อัลตราโซนิก Lysis สําหรับ Western Blotting
- เวสเทิร์นบลอตเป็นขั้นตอนการวิเคราะห์สําหรับการตรวจหาโปรตีนเฉพาะในตัวอย่างของเนื้อเยื่อโฮโมจีเนตหรือสารสกัดจากเซลล์
- ในการเรียกใช้ Western blot หรือเพื่อวัดการทํางานของเอนไซม์การทดสอบจํานวนมากจําเป็นต้องเข้าถึงวัสดุ (เช่นโปรตีนดีเอ็นเอชิ้นส่วนย่อยของเซลล์) ที่ติดอยู่ในเซลล์
- Sonication เป็นวิธีที่เชื่อถือได้และง่ายต่อการจัดการสําหรับการหยุดชะงักของเซลล์และการสลายที่ควบคุมได้
การหยุดชะงักของเซลล์อัลตราโซนิก
การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อและเซลล์เพาะเลี้ยงเป็นขั้นตอนแรกสําหรับเทคนิคทางชีวภาพ ชีวเคมี และการวิเคราะห์ (PAGE, Western blotting, ELISA, แมสสเปกโตรเมตรี ฯลฯ) หรือการทําให้โปรตีนบริสุทธิ์ เพื่อให้ได้ผลผลิตโปรตีนสูงวัสดุของเซลล์และเนื้อเยื่อจะต้องถูกขัดขวาง/สลายอย่างมีประสิทธิภาพ ไม่ว่าจะเป็นเซลล์พืชหรือเนื้อเยื่อสัตว์ sonication เป็นวิธีการเตรียมเซลล์ไลเซตของคุณได้ง่ายและรวดเร็ว
ข้อดีของ Sonication
- เร็ว & ซึ่งมีประสิทธิภาพ
- ใช้งานง่าย
- ผลผลิตโปรตีนสูง
- ทําซ้ําได้/ทําซ้ําได้
- ควบคุมได้อย่างแม่นยํา
- ปรับขนาดได้

เครื่องสะท้อนเสียงไวอัลทวีตเตอร์ สําหรับการเตรียมตัวอย่างอัลตราโซนิก เช่น การหยุดชะงักของเซลล์และการแยกโปรตีน
โปรโตคอลการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันสําหรับ Western Immunoblotting
A. รีเอเจนต์
สําหรับการเตรียมสารละลาย ให้ใช้น้ําบริสุทธิ์ เช่น Milli-Q
- 1X น้ําเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS)
- บัฟเฟอร์การสลายเซลล์ 1X: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM โซเดียมไพโรฟอสเฟต, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
สําคัญ: เติม 1 mM PMSF ทันทีก่อนใช้งาน - โปรตีน A 15 ไมโครลิตร+โปรตีน G 15 ไมโครลิตรเพียงพอสําหรับ IP แต่อาจขึ้นอยู่กับแอนติบอดีหลักและปริมาตรตัวอย่างของคุณ คุณยังสามารถใช้โปรตีนอะกาโรส A/ G ที่ผสมไว้ล่วงหน้า (เช่น โปรตีน A สําหรับกระต่าย IgG แบบดึงลง และโปรตีน G สําหรับหนู IgG แบบดึงลง)
- บัฟเฟอร์ตัวอย่าง 3X SDS: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 ที่ 25°C), 6% w/v SDS, กลีเซอรอล 30%, 150 mM DTT, 0.03% w/v โบรโมฟีนอลบลู
B. การเตรียมเซลล์ไลเสท
- เก็บเกี่ยวเซลล์ ในการเก็บเกี่ยวเซลล์ภายใต้สภาวะที่ไม่เปลี่ยนสภาพ ให้นําสื่อออกและล้างเซลล์หนึ่งครั้งด้วย PBS เย็น
- นํา PBS ออกและเติมบัฟเฟอร์การสลายเซลล์ 1X เย็น 0.5 มล. ลงในแต่ละจาน (10 ซม.) และบ่มจานบนน้ําแข็งเป็นเวลา 5 นาที
- ขูดเซลล์ออกจากเพลตและถ่ายโอนไปยังหลอดไมโครเซนตอริ่งเหวี่ยง เก็บไว้บนน้ําแข็ง
- โซนิคสองครั้งเป็นเวลา 10 วินาทีในบัฟเฟอร์การตกตะกอนของภูมิคุ้มกันเย็น (บัฟเฟอร์ IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 และส่วนผสมของสารยับยั้งโปรตีเอส) สําหรับการ sonication ไวอัลทวีตเตอร์ หรือเครื่องอัลตราโซนิกโพรบเช่น UP100H หรือ UP200 ฮิต เหมาะสมที่สุด
- หมุนเหวี่ยงไลเสทที่ 15,000 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่ 4°C
- โอนส่วนเหนือน้ําไปยังหลอดใหม่ (หากจําเป็น สามารถเก็บไลเสทได้ที่ –80°C)
- เพิ่มแอนติบอดีปฐมภูมิให้กับ supernatant ส่วนเหนือน้ําที่มีแอนติบอดีปฐมภูมิถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 4°C ภายใต้การกวนเบา ๆ โดยทั่วไปแล้วแอนติบอดีปฐมภูมิจะถูกเติมในปริมาณที่เข้มข้นกว่าที่ใช้สําหรับการซับแบบตะวันตกถึง 10 เท่า (คุณสามารถเริ่มต้นด้วย 1μg ต่อ 100μL)
- จากนั้นสารน้ําชั้นบนจะถูกบ่มต่อไปด้วยส่วนผสมของโปรตีน A-agarose (Invitrogen) และโปรตีน G agarose ในปริมาณที่เท่ากันอีก 1 ชั่วโมง
- ล้างเม็ดอะกาโรสสามครั้งด้วยบัฟเฟอร์ IP หลังจากนั้น สกัดโปรตีนที่ผูกมัดด้วยบัฟเฟอร์โหลด SDS-PAGE โดยให้ความร้อนที่ 95°C เป็นเวลา 5 นาที
C. การตกตะกอนของภูมิคุ้มกัน
- ใช้ไลเสทเซลล์ 200 ไมโครลิตรและเพิ่มแอนติบอดีปฐมภูมิ ฟักด้วยการโยกเบา ๆ ค้างคืนที่อุณหภูมิ 4°C
- เพิ่มลูกปัดโปรตีน A หรือ G (สารละลายลูกปัด 50% 20 ไมโครลิตร) ฟักด้วยการโยกเบา ๆ เป็นเวลา 1-3 ชั่วโมงที่ 4°C
- ไมโครเซนทราเวลเป็นเวลา 30 วินาทีที่ 4°C ล้างเม็ดห้าครั้งด้วยบัฟเฟอร์การสลายเซลล์ 1X 500 ไมโครลิตร เก็บน้ําแข็งระหว่างการซัก
- ระงับเม็ดอีกครั้งด้วยบัฟเฟอร์ตัวอย่าง 20X SDS 3 ไมโครลิตร Vortex จากนั้นหมุนเหวี่ยงขนาดเล็กเป็นเวลา 30 วินาที
- อุ่นตัวอย่างที่ 95–100°C เป็นเวลา 2-5 นาที และเครื่องหมุนเหวี่ยงขนาดเล็กเป็นเวลา 1 นาทีที่ 14,000 X g
- ใส่ตัวอย่าง (15–30 μl) บนเจล SDS-PAGE (12–15%)
- วิเคราะห์ตัวอย่างโดยการพ่นแบบตะวันตก
การวิเคราะห์ Western Blot ด้วย Sonicator UP50H
โปรโตคอลต่อไปนี้โดยใช้เครื่องสะท้อนเสียงแบบโพรบ UP50H ถูกนํามาใช้ในการศึกษาของ Kriebisch et al. (2011):
โปรตีนทั้งหมดถูกแยกออกจากเซลล์ MC3T3-E1 ที่ผ่านการบําบัดด้วย 1,25(OH)2D3 (10−8 M) หรือยานพาหนะ เซลล์ถูกไลซิสด้วยบัฟเฟอร์ที่มี 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 มิลลิเมตร NaCl (ฟิชเชอร์ไซเอนเชียล); โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) 0.1% (ฟิชเชอร์ไซเอนเชียล); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) และโซเดียมดีออกซีโคเลต 0.5% (Merck) เซลล์ไลเสทถูกโซนิกเป็นเวลา 2 × 10 วินาทีที่รอบที่ 1 และแอมพลิจูด 80 ด้วย UP50H โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิก (Hielscher, เทคโนโลยีอัลตราซาวนด์, Teltow, เยอรมนี) หลังจากนั้นวัสดุจะถูกหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 10 นาทีที่ 14,000 รอบต่อนาที และใช้สารเหนือน้ําสําหรับการซับแบบตะวันตก โปรตีนยี่สิบห้าไมโครกรัมถูกต้มในบัฟเฟอร์ตัวอย่างและสารรีดิวซ์ (Invitrogen) และต่อมาแยกโดย SDS-PAGE โดยใช้เจลโพลีอะคริลาไมด์ 4-12% (Invitrogen) และถ่ายโอนไปยังเมมเบรนไนโตรเซลลูโลส (GE health care) เมมเบรนถูกปิดกั้นเป็นเวลา 1 ชั่วโมงด้วย TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl) ที่มีเคซีน 1% (Sigma-Aldrich) และ 1% Tris (1 M) หลังจากปิดกั้น เมมเบรนจะถูกบ่มด้วยการกวนเล็กน้อยค้างคืนที่อุณหภูมิ 4°C ด้วยแอนติบอดีหลัก (กระต่ายต่อต้านมนุษย์ CBS 1/500 พัฒนาขึ้นในห้องปฏิบัติการของ Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA) การฟักตัวด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิคอนจูเกตมะรุมเปอร์ออกซิเดส (HPR) (Dako) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง รอยเปื้อนทั้งหมดได้รับการพัฒนาโดยเคมีเรืองแสงที่เพิ่มขึ้น (Perkin Elmer)
คลิกที่นี่เพื่ออ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุดสําหรับการสลายเซลล์อัลตราโซนิกและการสกัดการเตรียมการไลเซตและคําแนะนําสําหรับการปรับปรุงกระบวนการ!
ตารางด้านล่างให้ข้อบ่งชี้เกี่ยวกับความสามารถในการประมวลผลโดยประมาณของเครื่องอัลตราโซนิกขนาดห้องปฏิบัติการของเรา:
อุปกรณ์ที่แนะนํา | ปริมาณแบทช์ | อัตราการไหล |
---|---|---|
UIP400MTP เครื่องโซนิคเตอร์แผ่น 96 หลุม | แผ่นมัลติเวล / ไมโครไทเตอร์ | ไม่ |
อัลตราโซนิก CupHorn | CupHorn สําหรับขวดหรือบีกเกอร์ | ไม่ |
จีดีมินิ 2 | เครื่องปฏิกรณ์ไมโครโฟลว์อัลตราโซนิก | ไม่ |
ไวอัลทวีตเตอร์ | 0.5 ถึง 1.5 มล. | ไม่ |
UP100H | 1 ถึง 500 มล. | 10 ถึง 200 มล. / นาที |
UP200 ฮิต, UP200 เซนต์ | 10 ถึง 1000 มล. | 20 ถึง 200 มล. / นาที |
UP400ST | 10 ถึง 2000 มล. | 20 ถึง 400 มล. / นาที |
เครื่องปั่นตะแกรงอัลตราโซนิก | ไม่ | ไม่ |
ติดต่อเรา! / ถามเรา!

เครื่องสะท้อนเสียงแผ่น UIP400MTP สําหรับการ sonication ปริมาณงานสูงของแผ่น 96 หลุม
เกี่ยวกับ Western Blotting
บลอตเป็นขั้นตอนการวิเคราะห์ที่ถ่ายโอน DNA, RNA และโปรตีนไปยังพาหะเพื่อให้สามารถแยกออกจากกันได้
Southern blot ใช้สําหรับการตรวจหา DNA, Northern blot สําหรับ RNA และ Western blot สําหรับโปรตีน
Western blotting เรียกอีกอย่างว่าโปรตีนอิมมูโนบลอตเนื่องจากแอนติบอดีถูกใช้เพื่อตรวจหาแอนติเจนโดยเฉพาะ Western Blotting เป็นหนึ่งในวิธีการวิเคราะห์ที่สําคัญที่สุดในการตรวจหาโปรตีนเฉพาะในตัวอย่าง ในเวสเทิร์นบล็อต โปรตีนจะถูกตรึงไว้บนเยื่อหุ้มเพื่อตรวจจับโดยใช้โมโนโคลนอลหรือโพลีโคลนอลแอนติบอดี
โดย SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) โปรตีนดั้งเดิมจะถูกแยกออกด้วยโครงสร้าง 3 มิติหรือโปรตีนที่แปรสภาพตามความยาวของโพลีเปปไทด์ จากนั้นโปรตีนจะถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรน (โดยทั่วไปคือไนโตรเซลลูโลสหรือ PVDF) ซึ่งพวกมันจะถูกย้อมด้วยแอนติบอดีที่จําเพาะต่อโปรตีนเป้าหมาย ขั้นตอนอิเล็กโทรโฟรีซิสเจลรวมอยู่ในการวิเคราะห์ western blot เพื่อแก้ไขปัญหาปฏิกิริยาข้ามของแอนติบอดี
หลังจากนั้น โปรตีนที่แยกออกจากกันจะถูกซับลงบนเมทริกซ์ (ส่วนใหญ่บนไนโตรเซลลูโลสหรือเมมเบรน PVDF) ซึ่งพวกมันจะถูกย้อมด้วยแอนติบอดี แอนติบอดีทําหน้าที่เป็นโพรบและได้รับการคัดเลือกเฉพาะสําหรับโปรตีนเป้าหมาย การวิเคราะห์ตําแหน่งและความเข้มของปฏิกิริยาเฉพาะเผยให้เห็นรายละเอียดการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมายในตัวอย่างที่กําหนด Western blotting สามารถตรวจจับโปรตีนเป้าหมายซึ่งต่ําถึง 1ng เนื่องจากอิเล็กโทรโฟรีซิสเจลมีความละเอียดสูงและความจําเพาะที่แข็งแกร่งและความไวสูงของอิมมูโนแอสเซย์ วิธี Western blot ใช้ในชีววิทยาโมเลกุล ชีวเคมี ภูมิคุ้มกันพันธุศาสตร์ และสาขาการวิจัยระดับโมเลกุลอื่นๆ
เทคนิคอื่นๆ ที่เกี่ยวข้อง ได้แก่ การวิเคราะห์จุดบล็อต อิมมูโนฮิสโตเคมี และอิมมูโนไซโตเคมี ซึ่งใช้แอนติบอดีเพื่อตรวจหาโปรตีนในเนื้อเยื่อและเซลล์โดยการย้อมสีด้วยภูมิคุ้มกัน และการทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA)
วรรณกรรม / อ้างอิง
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.

เครื่องสะท้อนเสียงไวอัลทวีตเตอร์ สําหรับการเตรียมตัวอย่างพร้อมกันของขวดหลายขวด