การสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกสำหรับเวสเทิร์นบลอต

• เวสเทิร์นบลอตเป็นกระบวนการวิเคราะห์เพื่อตรวจหาโปรตีนจำเพาะในตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันหรือสารสกัดจากเซลล์
• ในการทำเวสเทิร์นบลอตหรือวัดกิจกรรมของเอนไซม์ การทดสอบหลายชนิดจำเป็นต้องเข้าถึงสารต่าง ๆ (เช่น โปรตีน DNA และชิ้นส่วนองค์ประกอบภายในเซลล์) ที่ถูกกักอยู่ภายในเซลล์
• การใช้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นวิธีที่เชื่อถือได้และใช้งานง่ายสำหรับการทำให้เซลล์แตกและการสลายเซลล์อย่างควบคุมได้

การทำให้เซลล์แตกด้วยอัลตราโซนิก

การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อและเซลล์เพาะเลี้ยงเป็นขั้นตอนแรกของเทคนิคทางชีววิทยา ชีวเคมี และการวิเคราะห์หลายชนิด (PAGE เวสเทิร์นบลอต ELISA แมสสเปกโทรเมทรี ฯลฯ) หรือการทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ เพื่อให้ได้ผลผลิตโปรตีนสูง วัสดุจากเซลล์และเนื้อเยื่อต้องถูกทำให้แตก/สลายอย่างมีประสิทธิภาพ ไม่ว่าจะเป็นเซลล์พืชหรือเนื้อเยื่อสัตว์ การใช้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นวิธีเตรียมสารสลายเซลล์ได้อย่างง่ายดายและรวดเร็ว

ข้อดีของการใช้คลื่นอัลตราโซนิก

• รวดเร็วและมีประสิทธิภาพ
• ใช้งานง่าย
• ผลผลิตโปรตีนสูง
• ให้ผลที่ทำซ้ำได้/ทำซ้ำได้ภายใต้สภาวะเดิม
• ควบคุมได้อย่างแม่นยำ
• ปรับขยายขนาดได้

โพรโทคอลการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันสำหรับเวสเทิร์นอิมมูโนบลอต

A. สารเคมี

ในการเตรียมสารละลาย ให้ใช้น้ำบริสุทธิ์ เช่น Milli-Q

• น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) 1X
• บัฟเฟอร์สลายเซลล์ 1X: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM Sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
  สำคัญ: เติม 1 mM PMSF ทันทีก่อนใช้งาน
• 15 μl Protein A+15 μl Protein G เพียงพอสำหรับ IP แต่อาจขึ้นอยู่กับแอนติบอดีปฐมภูมิและปริมาตรตัวอย่างของคุณ คุณยังสามารถใช้อะกาโรสที่จับกับโปรตีน A/ G ซึ่งผสมไว้ล่วงหน้าได้ (เช่น Protein A สำหรับการดึงแยก IgG ของกระต่าย และ Protein G สำหรับการดึงแยก IgG ของหนูเมาส์)
• บัฟเฟอร์ตัวอย่าง SDS 3X: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 ที่ 25°C), 6% w/v SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0.03% w/v bromophenol blue

B. การเตรียมสารสลายเซลล์

• เก็บเซลล์ ในการเก็บเซลล์ภายใต้สภาวะที่ไม่ทำให้โปรตีนเสียสภาพ ให้นำอาหารเลี้ยงเซลล์ออกและล้างเซลล์ครั้งเดียวด้วย PBS ที่เย็นจัดระดับน้ำแข็ง
• นำ PBS ออกและเติมบัฟเฟอร์สลายเซลล์ 1X ที่เย็นจัดระดับน้ำแข็ง 0.5 ml ลงในจานแต่ละใบ (10 cm) แล้วบ่มจานบนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที
• ขูดเซลล์ออกจากจานและย้ายไปยังหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ เก็บไว้บนน้ำแข็ง
• ใช้คลื่นอัลตราโซนิกสองครั้ง ครั้งละ 10 วินาที ในบัฟเฟอร์สำหรับการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันที่เย็นจัดระดับน้ำแข็ง (บัฟเฟอร์ IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 และสารผสมตัวยับยั้งโปรตีเอส) สำหรับการใช้คลื่นอัลตราโซนิก เครื่อง VialTweeter หรือเครื่องอัลตราโซนิกแบบโพรบ เช่น UP100H หรือ UP200Ht เหมาะสมที่สุด
• ปั่นเหวี่ยงสารสลายเซลล์ที่ 15,000 g เป็นเวลา 10 นาที ที่ 4°C
• ย้ายของเหลวส่วนใสไปยังหลอดใหม่ (หากจำเป็น สามารถเก็บสารสลายเซลล์ไว้ที่ –80°C ได้)
• เติมแอนติบอดีปฐมภูมิลงในของเหลวส่วนใส บ่มของเหลวส่วนใสที่มีแอนติบอดีปฐมภูมิเป็นเวลา 1 h ที่ 4°C พร้อมเขย่าเบา ๆ โดยทั่วไปจะเติมแอนติบอดีปฐมภูมิให้มีความเข้มข้นเป็น 10 เท่าของที่ใช้สำหรับเวสเทิร์นบลอต (คุณอาจเริ่มต้นที่ 1μg ต่อ 100μL)
• จากนั้นบ่มของเหลวส่วนใสต่อกับส่วนผสมของ Protein A-agarose (Invitrogen) และอะกาโรสที่จับกับ Protein G ในปริมาณเท่ากันเป็นเวลาอีก 1 h
• ล้างตะกอนอะกาโรสสามครั้งด้วยบัฟเฟอร์ IP จากนั้นสกัดโปรตีนที่จับอยู่ด้วยบัฟเฟอร์สำหรับโหลดตัวอย่าง SDS-PAGE โดยให้ความร้อนที่ 95°C เป็นเวลา 5 นาที

C. การตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกัน

• นำสารสลายเซลล์ 200 μl มาเติมแอนติบอดีปฐมภูมิ บ่มโดยโยกเบา ๆ ข้ามคืนที่ 4°C
• เติมเม็ดอะกาโรสที่จับกับโปรตีน A หรือ G (สารแขวนลอยเม็ดอะกาโรส 50% ปริมาตร 20 μl) บ่มโดยโยกเบา ๆ เป็นเวลา 1–3 ชั่วโมง ที่ 4°C
• ปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่องไมโครเซนตริฟิวจ์เป็นเวลา 30 วินาที ที่ 4°C ล้างตะกอนห้าครั้งด้วยบัฟเฟอร์สลายเซลล์ 1X ปริมาตร 500 µl เก็บไว้บนน้ำแข็งระหว่างการล้าง
• แขวนลอยตะกอนอีกครั้งด้วยบัฟเฟอร์ตัวอย่าง SDS 3X ปริมาตร 20 μl ผสมด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์ แล้วปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่องไมโครเซนตริฟิวจ์เป็นเวลา 30 วินาที
• ให้ความร้อนแก่ตัวอย่างจนถึง 95–100°C เป็นเวลา 2–5 นาที แล้วปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่องไมโครเซนตริฟิวจ์เป็นเวลา 1 นาที ที่ 14,000 X g
• โหลดตัวอย่าง (15–30 μl) ลงบนเจล SDS-PAGE (12–15%)
• วิเคราะห์ตัวอย่างด้วยเวสเทิร์นบลอต

การวิเคราะห์เวสเทิร์นบลอตด้วยเครื่องอัลตราโซนิก UP50H

โพรโทคอลต่อไปนี้ซึ่งใช้เครื่องอัลตราโซนิกแบบโพรบ UP50H ถูกใช้ในการศึกษาของ Kriebisch และคณะ (2011):
แยกโปรตีนทั้งหมดจากเซลล์ MC3T3-E1 ที่ได้รับ 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) หรือสารตัวพา สลายเซลล์ด้วยบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) และ 0.5% sodium deoxycholate (Merck) ใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับสารสลายเซลล์เป็นเวลา 2 × 10 s โดยตั้งรอบการทำงานที่ 1 และแอมพลิจูดที่ 80 ด้วย เครื่องประมวลผลอัลตราโซนิก UP50H (Hielscher, เทคโนโลยีอัลตราซาวนด์, Teltow, เยอรมนี) จากนั้นปั่นเหวี่ยงวัสดุเป็นเวลา 10 min ที่ 14,000 rpm และนำของเหลวส่วนใสไปใช้สำหรับเวสเทิร์นบลอต ต้มโปรตีนยี่สิบห้า μg ในบัฟเฟอร์ตัวอย่างและสารรีดิวซ์ (Invitrogen) จากนั้นแยกด้วย SDS-PAGE โดยใช้เจลพอลิอะคริลาไมด์ 4–12% (Invitrogen) และถ่ายโอนไปยังเมมเบรนไนโตรเซลลูโลส (GE health care) บล็อกเมมเบรนเป็นเวลา 1 h ด้วย TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl) ที่มี 1% casein (Sigma-Aldrich) และ 1% Tris (1 M) หลังการบล็อก บ่มเมมเบรนพร้อมเขย่าเบา ๆ ข้ามคืนที่ 4°C กับแอนติบอดีปฐมภูมิ (แอนติบอดีจากกระต่ายต่อ CBS ของมนุษย์ 1/500 ซึ่งพัฒนาขึ้นในห้องปฏิบัติการของ Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, สหรัฐอเมริกา) บ่มกับแอนติบอดีทุติยภูมิที่เชื่อมกับเอนไซม์ฮอร์สแรดิชเพอร์ออกซิเดส (HPR) (Dako) เป็นเวลา 1 h ที่อุณหภูมิห้อง ทำให้บลอตทั้งหมดปรากฏสัญญาณด้วยเคมิลูมิเนสเซนซ์แบบเพิ่มความเข้ม (Perkin Elmer)
 

คลิกที่นี่เพื่ออ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับแนวปฏิบัติที่ดีที่สุดสำหรับการสลายเซลล์และการสกัดด้วยอัลตราโซนิก การเตรียมสารสลายเซลล์ และคำแนะนำในการปรับปรุงกระบวนการ!
 
ตารางด้านล่างแสดงความสามารถในการประมวลผลโดยประมาณของเครื่องอัลตราโซนิกขนาดห้องปฏิบัติการของเรา:

วรรณกรรม / เอกสารอ้างอิง

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.