การเตรียมตัวอย่าง C. Elegans ด้วยอัลตราโซนิก

C. elegans เป็นหนอนตัวกลมที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในฐานะสิ่งมีชีวิตต้นแบบทางชีววิทยา การเตรียมตัวอย่างก่อนการวิเคราะห์ต้องอาศัยการสลายเซลล์ การสกัดโปรตีนและลิพิด รวมถึงการทำให้ RNA แตกเป็นชิ้น ซึ่งสามารถดำเนินการได้อย่างเชื่อถือได้ด้วยการใช้คลื่นอัลตราโซนิก เครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกเป็นอุปกรณ์ที่เชื่อถือได้ มีเทคโนโลยีขั้นสูง และใช้งานง่าย สำหรับการเตรียมตัวอย่าง C. elegans อย่างรวดเร็ว

การเตรียมตัวอย่าง C. elegans ด้วยอัลตราโซนิก

Caenorhabditis elegans เป็นหนอนตัวกลมที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในห้องปฏิบัติการวิจัยเพื่อศึกษาจีโนมิกส์ ชีววิทยาพัฒนาการ และโรคต่าง ๆ ยีนหลายชนิดในจีโนมของ C. elegans มียีนคู่เทียบในมนุษย์ที่ทำหน้าที่สอดคล้องกัน ด้วยเหตุนี้ หนอนตัวกลมชนิดนี้จึงเป็นสิ่งมีชีวิตต้นแบบที่มีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการศึกษาโรคของมนุษย์ ข้อดีอื่น ๆ ที่ทำให้ C. elegans ถูกใช้อย่างแพร่หลาย ได้แก่ การเพาะเลี้ยงบนจานที่มีแบคทีเรีย (เช่น E. coli) ได้ง่ายและมีค่าใช้จ่ายต่ำ ความโปร่งใสของลำตัว การจัดการที่สะดวก รวมถึงความสามารถในการแช่แข็งและเก็บรักษาหนอนไว้เป็นระยะเวลานานขึ้น
การวิเคราะห์โปรตีนและลิพิดเป็นขั้นตอนที่ทำเป็นประจำในห้องปฏิบัติการ และการเตรียมตัวอย่างด้วยอัลตราโซนิกเป็นวิธีที่ได้รับการยอมรับในการสลายหนอนตัวกลม C. elegans ในทุกระยะพัฒนาการ (ได้แก่ เอ็มบริโอ ตัวอ่อน L1-L4 และตัวเต็มวัย) เนื่องจาก C. elegans ยังใช้เป็นระบบแสดงออกของโปรตีนเพื่อให้มีการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมายมากเกินระดับปกติ จึงจำเป็นต้องมีวิธีสลายเซลล์และสกัดโปรตีนที่เชื่อถือได้ ให้ผลซ้ำได้ และให้ผลผลิตโปรตีนสูง ระบบทำลายเซลล์และสกัดด้วยอัลตราโซนิกมีทั้งแบบเครื่องโฮโมจีไนเซอร์ชนิดโพรบและเครื่องอัลตราโซนิกสำหรับหลายตัวอย่าง Hielscher Ultrasonics มีเครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกที่เหมาะอย่างยิ่งสำหรับขั้นตอนในห้องปฏิบัติการของคุณ โดยรองรับการเตรียมตัวอย่างที่สะดวก รวมถึงตัวอย่างทุกขนาดและทุกจำนวน

โพรโทคอลการทำลายและสลาย C. Elegans ด้วยอัลตราโซนิก

การทำให้ C. elegans เป็นเนื้อเดียวกันและการสลายด้วยอัลตราโซนิก รวมถึงการสกัดโปรตีนและลิพิดในขั้นตอนถัดไป สามารถดำเนินการด้วยขั้นตอนที่หลากหลาย โดยใช้บัฟเฟอร์สำหรับการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันและการสลายที่แตกต่างกัน เป็นต้น โพรโทคอลการสลายทุกแบบมีข้อกำหนดร่วมกันคือ ต้องเก็บตัวอย่างไว้บนน้ำแข็งอย่างต่อเนื่องเพื่อป้องกันการเสื่อมสลายของโปรตีน ด้านล่างนี้ เรานำเสนอโพรโทคอลการสลายและสกัดด้วยอัลตราโซนิกบางแบบที่เชื่อถือได้และรวดเร็ว สำหรับการเตรียมตัวอย่าง C. elegans ที่มีโปรตีนหรือลิพิดคุณภาพสูง

ข้อดีของการสลาย C. elegans ด้วยอัลตราโซนิก

• เชื่อถือได้
• ให้ผลซ้ำได้
• ควบคุมอุณหภูมิได้อย่างแม่นยำ
• ควบคุมกระบวนการได้อย่างเชื่อถือได้
• เป็นวิธีที่อ่อนโยน
• นำไปใช้ได้ง่าย
• ปลอดภัย

การสกัดโปรตีนจากตัวอย่าง C. elegans ด้วยอัลตราโซนิก

การสลายและสกัดโปรตีนจากหนอน C. elegans ด้วยอัลตราโซนิกสามารถดำเนินการได้โดยใช้โพรโทคอลต่าง ๆ ด้านล่างนี้ เรานำเสนอโพรโทคอลการสลายบางแบบที่เชื่อถือได้และรวดเร็ว เพื่อให้ได้ผลการสกัดโปรตีนที่ทำซ้ำได้

การเตรียมสารสกัดไซโทซอลจากหนอน C. elegans อย่างรวดเร็วด้วยคลื่นอัลตราโซนิก

ด้วยโพรโทคอลต่อไปนี้ คุณสามารถเตรียมไลเสตของ C. elegans ได้ภายในเวลาไม่ถึง 30 นาที
การเก็บรวบรวม C. elegans
หยิบหนอน C. elegans ที่ต้องการใส่ในหลอดขนาด 1.5ml ที่มีสารละลายน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) หรือชะล้างหนอนออกจากจานด้วย PBS ปริมาตร 1.5ml ปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 1min ที่ 2000rpm เพื่อให้เกิดตะกอน เก็บตัวอย่างไว้บนน้ำแข็งตลอดเวลา
จากนั้น ล้างหนอนสองครั้งด้วย PBS
หลังจากนั้น ล้างหนอนสองครั้งด้วย ddH₂O.
แขวนลอยหนอนอีกครั้งในบัฟเฟอร์สำหรับการทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน (HB) ปริมาตรอย่างน้อย 500ul ขณะนี้ตัวอย่างหนอนพร้อมสำหรับการสลายด้วยอัลตราโซนิกแล้ว
เพื่อให้สารสกัดโปรตีนมีคุณภาพสูงขึ้น คุณอาจต้องการลดการปนเปื้อนของแบคทีเรียโดยล้างหนอนเป็นเวลาอย่างละ 5min ใน PBS และน้ำบริสุทธิ์ยิ่งยวดที่ปราศจากเชื้อ (ddH₂O) หรือใช้วิธีทำให้ลอยด้วย sucrose เก็บตัวอย่างหนอนไว้บนน้ำแข็งอย่างต่อเนื่อง

โพรโทคอลการสลาย C. elegans ด้วยอัลตราโซนิก

• ตรวจสอบให้แน่ใจว่าได้เตรียมเครื่องอัลตราโซนิกไว้ล่วงหน้า เพื่อให้เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกพร้อมใช้งาน (ติดตั้งโพรบและตั้งโปรแกรมการใช้คลื่นอัลตราโซนิกไว้แล้ว) 

หากเครื่องอัลตราโซนิกของคุณติดตั้งบนขาตั้ง ให้วางอ่างน้ำแข็งที่มีหลอดตัวอย่างไว้ใต้โพรบอัลตราโซนิก แล้วสอดโพรบอัลตราโซนิกเข้าไปในหลอดขนาด 1.5ml

• สำหรับการสลาย C. elegans ด้วย UP200St หรือ UP200Ht ควรใช้คลื่นอัลตราโซนิกผ่านไมโครทิป (เช่น โพรบ S26d2 ขนาด 2mm ดูภาพด้านซ้าย) ที่แอมพลิจูด 40% เป็นเวลา 1sec โดยเว้นช่วงพัก 30sec ระหว่างการทำงาน การใช้คลื่นอัลตราโซนิก 5 รอบ รอบละ 1 วินาที โดยเว้นช่วงพัก 30sec เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการสลาย C. elegans หากคุณดำเนินการสลายเป็นครั้งแรก คุณสามารถตรวจสอบความคืบหน้าของการสลายในตัวอย่างส่วนย่อยปริมาณเล็กน้อยหลังจากแต่ละพัลส์ด้วยกล้องจุลทรรศน์
• การสลายเสร็จสมบูรณ์เมื่อหนอนถูกทำลาย การใช้คลื่นอัลตราโซนิกมากเกินไปทำให้นิวเคลียสแตก และสังเกตได้เมื่อตัวอย่างมีความหนืดหรือเกิดฟอง เพื่อป้องกันการเสื่อมสลายของตัวอย่าง ให้เพิ่มจำนวนพัลส์หากจำเป็น อย่าเพิ่มระยะเวลาของแต่ละรอบพัลส์อัลตราโซนิก เพื่อให้ได้สารสกัดโปรตีนคุณภาพสูง
• ทำให้ไลเสตของเซลล์ใสโดยปั่นเหวี่ยงหนอนที่สลายด้วยอัลตราโซนิกแล้วที่ 14,000rpm เป็นเวลา 10min ที่ 4ºC
• จากนั้น ย้ายส่วนใสเหนือตะกอนไปยังหลอดใหม่ และเตรียมสำหรับการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันหรือการทดสอบอื่น ๆ

หมายเหตุเกี่ยวกับบัฟเฟอร์สำหรับการทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน: เตรียมบัฟเฟอร์สำหรับการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันสำหรับโพรโทคอลการสลายด้วยอัลตราโซนิกข้างต้นดังนี้:

การสลาย C. elegans ที่รองรับตัวอย่างจำนวนมากในเพลต 96 หลุมโดยใช้เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลต UIP400MTP

การสลาย C. elegans (หนอนตัวกลมระยะตัวเต็มวัย)
UIP400MTP แอมพลิจูด 80%, 20 รอบ (แต่ละรอบการใช้คลื่นอัลตราโซนิก: เปิด 30 sec, ปิด 30 sec)
บัฟเฟอร์สำหรับการสลาย:

• ตัวเลือก 1) 4% SDS, 0.1 M Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA
• ตัวเลือก 2) สำหรับการตกตะกอนร่วมด้วยภูมิคุ้มกัน (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.5 % NP-40 (สารผสมยับยั้งโปรตีเนส Complete)

การทำให้ DNA แตกเป็นชิ้นที่รองรับตัวอย่างจำนวนมาก
DNA ของ C. elegans (หนอนตัวกลมระยะตัวเต็มวัย) ขนาด 200–300bp: เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลต UIP400MTP – ตั้งแอมพลิจูด 80%, 30 พัลส์ – แต่ละพัลส์เปิด 30sec และปิด 30sec

เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลต UIP400MTP สำหรับการเตรียมตัวอย่างจำนวนมาก ใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับตัวอย่างในเพลตหลายหลุม เพลตไมโครไทเทอร์ และเพลต 96 หลุมอย่างสม่ำเสมอ

การสลาย C. elegans ด้วยอัลตราโซนิกสำหรับการทดสอบการทำให้บริสุทธิ์ด้วยสัมพรรคภาพเชิงปริมาณ

เก็บเอ็มบริโอ C. elegans สด (∼2 ล้านตัวต่อชุดซ้ำ) โดยทำซ้ำทางชีวภาพสามชุด ด้วยการใช้สารฟอกขาวกับหนอนกะเทยอายุน้อยที่มีไข่ แล้วใช้คลื่นอัลตราโซนิกบนน้ำแข็ง (รอบ: 0.5 s, แอมพลิจูด: 40–45%, 5 พัลส์/ชุด, 5 ชุด, ช่วงพักระหว่างชุด: 30 s; เครื่องประมวลผลอัลตราโซนิก UP200S พร้อมไมโครทิป S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) ในบัฟเฟอร์สำหรับการสลาย (ปริมาตรรวม: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7.4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glycerol, สารผสมยับยั้งโปรตีเอส, 0.1% Nonidet P-40 Substitute) หลังจากใช้คลื่นอัลตราโซนิก เติม Nonidet P-40 Substitute จนมีความเข้มข้นถึง 1% และบ่มไลเสตโดยหมุนสลับปลายหลอดที่ 4°C เป็นเวลา 30 min จากนั้นปั่นเหวี่ยงที่ 20,000 × g เป็นเวลา 20 min ที่ 4°C แล้วดูดไลเสตที่ทำให้ใสแล้วโดยไม่รบกวนชั้นลิพิดด้านบน และแบ่งเป็นสองส่วนเท่า ๆ กันเพื่อใส่ลงในเม็ดอะกาโรส anti-GFP หรือเม็ดควบคุมที่ผ่านการบล็อกแล้ว (40–50 μl) หลังจากหมุนสลับปลายหลอดที่ 4°C เป็นเวลา 60–90 min ล้างเม็ดหนึ่งครั้งด้วยบัฟเฟอร์สำหรับการสลายที่มี 0.1% Nonidet P-40 Substitute ตามด้วยการล้างสองครั้งในบัฟเฟอร์ I (25 mm Tris-HCl, pH 7.4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) หรือบัฟเฟอร์ II (1 mm Tris-HCl, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) หรือทั้งสองชนิด สำหรับการดึงจับ GFP:MBK-2 ดำเนินการทดลองแยกกันสองการทดลองโดยใช้สภาวะการล้างที่แตกต่างกัน ชะโปรตีนออกโดยเขย่าแบบวงโคจรใน 6 m urea/2 M thiourea ปริมาตร 50 μl ที่อุณหภูมิห้อง สำหรับการทดลองดึงจับ MBK-1::GFP ชะโปรตีนออกสองครั้งโดยเขย่าใน 8 m guanidinium chloride ปริมาตร 50μl ที่ 90°C ตามด้วยการตกตะกอนด้วย ethanol จากนั้นย่อยตัวอย่างโปรตีนที่ชะออกมาในสารละลาย
(ดู Chen et al., 2016)

การทำให้หนอนเป็นเนื้อเดียวกันและการสลายด้วยอัลตราโซนิก

สำหรับขั้นตอนการสลาย C.elegans และการสกัดโปรตีน เก็บหนอนตัวกลมระยะที่ต้องการ 30,000 ตัวต่อหนึ่งตัวอย่าง แล้วล้างใน S-basal ที่เย็นจัด ทำให้เข้มข้นด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ 1500 rpm เป็นเวลา 2 min ล้างหกครั้งด้วย S-basal ที่เย็นจัดเพื่อกำจัดแบคทีเรียตกค้าง แล้วเก็บไว้บนน้ำแข็งจนกว่าจะพร้อมใช้ สำหรับการสกัดโปรตีน ปล่อยให้หนอนตัวเต็มวัยที่มีไข่รวมตัวเป็นตะกอนแน่นหลังจากการล้างด้วย S-basal ครั้งสุดท้าย จากนั้นแขวนลอยตะกอนหนอนอีกครั้งในบัฟเฟอร์สกัดที่เย็นจัดปริมาตร 1 ml [20 mM potassium phosphate, pH 7.4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, สารยับยั้งโปรตีเอส (Sigma P2714)] และดำเนินการทันที
ใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับหนอนตัวเต็มวัยที่มีไข่ ∼30,000 ตัว (เทียบเท่าน้ำหนักเปียก ∼100 mg) บนน้ำแข็ง โดยใช้เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบ (เช่น UP50H พร้อมไมโครทิป MS2) ที่แอมพลิจูด 40% เป็นจำนวน 10 รอบ โดยเปิด 3 sec และปิด 30 sec ในบัฟเฟอร์สกัดที่เย็นจัดปริมาตร 1 ml (ดู Baskharan et al. 2012)

การสกัดลิพิดจาก C. elegans ด้วยอัลตราโซนิก

ลิพิโดมิกส์ ซึ่งเป็นสาขาหนึ่งของเมแทโบโลมิกส์ เป็นการศึกษาลักษณะและวิเคราะห์ลิพิดทั้งหมดในระบบชีวภาพ C. elegans ถูกใช้กันอย่างแพร่หลายในลิพิโดมิกส์เพื่อศึกษาปฏิสัมพันธ์ของลิพิดในเมแทบอลิซึมและผลของลิพิดเหล่านี้ต่อสุขภาพและอายุขัย
การสลายและสกัดด้วยอัลตราโซนิกใช้เพื่อปลดปล่อยลิพิด เช่น sphingolipids จากเอ็มบริโอ ตัวอ่อน และหนอนตัวเต็มวัยของ C. elegans การใช้คลื่นอัลตราโซนิกใช้เพื่อเตรียมโฮโมจีเนตของหนอน และสกัดลิพิดจากตัวอย่างในขั้นตอนถัดไป
โพรโทคอลการสกัดลิพิดจาก C. elegans ด้วยอัลตราโซนิก
ละลายตะกอน C. elegans ที่แช่แข็งไว้บนน้ำแข็ง แล้วแขวนลอยอีกครั้งด้วย ultrawater ปริมาตร 0.5 ml ใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับตัวอย่าง C. elegans ในหลอดทดลองขนาด 1.5mL โดยเก็บตัวอย่างไว้บนน้ำแข็งอย่างต่อเนื่อง
สามารถใช้คลื่นอัลตราโซนิกด้วยเครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบ เช่น UP200Ht, ชุดเตรียมตัวอย่างด้วยอัลตราโซนิก VialTweeter (ใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับตัวอย่าง 10 ตัวอย่างพร้อมกัน) หรือ UIP400MTP (สำหรับการใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับเพลตหลายหลุม เช่น เพลต 96 หลุม) สำหรับการสลายด้วยอัลตราโซนิกโดยใช้ UP200Ht ให้ใช้ไมโครทิป S26d2 ตั้งโหมดรอบการทำงานของอัลตราโซนิกไว้ล่วงหน้าในเมนูดิจิทัล ตั้งแอมพลิจูดเป็น 10% และตั้งโหมดรอบการใช้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นพัลส์ยาว 2 sec จำนวน 20 รอบ โดยเว้นช่วงพัก 30 sec ระหว่างชุดพัลส์อัลตราโซนิกแต่ละชุด
ย้ายส่วนใสเหนือตะกอนไปยังหลอดแก้วที่มีฝาเกลียว ดำเนินการสกัดแบบ Folch โดยเติม ultrawater ปริมาตร 1 ml ลงในหลอดแก้วแต่ละหลอด ตามด้วยการเติมส่วนผสม chloroform/methanol (อัตราส่วน = 2:1) ปริมาตร 6 ml ลงในหลอดแก้วแต่ละหลอด
ผสมหลอดแก้วแต่ละหลอดด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์เป็นเวลา 30 sec จำนวน 4 ครั้ง ปั่นเหวี่ยงหลอดที่ 1,258 x g เป็นเวลา 15 min (Eppendorf, 5810 R) เพื่อเพิ่มการแยกเฟส ใช้ปิเปตแก้ว Pasteur ย้ายส่วนที่ไม่ชอบน้ำชั้นล่างไปยังหลอดแก้วสะอาด ทำให้ส่วนที่ไม่ชอบน้ำชั้นล่างแห้งภายใต้กระแสไนโตรเจนในเครื่องระเหยด้วยไนโตรเจน เก็บตะกอนแห้งไว้ในตู้แช่แข็งที่ -80 °C จนกว่าจะใช้ 


การเตรียมไลเสตของหนอนด้วยอัลตราโซนิก

ไลเสตของหนอน: เก็บหนอนระยะ L4 และล้างสามครั้งด้วยบัฟเฟอร์ M9 (42.26 mM Na₂HPO₄, 22.04 mM KH₂PO₄, 85.56 mM NaCl และ 0.87 mM MgSO₄) เพื่อกำจัดแบคทีเรียทั้งหมด หลังจากกำจัดบัฟเฟอร์ M9 ออกให้ได้มากที่สุด แขวนลอยหนอนอีกครั้งในบัฟเฟอร์สำหรับการสลาย: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM phosphate β-glycerol, 0.1% (v/v) Triton X-100, 50 mM sodium fluoride, 1 mM sodium orthovanadate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.2 mM phenylmethanesulfonylfluoride และสารยับยั้งโปรตีเอส แช่แข็งหนอนในไนโตรเจนเหลวและละลายที่ 37°C จำนวนสามครั้ง จากนั้นใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับหนอนบนน้ำแข็งแห้งด้วยชุดอัลตราโซนิก VialTweeter สำหรับการเตรียมหลอดตัวอย่าง 10 หลอดพร้อมกัน ใช้คลื่นอัลตราโซนิกที่แอมพลิจูด 50% เป็นจำนวน 10 รอบ รอบละ 2 sec โดยเว้นช่วงพัก 30 sec ระหว่างชุดพัลส์อัลตราโซนิก หลังจากนั้น ปั่นเหวี่ยงตัวอย่างที่ 12,000 rpm ที่ 4°C เป็นเวลา 15 min เก็บรวบรวมส่วนใสเหนือตะกอนและเก็บรักษาที่ -70°C ใช้ตัวอย่างส่วนย่อยเพื่อหาปริมาณโปรตีนด้วยการทดสอบ Bradford
การหาปริมาณ glutathione ทั้งหมด, GSH และ GSSG: สำหรับการหาปริมาณ glutathione เตรียมไลเสตและดำเนินการวัดในวันเดียวกัน เก็บตัวอ่อน L4 ที่ได้รับ glucose และกลุ่มควบคุม แล้วล้างด้วยบัฟเฟอร์ M9 จำนวนสามครั้ง หลังจากกำจัดบัฟเฟอร์ M9 ออกให้ได้มากที่สุด แขวนลอยหนอนอีกครั้งใน metaphosphoric acid ที่เย็นจัด (5% w/v) จากนั้นใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับหนอนในน้ำแข็งด้วย VialTweeter ที่แอมพลิจูด 50% เป็นจำนวนสิบรอบ รอบละ 2 sec โดยเว้นช่วงพัก 30 sec ระหว่างแต่ละรอบ หลังจากนั้น ปั่นเหวี่ยงที่ 12,000 rpm ที่ 4 ̊C เป็นเวลา 15 min
(ดู Alcántar-Fernández et al., 2018)

การเตรียมตัวอย่าง C. elegans ก่อนการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันและการทำเวสเทิร์นบลอต

โดยสังเขป สำหรับสารสกัดจากเอ็มบริโอ เพาะเลี้ยงตัวอ่อน C. elegans ระยะ L1 ในอาหารเหลว S-medium ปริมาณมากจนถึงระยะตัวเต็มวัย เก็บเอ็มบริโอด้วยวิธีใช้สารฟอกขาวมาตรฐาน แล้วแขวนลอยในบัฟเฟอร์สำหรับการสลาย (50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8.7% glycerol, 0.05% NP-40, 1􏰅 สารผสมยับยั้งโปรตีเอส และ 1􏰅 สารผสมยับยั้งฟอสฟาเทส I และ II) แช่แข็งอย่างรวดเร็วในไนโตรเจนเหลว และสลายด้วยการทำลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกโดยใช้เครื่องอัลตราโซนิกพร้อมไมโครทิป เช่น UP200Ht พร้อม S26d2 จำนวน 10 พัลส์ในช่วงเวลา 10 s ที่แอมพลิจูด 30% หากต้องเตรียมตัวอย่างจำนวนมากขึ้น แนะนำให้ใช้เครื่องอัลตราโซนิก VialTweeter หรือเครื่องอัลตราโซนิกสำหรับหลายตัวอย่าง UIP400MTP สำหรับเพลตหลุม หลังจากใช้คลื่นอัลตราโซนิก ทำให้สารสกัดใสเบื้องต้นด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ 30,000g เป็นเวลา 20 min ที่ 4°C บ่มสารสกัดที่ทำให้ใสเบื้องต้นแล้ว (โปรตีนทั้งหมด 300µg) กับแอนติบอดีปริมาณ 40µ􏰂g ชนิด anti-CDC-25.1 ที่ทำให้บริสุทธิ์ด้วยสัมพรรคภาพ (ในการศึกษานี้) และเชื่อมขวางกับ protein A-agarose หรือใช้อิมมูโนโกลบูลิน (Ig)G จากกระต่ายปริมาณใกล้เคียงกันที่เชื่อมขวางกับ protein A-agarose เป็นกลุ่มควบคุม โดยใช้บัฟเฟอร์สำหรับการสลายปริมาตรรวม 200µl ที่มี 1% NP-40 ซึ่งการเติมสารนี้ช่วยลดการจับแบบไม่จำเพาะของโปรตีนกับเมทริกซ์ หมุนตัวอย่างเป็นเวลา 1 h ที่ 4°C ล้างเม็ดสามครั้งด้วยบัฟเฟอร์สำหรับการสลาย และชะออกด้วยสารละลายปริมาตร 30µl ที่มี glycine/HCl และ 200 mM NaCl, pH 2.2 หลังจากการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกัน เจือจางสารที่ชะออกมาในบัฟเฟอร์ตัวอย่าง SDS ปริมาตร 30µ􏰂l ให้ความร้อนถึง 95°C เป็นเวลา 4 min และโดยทั่วไป นำ 3% ของปริมาณทั้งหมดสำหรับตัวอย่างเริ่มต้นและ 30% ของสารที่ชะออกมาไปทำ SDS-PAGE ตามด้วยการทำเวสเทิร์นบลอตด้วยแอนติบอดี anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) หรือ anti-􏰁β-actin (1:2000) ในกรณีที่สารสกัดไม่ได้ผ่านการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกัน แขวนลอยโปรตีนทั้งหมดปริมาณเท่ากันจากสารสกัดเหล่านั้นอีกครั้งในบัฟเฟอร์ตัวอย่าง SDS ให้ความร้อนถึง 95°C แล้วนำไปทำ SDS-PAGE โดยตรงและวิเคราะห์ด้วยเวสเทิร์นบลอต (ดู Segref et al. 2020)

การสลายด้วยอัลตราโซนิกภายใต้การควบคุมอุณหภูมิอย่างแม่นยำ

การควบคุมอุณหภูมิอย่างแม่นยำและเชื่อถือได้มีความสำคัญอย่างยิ่งเมื่อจัดการตัวอย่างทางชีวภาพ อุณหภูมิสูงทำให้โปรตีนในตัวอย่างเริ่มเสื่อมสลายจากความร้อน
เช่นเดียวกับเทคนิคการเตรียมตัวอย่างเชิงกลทุกชนิด การใช้คลื่นอัลตราโซนิกก่อให้เกิดความร้อน อย่างไรก็ตาม สามารถควบคุมอุณหภูมิของตัวอย่างได้ดีเมื่อใช้ VialTweeter เรานำเสนอทางเลือกต่าง ๆ สำหรับการติดตามและควบคุมอุณหภูมิของตัวอย่างขณะเตรียมด้วย VialTweeter และ VialPress เพื่อการวิเคราะห์

1. การติดตามอุณหภูมิตัวอย่าง: เครื่องประมวลผลอัลตราโซนิก UP200St ซึ่งขับเคลื่อน VialTweeter มีซอฟต์แวร์อัจฉริยะและเซนเซอร์อุณหภูมิแบบเสียบต่อได้ เสียบเซนเซอร์อุณหภูมิเข้ากับ UP200St และสอดปลายเซนเซอร์อุณหภูมิลงในหลอดตัวอย่างหลอดหนึ่ง คุณสามารถกำหนดช่วงอุณหภูมิเฉพาะสำหรับการใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับตัวอย่างในเมนูของ UP200St ผ่านจอสัมผัสสีดิจิทัล เครื่องอัลตราโซนิกจะหยุดโดยอัตโนมัติเมื่อถึงอุณหภูมิสูงสุด และพักจนกว่าอุณหภูมิตัวอย่างจะลดลงถึงค่าต่ำสุดของช่วงอุณหภูมิ ∆ ที่ตั้งไว้ จากนั้นการใช้คลื่นอัลตราโซนิกจะเริ่มอีกครั้งโดยอัตโนมัติ คุณสมบัติอัจฉริยะนี้ป้องกันการเสื่อมสลายที่เกิดจากความร้อน
2. สามารถทำให้บล็อก VialTweeter เย็นไว้ล่วงหน้าได้ นำบล็อก VialTweeter (เฉพาะโซโนโทรดที่ไม่มีทรานสดิวเซอร์เท่านั้น!) ใส่ในตู้เย็นหรือตู้แช่แข็งเพื่อทำให้บล็อกไทเทเนียมเย็นไว้ล่วงหน้า ซึ่งช่วยชะลอการเพิ่มขึ้นของอุณหภูมิในตัวอย่าง หากเป็นไปได้ สามารถทำให้ตัวอย่างเย็นไว้ล่วงหน้าได้เช่นกัน
3. ใช้น้ำแข็งแห้งเพื่อให้ความเย็นระหว่างการใช้คลื่นอัลตราโซนิก ใช้ถาดตื้นที่เติมน้ำแข็งแห้ง และวาง VialTweeter บนน้ำแข็งแห้งเพื่อให้ความร้อนระบายออกได้อย่างรวดเร็ว

ค้นหาเครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกที่เหมาะสมที่สุดสำหรับงานสลายเซลล์ของคุณ

Hielscher Ultrasonics เป็นผู้ผลิตที่มีประสบการณ์ยาวนานด้านเครื่องทำลายเซลล์และเครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกสมรรถนะสูงสำหรับห้องปฏิบัติการ ระบบระดับตั้งโต๊ะ และระบบระดับอุตสาหกรรม ขนาดของการเพาะเลี้ยงเซลล์แบคทีเรีย เป้าหมายการวิจัยหรือการผลิต และปริมาตรเซลล์ที่ต้องดำเนินการต่อชั่วโมงหรือต่อวัน เป็นปัจจัยสำคัญในการเลือกเครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกที่เหมาะกับงานของคุณ
Hielscher Ultrasonics นำเสนอโซลูชันหลากหลายสำหรับการใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับหลายตัวอย่างพร้อมกัน (สูงสุด 10 ขวดตัวอย่าง) รวมถึงตัวอย่างจำนวนมาก (ได้แก่ เพลตไมโครไทเทอร์ / เพลต 96 หลุม) ตั้งแต่เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับห้องปฏิบัติการชนิดโพรบแบบดั้งเดิมที่มีระดับกำลังต่าง ๆ ตั้งแต่ 50 ถึง 400 วัตต์ ไปจนถึงเครื่องประมวลผลอัลตราโซนิกระดับอุตสาหกรรมเต็มรูปแบบที่มีกำลังสูงสุด 16,000 วัตต์ต่อเครื่อง สำหรับการทำลายเซลล์เชิงพาณิชย์และการสกัดโปรตีนในการผลิตขนาดใหญ่ เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher ทุกเครื่องสร้างขึ้นเพื่อการทำงานแบบ 24/7/365 ภายใต้โหลดเต็ม ความทนทานและความเชื่อถือได้เป็นคุณสมบัติหลักของอุปกรณ์อัลตราโซนิกของเรา
เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกแบบดิจิทัลทุกเครื่องมีซอฟต์แวร์อัจฉริยะ จอสัมผัสสี และระบบบันทึกข้อมูลอัตโนมัติ ซึ่งทำให้อุปกรณ์อัลตราโซนิกเป็นเครื่องมือที่ใช้งานสะดวกในห้องปฏิบัติการและสถานที่ผลิต
แจ้งให้เราทราบว่าคุณต้องดำเนินการกับตัวอย่างทางชีวภาพที่เป็นเซลล์ชนิดใด ปริมาตรเท่าใด บ่อยเพียงใด และมีเป้าหมายอะไร เราจะแนะนำเครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกที่เหมาะสมที่สุดกับข้อกำหนดกระบวนการของคุณ

ตารางด้านล่างแสดงความสามารถในการประมวลผลโดยประมาณของระบบอัลตราโซนิกของเรา ตั้งแต่เครื่องโฮโมจีไนเซอร์แบบมือถือขนาดกะทัดรัดและเครื่องอัลตราโซนิกสำหรับหลายตัวอย่าง ไปจนถึงเครื่องประมวลผลอัลตราโซนิกระดับอุตสาหกรรมสำหรับงานเชิงพาณิชย์: