การสกัดโปรตีนจากอัลตราโซนิกเนื้อเยื่อและเซลล์วัฒนธรรม

• การสกัดโปรตีนเป็นขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างที่จำเป็นในโปรตีน
• โปรตีนที่สามารถสกัดได้จากพืชและสัตว์เนื้อเยื่อยีสต์และจุลินทรีย์
• sonication เป็นที่เชื่อถือได้วิธีการสกัดโปรตีนที่มีประสิทธิภาพให้อัตราผลตอบแทนที่มีโปรตีนสูงภายในเวลาที่สกัดสั้น

การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อและเซลล์

การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อและเซลล์เพาะเลี้ยงเป็นขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างที่จำเป็นซึ่งจะดำเนินการในช่วงเทคนิคทางชีวเคมีและการวิเคราะห์หลายอย่างเช่นวิธี ELISA, หน้า, ซับตะวันตกมวลสารหรือทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ ล้ำเสียง การหยุดชะงักของเซลล์สลายและการสกัด เป็นเทคนิคที่สามารถควบคุมได้อย่างแม่นยำเพื่อให้แน่ใจว่าผลตอบแทนสูงของโปรตีน

การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อสัตว์

สำหรับการเตรียมความพร้อมของเนื้อเยื่อขนาดใหญ่ (เช่นไต, หัวใจ, ปอด, กล้ามเนื้อฯลฯ), เนื้อเยื่อควรจะหลุดออกเป็นชิ้นเล็กๆที่มีเครื่องมือที่สะอาด, บนน้ำแข็งโดยเฉพาะอย่างยิ่ง, และเร็วที่สุดเท่าที่เป็นไปได้เพื่อป้องกันการย่อยสลายโดย proteases (เช่นบัฟเฟอร์สลายเช่น การสลายของ RIPA หรือ hypotonic ที่ประกอบด้วยโปรติเอสและสารเรืองแสงค็อกเทล) หลังจาก dissecting, ตัวอย่างจะถูกจุ่มเข้าไปในไนโตรเจนของเหลวสำหรับการแช่แข็ง snap. ตัวอย่างสามารถเก็บไว้ที่-80 ° c สำหรับการใช้งานในภายหลังหรือ keept บนน้ำแข็งสำหรับการเป็นเนื้อเดียวกันทันที ทันทีก่อนที่จะสกัดล้ำ, น้ำแข็งบัฟเฟอร์สลายเย็น (กับสารยับยั้งโปรติเอส dtt, leupeptin และ aprotinin) จะถูกเพิ่มเข้าไปในท่อตัวอย่างรวดเร็ว (ต่อ ~ 10 มิลลิกรัมของเนื้อเยื่อประมาณ ~ ๖๐๐μ l ของบัฟเฟอร์ที่แนะนำ). ประมาณ 20-60 มิลลิกรัมของเนื้อเยื่อที่แนะนำต่อหลอดตัวอย่าง.
ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันอัลตราโซนิก, สลายและการสกัดจะดำเนินการกับ homogenizer ล้ำเช่น Uf200 ःที หรือ UP200Stพร้อมกับ sonotrode ไมโครปลาย ระยะเวลา sonication เป็น 60-90 วินาที ในรอบโหมดอัลตราโซนิก 15 วินาที sonication และ 10 วินาที เวลาพักผ่อน กลุ่มตัวอย่างที่ควรเก็บไว้ในน้ำแข็งตลอดเวลา
หลังจากที่ล้ำทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน / สกัด lysate จะหมุนเหวี่ยงที่ 27,000g ประมาณ 20 นาที หลังจากนั้น supernatent จะถูกเก็บรวบรวมเพื่อให้ความเข้มข้นของโปรตีนจะถูกกำหนดโดยการทดสอบโปรตีนเช่นเพียร์ซโปรตีนทดสอบเก็บกวาด

การสกัดโปรตีนจากเลือด

สำหรับส่วนผสมเป็นเนื้อเดียวกันของซีรั่มและบัฟเฟอร์ฟอสเฟตตัวอย่างจะถูกหมุนวนก่อนที่จะสลายเซลล์อัลตราโซนิก สำหรับสลายล้ำตัวอย่างจะถูก sonicated กับ homogenizer ห้องปฏิบัติการล้ำเช่น UP100H 8 รอบที่ 20% กว้างสำหรับรอบละ 5 วินาทีและ 15 วินาทีปิด Sonocation จะดำเนินการโดย sonicationg ในรอบและโดยการวางตัวอย่างบนน้ำแข็งเพื่อให้ความร้อนสูงเกินไปและสลายตัวของกลุ่มตัวอย่างที่จะหลีกเลี่ยง ตั้งแต่ซีรั่มที่มีจำนวนมากสูงโปรตีนน้ำหนักโมเลกุล (เช่นอัลบูมิ, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, อิมมูโน G และอิมมูโน) ซึ่งยุ่งเกี่ยวกับการแยกต่ำน้ำหนักโมเลกุลโปรตีนในช่วง IEF ก็จะแนะนำให้หมดสิ้นลงพวกเขา จากซีรั่มโดยใช้คอลัมน์พร่อง

การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อพืช

สดเนื้อเยื่อพืชที่อ่อนนุ่มเช่น ตะไคร่น้ำ ฯลฯ สามารถถูกรบกวนได้ง่ายโดยเพียงแค่วางวัสดุตัวอย่างสับในบัฟเฟอร์สลายสำหรับ sonication ยากเนื้อเยื่อพืช ligenous เช่นเมล็ดเข็มเฟอร์ ฯลฯ ควรเป็นพื้นดินแห้ง บางวัสดุแข็งและพืชยืนต้นต้องถูกแช่แข็งและพื้นดินในไนโตรเจนเหลวสกัดมาก่อนโดย sonication สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอยพืชการรักษาล้ำระหว่าง 30 และ 150 วินาทีในบัฟเฟอร์สลายเป็นส่วนใหญ่เพียงพอ วัสดุที่รุนแรงเช่นเมล็ดฟักทองต้องมี sonication รุนแรงมากขึ้นตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง

โปรโตคอลสำหรับการสกัดล้ำของโปรตีนชนิดหนึ่งจากเมล็ดฟักทอง

สำหรับการสกัดโปรตีนอัลบูมิล้ำจากผงเมล็ดฟักทองปรับพื้น 10 กรัมผงเมล็ดฟักทองสกัดและ 100 มิลลิลิตรของน้ำเป็นตัวทำละลาย deionised มีการเพิ่มในบีกเกอร์แก้ว 250mL การสกัดโปรตีนประกอบด้วยในขั้นตอนที่สอง: First ตัวอย่างจะถูก sonicated กับการสอบสวนชนิด ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) ด้วยการติดตั้ง sonotrode S24d7 บีกเกอร์แก้วถูกวางไว้ในอ่างน้ำเย็นในช่วงที่เป็นเนื้อเดียวกันอัลตราโซนิก การตั้งค่าของ ultrasonicator ที่ UP400St เซ็นเซอร์วัดอุณหภูมิเซนให้แน่ใจว่าอุณหภูมิตัวอย่างจะถูกเก็บไว้ต่ำกว่า30องศาเซลเซียส โดยการควบคุมอุณหภูมิที่แม่นยำในระหว่าง sonication denaturation ของ albumin จะหลีกเลี่ยง ประการที่สองการสกัดถูกดำเนินการกับมิกเซอร์ที่ความเร็ว๒๐๐ rpm และที่30° c หลังจากบีกเกอร์ถูกถ่ายโอนเข้าไปในเครื่องปั่นอุณหภูมิขี้ Globulin จะถูกลบออกผ่านการฟอกไตด้วยน้ำกลั่น หลังจากการกำจัด globulin, สารสกัดจากโปรตีนสามารถสุ่มตัวอย่างสำหรับการกำหนดของโปรไฟล์ albumin และต่อมาปรับให้ pI = 3.0 ใช้๐.๑ M HCl สำหรับ albumin แข็งตัว. เฟสที่เป็นของแข็งจะถูกแยกออกด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 5000g, 20 ° c และละลายในน้ำที่มีการสลายตัว การแข็งตัวของ Albumin จะดำเนินการสองครั้งเพื่อเพิ่มอัตราส่วนโปรตีนใน Albumin มีสมาธิ.

อัลตราโซนิกการสกัดโปรตีนอัลคาไลน์สำหรับการเตรียมความพร้อมของโปรตีนจากรำข้าวที่แสดงให้เห็นว่าผลการรักษาล้ำผลผลิตโปรตีนสูงขึ้นในระยะเวลาที่สั้นลงอย่างมีนัยสำคัญในการสกัด – เมื่อเทียบกับวิธีการสกัดการชุมนุม

โปรโตคอลการเตรียมตัวสำหรับการทำงานของเอนไซม์ iNOS

ที่จะได้รับเอนไซม์ iNOS ทำงานได้อย่างสมบูรณ์ (เช่นสำหรับการคัดกรองยาเสพติด) โปรโตคอลต่อไปนี้ขอแนะนำ: ระงับมือถือควรอยู่บนน้ำแข็งและ sonicate กับ UP100H ที่กว้าง10μmโหมดรอบ 5 วินาที sonication และ 25 วินาที ส่วนที่เหลือบนน้ำแข็ง ขั้นตอนที่ควรจะทำซ้ำประมาณ 3 ครั้ง. เวลาพักผ่อนในระหว่างรอบ sonication ช่วยลดอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นและดังนั้นจึงจะช่วยลดความเสี่ยงของการสูญเสียสภาพธรรมชาติ

อัลตราโซนิกโปรตีนละลาย

sonication อาจเร่งกระบวนการละลายโปรตีนซึ่งมักจะต้องใช้เวลาหลายชั่วโมง เพื่อไม่ให้ร้อนมากเกินไปตัวอย่างและป้องกันการย่อยสลายโปรตีนและการปรับเปลี่ยนในการแก้ปัญหาที่มียูเรียระเบิดอัลตราโซนิกไม่ควรนานกว่าไม่กี่วินาที

คำแนะนำทั่วไป

การควบคุมอุณหภูมิ: เพื่อให้แน่ใจว่าเป็นอัตราผลตอบแทนที่มีโปรตีนสูงโดยไม่ต้องสูญเสียสภาพธรรมชาติความร้อนอุณหภูมิในระหว่างการสกัดจะต้องถูกควบคุม Hielscher รัฐของศิลปะ homogenizers ล้ำ – เรียกว่า disintegrator อัลตราโซนิกหรือ sonificator – สามารถควบคุมได้อย่างแม่นยำ พวกเขามาพร้อมกับเซ็นเซอร์อุณหภูมิ plugable ในการตั้งค่าตัวเลือกของ homogenizer ล้ำอุณหภูมิสูงสุดที่สามารถตั้งค่า เมื่ออุณหภูมินี้สูงสุดถึง ultrasonicator จะหยุดโดยอัตโนมัติจนกว่าตัวอย่างเย็นลง
กันชน: choise ที่ของบัฟเฟอร์ที่เหมาะสมและปริมาณที่เหมาะสมของบัฟเฟอร์ที่แตกต่างจากเนื้อเยื่อเนื้อเยื่อและจะต้องคิดออกโดยการทดสอบทดลองและข้อผิดพลาด
แยก / บริสุทธิ์: lysates โปรตีนสามารถมีส่วนเกินของสารชีวโมเลกุลเช่นดีเอ็นเอหรือคาร์โบไฮเดรตซึ่งอาจจะถูกลบออกโดยการตกตะกอนโปรตีน (กรด Deoxycholate-ไตรคลอโร) หรือ buffer แลกเปลี่ยน

Chittapalo และ Noomhorm (2009) รายงานว่าผลผลิตโปรตีนเพิ่มขึ้นโดยใช้ sonication และที่ล้ำทำให้เป็นเนื้อเดียวกันของเนื้อเยื่อและการสลายกระบวนการสามารถเพิ่มประสิทธิภาพกระบวนการสกัดที่มีอยู่อย่างมีนัยสำคัญ – ช่วยให้การหาโอกาสในการสกัดพาณิชย์ใหม่

อุปกรณ์อัลตราโซนิกสำหรับการสกัดโปรตีน

Hielscher Ultrasonics มีความหลากหลายของ homogenizers ล้ำสำหรับการสลายตัวของเซลล์เนื้อเยื่อแบคทีเรียจุลินทรีย์ยีสต์และสปอร์
ultrasonicators ห้องปฏิบัติการ Hielscher มีประสิทธิภาพและใช้งานง่าย สร้างขึ้นสำหรับการดำเนินงาน 24/7 พวกเขาจะได้รับการออกแบบเป็นห้องปฏิบัติการที่แข็งแกร่งและมีประสิทธิภาพและอุปกรณ์บนม้านั่ง สำหรับอุปกรณ์ทั้งหมดที่ออกพลังงานและความกว้างสามารถควบคุมได้อย่างแม่นยำ ช่วงกว้างของ อุปกรณ์ เปิดตัวเลือกการติดตั้งต่อไป อุปกรณ์ดิจิตอลเช่น VialTweeter, Uf200 ःที, UP200Stและ UP400St มีการควบคุมอุณหภูมิแบบบูรณาการและสร้างขึ้นในการ์ด SD สำหรับการบันทึกข้อมูลอัตโนมัติ
สำหรับทางอ้อมการปนเปื้อนฟรีและ sonication พร้อมกันของหลายตัวอย่างที่เรานำเสนอ VialTweeter หรือ อัลตราโซนิก cuphorn.
ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับการประยุกต์ใช้วัสดุและปริมาณตัวอย่างของคุณเราจะแนะนำให้คุณตั้งค่าที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการเตรียมตัวอย่างของคุณ ติดต่อเราวันนี้!