การเตรียมตัวอย่างด้วยอัลตราโซนิกสำหรับการทดสอบ ELISA

การทดสอบ เช่น ELISA ใช้กันอย่างแพร่หลายในการวินิจฉัยภายนอกร่างกาย การตรวจหาโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับโรค และการควบคุมคุณภาพ (เช่น การติดตามสารก่อภูมิแพ้ในอาหาร) การเตรียมตัวอย่างด้วยอัลตราโซนิกเป็นเทคนิคที่รวดเร็ว เชื่อถือได้ และให้ผลที่ทำซ้ำได้ สำหรับการสลายเซลล์และแยกโปรตีนภายในเซลล์ DNA, RNA และออร์แกเนลล์ Hielscher Ultrasonics นำเสนอโซลูชันอัลตราโซนิกหลากหลายรูปแบบเพื่อให้เตรียมตัวอย่างเดี่ยว ตัวอย่างในขวดหลายขวด รวมถึงตัวอย่างในแผ่นไมโครไทเทอร์และแผ่น 96 หลุมได้อย่างสะดวก

ELISA – การทดสอบอิมมูโนซอร์เบนต์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์

ELISA ย่อมาจากการทดสอบอิมมูโนซอร์เบนต์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ และเป็นเทคนิคการวิเคราะห์ทางชีวเคมีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในกลุ่มการทดสอบการจับกับลิแกนด์ ในการทดสอบ ELISA จะเติมตัวอย่างของเหลวลงบนเฟสของแข็งที่อยู่กับที่ซึ่งมีคุณสมบัติการจับเฉพาะ โดยปกติจะเคลือบเฟสของแข็งที่อยู่กับที่นี้ลงบนแผ่นหลุมหรือแผ่น ELISA จากนั้นเติมรีเอเจนต์ของเหลวชนิดต่าง ๆ บ่ม และล้างตามลำดับ จนในที่สุดเกิดการเปลี่ยนแปลงทางแสง (เช่น การเกิดสีจากผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยาเอนไซม์) ในของเหลวสุดท้ายที่อยู่ในหลุม การเปลี่ยนแปลงทางแสงนี้ช่วยให้วัดปริมาณสารที่ต้องการวิเคราะห์ได้ด้วยสิ่งที่เรียกว่า “การอ่านค่า” เชิงปริมาณ สำหรับการอ่านค่าเชิงปริมาณ จะใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ เครื่องฟลูออโรมิเตอร์ หรือเครื่องลูมิโนมิเตอร์เพื่อตรวจจับและวัดความเข้มของแสงที่ส่องผ่าน ความไวในการตรวจจับขึ้นอยู่กับการขยายสัญญาณระหว่างปฏิกิริยาการวิเคราะห์ เนื่องจากปฏิกิริยาเอนไซม์เป็นกระบวนการขยายสัญญาณที่ได้รับการศึกษาอย่างละเอียดและเชื่อถือได้ จึงใช้เอนไซม์เพื่อสร้างสัญญาณ เอนไซม์จะเชื่อมโยงกับรีเอเจนต์สำหรับการตรวจจับในสัดส่วนคงที่เพื่อให้วัดปริมาณได้อย่างแม่นยำ ซึ่งอธิบายที่มาของชื่อการทดสอบอิมมูโนซอร์เบนต์ที่ “เชื่อมโยงกับเอนไซม์” ด้วย
เนื่องจากการทดสอบ ELISA ดำเนินการในแผ่นไมโครไทเทอร์ / แผ่น 96 หลุม จึงเรียกว่าเทคนิคการทดสอบบนแผ่น และใช้ในงานต่าง ๆ เช่น การวินิจฉัยทางคลินิกภายนอกร่างกาย การวิจัย และการพัฒนายา เพื่อตรวจหาและวัดปริมาณแอนติบอดี เปปไทด์ โปรตีน และฮอร์โมน
เทคนิค ELISA ใช้เป็นเครื่องมือวินิจฉัยบ่อยครั้งในด้านการแพทย์ เทคโนโลยีชีวภาพ และโรคพืช และยังเป็นวิธีตรวจวัดที่สำคัญสำหรับการควบคุมคุณภาพในหลายอุตสาหกรรม

การเตรียมตัวอย่างด้วยอัลตราโซนิกก่อนการทดสอบ ELISA

ก่อนดำเนินการทดสอบ ELISA ตัวอย่างต้องผ่านขั้นตอนการเตรียม เช่น การสลายเซลล์และการสกัดโปรตีนภายในเซลล์ DNA, RNA เป็นต้น ข้อดีของการสลายเซลล์และการแยกโปรตีนด้วยอัลตราโซนิกคือประสิทธิภาพสูง ความน่าเชื่อถือ และการให้ผลที่ทำซ้ำได้ ปัจจัยทั้งหมดนี้มีความสำคัญต่อการได้ผลการวินิจฉัยและผลการวิจัยที่มีคุณภาพสูง

ขั้นตอนการสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกก่อนการทดสอบ ELISA

• สำหรับเซลล์เพาะเลี้ยง: ก่อนสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิก ให้ปั่นเหวี่ยงเซลล์เป็นเวลา 5 นาที ที่ 270 x g ในเครื่องปั่นเหวี่ยงขนาดเล็ก ดูดของเหลวส่วนใสเหนือตะกอนออก แล้วทำให้เซลล์แขวนลอยอีกครั้งในบัฟเฟอร์ RIPA ปริมาตร 30 – 100 μL จากนั้นบ่มตะกอนเซลล์บนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 นาที
• ขณะนี้ตัวอย่างเซลล์พร้อมสำหรับการสลายด้วยอัลตราโซนิกแล้ว:
  ใช้เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบ (เช่น UP200Ht พร้อมโพรบ S26d2) หรือเครื่องอัลตราโซนิกสำหรับหลายตัวอย่าง (เช่น VialTweeter สำหรับการให้คลื่นอัลตราโซนิกแก่ตัวอย่างในขวดสูงสุด 10 ขวดพร้อมกัน หรือ UIP400MPT สำหรับแผ่นไมโครไทเทอร์ / แผ่น 96 หลุม) โดยเลือกตามจำนวนตัวอย่างที่ต้องเตรียม
  สำหรับการให้คลื่นอัลตราโซนิกแก่ตัวอย่างเดี่ยวด้วยเครื่องชนิดโพรบ ให้ใส่เซลล์ในหลอดปั่นเหวี่ยงขนาดเล็กขนาด 1.5 mL
• ตั้งค่าระยะเวลาการให้คลื่นอัลตราโซนิก พลังงานที่ป้อนทั้งหมด โหมดรอบการทำงาน และ/หรือขีดจำกัดอุณหภูมิไว้ล่วงหน้าในเมนูดิจิทัลของเครื่องอัลตราโซนิก วิธีนี้ช่วยให้การให้คลื่นอัลตราโซนิกมีความน่าเชื่อถือสูงและทำซ้ำได้
• สอดโซโนโทรดลงในตัวอย่างและเปิดเครื่องอัลตราโซนิก ค่อย ๆ เคลื่อนปลายโพรบอัลตราโซนิกขนาดเล็กไปทั่วตัวอย่างเพื่อให้ตัวอย่างได้รับคลื่นอัลตราโซนิกอย่างสม่ำเสมอ
  สำหรับเซลล์ส่วนใหญ่ การสลายด้วยอัลตราโซนิกจะเสร็จสมบูรณ์หลังจากให้คลื่นอัลตราโซนิก 2 – 4 รอบ รอบละ 10 วินาที
• หลังให้คลื่นอัลตราโซนิก ให้นำโซโนโทรดออกจากตัวอย่าง ควรบ่มตัวอย่างบนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที จากนั้นปั่นเหวี่ยงที่ 10,000 x g เป็นเวลา 20 นาที เพื่อให้เศษเซลล์ตกตะกอน ย้ายของเหลวส่วนใสเหนือตะกอนไปยังหลอดปั่นเหวี่ยงขนาดเล็กหลอดใหม่ ติดฉลากสารที่ต้องการวิเคราะห์และเก็บไว้ที่ -20°C
• สามารถทำความสะอาดโซโนโทรดอัลตราโซนิกได้โดยเช็ดด้วยแอลกอฮอล์อย่างทั่วถึง หรือให้คลื่นอัลตราโซนิกในบีกเกอร์ที่บรรจุแอลกอฮอล์ เช่น เอทานอล 70% โพรบอัลตราโซนิกทุกชิ้นที่ทำจากไทเทเนียมสามารถฆ่าเชื้อด้วยเครื่องนึ่งฆ่าเชื้อได้

• ล้างเนื้อเยื่อด้วย PBS ที่เย็นจัดด้วยน้ำแข็ง (0.01M, pH=7.4) เพื่อขจัดเลือดส่วนเกินที่มีเม็ดเลือดแดงแตกออกอย่างทั่วถึง
• ชั่งน้ำหนักเนื้อเยื่อ (ไต หัวใจ ปอด ม้าม เป็นต้น) แล้วบดให้เป็นชิ้นเล็ก ๆ จากนั้นทำให้เป็นเนื้อเดียวกันใน PBS ปริมาตร PBS ที่ต้องใช้สัมพันธ์กับน้ำหนักของเนื้อเยื่อ โดยหลักประมาณทั่วไป เนื้อเยื่อ 1g ต้องใช้ PBS ประมาณ 9mL แนะนำให้เติมสารยับยั้งโปรตีเอสเล็กน้อยลงใน PBS (สามารถใช้บัฟเฟอร์ RIPA หรือบัฟเฟอร์สลายเซลล์ชนิดไฮโปโทนิกที่มีส่วนผสมของสารยับยั้งโปรตีเอสและฟอสฟาเทสแทนได้)
• การผสมด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์เป็นช่วงเวลาสั้น ๆ (ประมาณ 1 – 2 นาที โดยทำเป็นช่วงละ 15 วินาที) อาจช่วยเตรียมเนื้อเยื่อในเบื้องต้นได้ ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับขนาดของเนื้อเยื่อ
• ติดตั้งปลายโพรบขนาดเล็ก เช่น S26d2 เข้ากับเครื่องอัลตราโซนิก วางหลอดตัวอย่างที่มีเนื้อเยื่อในอ่างน้ำแข็ง
• ให้คลื่นอัลตราโซนิกแก่ตัวอย่างด้วยเครื่องอัลตราโซนิก เช่น UP200St (แอมพลิจูด 80%) เป็นเวลา 1 นาที ในโหมดพัลส์ (ทำงาน 15 วินาที หยุดพัก 15 วินาที) คงตัวอย่างไว้ในอ่างน้ำแข็ง
• จากนั้นปั่นเหวี่ยงตัวอย่างที่ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันเพื่อให้ได้ส่วนเฉพาะ (ส่วนไซโทซอล นิวเคลียส ไมโทคอนเดรีย หรือไลโซโซม) เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของโปรตีนสำหรับการวิเคราะห์ โดยปั่นเหวี่ยงตัวอย่างเป็นเวลา 5 นาที ที่ 5000×g แล้วเก็บของเหลวส่วนใสเหนือตะกอน

การควบคุมอุณหภูมิที่เชื่อถือได้ระหว่างการให้คลื่นอัลตราโซนิก

อุณหภูมิเป็นปัจจัยสำคัญที่มีผลต่อกระบวนการ โดยมีความสำคัญเป็นพิเศษในการจัดการตัวอย่างทางชีวภาพ เช่น เพื่อป้องกันการเสื่อมสภาพของโปรตีนจากความร้อน เช่นเดียวกับเทคนิคการเตรียมตัวอย่างเชิงกลทุกชนิด การให้คลื่นอัลตราโซนิกก่อให้เกิดความร้อน อย่างไรก็ตาม สามารถควบคุมอุณหภูมิของตัวอย่างได้ดีเมื่อใช้เครื่องของ Hielscher Ultrasonics เรานำเสนอทางเลือกหลากหลายสำหรับการติดตามและควบคุมอุณหภูมิของตัวอย่างขณะเตรียมตัวอย่างก่อนการวิเคราะห์ด้วยเครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบหรือ VialTweeter

1. การติดตามอุณหภูมิตัวอย่าง: เครื่องประมวลผลอัลตราโซนิกดิจิทัลของ Hielscher ทุกเครื่องมีซอฟต์แวร์อัจฉริยะและเซนเซอร์อุณหภูมิแบบเสียบต่อได้ เสียบเซนเซอร์อุณหภูมิเข้ากับเครื่องอัลตราโซนิก (เช่น UP200Ht, UP200St, VialTweeter, เครื่องให้คลื่นอัลตราโซนิกสำหรับแผ่นหลายหลุม UIP400MTP) และสอดปลายเซนเซอร์อุณหภูมิลงในหลอดตัวอย่างหลอดหนึ่ง คุณสามารถกำหนดช่วงอุณหภูมิเฉพาะสำหรับการให้คลื่นอัลตราโซนิกแก่ตัวอย่างได้ในเมนูของเครื่องประมวลผลอัลตราโซนิกผ่านหน้าจอสัมผัสสีแบบดิจิทัล เครื่องอัลตราโซนิกจะหยุดโดยอัตโนมัติเมื่ออุณหภูมิถึงค่าสูงสุด และหยุดพักจนกว่าอุณหภูมิตัวอย่างจะลดลงถึงค่าล่างของช่วงอุณหภูมิ ∆ ที่ตั้งไว้ จากนั้นจะเริ่มให้คลื่นอัลตราโซนิกอีกครั้งโดยอัตโนมัติ คุณสมบัติอัจฉริยะนี้ช่วยป้องกันการเสื่อมสภาพจากความร้อน
2. สำหรับเครื่องอัลตราโซนิกหลายตัวอย่าง VialTweeter สามารถทำให้บล็อกไทเทเนียมที่รองรับหลอดตัวอย่างเย็นลงล่วงหน้าได้ นำบล็อก VialTweeter (เฉพาะโซโนโทรดที่ไม่มีทรานสดิวเซอร์เท่านั้น!) ใส่ในตู้เย็นหรือช่องแช่แข็งเพื่อทำให้บล็อกไทเทเนียมเย็นลงล่วงหน้า ซึ่งช่วยชะลอการเพิ่มขึ้นของอุณหภูมิในตัวอย่าง หากเป็นไปได้ สามารถทำให้ตัวอย่างเย็นลงล่วงหน้าได้เช่นกัน
3. ใช้อ่างน้ำแข็งหรือน้ำแข็งแห้งเพื่อทำความเย็นระหว่างการให้คลื่นอัลตราโซนิก วางหลอดตัวอย่างในอ่างน้ำแข็งระหว่างการให้คลื่นอัลตราโซนิก สำหรับ VialTweeter ให้ใช้ถาดตื้นที่บรรจุน้ำแข็งแห้ง และวาง VialTweeter บนน้ำแข็งแห้งเพื่อให้ความร้อนระบายออกได้อย่างรวดเร็ว

ลูกค้าทั่วโลกใช้เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบของ Hielscher รวมถึงเครื่องให้คลื่นอัลตราโซนิกสำหรับหลายตัวอย่าง VialTweeter และ UIP400MTP สำหรับงานเตรียมตัวอย่างประจำวันในห้องปฏิบัติการทางชีววิทยา ชีวเคมี การแพทย์ และคลินิก ซอฟต์แวร์อัจฉริยะและระบบควบคุมอุณหภูมิของเครื่องประมวลผล Hielscher ช่วยควบคุมอุณหภูมิได้อย่างเชื่อถือได้และหลีกเลี่ยงการเสื่อมสภาพของตัวอย่างจากความร้อน การเตรียมตัวอย่างด้วยอัลตราโซนิกโดยใช้โซลูชันอัลตราโซนิกของ Hielscher ให้ผลที่มีความน่าเชื่อถือสูงและทำซ้ำได้!
อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับการให้คลื่นอัลตราโซนิกที่รองรับการประมวลผลตัวอย่างจำนวนมากโดยใช้เครื่องให้คลื่นอัลตราโซนิกสำหรับแผ่นหลายหลุม UIP400MTP สำหรับการทดสอบ!