การสกัดโปรตีนอัลตราโซนิกจากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อและเซลล์
- การสกัดโปรตีนเป็นขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างที่จําเป็นในโปรตีโอมิกส์
- โปรตีนสามารถสกัดได้จากเนื้อเยื่อพืชและสัตว์ยีสต์และจุลินทรีย์
- Sonication เป็นวิธีการสกัดโปรตีนที่เชื่อถือได้และมีประสิทธิภาพให้ผลผลิตโปรตีนสูงภายในเวลาสกัดอันสั้น
การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อและเซลล์
การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อและเซลล์ที่เพาะเลี้ยงเป็นขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างที่จําเป็นซึ่งดําเนินการในระหว่างเทคนิคทางชีวเคมีและการวิเคราะห์หลายอย่าง เช่น ELISA, PAGE, Western blotting, mass spectrometry หรือการทําให้โปรตีนบริสุทธิ์ การหยุดชะงักของเซลล์อัลตราโซนิกการสลายและการสกัดเป็นเทคนิคที่ควบคุมได้อย่างแม่นยําและไม่ใช้ความร้อนเพื่อให้แน่ใจว่าโปรตีนให้ผลผลิตสูง
การสกัดโปรตีนจากเซลล์ด้วย โพรบอัลตราโซนิก UP200St
- เร็ว
- ผลผลิตสูง
- ประสิทธิภาพสูง
- การควบคุมพารามิเตอร์ที่แม่นยํา
- ผลลัพธ์ที่ทําซ้ําได้
- ความสามารถในการปรับขนาดเชิงเส้น
คําแนะนําทั่วไปสําหรับการสกัดอัลตราโซนิกและการสกัดโปรตีน
- การควบคุมอุณหภูมิ: เพื่อให้แน่ใจว่าได้ผลผลิตโปรตีนสูงโดยไม่มีการเปลี่ยนสภาพด้วยความร้อนต้องควบคุมอุณหภูมิระหว่างการสกัด โฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกที่ล้ําสมัยของ Hielscher – เรียกอีกอย่างว่าเครื่องสลายอัลตราโซนิกหรืออัลตราโซนิฟา – สามารถควบคุมได้อย่างแม่นยํา พวกเขามาพร้อมกับเซ็นเซอร์อุณหภูมิแบบเสียบได้ ในตัวเลือกการตั้งค่าของ homogenizer อัลตราโซนิกสามารถตั้งค่าอุณหภูมิสูงสุดได้ เมื่อถึงอุณหภูมิสูงสุดนี้เครื่องอัลตราโซนิกจะหยุดโดยอัตโนมัติจนกว่าตัวอย่างจะเย็นลง
- กันชน: การเลือกบัฟเฟอร์ที่เหมาะสมและปริมาณบัฟเฟอร์ที่เหมาะสมจะแตกต่างกันไปในแต่ละเนื้อเยื่อ และต้องหาคําตอบโดยการทดสอบลองผิดลองถูก
- การแยก / การทําให้บริสุทธิ์: โปรตีนไลเสทอาจมีโมเลกุลชีวภาพส่วนเกิน เช่น DNA หรือคาร์โบไฮเดรต ซึ่งอาจถูกกําจัดออกโดยการตกตะกอนของโปรตีน (กรดดีออกซีโคเลต-ไตรคลอโรอะซิติก) หรือการแลกเปลี่ยนบัฟเฟอร์
Chittapalo และ Noomhorm (2009) รายงานในการศึกษาของพวกเขาว่าผลผลิตโปรตีนเพิ่มขึ้นโดยใช้ sonication และกระบวนการทําให้เนื้อเยื่ออัลตราโซนิกเป็นเนื้อเดียวกันและการสลายสามารถปรับปรุงกระบวนการสกัดที่มีอยู่ได้อย่างมีนัยสําคัญ – เปิดใช้งานโอกาสในการสกัดเชิงพาณิชย์ใหม่
อัลตราโซนิก CupHorn สําหรับการเตรียมตัวอย่างหลายตัวอย่างพร้อมกันและมีประสิทธิภาพสูงภายใต้สภาวะเดียวกันสําหรับการแยกโปรตีนและการกระจายตัวของ DNA
การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อสัตว์
สําหรับการเตรียมเนื้อเยื่อขนาดทั้งหมด (เช่น ไต หัวใจ ปอด กล้ามเนื้อ ฯลฯ) ควรผ่าเนื้อเยื่อออกเป็นชิ้นเล็กๆ ด้วยเครื่องมือที่สะอาด ควรใช้น้ําแข็ง และโดยเร็วที่สุดเพื่อป้องกันการย่อยสลายโดยโปรตีเอส (เช่น บัฟเฟอร์สไลซิส เช่น RIPA หรือบัฟเฟอร์สลายไฮโปโทนิกที่มีโปรตีเอสและค็อกเทลยับยั้งฟอสฟาเตส) หลังจากผ่าแล้ว ตัวอย่างจะถูกแช่ลงในไนโตรเจนเหลวเพื่อแช่แข็งแบบสแน็ป ตัวอย่างสามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -80°C เพื่อใช้ในภายหลังหรือเก็บไว้บนน้ําแข็งเพื่อการทําให้เป็นเนื้อเดียวกันทันที ทันทีก่อนการสกัดอัลตราโซนิกบัฟเฟอร์การสลายเย็น (พร้อมสารยับยั้งโปรตีเอส DTT, leupeptin และ aprotinin) จะถูกเติมลงในหลอดตัวอย่างอย่างรวดเร็ว (แนะนําให้ใช้บัฟเฟอร์ประมาณ ~600 μL ต่อเนื้อเยื่อ ~ 10 มก. แนะนําให้ใช้เนื้อเยื่อประมาณ 20-60 มก. ต่อหลอดตัวอย่าง
การทําให้เป็นเนื้อเดียวกันอัลตราโซนิกการสลายและการสกัดจะดําเนินการด้วยโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกเช่น UP100H หรือ UP200Ht พร้อมกับ sonotrode ไมโครทิป ระยะเวลา sonication คือ 60-90 วินาที ที่โหมดวงจรอัลตราโซนิก 15 วินาที sonication และ 10 วินาที เวลาพัก ตัวอย่างควรเก็บไว้ในน้ําแข็งตลอดเวลา
หลังจากการทําให้เป็นเนื้อเดียวกัน / การสกัดอัลตราโซนิกไลเสทจะถูกหมุนเหวี่ยงที่ 27,000 กรัมเป็นเวลาประมาณ 20 นาที หลังจากนั้น supernatent จะถูกรวบรวม เพื่อให้สามารถกําหนดความเข้มข้นของโปรตีนได้โดยการทดสอบโปรตีน เช่น การทดสอบโปรตีน Pierce BCA
การสกัดโปรตีนจากเซรั่มเลือด
สําหรับส่วนผสมที่เป็นเนื้อเดียวกันของซีรั่มและบัฟเฟอร์ฟอสเฟตตัวอย่างจะถูกกระแสน้ําวนก่อนการสลายเซลล์อัลตราโซนิก สําหรับการสลายอัลตราโซนิกตัวอย่างจะถูก sonicated ด้วยโฮโมจีไนเซอร์ในห้องปฏิบัติการอัลตราโซนิกเช่น UP100H เป็นเวลา 8 รอบที่แอมพลิจูด 20% สําหรับรอบของแต่ละ 5 วินาทีเปิดและปิด 15 วินาที การสกัดโปรตีนจะดําเนินการโดยการ sonicating เป็นรอบ (โหมดการเต้นเป็นจังหวะ) และโดยการวางตัวอย่างบนน้ําแข็งเพื่อหลีกเลี่ยงความร้อนสูงเกินไปและการเสื่อมสภาพทางความร้อนของตัวอย่าง เนื่องจากซีรั่มมีโปรตีนที่มีน้ําหนักโมเลกุลสูงจํานวนมาก (เช่น อัลบูมิน, α1-แอนติทริปซิน, ทรานสเฟอร์ริน, แฮปโตโกลบูลิน, อิมมูโนโกลบูลิน G และอิมมูโนโกลบูลิน A) ซึ่งรบกวนการแยกโปรตีนที่มีน้ําหนักโมเลกุลต่ําในระหว่าง IEF จึงแนะนําให้กําจัดโปรตีนเหล่านั้นออกจากซีรั่มโดยใช้คอลัมน์การพร่อง
การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อพืช
เนื้อเยื่อพืชที่สดและอ่อนนุ่มเช่นตะไคร่น้ํา ฯลฯ สามารถหยุดชะงักได้ง่ายเพียงแค่วางวัสดุตัวอย่างที่สับไว้ในบัฟเฟอร์การสลายเพื่อ sonication เนื้อเยื่อพืชที่เหนียวและเป็นของเหลว เช่น เมล็ด เข็มเฟอร์ ฯลฯ ควรบดให้แห้ง วัสดุไม้เนื้อแข็งบางชนิดต้องแช่แข็งและบดในไนโตรเจนเหลวก่อนที่จะสกัดโดยการ sonication สําหรับสารแขวนลอยการเพาะเลี้ยงเซลล์พืชการรักษาด้วยอัลตราโซนิกระหว่าง 30 ถึง 150 วินาทีในบัฟเฟอร์สไลซิสส่วนใหญ่ก็เพียงพอแล้ว วัสดุที่เหนียวกว่าเช่นเมล็ดฟักทองต้องการการ sonication ที่เข้มข้นมากขึ้นตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง
โปรโตคอลสําหรับการสกัดอัลตราโซนิกของอัลบูมินจากเมล็ดฟักทอง
สําหรับการสกัดโปรตีนอัลตราโซนิกของอัลบูมินจากผงเมล็ดฟักทองบดละเอียด ให้เติมผงเมล็ดฟักทองที่ขจัดไขมัน 10 กรัมและน้ําปราศจากไอออน 100 มล. เป็นตัวทําละลายในบีกเกอร์แก้ว 250 มล. การสกัดโปรตีนประกอบด้วยสองขั้นตอน: ขั้นแรกตัวอย่างจะถูก sonicated ด้วย เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบ UP400St (400W, 24kHz) ที่ติดตั้ง sonotrode S24d7 บีกเกอร์แก้วถูกวางไว้ในอ่างน้ําเย็นระหว่างการทําให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยอัลตราโซนิก เซ็นเซอร์อุณหภูมิแบบเสียบได้และการตั้งค่าการควบคุมอุณหภูมิของเครื่องอัลตราโซนิก UP400St ช่วยให้มั่นใจได้ว่าอุณหภูมิตัวอย่างจะต่ํากว่า 30 °C เสมอ โดยการควบคุมอุณหภูมิที่แม่นยําในระหว่างการ sonication จะหลีกเลี่ยงการเปลี่ยนสภาพของอัลบูมิน ประการที่สอง การสกัดทําด้วยเครื่องผสมที่ความเร็ว 200 รอบต่อนาทีและที่ 30°C หลังจากนั้นบีกเกอร์จะถูกถ่ายโอนไปยังเครื่องปั่นอุณหภูมิ โกลบูลินจะถูกกําจัดออกโดยการฟอกไตด้วยน้ํากลั่น หลังจากการกําจัดโกลบูลิน สารสกัดจากโปรตีนสามารถสุ่มตัวอย่างเพื่อกําหนดโปรไฟล์อัลบูมิน และต่อมาปรับเป็น pI=3.0 โดยใช้ 0.1 M HCl สําหรับการแข็งตัวของอัลบูมิน เฟสของแข็งถูกแยกออกจากกันโดยการหมุนเหวี่ยงที่อุณหภูมิ 5000g, 20°C และละลายในน้ําปราศจากไอออน การแข็งตัวของอัลบูมินจะดําเนินการสองครั้งเพื่อเพิ่มอัตราส่วนโปรตีนในสารสกัดเข้มข้นของอัลบูมิน
การสกัดโปรตีนอัลคาไลน์อัลตราโซนิกสําหรับการเตรียมโปรตีนเข้มข้นจากรําข้าวแสดงให้เห็นว่าการบําบัดด้วยอัลตราโซนิกส่งผลให้ผลผลิตโปรตีนสูงขึ้นในเวลาสกัดที่สั้นลงอย่างมีนัยสําคัญ – เมื่อเทียบกับวิธีการสกัดทั่วไป
โปรโตคอลการเตรียมตัวอย่างสําหรับเอนไซม์ iNOS ที่ใช้งานได้
เพื่อให้ได้เอนไซม์ iNOS ที่ทํางานได้อย่างสมบูรณ์ (เช่น สําหรับการคัดกรองยา) แนะนําให้ใช้โปรโตคอลต่อไปนี้: ควรวางสารแขวนลอยของเซลล์ไว้บนน้ําแข็งและทํา sonicated ด้วย UP100H ที่แอมพลิจูด 10μm ที่โหมดรอบ 5 วินาที sonication และ 25 วินาที พักบนน้ําแข็ง ควรทําซ้ําขั้นตอนประมาณ 3 ครั้ง เวลาพักระหว่างรอบการ sonication ช่วยลดอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นและจะช่วยลดความเสี่ยงของการเสื่อมสภาพ
การละลายโปรตีนอัลตราโซนิก
Sonication อาจเร่งกระบวนการละลายโปรตีนซึ่งมักจะใช้เวลาหลายชั่วโมง เพื่อไม่ให้ตัวอย่างร้อนเกินไปและป้องกันการย่อยสลายของโปรตีนและการดัดแปลงในสารละลายที่มียูเรียการระเบิดของอัลตราโซนิกไม่ควรนานกว่าสองสามวินาที
เครื่องอัลตราโซนิก UP200Ht ด้วยไมโครทิป S26d2 ขนาด 2 มม. สําหรับการ sonication ของตัวอย่างขนาดเล็ก
อุปกรณ์อัลตราโซนิกสําหรับการสกัดโปรตีน
Hielscher Ultrasonics นําเสนอความหลากหลายของโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกสําหรับการสลายตัวของเซลล์เนื้อเยื่อแบคทีเรียจุลินทรีย์ยีสต์และสปอร์
เครื่องอัลตราโซนิกในห้องปฏิบัติการ Hielscher มีประสิทธิภาพและใช้งานง่าย สร้างขึ้นสําหรับการทํางานตลอด 24 ชั่วโมงทุกวัน ได้รับการออกแบบให้เป็นอุปกรณ์ในห้องปฏิบัติการและแบบตั้งโต๊ะที่แข็งแกร่งและมีประสิทธิภาพ สําหรับอุปกรณ์ทั้งหมดสามารถควบคุมพลังงานและแอมพลิจูดได้อย่างแม่นยํา อุปกรณ์เสริมที่หลากหลายเปิดตัวเลือกการตั้งค่าเพิ่มเติม เครื่องอัลตราโซนิกดิจิตอลเช่น VialTweeter, UP200Ht, UP200St และ UP400St มีระบบควบคุมอุณหภูมิในตัวและการ์ด SD ในตัวสําหรับการบันทึกข้อมูลอัตโนมัติ
สําหรับการ sonication ทางอ้อมปราศจากการปนเปื้อนข้ามและพร้อมกันของตัวอย่างหลายตัวอย่างเรามี VialTweeter หรือ CupHorn อัลตราโซนิก
ตารางด้านล่างให้ภาพรวมเกี่ยวกับเครื่องอัลตราโซนิกของเราสําหรับการเตรียมตัวอย่างการหยุดชะงักของเซลล์และการสกัด คลิกที่ประเภทอุปกรณ์เพื่อรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกแต่ละตัว เจ้าหน้าที่ด้านเทคนิคที่ผ่านการฝึกอบรมมาเป็นอย่างดีและมีประสบการณ์มายาวนานของเรายินดีที่จะช่วยคุณเลือกเครื่องอัลตราโซนิกที่เหมาะสมที่สุดสําหรับการเตรียมตัวอย่างของคุณ!
| ปริมาณแบทช์ | อัตราการไหล | อุปกรณ์ที่แนะนํา |
|---|---|---|
| มากถึง 10 ขวดหรือหลอด | ไม่ | ไวอัลทวีตเตอร์ |
| แผ่นมัลติเวลล์ / ไมโครไทเตอร์ | ไม่ | UIP400MTP |
| หลายหลอด / ภาชนะ | ไม่ | คัพฮอร์น |
| 1 ถึง 500 มล. | 10 ถึง 200 มล. / นาที | UP100H |
| 10 ถึง 1000 มล. | 20 ถึง 200 มล. / นาที | UP200 ฮิต, UP200 เซนต์ |
| 10 ถึง 2000 มล. | 20 ถึง 400 มล. / นาที | UP400ST |
ขึ้นอยู่กับการใช้งาน วัสดุ และปริมาตรตัวอย่าง เราจะแนะนําการตั้งค่าที่เหมาะสมที่สุดสําหรับการเตรียมตัวอย่างของคุณ ติดต่อเราวันนี้!
ติดต่อเรา! / ถามเรา!
เครื่องอัลตราโซนิกดิจิตอล Hielscher มีรีโมทคอนโทรลของเบราว์เซอร์และโปรโตคอลข้อมูลอัตโนมัติบนการ์ด SD ในตัว
ไวอัลทวีตเตอร์ สําหรับการ sonication ทางอ้อม
ข้อเท็จจริงที่ควรค่าแก่การรู้
โปรตีโอมิกส์
โปรตีโอมิกส์เป็นสาขาการวิจัยที่ตรวจสอบโปรตีนและโปรตีโอม โปรตีนเติมเต็มฟังก์ชั่นที่สําคัญมากมายภายในสิ่งมีชีวิต โปรตีโอมคือโปรตีนทั้งชุดที่แสดงโดยจีโนม เซลล์ เนื้อเยื่อ หรือสิ่งมีชีวิตในช่วงเวลาหนึ่ง โปรตีโอมจะแตกต่างกันไปตามเวลาและความต้องการที่แตกต่างกันหรือความเครียดที่เซลล์หรือสิ่งมีชีวิตต้องเผชิญ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เป็นชุดของโปรตีนที่แสดงออกในเซลล์หรือสิ่งมีชีวิตประเภทหนึ่ง ณ เวลาที่กําหนดภายใต้เงื่อนไขที่กําหนด คํานี้เป็นการผสมผสานระหว่างโปรตีนและจีโนม โปรตีโอมิกส์คือการศึกษาโปรตีโอม
โปรตีน
โปรตีนเป็นโมเลกุลชีวภาพขนาดใหญ่ที่เรียกว่าโมเลกุลขนาดใหญ่ – ซึ่งประกอบด้วยสายยาวของกรดอะมิโนตกค้างอย่างน้อยหนึ่งสาย โปรตีนมีอยู่ในสิ่งมีชีวิตทั้งหมดที่มีต้นกําเนิดจากพืชและสัตว์ และมีความสําคัญต่อหน้าที่ทางชีวภาพส่วนใหญ่ เนื่องจากโปรตีนมีข้อมูลทางชีวภาพจํานวนมาก จึงถูกสกัดเพื่อวัตถุประสงค์ในการวิเคราะห์ เช่น เพื่อการวิจัยโปรตีโอมิก หน้าที่ที่สําคัญที่สุดที่ดําเนินการโดยโปรตีน ได้แก่ การเร่งปฏิกิริยาการเผาผลาญการจําลองแบบดีเอ็นเอการตอบสนองต่อสิ่งเร้าและการขนส่งโมเลกุลจากที่หนึ่งไปยังอีกที่หนึ่ง โปรตีนแตกต่างกันเป็นหลักในลําดับของกรดอะมิโนซึ่งถูกกําหนดโดยลําดับนิวคลีโอไทด์ของยีนและมักจะส่งผลให้โปรตีนพับเป็นโครงสร้างสามมิติเฉพาะที่กําหนดกิจกรรมของมัน โปรตีนคือ – นอกจากเปปไทด์ – หนึ่งในองค์ประกอบสําคัญของอาหาร ดังนั้นโปรตีโอมิกส์จึงเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพในวิทยาศาสตร์การอาหารเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพกระบวนการความปลอดภัยของอาหารและการประเมินทางโภชนาการ
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction เป็นขั้นตอนก่อนการวิเคราะห์เพื่อแยกและแยกสารวิเคราะห์ล่วงหน้า เมื่อใช้ร่วมกับอัลตราโซนิกการสกัดจุดเมฆสามารถเพิ่มความเข้มข้นขึ้นทําให้กระบวนการมีประสิทธิภาพเร็วขึ้นและเป็นมิตรกับสิ่งแวดล้อมมากขึ้น ด้วยอัลตราโซนิกการสกัดจุดเมฆเป็นวิธีการเตรียมสารวิเคราะห์ที่มีประสิทธิภาพมากกว่าอย่างมีนัยสําคัญ อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับการสกัดจุดคลาวด์ด้วยอัลตราโซนิก!เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส
อิเล็กโทรโฟรีซิสเจลเป็นวิธีหลักในการแยกและวิเคราะห์โมเลกุลขนาดใหญ่ เช่น DNA, RNA และโปรตีน ตลอดจนชิ้นส่วนของโมเลกุลเหล่านี้ โดยพิจารณาจากขนาดและประจุ ใช้ในเคมีทางคลินิกเพื่อแยกโปรตีนตามประจุและ/หรือขนาด (IEF อะกาโรส โดยพื้นฐานแล้วไม่ขึ้นกับขนาด) และในชีวเคมี ชีววิทยาโมเลกุล และโปรตีโอมิกส์เพื่อแยกประชากรผสมของชิ้นส่วน DNA และ RNA ตามความยาว เพื่อประเมินขนาดของชิ้นส่วน DNA และ RNA หรือเพื่อแยกโปรตีนตามประจุ
การเพาะเลี้ยงเซลล์
การเพาะเลี้ยงเซลล์เป็นกระบวนการเจริญเติบโตที่มีการควบคุมซึ่งเซลล์ได้รับการเพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะที่มีการควบคุม สภาวะการเพาะเลี้ยงเซลล์จะแตกต่างกันไปในแต่ละประเภท โดยทั่วไปสภาพแวดล้อมของการเพาะเลี้ยงเซลล์ประกอบด้วยภาชนะที่เหมาะสม (เช่นจานเพาะเชื้อ) ที่มีสารตั้งต้นหรือสื่อที่ให้สารอาหารที่จําเป็น (กรดอะมิโนคาร์โบไฮเดรตวิตามินแร่ธาตุ)2, O2) และควบคุมสภาพแวดล้อมทางกายภาพและเคมี (บัฟเฟอร์ pH, ความดันออสโมติก, อุณหภูมิ) เซลล์ส่วนใหญ่ต้องการพื้นผิวหรือสารตั้งต้นเทียมในขณะที่การเพาะเลี้ยงเซลล์อื่น ๆ สามารถเพาะเลี้ยงได้อย่างอิสระลอยอยู่ในอาหารเลี้ยงเชื้อ (การเพาะเลี้ยงแขวนลอย, สารแขวนลอยของเซลล์)
การเพาะเลี้ยงเซลล์สัตว์จํานวนมากถูกนํามาใช้ในการผลิตวัคซีนไวรัสและผลิตภัณฑ์ที่ได้จากเทคโนโลยีชีวภาพอื่น ๆ ในอุตสาหกรรม สเต็มเซลล์ของมนุษย์ได้รับการเพาะเลี้ยงเพื่อเพิ่มจํานวนเซลล์และแยกเซลล์ออกเป็นเซลล์โซมาติกประเภทต่างๆ เพื่อวัตถุประสงค์ในการปลูกถ่าย
ตัวอย่างเนื้อเยื่อ
คําว่าเนื้อเยื่ออธิบายถึงตัวกลางของเซลล์ ซึ่งวัสดุของเซลล์อยู่ในระดับองค์กรระหว่างเซลล์และอวัยวะที่สมบูรณ์ ในเนื้อเยื่อเซลล์ที่คล้ายคลึงกันจากแหล่งกําเนิดเดียวกันซึ่งร่วมกันทําหน้าที่เฉพาะจะถูกประกอบเข้าด้วยกัน โดยการจัดกลุ่มการทํางานของเนื้อเยื่อหลาย ๆ เซลล์โครงสร้างที่ซับซ้อนของอวัยวะจะก่อตัวขึ้น
เนื้อเยื่อถูกสุ่มตัวอย่างเพื่อการวิจัยด้านชีววิทยา เนื้อเยื่อวิทยา / จุลพยาธิวิทยาปรสิตวิทยาชีวเคมีอิมมูโนฮิสโตเคมีตลอดจนการเพาะปลูกและสกัดดีเอ็นเอ สามารถแยกแยะได้ระหว่างสัตว์ (การแบ่งย่อย: เนื้อเยื่อสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม) และเนื้อเยื่อพืช เนื้อเยื่อของสัตว์แบ่งออกเป็นสี่ประเภทพื้นฐาน ได้แก่ เนื้อเยื่อเกี่ยวพัน กล้ามเนื้อ ประสาท และเยื่อบุผิว เนื้อเยื่อพืชแบ่งออกเป็นสามระบบเนื้อเยื่อต่อไปนี้ ได้แก่ หนังกําพร้า เนื้อเยื่อพื้นดิน และเนื้อเยื่อหลอดเลือด
ตัวอย่างเนื้อเยื่อสามารถเตรียมได้จากส่วนต่างๆ ของสัตว์หรือพืช เช่น กระดูก กล้ามเนื้อ ใบไม้ เป็นต้น
ของเหลวในร่างกาย
เลือด เซรั่ม พลาสมา น้ําไขสันหลัง น้ําลาย และน้ําไขข้อเป็นของเหลวในร่างกาย ซึ่งเป็นแหล่งข้อมูลที่เกี่ยวข้องกับการวินิจฉัยที่ดี ดังนั้นการเตรียมตัวอย่างของเหลวในร่างกายที่ซับซ้อนสําหรับการวิเคราะห์จึงเป็นสิ่งสําคัญ ความยากลําบากประการแรกเกี่ยวข้องกับช่วงไดนามิกที่กว้างของส่วนประกอบที่มีอยู่ในของเหลวในร่างกาย
การกําหนดความเข้มข้นของโปรตีน
การทดสอบแบรดฟอร์ด การทดสอบ Lowry และการทดสอบกรดไบซินโคนินิก (BCA) เป็นการทดสอบทั่วไปเพื่อกําหนดความเข้มข้นของโปรตีน อัลบูมินในซีรั่มวัว (BSA) เป็นหนึ่งในโปรตีนมาตรฐานที่ใช้บ่อยที่สุด
บัฟเฟอร์ lysis
ต้องเลือกบัฟเฟอร์ Lysis ตามวัสดุของเซลล์หรือเนื้อเยื่อ (การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ พืช แบคทีเรีย เชื้อรา ฯลฯ) และเซลล์อยู่ในโครงสร้างและประเภทของโครงสร้างหรือไม่ บัฟเฟอร์สไลซิสที่หลากหลายสําหรับการสกัดโปรตีน เมมเบรน และออร์แกเนลล์มีส่วนผสมของผงซักฟอกอย่างน้อยหนึ่งชนิด ผงซักฟอกมักจะถูกเลือกผ่านการทดสอบลองผิดลองถูกหรือ – ถ้ามี – ตามโปรโตคอลการสกัดโปรตีนที่มีอยู่ ผงซักฟอกต้องเข้ากันได้กับแหล่งเนื้อเยื่อและโปรตีน โดยทั่วไปผงซักฟอกที่อ่อนโยนที่สุดที่ใช้ได้กับเนื้อเยื่อ / โปรตีนเฉพาะจะถูกเลือกเพื่อรักษาการทํางานสูงสุดของสารสกัด นอกจากนี้ในกรณีของการสกัดเยื่อหุ้มและออร์แกเนลล์ผงซักฟอกอ่อน ๆ จะช่วยให้เมมเบรนไม่บุบสลาย ผงซักฟอกที่ใช้กันทั่วไปในบัฟเฟอร์สไลซิสส่วนใหญ่เป็นแบบไม่มีไอออนิกหรือซิวิทเทอริกนิก เช่น CHAPS, deoxycholate, Triton™ X-100, NP40 และ Tween 20
ตัวอย่างเช่น เนื้อเยื่อต่างๆ เช่น สมอง ตับ ลําไส้ ไต ม้าม ฯลฯ สามารถบัฟเฟอร์ด้วย RIPA ได้ – อย่างไรก็ตาม ควรรวมสารยับยั้งโปรตีเอสและ DTT (เช่น สําหรับอิเล็กโทรโฟรีซิสเจล)
บัฟเฟอร์การสลายสําหรับเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อโครงร่าง (เย็นจัด): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) กลีเซอรอล, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol เสริมด้วยโปรตีเอสและค็อกเทลยับยั้งฟอสฟาเตส
ตารางบัฟเฟอร์ทั่วไปและช่วง pH โดยทั่วไป บัฟเฟอร์เหล่านี้จะใช้ที่ความเข้มข้น 20-50 mM
| กันชน | ช่วง pH |
|---|---|
| กรดมะนาว – นาโอ | 2.2 – 6.5 |
| โซเดียมซิเตรต – กรดมะนาว | 3.0 – 6.2 |
| โซเดียมอะซิเตท – กรดน้ําส้ม | 3.6 – 5.6 |
| เกลือโซเดียมกรด Cacodylic – เอชซีแอล | 5.0 – 7.4 |
| MES – นาโอ | 5.6 – 6.8 |
| โซเดียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต – ไดโซเดียมไฮโดรเจนฟอสเฟต | 5.8 – 8.0 |
| อิมิดาโซล – เอชซีแอล | 6.2 – 7.8 |
| ไม้ถูพื้น – เกาะ | 6.6 – 7.8 |
| ไตรเอทาโนลามีนไฮโดรคลอไรด์ – นาโอ | 6.8 – 8.8 |
| ทริส – เอชซีแอล | 7.0 – 9.0 |
| เฮเปส – นาโอ | 7.2 – 8.2 |
| ไตรซีน – นาโอ | 7.6 – 8.6 |
| โซเดียมเตตระบอเรต – กรดบอริก | 7.6 – 9.2 |
| ไบซีน – นาโอ | 7.7 – 8.9 |
| ไกลซีน – นาโอ | 8.6 – 10.6 |
บัฟเฟอร์ส่วนใหญ่แสดงการพึ่งพาค่า pH กับอุณหภูมิ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสําหรับบัฟเฟอร์ Tris pKa เปลี่ยนจาก 8.06 ที่ 25°C เป็น 8.85 ที่ 0°C
(pH และ pKa ของบัฟเฟอร์: pH วัดความเข้มข้นของไฮโดรเจนไอออนในสารละลายที่เป็นน้ํา pKa (= ค่าคงที่การแยกตัวของกรด) เป็นมาตรการที่เกี่ยวข้อง แต่เฉพาะเจาะจงกว่า ซึ่งช่วยในการคาดการณ์ว่าโมเลกุลจะทําหน้าที่อย่างไรที่ค่า pH ที่เฉพาะเจาะจง)
ทริโซล
TRIzol เป็นสารละลายทางเคมีที่ใช้ในการสกัด RNA/DNA/โปรตีนระหว่างการสกัดกัวนิดินเนียมไทโอไซยาเนต-ฟีนอล-คลอโรฟอร์ม การใช้การสกัด TRIzol ด้วยอัลตราโซนิกช่วยส่งผลให้มีผลผลิต DNA, RNA และโปรตีนสูงจากตัวอย่างเดียวกัน และมีประสิทธิภาพในการสกัดอื่นๆ
วรรณกรรม/อ้างอิง
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.