อัลตราโซนิกสลายสำหรับซับตะวันตก

• ดวงตะวันเป็นขั้นตอนการวิเคราะห์สำหรับการตรวจสอบของโปรตีนที่เฉพาะเจาะจงในตัวอย่างของเนื้อเยื่อ homogenate หรือสารสกัดจากเซลล์
• ในการเรียกใช้ดวงตะวันหรือการวัดกิจกรรมของเอนไซม์, การวิเคราะห์จำนวนมากต้องการการเข้าถึงวัสดุ (เช่นโปรตีนดีเอ็นเอเศษ subcellular) เก็บกักในเซลล์
• sonication เป็นวิธีการที่เชื่อถือได้และง่ายต่อการจัดการสำหรับการหยุดชะงักมือถือการควบคุมและสลาย

อัลตราโซนิกการหยุดชะงักมือถือ

การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อและเซลล์เพาะเลี้ยงเป็นขั้นตอนแรกสำหรับหลาย ๆ คนชีววิทยาชีวเคมีและการวิเคราะห์เทคนิค (หน้า, ซับตะวันตก ELISA มวลสาร ฯลฯ ) หรือโปรตีนให้บริสุทธิ์ เพื่อให้ได้ผลผลิตที่มีโปรตีนสูงวัสดุเซลล์และเนื้อเยื่อที่จะต้องหยุดชะงักอย่างมีประสิทธิภาพ / lysed ไม่ว่าจะเป็นเซลล์พืชหรือเนื้อเยื่อสัตว์ sonication เป็นวิธีการเพื่อเตรียมความพร้อม lysate มือถือของคุณได้ง่ายและรวดเร็ว

ข้อดีของการ Sonication

• รวดเร็ว & ที่มีประสิทธิภาพ
• ใช้งานง่าย
• อัตราผลตอบแทนที่มีโปรตีนสูง
• ทำซ้ำ / ทำซ้ำ
• การควบคุมอย่างแม่นยำ
• สามารถปรับขนาดได้

immunoprecipitation Protocol สำหรับ immunoblotting ตะวันตก

เอเจนต์

สำหรับการเตรียมความพร้อมของการแก้ปัญหาให้ใช้น้ำบริสุทธิ์เช่น Milli-Q

• 1X ฟอสเฟต Buffered Saline (พีบีเอส)
• 1X เซลล์สลายบัฟเฟอร์: 20 มิลลิเมตร Tris (pH 7.5) 150 มิลลิเมตรโซเดียมคลอไรด์ 1 มิลลิ EDTA, 1 มิลลิ EGTA, 1% Triton X-100 ขนาด 2.5 มมโซเดียมไพโรฟอสเฟต 1 มิลลิβ-glycerophosphate 1 มิลลิ Na3VO4 1 ไมโครกรัม / มล. Leupeptin
  สำคัญ: เพิ่ม 1 มิลลิ PMSF ทันทีก่อนที่จะใช้
• 15 ไมโครลิตรโปรตีน A + 15 ไมโครลิตรกรัมโปรตีนเพียงพอสำหรับ IP แต่มันอาจจะขึ้นอยู่กับแอนติบอดีหลักของคุณและปริมาณตัวอย่าง นอกจากนี้คุณยังสามารถใช้ก่อนผสมโปรตีน A / G agarose (เช่นโปรตีนสำหรับกระต่าย IgG ดึงลงและโปรตีน G สำหรับเมาส์ IgG ดึงลง)
• 3X SDS บัฟเฟอร์ตัวอย่าง: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 ที่ 25 ° C), 6% w / v SDS 30% กลีเซอรอล 150 มิลลิเมตร DTT 0.03% w / v bromophenol สีฟ้า

B. การเตรียมเซลล์ไลเซส

• เก็บเกี่ยวเซลล์ เพื่อเก็บเกี่ยวเซลล์ภายใต้เงื่อนไข nondenaturing เอาสื่อและล้างเซลล์ครั้งกับเย็นพีบีเอส
• นำพีบีเอสและเพิ่ม 0.5 มล. เย็น 1X บัฟเฟอร์เซลล์สลายแต่ละแผ่น (10 ซม.) และฟักไข่แผ่นบนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที
• ขูดเซลล์ปิดแผ่นและโอนไปยังหลอดไมโคร เก็บบนน้ำแข็ง
• Sonicate สองครั้งเป็นเวลา 10 วินาทีในเย็นบัฟเฟอร์ immunoprecipitation (IP บัฟเฟอร์: 50 มิลลิ Tris-HCl [ค่า pH 7.4], 150 มิลลิเมตรโซเดียมคลอไรด์, 5 มิลลิ EDTA, 0.1% NP-40 และการผสมผสานน้ำย่อยยับยั้ง) สำหรับ sonication ที่ VialTweeter หรือการสอบสวน ultrasonicator เช่น UP100H หรือ Uf200 ःที มีความเหมาะสมมากที่สุด
• centrifuge lysates 15,000 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส
• โอนสารละลายไปยังหลอดใหม่ (ถ้าจำเป็น lysate สามารถเก็บไว้ที่ -80 ° C.)
• เพิ่มแอนติบอดีหลักเพื่อใส ใสกับแอนติบอดีหลักบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 4 องศาเซลเซียสภายใต้การกวนแสง แอนติบอดีหลักมีการเพิ่มมักจะอยู่ในปริมาณที่เข้มข้นมากขึ้น 10 เท่ากว่าจะใช้สำหรับซับตะวันตก (คุณอาจเริ่มต้นด้วย1μgต่อ100μL.)
• ใสถูกบ่มแล้วต่อไปด้วยส่วนผสมของจำนวนเงินที่เท่ากันของโปรตีน A-agarose (Invitrogen) และโปรตีน G agarose อีก 1 ชั่วโมง
• ล้าง agarose เม็ดสามครั้งด้วยบัฟเฟอร์ IP หลังจากนั้นสารสกัดจากโปรตีนที่ถูกผูกไว้กับบัฟเฟอร์ระบบ SDS-การโหลดหน้าเว็บโดยใช้ความร้อนที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที

ซี immunoprecipitation

• ใช้เวลา 200 lysate เซลล์ไมโครลิตรและเพิ่มแอนติบอดีหลัก บ่มเพาะกับอ่อนโยนโยกค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียส
• เพิ่มทั้งโปรตีนหรือ G ลูกปัด agarose (20 ไมโครลิตรของลูกปัดสารละลาย 50%) บ่มเพาะกับโยกอ่อนโยนสำหรับ 1-3 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส
• ไมโครเวลา 30 วินาทีที่ 4 ° C ล้างเม็ดห้าครั้ง 500 ไมโครลิตรของ 1X บัฟเฟอร์เซลล์สลาย เก็บบนน้ำแข็งในระหว่างการล้าง
• Resuspend เม็ดกับ 20 ไมโครลิตรบัฟเฟอร์ตัวอย่าง 3X SDS Vortex แล้วไมโคร 30 วินาที
• ความร้อนตัวอย่างเพื่อ 95-100 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2-5 นาทีและไมโครเป็นเวลา 1 นาทีที่ 14,000 X กรัม
• โหลดตัวอย่าง (15-30 ไมโครลิตร) เจล SDS-PAGE (12-15%)
• วิเคราะห์ตัวอย่างโดยวิธี western blotting

วิเคราะห์ดวงตะวันกับ ultrasonicator UP50H

ต่อไปนี้โปรโตคอลที่ใช้ในการศึกษาของ Kriebisch et al, (2011):
โปรตีนรวมที่แยกได้จากเซลล์ MC3T3-E1 รับการรักษาด้วย 1,25 (OH)₂D₃ (10^-8 M) หรือยานพาหนะ เซลล์ที่ถูก lysed กับกันชนที่มี 50 มิลลิ Tris HCl ค่า pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 มิลลิเมตรโซเดียมคลอไรด์ (Fisher Scientific); 0.1% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) และ 0.5% โซเดียม Deoxycholate (เมอร์ค) lysate เซลล์ sonicated สำหรับ 2 × 10 วินาทีในรอบ 1 และความกว้าง 80 ด้วย UP50H อัลตราโซนิกตัวประมวลผล (Hielscher, เทคโนโลยีอัลตราซาวนด์, Teltow, เยอรมนี). หลังจากนั้นวัสดุถูกปั่นสำหรับ10นาทีที่๑๔,๐๐๐รอบต่อนาทีและใสถูกนำมาใช้สำหรับการดูดซับตะวันตก ยี่สิบห้าไมโครกรัมของโปรตีนถูกต้มในบัฟเฟอร์ตัวอย่างและลดตัวแทน (Invitrogen) และต่อมาแยกโดย SDS-หน้าโดยใช้4– 12% polyacrylamide เจล (Invitrogen) และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน nitrocellulose (การดูแลสุขภาพ GE). เมมเบรนถูกบล็อคสำหรับ1ชั่วโมงกับ TBS (10 มิลลิเมตร Tris-HCl; pH ๗.๖; ๑๕๐ mM NaCl) ที่ประกอบด้วย1% เคซีน (Sigma-Aldrich) และ 1% Tris (1 ม.) หลังจากปิดกั้น, เมมเบรนถูก incubated ด้วยความปั่นป่วนเล็กน้อยค้างคืนที่4° c กับแอนติบอดีหลัก (กระต่ายป้องกันมนุษย์ CBS 1/500, พัฒนาในห้องปฏิบัติการของ Prof. อาร์. การบ่มด้วยฮอสแรดิชฮอส (hpr)-ผันแอนติบอดีทุติยภูมิ (dako) ถูกดำเนินการสำหรับ1ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ทั้งหมดได้รับการพัฒนาโดย chemiluminescence ที่เพิ่มขึ้น (Perkin Elmer)

วรรณกรรม / อ้างอิง