การเตรียมตัวอย่างอัลตราโซนิกสําหรับการทดสอบ ELISA

การทดสอบเช่น ELISA ใช้กันอย่างแพร่หลายสําหรับการวินิจฉัยในหลอดทดลอง การตรวจหาโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับโรค และการควบคุมคุณภาพ (เช่น การตรวจสอบสารก่อภูมิแพ้ในอาหาร) การเตรียมตัวอย่างอัลตราโซนิกเป็นเทคนิคที่รวดเร็วเชื่อถือได้และทําซ้ําได้ในการสลายเซลล์และแยกโปรตีนภายในเซลล์ DNA, RNA และออร์แกเนลล์ Hielscher Ultrasonics นําเสนอโซลูชั่นอัลตราโซนิกที่หลากหลายสําหรับการเตรียมตัวอย่างเดียวขวดหลายขวดที่สะดวกสําหรับแผ่นไมโครไทเตอร์และแผ่น 96 หลุม

เอลิซ่า – การทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์

ELISA ย่อมาจากการทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์และเป็นเทคนิคการวิเคราะห์ทางชีวเคมีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในหมวดหมู่ของการทดสอบการจับลิแกนด์ ใน ELISA ตัวอย่างของเหลวจะถูกเติมลงในเฟสของแข็งนิ่งที่มีคุณสมบัติการยึดเกาะพิเศษ โดยปกติเฟสของแข็งที่อยู่กับที่จะถูกนําไปใช้เป็นการเคลือบกับแผ่นหลุมหรือแผ่น ELISA จากนั้นรีเอเจนต์เหลวต่างๆจะถูกเติมฟักตัวและล้างตามลําดับเพื่อให้ในที่สุดการเปลี่ยนแปลงทางแสง (เช่นการพัฒนาสีโดยผลของปฏิกิริยาเอนไซม์) เกิดขึ้นในของเหลวสุดท้ายในบ่อน้ํา การเปลี่ยนแปลงทางแสงช่วยให้สามารถวัดปริมาณของสารวิเคราะห์ได้ด้วยสิ่งที่เรียกว่าเชิงปริมาณ “การอ่าน" สําหรับการอ่านเชิงปริมาณจะใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ฟลูออโรมิเตอร์หรือลูมิโนมิเตอร์เพื่อตรวจจับและวัดความเข้มของแสงที่ส่งผ่าน ความไวของการตรวจจับได้รับอิทธิพลจากการขยายสัญญาณระหว่างปฏิกิริยาการวิเคราะห์ เนื่องจากปฏิกิริยาของเอนไซม์ได้รับการตรวจสอบอย่างดีและกระบวนการขยายที่เชื่อถือได้เอนไซม์จึงถูกนํามาใช้เพื่อสร้างสัญญาณ เอนไซม์เชื่อมโยงกับรีเอเจนต์ตรวจจับในสัดส่วนคงที่เพื่อให้สามารถหาปริมาณได้อย่างแม่นยํา ซึ่งอธิบายชื่อการทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์
เนื่องจากการทดสอบ ELISA ดําเนินการในแผ่นไมโครไทเตอร์ / แผ่น 96 หลุม จึงเรียกว่าเทคนิคการทดสอบแบบแผ่น และใช้ เช่น ในการวินิจฉัยในหลอดทดลองทางคลินิก การวิจัย การพัฒนายา ฯลฯ สําหรับการตรวจจับและหาปริมาณแอนติบอดี เปปไทด์ โปรตีน และฮอร์โมน
เทคนิค ELISA มักใช้เป็นเครื่องมือวินิจฉัยทางการแพทย์เทคโนโลยีชีวภาพพยาธิวิทยาพืชและยังเป็นการวัดการควบคุมคุณภาพที่สําคัญในหลายอุตสาหกรรม

การเตรียมตัวอย่างอัลตราโซนิกก่อน ELISA

ก่อนที่การทดสอบ ELISA จะสามารถทําการทดสอบได้ ตัวอย่างต้องมีขั้นตอนในการเตรียม เช่น การสลายเซลล์และการสกัดโปรตีนภายในเซลล์ DNA, RNA เป็นต้น ข้อดีของการสลายเซลล์อัลตราโซนิกและการแยกโปรตีนคือประสิทธิภาพสูงความน่าเชื่อถือและความสามารถในการทําซ้ํา ปัจจัยทั้งหมดเหล่านี้มีความสําคัญเพื่อให้ได้ผลการวินิจฉัยและการวิจัยที่มีคุณภาพสูง

โปรโตคอลสําหรับ Pre-ELISA Ultrasonic Cell Lysis

• สําหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์: ก่อนการสลายเซลล์อัลตราโซนิกให้หมุนเหวี่ยงเซลล์เป็นเวลา 5 นาทีที่ 270 x g ในไมโครเซนติ้ง นําสารเหนือน้ําออกโดยการสําลักและระงับเซลล์อีกครั้งในบัฟเฟอร์ RIPA 30 – 100 μL จากนั้นบ่มเม็ดเซลล์บนน้ําแข็งเป็นเวลา 30 นาที
• ตอนนี้ตัวอย่างเซลล์พร้อมสําหรับการสลายอัลตราโซนิก:
  ใช้เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบ (เช่น UP200 ฮิต ด้วยโพรบ S26d2) หรืออุปกรณ์อัลตราโซนิกหลายตัวอย่าง (เช่น VialTweeter สําหรับการ sonication พร้อมกันได้ถึง 10 ขวดหรือ UIP400MPT สําหรับแผ่นไมโครไทเตอร์ / แผ่น 96 หลุม) ขึ้นอยู่กับปริมาณตัวอย่างที่คุณต้องเตรียม
  สําหรับการ sonication แบบโพรบของตัวอย่างเดียว ให้วางเซลล์ในหลอดไมโครเซ่นไหว 1.5 มล.
• ตั้งค่าระยะเวลาอัลตราโซนิกอินพุตพลังงานทั้งหมดโหมดรอบและ / หรือขีด จํากัด อุณหภูมิล่วงหน้าในเมนูดิจิตอลของเครื่องอัลตราโซนิก สิ่งนี้ทําให้มั่นใจได้ถึงการ sonication และความสามารถในการทําซ้ําที่มีความน่าเชื่อถือสูง
• ใส่ sonotrode และเปิดอุปกรณ์อัลตราโซนิก ค่อยๆ ขยับปลายไมโครของโพรบอัลตราโซนิกผ่านตัวอย่างเพื่อสะท้อนเสียงตัวอย่างอย่างสม่ําเสมอ
  สําหรับเซลล์ส่วนใหญ่การสลายอัลตราโซนิกจะเสร็จสิ้นหลังจาก 2 -4 รอบของ sonication 10 วินาที
• หลังจาก sonication ให้นํา sonotrode ออกจากตัวอย่าง ตัวอย่างควรบ่มบนน้ําแข็งเป็นเวลา 5 นาที จากนั้นหมุนเหวี่ยงที่ 10,000 x g เป็นเวลา 20 นาทีเพื่ออัดเม็ดเศษซาก ถ่ายโอน supernatants ไปยังหลอด microcentrifuge ใหม่ ติดฉลากสารวิเคราะห์และเก็บที่อุณหภูมิ -20°C
• sonotrode อัลตราโซนิกสามารถทําความสะอาดได้โดยการเช็ดอย่างถูกต้องด้วยแอลกอฮอล์หรือโซนิเคตในบีกเกอร์ที่เต็มไปด้วยแอลกอฮอล์เช่นเอทานอล 70% โพรบอัลตราโซนิกทั้งหมดที่ทําจากไทเทเนียมสามารถนึ่งฆ่าเชื้อได้

• ล้างเนื้อเยื่อด้วย PBS เย็น (0.01M, pH=7.4) เพื่อขจัดเลือดเม็ดเลือดแดงเหลืองส่วนเกินออกอย่างทั่วถึง
• ชั่งน้ําหนักเนื้อเยื่อ (ไต หัวใจ ปอด ม้าม ฯลฯ) แล้วหมักเป็นชิ้นเล็ก ๆ ซึ่งถูกทําให้เป็นเนื้อเดียวกันใน PBS ปริมาตรของ PBS ที่ต้องการสัมพันธ์กับน้ําหนักของเนื้อเยื่อ ตามหลักการทั่วไป เนื้อเยื่อ 1 กรัมต้องใช้ประมาณ 9 มล. PBS ขอแนะนําให้เพิ่มสารยับยั้งโปรตีเอสลงใน PBS (สามารถใช้บัฟเฟอร์ RIPA หรือไฮโปโทนิกสไลซิสที่มีโปรตีเอสและค็อกเทลยับยั้งฟอสฟาเทสได้)
• การรักษาด้วยกระแสน้ําวนสั้น ๆ (ประมาณ 1-2 นาทีใน 15 วินาที) อาจเป็นประโยชน์ในการรักษาเนื้อเยื่อล่วงหน้า
• ติดตั้งไมโครทิป เช่น S26d2 เข้ากับเครื่องอัลตราโซนิกของคุณ วางหลอดตัวอย่างพร้อมเนื้อเยื่อในอ่างน้ําแข็ง
• Sonicate samp ด้วยเครื่องอัลตราโซนิกของคุณ เช่น UP200St (80% amplitude) เป็นเวลา 1 นาที ในโหมดพัลส์ (เปิด 15 วินาที หยุดชั่วคราว 15 วินาที) เก็บตัวอย่างในอ่างน้ําแข็ง
• จากนั้นโฮโมจีเนตจะถูกหมุนเหวี่ยงเพื่อให้ได้สระเฉพาะ (ไซโตโซลิก นิวเคลียร์ ไมโทคอนเดรีย หรือไลโซโซมอล) เพื่อเพิ่มคุณค่าของโปรตีนสําหรับการวิเคราะห์ โดยการหมุนศูนย์ตัวอย่างเป็นเวลา 5 นาทีที่ 5000× ส่วนเหนือน้ําจะถูกดึงออกมา

การควบคุมอุณหภูมิที่เชื่อถือได้ระหว่างการ Sonication

อุณหภูมิเป็นปัจจัยสําคัญที่มีอิทธิพลต่อกระบวนการซึ่งมีความสําคัญอย่างยิ่งต่อการรักษาตัวอย่างทางชีวภาพ เช่น เพื่อป้องกันการย่อยสลายทางความร้อนของโปรตีน เนื่องจากเทคนิคการเตรียมตัวอย่างเชิงกลทั้งหมดการ sonication จะสร้างความร้อน อย่างไรก็ตาม อุณหภูมิของตัวอย่างสามารถควบคุมได้ดีเมื่อใช้อุปกรณ์ Hielscher Ultrasonics เรานําเสนอตัวเลือกต่างๆในการตรวจสอบและควบคุมอุณหภูมิของตัวอย่างของคุณในขณะที่เตรียมด้วยเครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบหรือ VialTweeter ก่อนการวิเคราะห์

1. การตรวจสอบอุณหภูมิตัวอย่าง: โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิกแบบดิจิตอลของ Hielscher ทั้งหมดมีซอฟต์แวร์อัจฉริยะและเซ็นเซอร์อุณหภูมิแบบเสียบได้ เสียบเซ็นเซอร์อุณหภูมิเข้ากับอุปกรณ์อัลตราโซนิก (เช่น UP200 ฮิต, UP200 เซนต์, ไวอัลทวีตเตอร์, เครื่อง sonicator แผ่นมัลติเวล UIP400MTP) และใส่ปลายเซ็นเซอร์อุณหภูมิลงในหลอดตัวอย่างใดหลอดหนึ่ง ผ่านหน้าจอสัมผัสสีดิจิตอลคุณสามารถตั้งค่าในเมนูของโปรเซสเซอร์อัลตราโซนิกช่วงอุณหภูมิเฉพาะสําหรับ sonication ตัวอย่างของคุณ เครื่องอัลตราโซนิกจะหยุดโดยอัตโนมัติเมื่อถึงอุณหภูมิสูงสุดและหยุดชั่วคราวจนกว่า samp อุณหภูมิจะลดลงเหลือค่าที่ต่ํากว่าของ∆อุณหภูมิที่ตั้งไว้ จากนั้นการ sonication จะเริ่มโดยอัตโนมัติอีกครั้ง คุณสมบัติอันชาญฉลาดนี้ป้องกันการเสื่อมสภาพที่เกิดจากความร้อน
2. เกี่ยวกับหน่วยอัลตราโซนิกหลายตัวอย่าง VialTweeter บล็อกไทเทเนียมซึ่งยึดหลอดตัวอย่างสามารถระบายความร้อนล่วงหน้าได้ ใส่บล็อก VialTweeter (เฉพาะ sonotrode ที่ไม่มีทรานสดิวเซอร์!) ลงในตู้เย็นหรือช่องแช่แข็งเพื่อทําให้บล็อกไททาเนียมเย็นลงก่อนจะช่วยเลื่อนอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นในตัวอย่าง ถ้าเป็นไปได้ ตัวอย่างเองก็สามารถระบายความร้อนล่วงหน้าได้เช่นกัน
3. ใช้อ่างน้ําแข็งหรือน้ําแข็งแห้งเพื่อทําให้เย็นในระหว่างการ sonication วางหลอดตัวอย่างของคุณในระหว่างการ sonication ลงในอ่างน้ําแข็ง สําหรับ VialTweeter ให้ใช้ถาดตื้นที่เต็มไปด้วยน้ําแข็งแห้ง แล้ววาง VialTweeter บนน้ําแข็งแห้งเพื่อให้ความร้อนกระจายไปอย่างรวดเร็ว

ลูกค้าทั่วโลกใช้เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบ Hielscher เช่นเดียวกับหน่วย sonication หลายตัวอย่าง VialTweeter และ UIP400MTP สําหรับงานเตรียมตัวอย่างประจําวันในห้องปฏิบัติการทางชีวภาพชีวเคมีทางการแพทย์และคลินิก ซอฟต์แวร์อัจฉริยะและการควบคุมอุณหภูมิของโปรเซสเซอร์ Hielscher ควบคุมอุณหภูมิได้อย่างน่าเชื่อถือและหลีกเลี่ยงการเสื่อมสภาพของตัวอย่างที่เกิดจากความร้อน การเตรียมตัวอย่างอัลตราโซนิกด้วยโซลูชั่นอัลตราโซนิกของ Hielscher ให้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้สูงและทําซ้ําได้!
อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับ sonication ปริมาณงานสูงโดยใช้ sonicator แบบหลายหลุม UIP400MTP สําหรับการทดสอบ!