อัลตราโซนิก Lysis สําหรับ Western Blotting

• เวสเทิร์นบลอตเป็นขั้นตอนการวิเคราะห์สําหรับการตรวจหาโปรตีนเฉพาะในตัวอย่างของเนื้อเยื่อโฮโมจีเนตหรือสารสกัดจากเซลล์
• ในการเรียกใช้ Western blot หรือเพื่อวัดการทํางานของเอนไซม์การทดสอบจํานวนมากจําเป็นต้องเข้าถึงวัสดุ (เช่นโปรตีนดีเอ็นเอชิ้นส่วนย่อยของเซลล์) ที่ติดอยู่ในเซลล์
• Sonication เป็นวิธีที่เชื่อถือได้และง่ายต่อการจัดการสําหรับการหยุดชะงักของเซลล์และการสลายที่ควบคุมได้

การหยุดชะงักของเซลล์อัลตราโซนิก

การสกัดโปรตีนจากเนื้อเยื่อและเซลล์เพาะเลี้ยงเป็นขั้นตอนแรกสําหรับเทคนิคทางชีวภาพ ชีวเคมี และการวิเคราะห์ (PAGE, Western blotting, ELISA, แมสสเปกโตรเมตรี ฯลฯ) หรือการทําให้โปรตีนบริสุทธิ์ เพื่อให้ได้ผลผลิตโปรตีนสูงวัสดุของเซลล์และเนื้อเยื่อจะต้องถูกขัดขวาง/สลายอย่างมีประสิทธิภาพ ไม่ว่าจะเป็นเซลล์พืชหรือเนื้อเยื่อสัตว์ sonication เป็นวิธีการเตรียมเซลล์ไลเซตของคุณได้ง่ายและรวดเร็ว

ข้อดีของ Sonication

• เร็ว & ซึ่งมีประสิทธิภาพ
• ใช้งานง่าย
• ผลผลิตโปรตีนสูง
• ทําซ้ําได้/ทําซ้ําได้
• ควบคุมได้อย่างแม่นยํา
• ปรับขนาดได้

โปรโตคอลการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันสําหรับ Western Immunoblotting

A. รีเอเจนต์

สําหรับการเตรียมสารละลาย ให้ใช้น้ําบริสุทธิ์ เช่น Milli-Q

• 1X น้ําเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS)
• บัฟเฟอร์การสลายเซลล์ 1X: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM โซเดียมไพโรฟอสเฟต, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
  สําคัญ: เติม 1 mM PMSF ทันทีก่อนใช้งาน
• โปรตีน A 15 ไมโครลิตร+โปรตีน G 15 ไมโครลิตรเพียงพอสําหรับ IP แต่อาจขึ้นอยู่กับแอนติบอดีหลักและปริมาตรตัวอย่างของคุณ คุณยังสามารถใช้โปรตีนอะกาโรส A/ G ที่ผสมไว้ล่วงหน้า (เช่น โปรตีน A สําหรับกระต่าย IgG แบบดึงลง และโปรตีน G สําหรับหนู IgG แบบดึงลง)
• บัฟเฟอร์ตัวอย่าง 3X SDS: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 ที่ 25°C), 6% w/v SDS, กลีเซอรอล 30%, 150 mM DTT, 0.03% w/v โบรโมฟีนอลบลู

B. การเตรียมเซลล์ไลเสท

• เก็บเกี่ยวเซลล์ ในการเก็บเกี่ยวเซลล์ภายใต้สภาวะที่ไม่เปลี่ยนสภาพ ให้นําสื่อออกและล้างเซลล์หนึ่งครั้งด้วย PBS เย็น
• นํา PBS ออกและเติมบัฟเฟอร์การสลายเซลล์ 1X เย็น 0.5 มล. ลงในแต่ละจาน (10 ซม.) และบ่มจานบนน้ําแข็งเป็นเวลา 5 นาที
• ขูดเซลล์ออกจากเพลตและถ่ายโอนไปยังหลอดไมโครเซนตอริ่งเหวี่ยง เก็บไว้บนน้ําแข็ง
• โซนิคสองครั้งเป็นเวลา 10 วินาทีในบัฟเฟอร์การตกตะกอนของภูมิคุ้มกันเย็น (บัฟเฟอร์ IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 และส่วนผสมของสารยับยั้งโปรตีเอส) สําหรับการ sonication ไวอัลทวีตเตอร์ หรือเครื่องอัลตราโซนิกโพรบเช่น UP100H หรือ UP200 ฮิต เหมาะสมที่สุด
• หมุนเหวี่ยงไลเสทที่ 15,000 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่ 4°C
• โอนส่วนเหนือน้ําไปยังหลอดใหม่ (หากจําเป็น สามารถเก็บไลเสทได้ที่ –80°C)
• เพิ่มแอนติบอดีปฐมภูมิให้กับ supernatant ส่วนเหนือน้ําที่มีแอนติบอดีปฐมภูมิถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 4°C ภายใต้การกวนเบา ๆ โดยทั่วไปแล้วแอนติบอดีปฐมภูมิจะถูกเติมในปริมาณที่เข้มข้นกว่าที่ใช้สําหรับการซับแบบตะวันตกถึง 10 เท่า (คุณสามารถเริ่มต้นด้วย 1μg ต่อ 100μL)
• จากนั้นสารน้ําชั้นบนจะถูกบ่มต่อไปด้วยส่วนผสมของโปรตีน A-agarose (Invitrogen) และโปรตีน G agarose ในปริมาณที่เท่ากันอีก 1 ชั่วโมง
• ล้างเม็ดอะกาโรสสามครั้งด้วยบัฟเฟอร์ IP หลังจากนั้น สกัดโปรตีนที่ผูกมัดด้วยบัฟเฟอร์โหลด SDS-PAGE โดยให้ความร้อนที่ 95°C เป็นเวลา 5 นาที

C. การตกตะกอนของภูมิคุ้มกัน

• ใช้ไลเสทเซลล์ 200 ไมโครลิตรและเพิ่มแอนติบอดีปฐมภูมิ ฟักด้วยการโยกเบา ๆ ค้างคืนที่อุณหภูมิ 4°C
• เพิ่มลูกปัดโปรตีน A หรือ G (สารละลายลูกปัด 50% 20 ไมโครลิตร) ฟักด้วยการโยกเบา ๆ เป็นเวลา 1-3 ชั่วโมงที่ 4°C
• ไมโครเซนทราเวลเป็นเวลา 30 วินาทีที่ 4°C ล้างเม็ดห้าครั้งด้วยบัฟเฟอร์การสลายเซลล์ 1X 500 ไมโครลิตร เก็บน้ําแข็งระหว่างการซัก
• ระงับเม็ดอีกครั้งด้วยบัฟเฟอร์ตัวอย่าง 20X SDS 3 ไมโครลิตร Vortex จากนั้นหมุนเหวี่ยงขนาดเล็กเป็นเวลา 30 วินาที
• อุ่นตัวอย่างที่ 95–100°C เป็นเวลา 2-5 นาที และเครื่องหมุนเหวี่ยงขนาดเล็กเป็นเวลา 1 นาทีที่ 14,000 X g
• ใส่ตัวอย่าง (15–30 μl) บนเจล SDS-PAGE (12–15%)
• วิเคราะห์ตัวอย่างโดยการพ่นแบบตะวันตก

การวิเคราะห์ Western Blot ด้วย Sonicator UP50H

โปรโตคอลต่อไปนี้โดยใช้เครื่องสะท้อนเสียงแบบโพรบ UP50H ถูกนํามาใช้ในการศึกษาของ Kriebisch et al. (2011):
โปรตีนทั้งหมดถูกแยกออกจากเซลล์ MC3T3-E1 ที่ผ่านการบําบัดด้วย 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) หรือยานพาหนะ เซลล์ถูกไลซิสด้วยบัฟเฟอร์ที่มี 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 มิลลิเมตร NaCl (ฟิชเชอร์ไซเอนเชียล); โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) 0.1% (ฟิชเชอร์ไซเอนเชียล); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) และโซเดียมดีออกซีโคเลต 0.5% (Merck) เซลล์ไลเสทถูกโซนิกเป็นเวลา 2 × 10 วินาทีที่รอบที่ 1 และแอมพลิจูด 80 ด้วย UP50H โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิก (Hielscher, เทคโนโลยีอัลตราซาวนด์, Teltow, เยอรมนี) หลังจากนั้นวัสดุจะถูกหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 10 นาทีที่ 14,000 รอบต่อนาที และใช้สารเหนือน้ําสําหรับการซับแบบตะวันตก โปรตีนยี่สิบห้าไมโครกรัมถูกต้มในบัฟเฟอร์ตัวอย่างและสารรีดิวซ์ (Invitrogen) และต่อมาแยกโดย SDS-PAGE โดยใช้เจลโพลีอะคริลาไมด์ 4-12% (Invitrogen) และถ่ายโอนไปยังเมมเบรนไนโตรเซลลูโลส (GE health care) เมมเบรนถูกปิดกั้นเป็นเวลา 1 ชั่วโมงด้วย TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl) ที่มีเคซีน 1% (Sigma-Aldrich) และ 1% Tris (1 M) หลังจากปิดกั้น เมมเบรนจะถูกบ่มด้วยการกวนเล็กน้อยค้างคืนที่อุณหภูมิ 4°C ด้วยแอนติบอดีหลัก (กระต่ายต่อต้านมนุษย์ CBS 1/500 พัฒนาขึ้นในห้องปฏิบัติการของ Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA) การฟักตัวด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิคอนจูเกตมะรุมเปอร์ออกซิเดส (HPR) (Dako) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง รอยเปื้อนทั้งหมดได้รับการพัฒนาโดยเคมีเรืองแสงที่เพิ่มขึ้น (Perkin Elmer)
 

คลิกที่นี่เพื่ออ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุดสําหรับการสลายเซลล์อัลตราโซนิกและการสกัดการเตรียมการไลเซตและคําแนะนําสําหรับการปรับปรุงกระบวนการ!
 
ตารางด้านล่างให้ข้อบ่งชี้เกี่ยวกับความสามารถในการประมวลผลโดยประมาณของเครื่องอัลตราโซนิกขนาดห้องปฏิบัติการของเรา:

วรรณกรรม / อ้างอิง