแนะโปรเซสเซอร์อัลตราโซนิกเกี่ยวกับอุณหภูมิ sonication จริง เมื่อถึงขีด จํากัด อุณหภูมิสูงสุดอุปกรณ์อัลตราโซนิกจะหยุดจนกว่าขีด จํากัด ล่างของชุด ∆ถึงและเริ่มต้นแล้ว sonicating โดยอัตโนมัติอีกครั้ง
หากจําเป็นต้องมี sonication กับการป้อนข้อมูลพลังงานที่เฉพาะเจาะจงคุณสามารถตั้งค่าพลังงานอัลตราโซนิกขั้นสุดท้ายของการวิ่ง sonication แน่นอนการเต้นของอัลตราโซนิกและโหมดวงจรสามารถตั้งค่าเป็นรายบุคคลได้เช่นกัน
ในการใช้พารามิเตอร์ sonication ที่ประสบความสําเร็จมากที่สุดของคุณคุณสามารถบันทึกโหมด sonication ต่างๆ (เช่นเวลา sonication ความเข้มโหมดวงจร ฯลฯ ) เป็นโหมดที่ตั้งไว้ล่วงหน้าเพื่อให้พวกเขาสามารถเริ่มต้นได้ง่ายและรวดเร็วอีกครั้ง
เพื่อความสะดวกในการดําเนินงานมากขึ้นหน่วยอัลตราโซนิกดิจิตอลทั้งหมดสามารถดําเนินการผ่านรีโมทคอนโทรลเบราว์เซอร์ในเบราว์เซอร์ทั่วไปใด ๆ (เช่น InternetExplorer, Safari, Chrome ฯลฯ ) การเชื่อมต่อ LAN เป็นการติดตั้งแบบ plug-n-play อย่างง่ายและไม่จําเป็นต้องติดตั้งซอฟต์แวร์เพิ่มเติม
เราที่ Hielscher รู้ว่า sonication ที่ประสบความสําเร็จของตัวอย่างทางชีวภาพต้องการความแม่นยําและการทําซ้ํา ดังนั้นเราจึงออกแบบ ultrasonicators ของเราเป็นอุปกรณ์สมาร์ทที่มีคุณสมบัติทั้งหมดที่ช่วยให้การเตรียมตัวอย่างที่มีประสิทธิภาพเชื่อถือได้ทําซ้ําได้และสะดวก

ตารางด้านล่างช่วยให้คุณบ่งชี้ความสามารถในการประมวลผลโดยประมาณของระบบอัลตราโซนิกของเราจากไมโครเคล็ดลับอัลตราโซนิกและ homogenizers อัลตราโซนิกคลาสสิกเพื่อ ultrasonicators MultiSample สําหรับการเตรียมที่สะดวกและเชื่อถือได้ของตัวอย่างจํานวนมาก: