อัลตราโซนิก Lysis ของตัวอย่าง Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster ใช้กันอย่างแพร่หลายในห้องปฏิบัติการเป็นสิ่งมีชีวิตแบบจําลอง ดังนั้นขั้นตอนการเตรียมก่อนการวิเคราะห์ เช่น การสลาย การหยุดชะงักของเซลล์ การสกัดโปรตีน และการตัด DNA ของตัวอย่าง Drosophila melanogaster จึงต้องดําเนินการบ่อยครั้ง เครื่องแยกอัลตราโซนิกมีความน่าเชื่อถือและมีประสิทธิภาพและสามารถใช้เพื่อทํางานต่างๆเช่นการสลายการสกัดโปรตีนหรือการกระจายตัวของดีเอ็นเอได้อย่างง่ายดายโดยการปรับพารามิเตอร์กระบวนการอัลตราโซนิกเท่านั้น โฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกจึงเป็นเครื่องมือที่ยืดหยุ่นพร้อมการใช้งานที่หลากหลาย

อัลตราโซนิก Lysis และการสกัดโปรตีน

การสลายการละลายของเซลล์การทําให้เป็นเนื้อเดียวกันและการสกัดโปรตีนเป็นงานทั่วไปสําหรับเครื่องแยกอัลตราโซนิกในห้องปฏิบัติการชีวภาพ เครื่องทําลายอัลตราโซนิกและตัวก่อกวนเซลล์เหมาะอย่างยิ่งในการทําให้เนื้อเยื่อสัตว์เป็นเนื้อเดียวกันแมลง (เช่น Drosophila melanogaster, C. elegans) หรือตัวอย่างพืช การประยุกต์ใช้อัลตราโซนิกในภายหลังคือการสลายสารแขวนลอยและเม็ดของเซลล์ตลอดจนการสกัดโปรตีนภายในเซลล์
การสลายอัลตราโซนิกและการสกัดโปรตีนเป็นกระบวนการที่มีความน่าเชื่อถือสูงและทําซ้ําได้ซึ่งสามารถดําเนินการตามโปรโตคอลที่กําหนดไว้ เนื่องจากความเข้มของกระบวนการอัลตราโซนิกสามารถปรับได้อย่างแม่นยําผ่านพารามิเตอร์ sonication เช่นแอมพลิจูดโหมดรอบ / พัลส์อุณหภูมิและปริมาตรตัวอย่างเมื่อโปรโตคอลที่พิสูจน์แล้วสามารถทําซ้ําได้ด้วยผลลัพธ์เดียวกันซ้ําแล้วซ้ําเล่า

อัลตราโซนิก DNA และ RNA Fragmentation

หลังจากการสลายเซลล์และการสกัดโปรตีนขั้นตอนที่จําเป็นทั่วไปในการเตรียมตัวอย่างคือการตัดและแยกส่วนของ DNA, RNA และโครมาตินเช่นก่อนการตกตะกอนของโครมาติน การกระจายตัวของ DNA และ RNA สามารถทําได้อย่างน่าเชื่อถือโดยการทําลายพันธะโควาเลนต์ที่ยึด DNA ไว้ด้วยกันด้วยแรงทางกายภาพ การใช้การตัดทางกายภาพเช่นการ sonication ในตอนแรกสาย DNA จะแตกจากนั้น DNA จะถูกแยกส่วนออกเป็นชิ้นเล็ก ๆ
การกระจายตัวของดีเอ็นเออัลตราโซนิกมีความน่าเชื่อถือและมีประสิทธิภาพในการตัดดีเอ็นเอให้ได้ความยาวเป้าหมาย เช่น 500bp (คู่เบส) ข้อได้เปรียบที่สําคัญของการกระจายตัวของดีเอ็นเออัลตราโซนิก ได้แก่ การควบคุมพารามิเตอร์และความเข้มของกระบวนการอัลตราโซนิกอย่างแม่นยํา พารามิเตอร์กระบวนการอัลตราโซนิกสามารถปรับได้โดยการปรับความเข้มของคลื่นความถี่และเวลาได้อย่างแม่นยํา ทําให้สามารถสร้างขนาด DNA ที่ต้องการได้ และสามารถผลิตและทําซ้ําความยาว DNA เป้าหมายได้อย่างน่าเชื่อถือ การตัดดีเอ็นเออัลตราโซนิกยังเหมาะอย่างยิ่งในการสร้างชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีน้ําหนักโมเลกุลสูง

โปรโตคอลสําหรับการสลายอัลตราโซนิกของ Drosophila melanogaster

คุณสามารถค้นหาโปรโตคอลต่างๆ สําหรับการสลายด้วยอัลตราโซนิก การสกัดโปรตีน และการแยกส่วน DNA หรือโครมาตินของตัวอย่าง Drosophila

อัลตราโซนิก Lysis สําหรับการทดสอบการตกตะกอนแบบเชื่อมขวาง (CLIP)

การทดสอบ CLIP ดําเนินการตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้โดยมีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง รังไข่ประมาณ 20 มก. จากตัวเมียชนิดป่าอายุ 0 ถึง 1 วันถูกเชื่อมขวางด้วยรังสียูวี (3 × 2000 μJ/cm2) ทําให้เป็นเนื้อเดียวกันบนน้ําแข็งในบัฟเฟอร์ RCB 1 มล. (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) เสริมด้วย 300 U RNAseOUT และวางบนน้ําแข็งเป็นเวลา 30 นาที โฮโมจีเนตถูก sonicated บนน้ําแข็งที่พลังงาน 80% ห้าครั้งใน 20 วินาทีระเบิดโดยพัก 60 วินาทีระหว่างการใช้โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิก Hielscher UP100H (100 วัตต์, 30 กิโลเฮิรตซ์) และหมุนเหวี่ยง (16000 × กรัมเป็นเวลา 5 นาทีที่ 4°C) สารสกัดที่ละลายน้ําได้ถูกล้างล่วงหน้าด้วยไดนาบีดโปรตีน-G 20 ไมโครลิตรเป็นเวลา 20 นาทีที่ 4°C หลังจากนําตัวอย่างออกเพื่ออิมมูโนบลอตและหาปริมาณอินพุต RNA (1%) HP1 ถูกกระตุ้นด้วยแอนติบอดีต่อต้าน HP1 9A9 จากสารสกัดที่ผ่านการล้างล่วงหน้า 450 ไมโครลิตรโดยการบ่มเพาะเป็นเวลา 4 ชั่วโมงด้วยไดนาบีดโปรตีน-G 50 ไมโครลิตร การตกตะกอนของภูมิคุ้มกันถูกล้าง 4 ครั้งด้วย RCB ในการชะล้าง RNA ที่ตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันลูกปัดเม็ดจะถูกต้มในน้ําที่ผ่านการบําบัดด้วย UltraPure DEPC 100 μL เป็นเวลา 5 นาที เติมน้ํายา Qiazol 900 μL ลงในส่วนเหนือน้ําที่กู้คืนสําหรับการเตรียม RNA RNA ที่บริสุทธิ์ถูกใช้เป็นแม่แบบในการสังเคราะห์ cDNA โดยใช้ oligo dT, เฮกซาเมอร์สุ่ม และ SuperScript reverse transcriptase III ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต
(Cassale et al. 2019)

อัลตราโซนิก Lysis สําหรับการทดสอบอิมมูโนครามเทนกรามโครมาน

การตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันโครมาตินดําเนินการตามวิธีการที่ Menet อธิบายโดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย รังไข่ประมาณ 20 มก. จากตัวเมียชนิดป่าอายุ 0 ถึง 1 วันถูกทําให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์ NEB 1 มล. (10 mM HEPES-Na ที่ pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA-Na ที่ pH 8, 0.5 mM EDTA-Na ที่ pH 8, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM Spermidine, 0.15 mM Spermine, 1× EDTA- free Complete Protease Inhibitors) ด้วยโฮโมจีไนเซอร์ / ตัวกระจายการแช่ 1 นาที (ที่ 3000 รอบต่อนาที) โฮโมจีเนตถูกถ่ายโอนไปยังแก้วที่แช่เย็นไว้ล่วงหน้าและใช้สากแน่น 15 จังหวะเต็ม จากนั้นนิวเคลียสอิสระจะถูกหมุนเหวี่ยงที่ 6000xg เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4°C เม็ดที่มีนิวเคลียสถูกแขวนลอยใน NEB 1 มล. และหมุนเหวี่ยงที่ 20000 × กรัมเป็นเวลา 20 นาทีบนการไล่ระดับสีซูโครส (ซูโครส 1.6 M 0.65 มล. ใน NEB, ซูโครส 0.35 มล. 0.8 M ใน NEB) เม็ดถูกแขวนลอยใน NEB และฟอร์มาลดีไฮด์ 1 มล. ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 1% นิวเคลียสถูกเชื่อมขวางเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องและดับโดยการเติม 1/10 ปริมาตรของ 1.375 M glycine นิวเคลียสถูกรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 6000 × กรัมเป็นเวลา 5 นาที นิวเคลียสถูกล้างสองครั้งใน NEB 1 มล. และแขวนลอยใหม่ใน Lysis Buffer 1 มล. (15 mM HEPES-Na ที่ pH 7.6, 140 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, 1 mM EDTA ที่ pH 8, 1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.1% Na Deoxycholate, 0.1% SDS, 0.5% N-lauroylsarcosine และ 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors) นิวเคลียสถูก sonicated โดยใช้ Hielscher Ultrasonic Processor UP100H (100 วัตต์, 30 กิโลเฮิรตซ์) หกครั้งเป็นเวลา 20 วินาทีบนน้ําแข็งและ 1 นาทีบนน้ําแข็ง นิวเคลียสที่โซนิคถูกหมุนเหวี่ยงที่ 13000 × กรัมเป็นเวลา 4 นาทีที่ 4°C โครมาตินโซนิตส่วนใหญ่มีความยาว 500 ถึง 1,000 คู่เบส (bp) สําหรับการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันแต่ละครั้ง โครมาติน 15 ไมโครกรัมถูกบ่มเพาะในที่ที่มีโมโนโคลนอลแอนติบอดี HP1 9A9 10 ไมโครกรัม (3 ชั่วโมงที่ 4°C ในวงล้อหมุน) จากนั้นเติมโปรตีนไดนาบีดส์ G 50 ไมโครลิตรและฟักตัวต่อไปค้างคืนที่ 4°C สารน้ําชั้นบนถูกทิ้งและล้างตัวอย่างสองครั้งใน Lysis Buffer (ล้างแต่ละครั้ง 15 นาทีที่ 4 °C) และสองครั้งใน TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl ที่ pH 8) โครมาตินถูกชะออกจากลูกปัดในสองขั้นตอน ครั้งแรกใน Eluition Buffer 100 μl (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl ที่ pH 8) ที่ 65°C เป็นเวลา 15 นาที ตามด้วยการหมุนเหวี่ยงและการกู้คืน supernatant วัสดุลูกปัดถูกสกัดใหม่ใน TE 100 μl + 0.67% SDS การชะรวม (200 μl) ถูกบ่มค้างคืนที่ 65°C เพื่อย้อนกลับการเชื่อมขวางและบําบัดโดย RNaseA 50 μg/ml เป็นเวลา 15 นาทีที่ 65°C และโดย Proteinase K 500 μg/ml เป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 65°C ตัวอย่างถูกสกัดฟีนอล-คลอโรฟอร์มและตกตะกอนเอทานอล ดีเอ็นเอถูกแขวนลอยในน้ํา 25 ไมโครลิตร สําหรับการวิเคราะห์ระดับโมเลกุลสูงสุดด้วยภูมิคุ้มกันตกตะกอนของ DNA ยีนผู้สมัครจะถูกขยายเป็นคู่ผ่านโปรโตคอลดูเพล็กซ์ PCR ที่ปรับให้เหมาะสมโดยใช้ไพรเมอร์สองชุดที่แตกต่างกันซึ่งมีอุณหภูมิหลอมเหลวใกล้เคียงกันในปฏิกิริยาเดียว
(Casale et al. 2019)
 

เครื่องรบกวนเซลล์อัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงสําหรับตัวอย่างทางชีวภาพ

Hielscher Ultrasonics เป็นพันธมิตรที่มีประสบการณ์ยาวนานของคุณเมื่อพูดถึงเครื่องอัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงสําหรับการหยุดชะงักของเซลล์การสลายการสกัดโปรตีน DNA, RNA และการกระจายตัวของโครมาตินตลอดจนขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างก่อนการวิเคราะห์อื่น ๆ นําเสนอพอร์ตโฟลิโอที่ครอบคลุมของเครื่องทําโฮโมจีไนเซอร์ในห้องปฏิบัติการอัลตราโซนิกและหน่วยเตรียมตัวอย่าง Hielscher มีอุปกรณ์อัลตราโซนิกที่เหมาะสําหรับการใช้งานและความต้องการทางชีวภาพของคุณ
เครื่องอัลตราโซนิกแบบโพรบแบบคลาสสิกพร้อมไมโครทิปเช่น UP200 เซนต์ (200W; ดูภาพด้านซ้าย) หรือหนึ่งในหน่วยเตรียมตัวอย่างอัลตราโซนิก ไวอัลทวีตเตอร์ หรือ UP200St_TD_CupHorn ด้วย VialHolder เป็นรุ่นที่ชื่นชอบในห้องปฏิบัติการวิจัยและการวิเคราะห์ โพรบอัลตราโซนิกแบบคลาสสิกเหมาะอย่างยิ่งเมื่อเตรียมตัวอย่างน้อยลงจะต้องสลายสกัดหรือแยกส่วน หน่วยเตรียมตัวอย่าง VialTweeter และ UP200St_TD_CupHorn ช่วยให้สามารถ sonication พร้อมกันได้ถึง 10 หรือ 5 ขวดตามลําดับ
หากต้องประมวลผลจํานวนตัวอย่างสูง (เช่น เพลต 96 หลุม เพลตไมโครไทเตอร์ ฯลฯ) UIP400MTP เป็นการตั้งค่า sonication ในอุดมคติ UIP400MTP ทําหน้าที่เหมือนคัพฮอร์นขนาดใหญ่ซึ่งเต็มไปด้วยน้ําและมีพื้นที่เพียงพอสําหรับเก็บแผ่นไมโครบ่อน้ํา ขับเคลื่อนโดยโปรเซสเซอร์อัลตราโซนิกที่ทรงพลัง 400 วัตต์ UIP400MTP ให้การ sonication ที่สม่ําเสมอและเข้มข้นของแผ่นหลายหลุมเพื่อขัดขวางเซลล์สไลซ์ตัวอย่างละลายเม็ดสกัดโปรตีนหรือเฉือนดีเอ็นเอ

การควบคุมที่แม่นยําผ่านซอฟต์แวร์อัจฉริยะ

โซลูชั่น sonication ของ Hielscher ทั้งหมดตั้งแต่ 200 วัตต์ขึ้นไปมีหน้าจอสัมผัสสีดิจิตอลและซอฟต์แวร์อัจฉริยะ ผ่านโปรโตคอลข้อมูลอัจฉริยะพารามิเตอร์กระบวนการอัลตราโซนิกทั้งหมดจะถูกบันทึกโดยอัตโนมัติเป็นไฟล์ CSV บนการ์ด SD ในตัวทันทีที่เริ่มเครื่องอัลตราโซนิก สิ่งนี้ทําให้การวิจัยและโปรโตคอลสะดวกยิ่งขึ้น หลังจากการทดลอง sonication หรือการเตรียมตัวอย่างคุณสามารถตรวจสอบพารามิเตอร์ sonication ของการเรียกใช้ sonication แต่ละครั้งและเปรียบเทียบได้
ผ่านเมนูที่ใช้งานง่ายพารามิเตอร์จํานวนมากสามารถตั้งค่าล่วงหน้าก่อนการ sonication: ตัวอย่างเช่นเพื่อควบคุมอุณหภูมิในตัวอย่างและเพื่อป้องกันการเสื่อมสภาพทางความร้อนสามารถตั้งค่าขีด จํากัด บนของอุณหภูมิตัวอย่างได้ เซ็นเซอร์อุณหภูมิแบบเสียบได้ซึ่งมาพร้อมกับหน่วยอัลตราโซนิกให้ข้อเสนอแนะของโปรเซสเซอร์อัลตราโซนิกเกี่ยวกับอุณหภูมิ sonication จริง เมื่อถึงขีด จํากัด อุณหภูมิบนอุปกรณ์อัลตราโซนิกจะหยุดชั่วคราวจนกว่าจะถึงขีด จํากัด ล่างของ ∆T ที่ตั้งไว้และเริ่ม sonicating โดยอัตโนมัติอีกครั้ง
หากจําเป็นต้องใช้คลื่นความถี่วิทยุด้วยอินพุตพลังงานเฉพาะคุณสามารถตั้งค่าพลังงานอัลตราโซนิกขั้นสุดท้ายของการเรียกใช้ sonication ได้ แน่นอนว่าการเต้นเป็นจังหวะของอัลตราโซนิกและโหมดวงจรสามารถตั้งค่าแยกกันได้เช่นกัน
ในการนําพารามิเตอร์ sonication ที่ประสบความสําเร็จมากที่สุดของคุณกลับมาใช้ใหม่คุณสามารถบันทึกโหมด sonication ต่างๆ (เช่นเวลา sonication ความเข้มโหมดรอบ ฯลฯ ) เป็นโหมดที่ตั้งไว้ล่วงหน้าเพื่อให้สามารถเริ่มต้นได้ง่ายและรวดเร็วอีกครั้ง
เพื่อความสะดวกในการใช้งานมากขึ้นหน่วยอัลตราโซนิกดิจิตอลทั้งหมดสามารถใช้งานได้ผ่านรีโมทคอนโทรลของเบราว์เซอร์ในเบราว์เซอร์ทั่วไป (เช่น InternetExplorer, Safari, Chrome เป็นต้น) การเชื่อมต่อ LAN เป็นการตั้งค่าแบบ Plug-n-play อย่างง่ายและไม่จําเป็นต้องติดตั้งซอฟต์แวร์เพิ่มเติม
พวกเราที่ Hielscher ทราบดีว่าการ sonication ที่ประสบความสําเร็จของตัวอย่างทางชีวภาพนั้นต้องการความแม่นยําและความสามารถในการทําซ้ํา ดังนั้นเราจึงออกแบบเครื่องอัลตราโซนิกของเราให้เป็นอุปกรณ์อัจฉริยะที่มีคุณสมบัติทั้งหมดที่ช่วยให้สามารถเตรียมตัวอย่างได้อย่างมีประสิทธิภาพเชื่อถือได้ทําซ้ําได้และสะดวก

ตารางด้านล่างให้ข้อบ่งชี้ถึงความสามารถในการประมวลผลโดยประมาณของระบบอัลตราโซนิกของเราตั้งแต่ไมโครทิปอัลตราโซนิกและโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกแบบคลาสสิกไปจนถึงเครื่องอัลตราโซนิก MultiSample เพื่อการเตรียมตัวอย่างจํานวนมากที่สะดวกและเชื่อถือได้: