การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อและเซลล์เพาะเลี้ยงด้วยอัลตราโซนิก
- การสกัดโปรตีนเป็นขั้นตอนสำคัญในการเตรียมตัวอย่างสำหรับโปรตีโอมิกส์
- โปรตีนสามารถสกัดได้จากเนื้อเยื่อพืชและสัตว์ ยีสต์ และจุลินทรีย์
- การใช้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นวิธีสกัดโปรตีนที่เชื่อถือได้และมีประสิทธิภาพ ให้ผลผลิตโปรตีนสูงภายในระยะเวลาสกัดสั้น
การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อและเซลล์
การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อและเซลล์เพาะเลี้ยงเป็นขั้นตอนสำคัญในการเตรียมตัวอย่าง ซึ่งดำเนินการในเทคนิคทางชีวเคมีและการวิเคราะห์หลายชนิด เช่น ELISA, PAGE, เวสเทิร์นบลอตติง แมสสเปกโทรเมทรี หรือการทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ การทำให้เซลล์แตก การสลายเซลล์ และการสกัดด้วยอัลตราโซนิกเป็นเทคนิคที่ไม่ใช้ความร้อนและควบคุมได้อย่างแม่นยำ เพื่อให้ได้ผลผลิตโปรตีนสูง
การสกัดโปรตีนจากเซลล์ด้วย โพรบอัลตราโซนิก UP200St
- รวดเร็ว
- ให้ผลผลิตสูง
- มีประสิทธิภาพสูง
- ควบคุมพารามิเตอร์ได้อย่างแม่นยำ
- ให้ผลลัพธ์ที่ทำซ้ำได้
- ขยายขนาดได้แบบเชิงเส้น
คำแนะนำทั่วไปสำหรับการสลายเซลล์และการสกัดโปรตีนด้วยอัลตราโซนิก
- การควบคุมอุณหภูมิ: เพื่อให้ได้ผลผลิตโปรตีนสูงโดยไม่เกิดการเสียสภาพจากความร้อน ต้องควบคุมอุณหภูมิระหว่างการสกัด เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกอันทันสมัยของ Hielscher – เรียกอีกอย่างว่าเครื่องทำให้แตกตัวด้วยอัลตราโซนิกหรือเครื่องให้คลื่นอัลตราโซนิก – สามารถควบคุมได้อย่างแม่นยำ เครื่องมาพร้อมกับเซนเซอร์วัดอุณหภูมิแบบเสียบต่อได้ สามารถกำหนดอุณหภูมิสูงสุดได้ในตัวเลือกการตั้งค่าของเครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิก เมื่อถึงอุณหภูมิสูงสุดนี้ เครื่องอัลตราโซนิกจะหยุดโดยอัตโนมัติจนกว่าตัวอย่างจะเย็นลง
- บัฟเฟอร์: การเลือกบัฟเฟอร์ที่เหมาะสมและปริมาตรบัฟเฟอร์ที่ถูกต้องแตกต่างกันไปตามชนิดของเนื้อเยื่อ และต้องหาค่าที่เหมาะสมด้วยการทดสอบแบบลองผิดลองถูก
- การแยก / การทำให้บริสุทธิ์: สารละลายโปรตีนที่ได้จากการสลายเซลล์อาจมีชีวโมเลกุล เช่น DNA หรือคาร์โบไฮเดรต ในปริมาณมากเกินไป ซึ่งอาจกำจัดได้ด้วยการตกตะกอนโปรตีน (deoxycholate-trichloroacetic acid) หรือการเปลี่ยนบัฟเฟอร์
Chittapalo และ Noomhorm (2009) รายงานในการศึกษาว่าการใช้คลื่นอัลตราโซนิกทำให้ผลผลิตโปรตีนเพิ่มขึ้น และกระบวนการทำเนื้อเยื่อให้เป็นเนื้อเดียวกันและการสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกสามารถปรับปรุงกระบวนการสกัดที่มีอยู่ได้อย่างมาก – เปิดโอกาสใหม่สำหรับการสกัดเชิงพาณิชย์
CupHorn อัลตราโซนิก สำหรับการเตรียมตัวอย่างหลายตัวอย่างพร้อมกันภายใต้สภาวะเดียวกันอย่างมีประสิทธิผลสูง เพื่อแยกโปรตีนและทำให้ DNA แตกเป็นชิ้นส่วน
การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อสัตว์
สำหรับการเตรียมเนื้อเยื่อทั้งชิ้น (เช่น ไต หัวใจ ปอด กล้ามเนื้อ ฯลฯ) ควรตัดเนื้อเยื่อเป็นชิ้นเล็กมากด้วยเครื่องมือสะอาด โดยควรทำบนน้ำแข็งและทำให้เร็วที่สุดเท่าที่เป็นไปได้ เพื่อป้องกันการย่อยสลายโดยโปรตีเอส (เช่น บัฟเฟอร์สลายเซลล์อย่าง RIPA หรือบัฟเฟอร์สลายเซลล์ชนิดไฮโปโทนิกที่มีส่วนผสมของสารยับยั้งโปรตีเอสและฟอสฟาเทส) หลังการตัด ให้นำตัวอย่างจุ่มลงในไนโตรเจนเหลวเพื่อแช่แข็งอย่างฉับพลัน สามารถเก็บตัวอย่างไว้ที่ -80°C เพื่อใช้ภายหลัง หรือเก็บไว้บนน้ำแข็งเพื่อทำให้เป็นเนื้อเดียวกันทันที ก่อนการสกัดด้วยอัลตราโซนิก ให้เติมบัฟเฟอร์สลายเซลล์ที่เย็นจัดด้วยน้ำแข็ง (ซึ่งมีสารยับยั้งโปรตีเอส DTT, leupeptin และ aprotinin) ลงในหลอดตัวอย่างอย่างรวดเร็วทันที (แนะนำให้ใช้บัฟเฟอร์ประมาณ ~600 μL ต่อเนื้อเยื่อ ~10 mg) แนะนำให้ใช้เนื้อเยื่อประมาณ 20–60mg ต่อหลอดตัวอย่าง
การทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน การสลายเซลล์ และการสกัดด้วยอัลตราโซนิกดำเนินการด้วยเครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิก เช่น UP100H หรือ UP200Ht ที่ติดตั้งโซโนโทรดปลายขนาดเล็ก ระยะเวลาการใช้คลื่นอัลตราโซนิกคือ 60–90 วินาที ในโหมดเป็นรอบ โดยให้คลื่นอัลตราโซนิก 15 วินาที และพัก 10 วินาที ควรเก็บตัวอย่างไว้ในน้ำแข็งตลอดเวลา
หลังการทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน / การสกัดด้วยอัลตราโซนิก ให้นำสารที่ได้จากการสลายเซลล์ไปปั่นเหวี่ยงที่ 27,000g เป็นเวลาประมาณ 20 นาที จากนั้นเก็บของเหลวส่วนใสเหนือตะกอน เพื่อวัดความเข้มข้นของโปรตีนด้วยวิธีทดสอบโปรตีน เช่น การทดสอบโปรตีน BCA ของ Pierce
การสกัดโปรตีนจากซีรัมในเลือด
เพื่อให้ซีรัมและบัฟเฟอร์ฟอสเฟตผสมเป็นเนื้อเดียวกัน ให้ผสมตัวอย่างด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์ก่อนการสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิก สำหรับการสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิก ให้ใช้เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกสำหรับห้องปฏิบัติการ เช่น UP100H ให้คลื่นอัลตราโซนิกแก่ตัวอย่าง 8 รอบ ที่แอมพลิจูด 20% โดยแต่ละรอบเปิด 5 วินาที และปิด 15 วินาที การสกัดโปรตีนดำเนินการโดยให้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นรอบ (โหมดพัลส์) และวางตัวอย่างบนน้ำแข็งเพื่อหลีกเลี่ยงความร้อนสูงเกินไปและการเสื่อมสลายของตัวอย่างจากความร้อน เนื่องจากซีรัมมีโปรตีนมวลโมเลกุลสูงจำนวนมาก (เช่น อัลบูมิน, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, อิมมูโนโกลบูลิน G และอิมมูโนโกลบูลิน A) ซึ่งรบกวนการแยกโปรตีนมวลโมเลกุลต่ำระหว่าง IEF จึงแนะนำให้กำจัดโปรตีนเหล่านี้ออกจากซีรัมโดยใช้คอลัมน์กำจัดโปรตีน
การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อพืช
เนื้อเยื่อพืชสดที่อ่อนนุ่ม เช่น มอส ฯลฯ สามารถทำให้แตกได้ง่าย เพียงใส่วัสดุตัวอย่างที่สับแล้วลงในบัฟเฟอร์สลายเซลล์เพื่อให้คลื่นอัลตราโซนิก เนื้อเยื่อพืชที่เหนียวและมีลิกนิน เช่น เมล็ด ใบรูปเข็มของต้นเฟอร์ ฯลฯ ควรบดในสภาพแห้ง วัสดุพืชบางชนิดที่แข็งและมีเนื้อไม้ต้องแช่แข็งและบดในไนโตรเจนเหลวก่อนสกัดด้วยคลื่นอัลตราโซนิก สำหรับสารแขวนลอยเซลล์พืชเพาะเลี้ยง การให้คลื่นอัลตราโซนิกในบัฟเฟอร์สลายเซลล์เป็นเวลา 30 ถึง 150 วินาทีมักเพียงพอ วัสดุที่เหนียวกว่า เช่น เมล็ดฟักทอง ต้องใช้คลื่นอัลตราโซนิกที่เข้มข้นกว่า ดังอธิบายด้านล่าง
ขั้นตอนการสกัดอัลบูมินจากเมล็ดฟักทองด้วยอัลตราโซนิก
สำหรับการสกัดโปรตีนอัลบูมินจากผงเมล็ดฟักทองบดละเอียดด้วยอัลตราโซนิก ให้เติมผงเมล็ดฟักทองที่ขจัดไขมันแล้ว 10 g และน้ำปราศจากไอออน 100 mL ซึ่งใช้เป็นตัวทำละลาย ลงในบีกเกอร์แก้วขนาด 250mL การสกัดโปรตีนประกอบด้วยสองขั้นตอน ขั้นแรก ให้คลื่นอัลตราโซนิกแก่ตัวอย่างด้วย เครื่องอัลตราโซนิกแบบโพรบ UP400St (400W, 24kHz) ที่ติดตั้งโซโนโทรด S24d7 วางบีกเกอร์แก้วในอ่างน้ำเย็นระหว่างการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยอัลตราโซนิก เซนเซอร์วัดอุณหภูมิแบบเสียบต่อได้และการตั้งค่าควบคุมอุณหภูมิของเครื่องอัลตราโซนิก UP400St ช่วยให้มั่นใจว่าอุณหภูมิตัวอย่างจะคงอยู่ต่ำกว่า 30°C เสมอ การควบคุมอุณหภูมิอย่างแม่นยำระหว่างการให้คลื่นอัลตราโซนิกช่วยหลีกเลี่ยงการเสียสภาพของอัลบูมิน ขั้นที่สอง ดำเนินการสกัดด้วยเครื่องผสมที่ความเร็ว 200 rpm และอุณหภูมิ 30°C จากนั้นย้ายบีกเกอร์ไปยังเครื่องเขย่าควบคุมอุณหภูมิ กำจัดโกลบูลินด้วยการไดอะไลซิสกับน้ำกลั่น หลังจากกำจัดโกลบูลินแล้ว สามารถเก็บตัวอย่างสารสกัดโปรตีนเพื่อตรวจสอบรูปแบบของอัลบูมิน และจากนั้นปรับให้เป็น pI=3.0 โดยใช้ 0.1 M HCl เพื่อทำให้อัลบูมินจับตัว แยกส่วนของแข็งด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ 5000g, 20°C และละลายใหม่ในน้ำปราศจากไอออน ดำเนินการทำให้อัลบูมินจับตัวสองครั้ง เพื่อเพิ่มสัดส่วนโปรตีนในอัลบูมินเข้มข้น
การสกัดโปรตีนด้วยด่างร่วมกับอัลตราโซนิกเพื่อเตรียมโปรตีนเข้มข้นจากรำข้าวแสดงให้เห็นว่า การใช้อัลตราโซนิกให้ผลผลิตโปรตีนสูงกว่าในระยะเวลาสกัดที่สั้นกว่าอย่างมาก – เมื่อเทียบกับวิธีสกัดแบบดั้งเดิม
ขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างสำหรับเอนไซม์ iNOS ที่ทำงานได้
เพื่อให้ได้เอนไซม์ iNOS ที่ทำงานได้อย่างสมบูรณ์ (เช่น สำหรับการคัดกรองยา) แนะนำขั้นตอนต่อไปนี้: ควรวางสารแขวนลอยเซลล์บนน้ำแข็งและให้คลื่นอัลตราโซนิกด้วย UP100H ที่แอมพลิจูด 10µm ในโหมดเป็นรอบ โดยให้คลื่นอัลตราโซนิก 5 วินาที และพักบนน้ำแข็ง 25 วินาที ควรทำขั้นตอนนี้ซ้ำประมาณ 3 ครั้ง ช่วงพักระหว่างรอบการให้คลื่นอัลตราโซนิกช่วยลดการเพิ่มขึ้นของอุณหภูมิ จึงช่วยลดความเสี่ยงของการเสียสภาพ
การทำให้โปรตีนละลายด้วยอัลตราโซนิก
การใช้คลื่นอัลตราโซนิกอาจเร่งกระบวนการทำให้โปรตีนละลาย ซึ่งปกติต้องใช้เวลาหลายชั่วโมง เพื่อไม่ให้ตัวอย่างร้อนเกินไปและป้องกันการเสื่อมสลายและการดัดแปรของโปรตีนในสารละลายที่มียูเรีย การให้คลื่นอัลตราโซนิกแต่ละช่วงไม่ควรนานเกินไม่กี่วินาที
เครื่องอัลตราโซนิก UP200Ht พร้อมปลายขนาดเล็ก S26d2 ขนาด 2mm สำหรับการให้คลื่นอัลตราโซนิกแก่ตัวอย่างขนาดเล็ก
อุปกรณ์อัลตราโซนิกสำหรับการสกัดโปรตีน
Hielscher Ultrasonics มีเครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกหลากหลายรุ่นสำหรับการทำให้เซลล์ เนื้อเยื่อ แบคทีเรีย จุลินทรีย์ ยีสต์ และสปอร์แตกตัว
เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับห้องปฏิบัติการของ Hielscher มีกำลังสูงและใช้งานง่าย ผลิตขึ้นสำหรับการทำงาน 24/7 โดยออกแบบให้เป็นอุปกรณ์สำหรับห้องปฏิบัติการและตั้งโต๊ะที่ทนทานและมีประสิทธิภาพ อุปกรณ์ทุกรุ่นสามารถควบคุมพลังงานขาออกและแอมพลิจูดได้อย่างแม่นยำ อุปกรณ์เสริมที่หลากหลายเพิ่มทางเลือกในการจัดชุดอุปกรณ์ เครื่องอัลตราโซนิกดิจิทัล เช่น VialTweeter, UP200Ht, UP200St และ UP400St มีระบบควบคุมอุณหภูมิในตัวและการ์ด SD ในตัวสำหรับบันทึกข้อมูลโดยอัตโนมัติ
สำหรับการให้คลื่นอัลตราโซนิกทางอ้อมแก่หลายตัวอย่างพร้อมกันโดยไม่มีการปนเปื้อนข้าม เรามี VialTweeter หรือ CupHorn อัลตราโซนิก
ตารางด้านล่างแสดงภาพรวมของเครื่องอัลตราโซนิกของเราสำหรับการเตรียมตัวอย่าง การทำให้เซลล์แตก และการสกัด คลิกที่รุ่นอุปกรณ์เพื่อดูข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับเครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกแต่ละรุ่น เจ้าหน้าที่ฝ่ายเทคนิคของเราซึ่งผ่านการฝึกอบรมอย่างดีและมีประสบการณ์ยาวนานยินดีช่วยคุณเลือกเครื่องอัลตราโซนิกที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการเตรียมตัวอย่างของคุณ!
| ปริมาตรต่อรุ่นการผลิต | อัตราการไหล | อุปกรณ์ที่แนะนำ |
|---|---|---|
| ขวดไวแอลหรือหลอดสูงสุด 10 ใบ | ไม่เกี่ยวข้อง | VialTweeter |
| เพลตหลายหลุม / เพลตไมโครไทเทอร์ | ไม่เกี่ยวข้อง | UIP400MTP |
| หลอด / ภาชนะหลายใบ | ไม่เกี่ยวข้อง | CupHorn |
| 1 ถึง 500mL | 10 ถึง 200mL/min | UP100H |
| 10 ถึง 1000mL | 20 ถึง 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 ถึง 2000mL | 20 ถึง 400mL/min | UP400St |
เราจะแนะนำชุดอุปกรณ์ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการเตรียมตัวอย่างของคุณ โดยพิจารณาจากการใช้งาน วัสดุ และปริมาตรตัวอย่าง ติดต่อเราวันนี้!
ติดต่อเรา! / สอบถามเรา!
เครื่องอัลตราโซนิกดิจิทัลของ Hielscher มีระบบควบคุมระยะไกลผ่านเบราว์เซอร์และบันทึกข้อมูลโดยอัตโนมัติลงในการ์ด SD ในตัว
VialTweeter สำหรับการให้คลื่นอัลตราโซนิกทางอ้อม
ข้อเท็จจริงที่ควรรู้
โปรตีโอมิกส์
โปรตีโอมิกส์เป็นสาขาการวิจัยที่ศึกษาโปรตีนและโปรตีโอม โปรตีนทำหน้าที่สำคัญต่อชีวิตอย่างหลากหลายภายในสิ่งมีชีวิต โปรตีโอมคือชุดโปรตีนทั้งหมดที่แสดงออกโดยจีโนม เซลล์ เนื้อเยื่อ หรือสิ่งมีชีวิต ณ เวลาหนึ่ง โปรตีโอมเปลี่ยนแปลงไปตามเวลาและความต้องการเฉพาะหรือความเครียดที่เซลล์หรือสิ่งมีชีวิตเผชิญ กล่าวให้เฉพาะเจาะจงยิ่งขึ้น โปรตีโอมคือชุดโปรตีนที่แสดงออกในเซลล์หรือสิ่งมีชีวิตชนิดหนึ่ง ณ เวลาหนึ่ง ภายใต้สภาวะที่กำหนด คำนี้เกิดจากการผสมคำว่าโปรตีนและจีโนม โปรตีโอมิกส์คือการศึกษาโปรตีโอม
โปรตีน
โปรตีนเป็นชีวโมเลกุลขนาดใหญ่ที่เรียกว่าโมเลกุลมหภาค – ซึ่งประกอบด้วยสายยาวของกรดอะมิโนที่เชื่อมต่อกันหนึ่งสายหรือมากกว่า โปรตีนพบในสิ่งมีชีวิตทุกชนิดทั้งพืชและสัตว์ และมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อหน้าที่ทางชีวภาพส่วนใหญ่ เนื่องจากโปรตีนมีข้อมูลทางชีวภาพจำนวนมาก จึงมีการสกัดโปรตีนเพื่อการวิเคราะห์ เช่น การวิจัยด้านโปรตีโอมิกส์ หน้าที่สำคัญที่สุดของโปรตีน ได้แก่ การเร่งปฏิกิริยาเมแทบอลิซึม การจำลอง DNA การตอบสนองต่อสิ่งเร้า และการขนส่งโมเลกุลจากตำแหน่งหนึ่งไปยังอีกตำแหน่งหนึ่ง โปรตีนแตกต่างกันเป็นหลักที่ลำดับกรดอะมิโน ซึ่งกำหนดโดยลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน และโดยทั่วไปทำให้โปรตีนพับเป็นโครงสร้างสามมิติเฉพาะที่กำหนดการทำงานของโปรตีนนั้น โปรตีน – นอกเหนือจากเปปไทด์ – เป็นองค์ประกอบสำคัญอย่างหนึ่งของอาหาร ดังนั้น โปรตีโอมิกส์จึงเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสูงในวิทยาศาสตร์การอาหารสำหรับการปรับกระบวนการ ความปลอดภัยของอาหาร และการประเมินคุณค่าทางโภชนาการให้เหมาะสมที่สุด
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction เป็นขั้นตอนก่อนการวิเคราะห์เพื่อแยกและเพิ่มความเข้มข้นของสารที่ต้องการวิเคราะห์ เมื่อใช้ร่วมกับอัลตราโซนิก การสกัดที่จุดขุ่นสามารถเพิ่มความเข้มข้นของกระบวนการได้ ทำให้กระบวนการมีประสิทธิภาพมากขึ้น เร็วขึ้น และเป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อมมากขึ้น เมื่อใช้อัลตราโซนิก การสกัดที่จุดขุ่นจะเป็นวิธีเตรียมสารที่ต้องการวิเคราะห์ที่มีประสิทธิภาพสูงขึ้นอย่างมาก อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับการสกัดที่จุดขุ่นโดยใช้อัลตราโซนิกช่วย!
เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส
เจลอิเล็กโทรโฟรีซิสเป็นวิธีหลักในการแยกและวิเคราะห์โมเลกุลมหภาค เช่น DNA, RNA และโปรตีน รวมถึงชิ้นส่วนของโมเลกุลเหล่านี้ โดยอาศัยขนาดและประจุ วิธีนี้ใช้ในเคมีคลินิกเพื่อแยกโปรตีนตามประจุและ/หรือขนาด (IEF ในอะกาโรส ซึ่งโดยหลักแล้วไม่ขึ้นกับขนาด) และใช้ในชีวเคมี ชีววิทยาระดับโมเลกุล และโปรตีโอมิกส์ เพื่อแยกกลุ่มชิ้นส่วน DNA และ RNA ที่ผสมกันตามความยาว ประเมินขนาดของชิ้นส่วน DNA และ RNA หรือแยกโปรตีนตามประจุ
เซลล์เพาะเลี้ยง
การเพาะเลี้ยงเซลล์เป็นกระบวนการเจริญเติบโตที่มีการควบคุม โดยเพาะเลี้ยงเซลล์ภายใต้สภาวะที่ควบคุม สภาวะการเพาะเลี้ยงเซลล์แตกต่างกันตามชนิดของเซลล์ โดยทั่วไป สภาพแวดล้อมของการเพาะเลี้ยงเซลล์ประกอบด้วยภาชนะที่เหมาะสม (เช่น จานเพาะเชื้อ) พร้อมวัสดุรองรับหรืออาหารเลี้ยงเซลล์ที่ให้สารอาหารจำเป็น (กรดอะมิโน คาร์โบไฮเดรต วิตามิน แร่ธาตุ) ปัจจัยการเจริญเติบโต ฮอร์โมน และก๊าซ (CO2, O2) และควบคุมสภาพแวดล้อมทางกายภาพและเคมี (บัฟเฟอร์ pH ความดันออสโมติก อุณหภูมิ) เซลล์ส่วนใหญ่ต้องการพื้นผิวหรือวัสดุรองรับสังเคราะห์ ขณะที่เซลล์เพาะเลี้ยงชนิดอื่นสามารถเพาะเลี้ยงให้ลอยอย่างอิสระในอาหารเลี้ยงเซลล์ได้ (การเพาะเลี้ยงแบบแขวนลอย สารแขวนลอยเซลล์)
การเพาะเลี้ยงเซลล์ไลน์สัตว์ในปริมาณมากใช้ในการผลิตวัคซีนไวรัสและผลิตภัณฑ์อื่นที่ได้จากเทคโนโลยีชีวภาพในระดับอุตสาหกรรม มีการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดของมนุษย์เพื่อเพิ่มจำนวนเซลล์และทำให้เซลล์เปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์ร่างกายชนิดต่าง ๆ เพื่อการปลูกถ่าย
ตัวอย่างเนื้อเยื่อ
คำว่าเนื้อเยื่ออธิบายระดับกลางของการจัดระเบียบเซลล์ โดยวัสดุเซลล์อยู่ในระดับการจัดระเบียบระหว่างเซลล์กับอวัยวะที่สมบูรณ์ ในเนื้อเยื่อ เซลล์ที่คล้ายกันและมีต้นกำเนิดเดียวกันจะรวมตัวกันเพื่อทำหน้าที่เฉพาะร่วมกัน การรวมกลุ่มตามหน้าที่ของเนื้อเยื่อหลายชนิดก่อให้เกิดโครงสร้างที่ซับซ้อนของอวัยวะ
มีการเก็บตัวอย่างเนื้อเยื่อเพื่อการวิจัยด้านชีววิทยา จุลกายวิภาคศาสตร์/จุลพยาธิวิทยา ปรสิตวิทยา ชีวเคมี และอิมมูโนฮิสโตเคมี รวมถึงเพื่อเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อและสกัด DNA สามารถแบ่งเนื้อเยื่อเป็นเนื้อเยื่อสัตว์ (ประเภทย่อย: เนื้อเยื่อสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม) และเนื้อเยื่อพืช เนื้อเยื่อสัตว์แบ่งเป็นชนิดพื้นฐานสี่ชนิด ได้แก่ เนื้อเยื่อเกี่ยวพัน เนื้อเยื่อกล้ามเนื้อ เนื้อเยื่อประสาท และเนื้อเยื่อบุผิว เนื้อเยื่อพืชแบ่งเป็นระบบเนื้อเยื่อสามระบบ ได้แก่ เนื้อเยื่อผิว เนื้อเยื่อพื้น และเนื้อเยื่อลำเลียง
สามารถเตรียมตัวอย่างเนื้อเยื่อจากส่วนต่าง ๆ ของสัตว์หรือพืช เช่น กระดูก กล้ามเนื้อ ใบ ฯลฯ
ของเหลวในร่างกาย
เลือด ซีรัม พลาสมา น้ำหล่อสมองและไขสันหลัง น้ำลาย และน้ำไขข้อ เป็นของเหลวในร่างกายที่เป็นแหล่งข้อมูลอันมีคุณค่าอย่างยิ่งต่อการวินิจฉัย ดังนั้น การเตรียมตัวอย่างของเหลวในร่างกายเพื่อการวิเคราะห์ด้วยวิธีที่ซับซ้อนและละเอียดจึงมีความสำคัญ ความยากประการแรกเกี่ยวข้องกับช่วงความเข้มข้นที่กว้างมากขององค์ประกอบต่าง ๆ ที่มีอยู่ในของเหลวในร่างกาย
การหาความเข้มข้นของโปรตีน
การทดสอบ Bradford การทดสอบ Lowry และการทดสอบด้วย bicinchoninic acid (BCA) เป็นวิธีทดสอบที่ใช้กันทั่วไปเพื่อหาความเข้มข้นของโปรตีน อัลบูมินจากซีรัมวัว (BSA) เป็นสารมาตรฐานโปรตีนชนิดหนึ่งที่ใช้บ่อยที่สุด
บัฟเฟอร์สลายเซลล์
ต้องเลือกบัฟเฟอร์สลายเซลล์ให้สอดคล้องกับวัสดุเซลล์หรือเนื้อเยื่อ (เนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง พืช แบคทีเรีย เชื้อรา ฯลฯ) รวมถึงพิจารณาว่าเซลล์อยู่ในโครงสร้างหรือไม่และเป็นโครงสร้างชนิดใด บัฟเฟอร์สลายเซลล์หลากหลายชนิดสำหรับสกัดโปรตีน เยื่อหุ้ม และออร์แกเนลล์ มีสูตรที่ประกอบด้วยสารซักฟอกหนึ่งชนิดหรือมากกว่า โดยทั่วไปจะเลือกสารซักฟอกด้วยการทดสอบแบบลองผิดลองถูก หรือ – หากมี – ตามขั้นตอนการสกัดโปรตีนที่มีอยู่ สารซักฟอกต้องเข้ากันได้กับแหล่งเนื้อเยื่อและโปรตีน โดยทั่วไปจะเลือกสารซักฟอกที่อ่อนโยนที่สุดซึ่งใช้ได้ผลกับเนื้อเยื่อ / โปรตีนเฉพาะชนิด เพื่อคงความสามารถในการทำงานของสารสกัดไว้ให้สูงสุด นอกจากนี้ ในกรณีของการสกัดเยื่อหุ้มและออร์แกเนลล์ สารซักฟอกที่อ่อนโยนจะช่วยรักษาเยื่อหุ้มให้คงสภาพสมบูรณ์ สารซักฟอกที่ใช้กันทั่วไปในบัฟเฟอร์สลายเซลล์ส่วนใหญ่เป็นชนิดไม่มีประจุหรือชนิดที่มีทั้งประจุบวกและประจุลบในโมเลกุลเดียวกัน เช่น CHAPS, deoxycholate, Triton™ X-100, NP40 และ Tween 20
ตัวอย่างเช่น เนื้อเยื่อสมอง ตับ ลำไส้ ไต ม้าม ฯลฯ สามารถใส่ในบัฟเฟอร์ RIPA ได้โดยตรง – อย่างไรก็ตาม ควรเติมสารยับยั้งโปรตีเอสและ DTT (เช่น สำหรับเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส) ด้วย
บัฟเฟอร์สลายเซลล์สำหรับเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อโครงร่าง (เย็นจัดด้วยน้ำแข็ง): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol เสริมด้วยส่วนผสมของสารยับยั้งโปรตีเอสและฟอสฟาเทส
ตารางบัฟเฟอร์ที่ใช้กันทั่วไปและช่วง pH โดยทั่วไป บัฟเฟอร์เหล่านี้มักใช้ที่ความเข้มข้น 20–50 mM
| บัฟเฟอร์ | ช่วง pH |
|---|---|
| Citric acid – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Sodium citrate – citric acid | 3.0 – 6.2 |
| Sodium acetate – acetic acid | 3.6 – 5.6 |
| Cacodylic acid sodium salt – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Sodium dihydrogen phosphate – disodium hydrogen phosphate | 5.8 – 8.0 |
| Imidazole – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Triethanolamine hydrochloride – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Sodium tetraborate – boric acid | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| Glycine – NaOH | 8.6 – 10.6 |
บัฟเฟอร์ส่วนใหญ่มีค่า pH ที่ขึ้นกับอุณหภูมิ โดยเฉพาะบัฟเฟอร์ Tris ค่า pKa เปลี่ยนจาก 8.06 ที่ 25°C เป็น 8.85 ที่ 0°C
(pH และ pKa ของบัฟเฟอร์: pH วัดความเข้มข้นของไฮโดรเจนไอออนในสารละลายที่มีน้ำเป็นตัวทำละลาย pKa (= ค่าคงที่การแตกตัวของกรด) เป็นค่าที่เกี่ยวข้องกันแต่เฉพาะเจาะจงกว่า โดยช่วยคาดการณ์ว่าโมเลกุลจะมีพฤติกรรมอย่างไรที่ค่า pH หนึ่ง)
TRIzol
TRIzol เป็นสารละลายเคมีที่ใช้สกัด RNA/DNA/โปรตีนในกระบวนการสกัดด้วย guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform การสกัดด้วย TRIzol โดยใช้อัลตราโซนิกช่วยให้ผลผลิต DNA, RNA และโปรตีนสูงจากตัวอย่างเดียวกัน จึงเหนือกว่าวิธีสกัดอื่น
เอกสารวิชาการ/เอกสารอ้างอิง
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.