อัลตราโซนิกสลายสำหรับซับตะวันตก

  • ดวงตะวันเป็นขั้นตอนการวิเคราะห์สำหรับการตรวจสอบของโปรตีนที่เฉพาะเจาะจงในตัวอย่างของเนื้อเยื่อ homogenate หรือสารสกัดจากเซลล์
  • ในการเรียกใช้ดวงตะวันหรือการวัดกิจกรรมของเอนไซม์, การวิเคราะห์จำนวนมากต้องการการเข้าถึงวัสดุ (เช่นโปรตีนดีเอ็นเอเศษ subcellular) เก็บกักในเซลล์
  • sonication เป็นวิธีการที่เชื่อถือได้และง่ายต่อการจัดการสำหรับการหยุดชะงักมือถือการควบคุมและสลาย

อัลตราโซนิกการหยุดชะงักมือถือ

การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อและเซลล์เพาะเลี้ยงเป็นขั้นตอนแรกสำหรับหลาย ๆ คนชีววิทยาชีวเคมีและการวิเคราะห์เทคนิค (หน้า, ซับตะวันตก ELISA มวลสาร ฯลฯ ) หรือโปรตีนให้บริสุทธิ์ เพื่อให้ได้ผลผลิตที่มีโปรตีนสูงวัสดุเซลล์และเนื้อเยื่อที่จะต้องหยุดชะงักอย่างมีประสิทธิภาพ / lysed ไม่ว่าจะเป็นเซลล์พืชหรือเนื้อเยื่อสัตว์ sonication เป็นวิธีการเพื่อเตรียมความพร้อม lysate มือถือของคุณได้ง่ายและรวดเร็ว

ข้อดีของการ Sonication

  • รวดเร็ว & ที่มีประสิทธิภาพ
  • ใช้งานง่าย
  • อัตราผลตอบแทนที่มีโปรตีนสูง
  • ทำซ้ำ / ทำซ้ำ
  • การควบคุมอย่างแม่นยำ
  • สามารถปรับขนาดได้

immunoprecipitation Protocol สำหรับ immunoblotting ตะวันตก

เอเจนต์

สำหรับการเตรียมความพร้อมของการแก้ปัญหาให้ใช้น้ำบริสุทธิ์เช่น Milli-Q

  • 1X ฟอสเฟต Buffered Saline (พีบีเอส)
  • 1X เซลล์สลายบัฟเฟอร์: 20 มิลลิเมตร Tris (pH 7.5) 150 มิลลิเมตรโซเดียมคลอไรด์ 1 มิลลิ EDTA, 1 มิลลิ EGTA, 1% Triton X-100 ขนาด 2.5 มมโซเดียมไพโรฟอสเฟต 1 มิลลิβ-glycerophosphate 1 มิลลิ Na3VO4 1 ไมโครกรัม / มล. Leupeptin
    สำคัญ: เพิ่ม 1 มิลลิ PMSF ทันทีก่อนที่จะใช้
  • 15 ไมโครลิตรโปรตีน A + 15 ไมโครลิตรกรัมโปรตีนเพียงพอสำหรับ IP แต่มันอาจจะขึ้นอยู่กับแอนติบอดีหลักของคุณและปริมาณตัวอย่าง นอกจากนี้คุณยังสามารถใช้ก่อนผสมโปรตีน A / G agarose (เช่นโปรตีนสำหรับกระต่าย IgG ดึงลงและโปรตีน G สำหรับเมาส์ IgG ดึงลง)
  • 3X SDS บัฟเฟอร์ตัวอย่าง: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 ที่ 25 ° C), 6% w / v SDS 30% กลีเซอรอล 150 มิลลิเมตร DTT 0.03% w / v bromophenol สีฟ้า

B. การเตรียมเซลล์ไลเซส

  • เก็บเกี่ยวเซลล์ เพื่อเก็บเกี่ยวเซลล์ภายใต้เงื่อนไข nondenaturing เอาสื่อและล้างเซลล์ครั้งกับเย็นพีบีเอส
  • นำพีบีเอสและเพิ่ม 0.5 มล. เย็น 1X บัฟเฟอร์เซลล์สลายแต่ละแผ่น (10 ซม.) และฟักไข่แผ่นบนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที
  • ขูดเซลล์ปิดแผ่นและโอนไปยังหลอดไมโคร เก็บบนน้ำแข็ง
  • Sonicate สองครั้งเป็นเวลา 10 วินาทีในเย็นบัฟเฟอร์ immunoprecipitation (IP บัฟเฟอร์: 50 มิลลิ Tris-HCl [ค่า pH 7.4], 150 มิลลิเมตรโซเดียมคลอไรด์, 5 มิลลิ EDTA, 0.1% NP-40 และการผสมผสานน้ำย่อยยับยั้ง) สำหรับ sonication ที่ VialTweeter หรือการสอบสวน ultrasonicator เช่น UP100H หรือ Uf200 ःที มีความเหมาะสมมากที่สุด
  • centrifuge lysates 15,000 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส
  • โอนสารละลายไปยังหลอดใหม่ (ถ้าจำเป็น lysate สามารถเก็บไว้ที่ -80 ° C.)
  • เพิ่มแอนติบอดีหลักเพื่อใส ใสกับแอนติบอดีหลักบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 4 องศาเซลเซียสภายใต้การกวนแสง แอนติบอดีหลักมีการเพิ่มมักจะอยู่ในปริมาณที่เข้มข้นมากขึ้น 10 เท่ากว่าจะใช้สำหรับซับตะวันตก (คุณอาจเริ่มต้นด้วย1μgต่อ100μL.)
  • ใสถูกบ่มแล้วต่อไปด้วยส่วนผสมของจำนวนเงินที่เท่ากันของโปรตีน A-agarose (Invitrogen) และโปรตีน G agarose อีก 1 ชั่วโมง
  • ล้าง agarose เม็ดสามครั้งด้วยบัฟเฟอร์ IP หลังจากนั้นสารสกัดจากโปรตีนที่ถูกผูกไว้กับบัฟเฟอร์ระบบ SDS-การโหลดหน้าเว็บโดยใช้ความร้อนที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที

ซี immunoprecipitation

  • ใช้เวลา 200 lysate เซลล์ไมโครลิตรและเพิ่มแอนติบอดีหลัก บ่มเพาะกับอ่อนโยนโยกค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียส
  • เพิ่มทั้งโปรตีนหรือ G ลูกปัด agarose (20 ไมโครลิตรของลูกปัดสารละลาย 50%) บ่มเพาะกับโยกอ่อนโยนสำหรับ 1-3 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส
  • ไมโครเวลา 30 วินาทีที่ 4 ° C ล้างเม็ดห้าครั้ง 500 ไมโครลิตรของ 1X บัฟเฟอร์เซลล์สลาย เก็บบนน้ำแข็งในระหว่างการล้าง
  • Resuspend เม็ดกับ 20 ไมโครลิตรบัฟเฟอร์ตัวอย่าง 3X SDS Vortex แล้วไมโคร 30 วินาที
  • ความร้อนตัวอย่างเพื่อ 95-100 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2-5 นาทีและไมโครเป็นเวลา 1 นาทีที่ 14,000 X กรัม
  • โหลดตัวอย่าง (15-30 ไมโครลิตร) เจล SDS-PAGE (12-15%)
  • วิเคราะห์ตัวอย่างโดยวิธี western blotting

ติดต่อเรา / สอบถามข้อมูลเพิ่มเติม

พูดคุยกับเราเกี่ยวกับความต้องการของคุณในการประมวลผล เราจะมาแนะนำการติดตั้งและการประมวลผลพารามิเตอร์ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับโครงการของคุณ






เพิ่มเติมโปรโตคอล Sonication

วิเคราะห์ดวงตะวันกับ ultrasonicator UP50H

ต่อไปนี้โปรโตคอลที่ใช้ในการศึกษาของ Kriebisch et al, (2011):
โปรตีนรวมที่แยกได้จากเซลล์ MC3T3-E1 รับการรักษาด้วย 1,25 (OH)2D3 (10-8 M) หรือยานพาหนะ เซลล์ที่ถูก lysed กับกันชนที่มี 50 มิลลิ Tris HCl ค่า pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 มิลลิเมตรโซเดียมคลอไรด์ (Fisher Scientific); 0.1% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) และ 0.5% โซเดียม Deoxycholate (เมอร์ค) lysate เซลล์ sonicated สำหรับ 2 × 10 วินาทีในรอบ 1 และความกว้าง 80 ด้วย UP50H อัลตราโซนิกตัวประมวลผล (Hielscher, เทคโนโลยีอัลตราซาวนด์, Teltow, เยอรมนี). หลังจากนั้นวัสดุถูกปั่นสำหรับ10นาทีที่๑๔,๐๐๐รอบต่อนาทีและใสถูกนำมาใช้สำหรับการดูดซับตะวันตก ยี่สิบห้าไมโครกรัมของโปรตีนถูกต้มในบัฟเฟอร์ตัวอย่างและลดตัวแทน (Invitrogen) และต่อมาแยกโดย SDS-หน้าโดยใช้4– 12% polyacrylamide เจล (Invitrogen) และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน nitrocellulose (การดูแลสุขภาพ GE). เมมเบรนถูกบล็อคสำหรับ1ชั่วโมงกับ TBS (10 มิลลิเมตร Tris-HCl; pH ๗.๖; ๑๕๐ mM NaCl) ที่ประกอบด้วย1% เคซีน (Sigma-Aldrich) และ 1% Tris (1 ม.) หลังจากปิดกั้น, เมมเบรนถูก incubated ด้วยความปั่นป่วนเล็กน้อยค้างคืนที่4° c กับแอนติบอดีหลัก (กระต่ายป้องกันมนุษย์ CBS 1/500, พัฒนาในห้องปฏิบัติการของ Prof. อาร์. การบ่มด้วยฮอสแรดิชฮอส (hpr)-ผันแอนติบอดีทุติยภูมิ (dako) ถูกดำเนินการสำหรับ1ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ทั้งหมดได้รับการพัฒนาโดย chemiluminescence ที่เพิ่มขึ้น (Perkin Elmer)

วรรณคดี / อ้างอิง



เกี่ยวกับเวสเทิร์ซับ

Blots มีการวิเคราะห์ที่ดีเอ็นเออาร์เอ็นเอและโปรตีนจะถูกโอนไปยังผู้ให้บริการเพื่อให้พวกเขาสามารถแยกออกจากกัน
blot ภาคใต้ถูกนำมาใช้ในการตรวจหาดีเอ็นเอที่ blot เหนืออาร์เอ็นเอและดวงตะวันโปรตีน
ซับตะวันตกจะเรียกว่า immunoblotting โปรตีนเพราะแอนติบอดีจะใช้ในการตรวจหาแอนติเจนของมันโดยเฉพาะ เวสเทิร์ blotting เป็นหนึ่งในวิธีการวิเคราะห์ที่สำคัญที่สุดในการตรวจสอบโปรตีนที่เฉพาะเจาะจงในกลุ่มตัวอย่าง ในดวงตะวันโปรตีนจะถูกตรึงบนเยื่อตรวจพบโดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดีหรือโพลี
โดยการ polyacrylamide เจ electrophoresis (SDS-หน้า) โปรตีนพื้นเมืองจะถูกแยกออกด้วยโครงสร้าง3มิติหรือโปรตีนตามความยาวของ polypeptide ไทด์ โปรตีนจะถูกโอนไปยังเมมเบรน (โดยทั่วไป nitrocellulose หรือ PVDF), ที่พวกเขาจะย้อมด้วยแอนติบอดีเฉพาะกับโปรตีนเป้าหมาย. ขั้นตอน electrophoresis เจลจะรวมอยู่ในการวิเคราะห์ซับตะวันตกเพื่อแก้ไขปัญหาการเกิดปฏิกิริยาระหว่างการทำงานของแอนติบอดี
หลังจากนั้นโปรตีนที่แยกจากกันจะถูกซับลงบนเมทริกซ์ (ส่วนใหญ่บน nitrocellulose หรือเยื่อ PVDF) ที่พวกเขาจะย้อมด้วยแอนติบอดี ฟังก์ชันแอนติบอดีเป็นโพรบและถูกเลือกโดยเฉพาะกับโปรตีนเป้าหมาย การวิเคราะห์สถานที่และความรุนแรงของปฏิกิริยาที่เฉพาะเจาะจงแสดงให้เห็นรายละเอียดนิพจน์ของโปรตีนเป้าหมายในตัวอย่างที่กำหนด ซับตะวันตกสามารถตรวจสอบโปรตีนเป้าหมายซึ่งเป็นต่ำเป็น1ng เนื่องจากความละเอียดสูงของเจ electrophoresis และความจำเพาะที่แข็งแกร่งและความไวสูงของภูมิคุ้มกัน. วิธีการซับตะวันตกถูกนำมาใช้ในอณูชีววิทยา, ชีวเคมี, พันธุศาสตร์ภูมิคุ้มกันและสาขาวิจัยโมเลกุลอื่นๆ.
เทคนิคอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้องรวมถึงการวิเคราะห์ blot จุด immunohistochemistry และ immunocytochemistry ที่แอนติบอดีที่ใช้ในการตรวจหาโปรตีนในเนื้อเยื่อและเซลล์โดย immunostaining และเอนไซม์ที่เชื่อมโยงการทดสอบอิมมูโน (ELISA)

Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter ตัวอย่างเตรียมอัลตราโซนิก

ติดต่อเรา! / ถามเรา!






sonication เป็นขั้นตอนที่สำคัญในระหว่างการเตรียมสารตัวอย่าง

UP200St กับไมโครเคล็ดลับสำหรับ sonication ตัวอย่าง