Hielscher Ultrasonics
เรายินดีที่จะพูดคุยเกี่ยวกับกระบวนการของคุณ
โทรหาเรา: +49 3328 437-420
ส่งอีเมลถึงเรา: info@hielscher.com

อัลตราโซนิก Lysis สําหรับ Western Blotting

  • เวสเทิร์นบลอตเป็นขั้นตอนการวิเคราะห์สําหรับการตรวจหาโปรตีนเฉพาะในตัวอย่างของเนื้อเยื่อโฮโมจีเนตหรือสารสกัดจากเซลล์
  • ในการเรียกใช้ Western blot หรือเพื่อวัดการทํางานของเอนไซม์การทดสอบจํานวนมากจําเป็นต้องเข้าถึงวัสดุ (เช่นโปรตีนดีเอ็นเอชิ้นส่วนย่อยของเซลล์) ที่ติดอยู่ในเซลล์
  • Sonication เป็นวิธีที่เชื่อถือได้และง่ายต่อการจัดการสําหรับการหยุดชะงักของเซลล์และการสลายที่ควบคุมได้

การหยุดชะงักของเซลล์อัลตราโซนิก

การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อและเซลล์เพาะเลี้ยงเป็นขั้นตอนแรกสําหรับเทคนิคทางชีวภาพ ชีวเคมี และการวิเคราะห์ (PAGE, Western blotting, ELISA, แมสสเปกโตรเมตรี ฯลฯ) หรือการทําให้โปรตีนบริสุทธิ์ เพื่อให้ได้ผลผลิตโปรตีนสูงวัสดุของเซลล์และเนื้อเยื่อจะต้องถูกขัดขวาง/สลายอย่างมีประสิทธิภาพ ไม่ว่าจะเป็นเซลล์พืชหรือเนื้อเยื่อสัตว์ sonication เป็นวิธีการเตรียมเซลล์ไลเซตของคุณได้ง่ายและรวดเร็ว

ข้อดีของ Sonication

  • เร็ว & ซึ่งมีประสิทธิภาพ
  • ใช้งานง่าย
  • ผลผลิตโปรตีนสูง
  • ทําซ้ําได้/ทําซ้ําได้
  • ควบคุมได้อย่างแม่นยํา
  • ปรับขนาดได้

การขอข้อมูล







VialTweeter ของ Hielscher เหมาะอย่างยิ่งสําหรับการสลายตัวอย่างหลายตัวอย่าง

เครื่องสะท้อนเสียงไวอัลทวีตเตอร์ สําหรับการเตรียมตัวอย่างอัลตราโซนิก เช่น การหยุดชะงักของเซลล์และการแยกโปรตีน

โปรโตคอลการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันสําหรับ Western Immunoblotting

A. รีเอเจนต์

สําหรับการเตรียมสารละลาย ให้ใช้น้ําบริสุทธิ์ เช่น Milli-Q

  • 1X น้ําเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS)
  • บัฟเฟอร์การสลายเซลล์ 1X: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM โซเดียมไพโรฟอสเฟต, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
    สําคัญ: เติม 1 mM PMSF ทันทีก่อนใช้งาน
  • โปรตีน A 15 ไมโครลิตร+โปรตีน G 15 ไมโครลิตรเพียงพอสําหรับ IP แต่อาจขึ้นอยู่กับแอนติบอดีหลักและปริมาตรตัวอย่างของคุณ คุณยังสามารถใช้โปรตีนอะกาโรส A/ G ที่ผสมไว้ล่วงหน้า (เช่น โปรตีน A สําหรับกระต่าย IgG แบบดึงลง และโปรตีน G สําหรับหนู IgG แบบดึงลง)
  • บัฟเฟอร์ตัวอย่าง 3X SDS: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 ที่ 25°C), 6% w/v SDS, กลีเซอรอล 30%, 150 mM DTT, 0.03% w/v โบรโมฟีนอลบลู

B. การเตรียมเซลล์ไลเสท

  • เก็บเกี่ยวเซลล์ ในการเก็บเกี่ยวเซลล์ภายใต้สภาวะที่ไม่เปลี่ยนสภาพ ให้นําสื่อออกและล้างเซลล์หนึ่งครั้งด้วย PBS เย็น
  • นํา PBS ออกและเติมบัฟเฟอร์การสลายเซลล์ 1X เย็น 0.5 มล. ลงในแต่ละจาน (10 ซม.) และบ่มจานบนน้ําแข็งเป็นเวลา 5 นาที
  • ขูดเซลล์ออกจากเพลตและถ่ายโอนไปยังหลอดไมโครเซนตอริ่งเหวี่ยง เก็บไว้บนน้ําแข็ง
  • โซนิคสองครั้งเป็นเวลา 10 วินาทีในบัฟเฟอร์การตกตะกอนของภูมิคุ้มกันเย็น (บัฟเฟอร์ IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 และส่วนผสมของสารยับยั้งโปรตีเอส) สําหรับการ sonication ไวอัลทวีตเตอร์ หรือเครื่องอัลตราโซนิกโพรบเช่น UP100H หรือ UP200 ฮิต เหมาะสมที่สุด
  • หมุนเหวี่ยงไลเสทที่ 15,000 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่ 4°C
  • โอนส่วนเหนือน้ําไปยังหลอดใหม่ (หากจําเป็น สามารถเก็บไลเสทได้ที่ –80°C)
  • เพิ่มแอนติบอดีปฐมภูมิให้กับ supernatant ส่วนเหนือน้ําที่มีแอนติบอดีปฐมภูมิถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 4°C ภายใต้การกวนเบา ๆ โดยทั่วไปแล้วแอนติบอดีปฐมภูมิจะถูกเติมในปริมาณที่เข้มข้นกว่าที่ใช้สําหรับการซับแบบตะวันตกถึง 10 เท่า (คุณสามารถเริ่มต้นด้วย 1μg ต่อ 100μL)
  • จากนั้นสารน้ําชั้นบนจะถูกบ่มต่อไปด้วยส่วนผสมของโปรตีน A-agarose (Invitrogen) และโปรตีน G agarose ในปริมาณที่เท่ากันอีก 1 ชั่วโมง
  • ล้างเม็ดอะกาโรสสามครั้งด้วยบัฟเฟอร์ IP หลังจากนั้น สกัดโปรตีนที่ผูกมัดด้วยบัฟเฟอร์โหลด SDS-PAGE โดยให้ความร้อนที่ 95°C เป็นเวลา 5 นาที

C. การตกตะกอนของภูมิคุ้มกัน

  • ใช้ไลเสทเซลล์ 200 ไมโครลิตรและเพิ่มแอนติบอดีปฐมภูมิ ฟักด้วยการโยกเบา ๆ ค้างคืนที่อุณหภูมิ 4°C
  • เพิ่มลูกปัดโปรตีน A หรือ G (สารละลายลูกปัด 50% 20 ไมโครลิตร) ฟักด้วยการโยกเบา ๆ เป็นเวลา 1-3 ชั่วโมงที่ 4°C
  • ไมโครเซนทราเวลเป็นเวลา 30 วินาทีที่ 4°C ล้างเม็ดห้าครั้งด้วยบัฟเฟอร์การสลายเซลล์ 1X 500 ไมโครลิตร เก็บน้ําแข็งระหว่างการซัก
  • ระงับเม็ดอีกครั้งด้วยบัฟเฟอร์ตัวอย่าง 20X SDS 3 ไมโครลิตร Vortex จากนั้นหมุนเหวี่ยงขนาดเล็กเป็นเวลา 30 วินาที
  • อุ่นตัวอย่างที่ 95–100°C เป็นเวลา 2-5 นาที และเครื่องหมุนเหวี่ยงขนาดเล็กเป็นเวลา 1 นาทีที่ 14,000 X g
  • ใส่ตัวอย่าง (15–30 μl) บนเจล SDS-PAGE (12–15%)
  • วิเคราะห์ตัวอย่างโดยการพ่นแบบตะวันตก

การวิเคราะห์ Western Blot ด้วย Sonicator UP50H

โปรโตคอลต่อไปนี้โดยใช้เครื่องสะท้อนเสียงแบบโพรบ UP50H ถูกนํามาใช้ในการศึกษาของ Kriebisch et al. (2011):
โฮโมจีไนเซอร์แบบโพรบอัลตราโซนิก UP50H มักใช้สําหรับการหยุดชะงักของเซลล์และการแยกโปรตีนเป็นขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างก่อน Western Blottingโปรตีนทั้งหมดถูกแยกออกจากเซลล์ MC3T3-E1 ที่ผ่านการบําบัดด้วย 1,25(OH)2D3 (10−8 M) หรือยานพาหนะ เซลล์ถูกไลซิสด้วยบัฟเฟอร์ที่มี 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 มิลลิเมตร NaCl (ฟิชเชอร์ไซเอนเชียล); โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) 0.1% (ฟิชเชอร์ไซเอนเชียล); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) และโซเดียมดีออกซีโคเลต 0.5% (Merck) เซลล์ไลเสทถูกโซนิกเป็นเวลา 2 × 10 วินาทีที่รอบที่ 1 และแอมพลิจูด 80 ด้วย UP50H โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิก (Hielscher, เทคโนโลยีอัลตราซาวนด์, Teltow, เยอรมนี) หลังจากนั้นวัสดุจะถูกหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 10 นาทีที่ 14,000 รอบต่อนาที และใช้สารเหนือน้ําสําหรับการซับแบบตะวันตก โปรตีนยี่สิบห้าไมโครกรัมถูกต้มในบัฟเฟอร์ตัวอย่างและสารรีดิวซ์ (Invitrogen) และต่อมาแยกโดย SDS-PAGE โดยใช้เจลโพลีอะคริลาไมด์ 4-12% (Invitrogen) และถ่ายโอนไปยังเมมเบรนไนโตรเซลลูโลส (GE health care) เมมเบรนถูกปิดกั้นเป็นเวลา 1 ชั่วโมงด้วย TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl) ที่มีเคซีน 1% (Sigma-Aldrich) และ 1% Tris (1 M) หลังจากปิดกั้น เมมเบรนจะถูกบ่มด้วยการกวนเล็กน้อยค้างคืนที่อุณหภูมิ 4°C ด้วยแอนติบอดีหลัก (กระต่ายต่อต้านมนุษย์ CBS 1/500 พัฒนาขึ้นในห้องปฏิบัติการของ Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA) การฟักตัวด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิคอนจูเกตมะรุมเปอร์ออกซิเดส (HPR) (Dako) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง รอยเปื้อนทั้งหมดได้รับการพัฒนาโดยเคมีเรืองแสงที่เพิ่มขึ้น (Perkin Elmer)
 

บทช่วยสอนนี้อธิบายว่าเครื่อง sonicator ประเภทใดดีที่สุดสําหรับงานเตรียมตัวอย่างของคุณเช่นการสลายการหยุดชะงักของเซลล์การแยกโปรตีนการกระจายตัวของ DNA และ RNA ในห้องปฏิบัติการการวิเคราะห์และการวิจัย เลือกประเภทเครื่องโซนิคเตอร์ที่เหมาะกับการใช้งานปริมาตรตัวอย่างจํานวนตัวอย่างและปริมาณงานของคุณ Hielscher Ultrasonics มีโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกที่เหมาะสําหรับคุณ!

วิธีค้นหาเครื่องสะท้อนเสียงที่สมบูรณ์แบบสําหรับการหยุดชะงักของเซลล์และการสกัดโปรตีนในวิทยาศาสตร์และการวิเคราะห์

ภาพขนาดย่อของวิดีโอ

 

คลิกที่นี่เพื่ออ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุดสําหรับการสลายเซลล์อัลตราโซนิกและการสกัดการเตรียมการไลเซตและคําแนะนําสําหรับการปรับปรุงกระบวนการ!
 
ตารางด้านล่างให้ข้อบ่งชี้เกี่ยวกับความสามารถในการประมวลผลโดยประมาณของเครื่องอัลตราโซนิกขนาดห้องปฏิบัติการของเรา:

อุปกรณ์ที่แนะนํา ปริมาณแบทช์ อัตราการไหล
UIP400MTP เครื่องโซนิคเตอร์แผ่น 96 หลุม แผ่นมัลติเวล / ไมโครไทเตอร์ ไม่
อัลตราโซนิก CupHorn CupHorn สําหรับขวดหรือบีกเกอร์ ไม่
จีดีมินิ 2 เครื่องปฏิกรณ์ไมโครโฟลว์อัลตราโซนิก ไม่
ไวอัลทวีตเตอร์ 0.5 ถึง 1.5 มล. ไม่
UP100H 1 ถึง 500 มล. 10 ถึง 200 มล. / นาที
UP200 ฮิต, UP200 เซนต์ 10 ถึง 1000 มล. 20 ถึง 200 มล. / นาที
UP400ST 10 ถึง 2000 มล. 20 ถึง 400 มล. / นาที
เครื่องปั่นตะแกรงอัลตราโซนิก ไม่ ไม่

ติดต่อเรา! / ถามเรา!

สอบถามข้อมูลเพิ่มเติม

โปรดใช้แบบฟอร์มด้านล่างเพื่อขอข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับเครื่องสะท้อนเสียงของเราสําหรับการเตรียมตัวอย่างก่อน Western Blots โปรโตคอลการใช้งานโดยละเอียดและราคา เรายินดีที่จะหารือเกี่ยวกับกระบวนการเตรียมตัวอย่างของคุณกับคุณและเสนอระบบอัลตราโซนิกที่ตอบสนองความต้องการของคุณ!












ไมโครเพลท, แผ่นมัลติเวล, แผ่น PCR และแผ่น 96 หลุมสามารถ sonication ได้อย่างสะดวกสบายและสม่ําเสมอโดยใช้เครื่อง sonicator แผ่น UIP400MTP

เครื่องสะท้อนเสียงแผ่น UIP400MTP สําหรับการ sonication ปริมาณงานสูงของแผ่น 96 หลุม



เกี่ยวกับ Western Blotting

บลอตเป็นขั้นตอนการวิเคราะห์ที่ถ่ายโอน DNA, RNA และโปรตีนไปยังพาหะเพื่อให้สามารถแยกออกจากกันได้
Southern blot ใช้สําหรับการตรวจหา DNA, Northern blot สําหรับ RNA และ Western blot สําหรับโปรตีน
Western blotting เรียกอีกอย่างว่าโปรตีนอิมมูโนบลอตเนื่องจากแอนติบอดีถูกใช้เพื่อตรวจหาแอนติเจนโดยเฉพาะ Western Blotting เป็นหนึ่งในวิธีการวิเคราะห์ที่สําคัญที่สุดในการตรวจหาโปรตีนเฉพาะในตัวอย่าง ในเวสเทิร์นบล็อต โปรตีนจะถูกตรึงไว้บนเยื่อหุ้มเพื่อตรวจจับโดยใช้โมโนโคลนอลหรือโพลีโคลนอลแอนติบอดี
โดย SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) โปรตีนดั้งเดิมจะถูกแยกออกด้วยโครงสร้าง 3 มิติหรือโปรตีนที่แปรสภาพตามความยาวของโพลีเปปไทด์ จากนั้นโปรตีนจะถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรน (โดยทั่วไปคือไนโตรเซลลูโลสหรือ PVDF) ซึ่งพวกมันจะถูกย้อมด้วยแอนติบอดีที่จําเพาะต่อโปรตีนเป้าหมาย ขั้นตอนอิเล็กโทรโฟรีซิสเจลรวมอยู่ในการวิเคราะห์ western blot เพื่อแก้ไขปัญหาปฏิกิริยาข้ามของแอนติบอดี
หลังจากนั้น โปรตีนที่แยกออกจากกันจะถูกซับลงบนเมทริกซ์ (ส่วนใหญ่บนไนโตรเซลลูโลสหรือเมมเบรน PVDF) ซึ่งพวกมันจะถูกย้อมด้วยแอนติบอดี แอนติบอดีทําหน้าที่เป็นโพรบและได้รับการคัดเลือกเฉพาะสําหรับโปรตีนเป้าหมาย การวิเคราะห์ตําแหน่งและความเข้มของปฏิกิริยาเฉพาะเผยให้เห็นรายละเอียดการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมายในตัวอย่างที่กําหนด Western blotting สามารถตรวจจับโปรตีนเป้าหมายซึ่งต่ําถึง 1ng เนื่องจากอิเล็กโทรโฟรีซิสเจลมีความละเอียดสูงและความจําเพาะที่แข็งแกร่งและความไวสูงของอิมมูโนแอสเซย์ วิธี Western blot ใช้ในชีววิทยาโมเลกุล ชีวเคมี ภูมิคุ้มกันพันธุศาสตร์ และสาขาการวิจัยระดับโมเลกุลอื่นๆ
เทคนิคอื่นๆ ที่เกี่ยวข้อง ได้แก่ การวิเคราะห์จุดบล็อต อิมมูโนฮิสโตเคมี และอิมมูโนไซโตเคมี ซึ่งใช้แอนติบอดีเพื่อตรวจหาโปรตีนในเนื้อเยื่อและเซลล์โดยการย้อมสีด้วยภูมิคุ้มกัน และการทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA)


วรรณกรรม / อ้างอิง

การตั้งค่า VialTweeter ที่สมบูรณ์: VialTweeter sonotrode ที่โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิก UP200St

เครื่องสะท้อนเสียงไวอัลทวีตเตอร์ สําหรับการเตรียมตัวอย่างพร้อมกันของขวดหลายขวด

ติดต่อเรา! / ถามเรา!








Sonication เป็นขั้นตอนสําคัญในระหว่างการเตรียมตัวอย่าง

UP200St พร้อมไมโครทิปสําหรับตัวอย่าง sonication

เรายินดีที่จะพูดคุยเกี่ยวกับกระบวนการของคุณ

Let's get in contact.