การสลายเซลล์ที่ผ่านวิศวกรรมชีวภาพด้วยอัลตราซาวนด์ในการผลิตระดับอุตสาหกรรม

แบคทีเรียชนิดต่าง ๆ ที่ผ่านวิศวกรรมชีวภาพ เช่น E. coli รวมถึงเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและเซลล์พืชที่ดัดแปลงพันธุกรรม มีการใช้อย่างแพร่หลายในเทคโนโลยีชีวภาพเพื่อแสดงออกโมเลกุล การปลดปล่อยชีวโมเลกุลที่สังเคราะห์ขึ้นเหล่านี้จำเป็นต้องใช้เทคนิคการทำลายเซลล์ที่เชื่อถือได้ การใช้อัลตราซาวนด์สมรรถนะสูงเป็นวิธีที่ได้รับการพิสูจน์แล้วสำหรับการสลายเซลล์อย่างมีประสิทธิภาพและเชื่อถือได้ – สามารถขยายขนาดเพื่อรองรับปริมาณงานสูงได้อย่างง่ายดาย Hielscher Ultrasonics นำเสนออุปกรณ์อัลตราซาวนด์สมรรถนะสูงสำหรับการสลายเซลล์อย่างมีประสิทธิผล เพื่อผลิตชีวโมเลกุลคุณภาพสูงในปริมาณมาก

การสกัดโมเลกุลจากโรงงานเซลล์

ในการผลิตชีวโมเลกุลหลากหลายชนิด สามารถใช้จุลินทรีย์และเซลล์พืชที่ผ่านการปรับแต่งทางวิศวกรรมหลายชนิดเป็นโรงงานเซลล์จุลินทรีย์ได้ ได้แก่ Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana และสาหร่าย รวมถึงอีกหลายชนิด โรงงานเซลล์เหล่านี้สามารถผลิตโปรตีน ลิพิด สารชีวเคมี พอลิเมอร์ เชื้อเพลิงชีวภาพ และสารเคมีจากน้ำมันและไขมัน ซึ่งใช้เป็นอาหารหรือวัตถุดิบสำหรับการประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรม เซลล์ที่ใช้เป็นโรงงานเซลล์จะเพาะเลี้ยงในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพแบบปิด ซึ่งสามารถให้ประสิทธิภาพสูง มีความจำเพาะ และมีความต้องการพลังงานต่ำ
ในการแยกโมเลกุลเป้าหมายออกจากเซลล์เพาะเลี้ยงที่ผ่านวิศวกรรมชีวภาพ ต้องทำลายเซลล์เพื่อปลดปล่อยสารภายในเซลล์ เครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์เป็นเทคนิคที่ได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางว่ามีความน่าเชื่อถือและประสิทธิภาพสูงสำหรับการทำให้เซลล์แตกสลายและปลดปล่อยสารประกอบ

โรงงานเซลล์จุลินทรีย์คือเซลล์ที่ผ่านวิศวกรรมเมแทบอลิซึมเพื่อใช้สังเคราะห์สารประกอบที่มีคุณค่าหลากหลายชนิด การทำลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพและเชื่อถือได้ในการปลดปล่อยสารประกอบที่มีคุณค่าออกจากภายในเซลล์
การศึกษาและภาพประกอบ: ©Villaverde, 2010.

ข้อดีของเครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์

เนื่องจากเป็นเทคโนโลยีที่ไม่ใช้ความร้อน มีความอ่อนโยน แต่มีประสิทธิภาพสูง เครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์จึงใช้ในห้องปฏิบัติการและอุตสาหกรรมเพื่อสลายเซลล์และผลิตสารสกัดคุณภาพสูง เช่น ใช้แยกโมเลกุลออกจากโรงงานเซลล์

อัลตราซาวนด์กำลังสูงสำหรับการทำลายโรงงานเซลล์จุลินทรีย์อย่างมีประสิทธิภาพ

กลไกและผลของเครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์:
การทำลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์ใช้พลังของคลื่นอัลตราซาวนด์ เครื่องโฮโมจีไนเซอร์ / เครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์ติดตั้งโพรบ (หรือที่เรียกว่าโซโนโทรด) ที่ทำจากโลหะผสมไทเทเนียม ซึ่งสั่นที่ความถี่สูงประมาณ 20 kHz ซึ่งหมายความว่าโพรบอัลตราซาวนด์ถ่ายทอดการสั่นสะเทือน 20,000 ครั้งต่อวินาทีเข้าสู่ของเหลวที่ได้รับอัลตราซาวนด์ คลื่นอัลตราซาวนด์ที่ถ่ายทอดเข้าสู่ของเหลวมีลักษณะเป็นวัฏจักรความดันสูง / ความดันต่ำสลับกัน ในช่วงวัฏจักรความดันต่ำ ของเหลวจะขยายตัวและเกิดฟองสุญญากาศขนาดเล็กมาก ฟองขนาดเล็กมากเหล่านี้จะเติบโตผ่านวัฏจักรความดันสลับกันหลายรอบจนไม่สามารถดูดซับพลังงานเพิ่มเติมได้ ณ จุดนี้ ฟองคาวิเทชันจะยุบตัวอย่างรุนแรงและก่อให้เกิดสภาวะแวดล้อมเฉพาะที่ที่มีความหนาแน่นของพลังงานสูงเป็นพิเศษ ปรากฏการณ์นี้เรียกว่าคาวิเทชันทางเสียง โดยมีลักษณะเฉพาะคือเกิดอุณหภูมิสูงมาก ความดันสูงมาก และแรงเฉือนในบริเวณเฉพาะที่ ความเค้นเฉือนเหล่านี้ทำลายผนังเซลล์อย่างมีประสิทธิภาพและเพิ่มการถ่ายเทมวลระหว่างภายในเซลล์กับตัวทำละลายที่อยู่รอบเซลล์ แรงเฉือนที่เกิดจากอัลตราซาวนด์เป็นเทคนิคเชิงกลล้วน ๆ ซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายและเป็นวิธีที่แนะนำสำหรับการทำลายเซลล์แบคทีเรีย รวมถึงการแยกโปรตีน การใช้อัลตราซาวนด์เป็นวิธีทำลายเซลล์ที่เรียบง่ายและรวดเร็ว จึงเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการแยกสารในปริมาตรขนาดเล็ก กลาง และใหญ่ เครื่องอัลตราซาวนด์แบบดิจิทัลของ Hielscher มีเมนูการตั้งค่าที่ชัดเจนสำหรับควบคุมการใช้อัลตราซาวนด์อย่างแม่นยำ ข้อมูลการใช้อัลตราซาวนด์ทั้งหมดจะถูกบันทึกโดยอัตโนมัติลงในการ์ด SD ที่ติดตั้งภายในและเข้าถึงได้ง่าย ตัวเลือกการระบายความร้อนที่มีความซับซ้อน เช่น การทำความเย็นจากภายนอก การใช้อัลตราซาวนด์ในโหมดพัลส์ เป็นต้น ระหว่างกระบวนการทำให้เซลล์แตกสลายด้วยอัลตราซาวนด์ ช่วยให้มั่นใจว่าจะรักษาอุณหภูมิกระบวนการที่เหมาะสมที่สุดไว้ได้ และด้วยเหตุนี้จึงรักษาความสมบูรณ์ของสารประกอบที่ไวต่อความร้อนซึ่งสกัดออกมา

งานวิจัยยืนยันจุดแข็งของการทำลายเซลล์และการสกัดด้วยอัลตราซาวนด์

ศาสตราจารย์ Chemat และคณะ (2017) สรุปในการศึกษาว่า “การสกัดโดยใช้อัลตราซาวนด์ช่วยเป็นทางเลือกที่เป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อมและคุ้มค่าทางเศรษฐกิจ เมื่อเทียบกับเทคนิคดั้งเดิมสำหรับอาหารและผลิตภัณฑ์ธรรมชาติ ประโยชน์หลักคือการลดเวลาในการสกัดและการแปรรูป ปริมาณพลังงานและตัวทำละลายที่ใช้ การดำเนินการหน่วย และการปล่อย CO₂ ”
Gabig-Ciminska และคณะ (2014) ใช้เครื่องโฮโมจีไนเซอร์ความดันสูงและเครื่องทำให้เซลล์แตกสลายด้วยอัลตราซาวนด์ในการศึกษาเพื่อสลายสปอร์และปลดปล่อย DNA เมื่อเปรียบเทียบวิธีทำลายเซลล์ทั้งสองวิธี ทีมวิจัยสรุปเกี่ยวกับการสลายเซลล์เพื่อให้ได้ DNA จากสปอร์ว่า “ได้ทำการวิเคราะห์โดยใช้สารจากเซลล์ที่สลายด้วยการโฮโมจีไนซ์ความดันสูง หลังจากนั้น เราตระหนักว่าการทำลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์มีข้อดีที่โดดเด่นสำหรับวัตถุประสงค์นี้ วิธีนี้ค่อนข้างรวดเร็วและสามารถใช้กับตัวอย่างปริมาตรน้อยได้” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

ชีวโมเลกุลจากโรงงานเซลล์สำหรับการผลิตอาหาร

โรงงานเซลล์จุลินทรีย์เป็นวิธีการผลิตที่สามารถใช้งานได้จริงและมีประสิทธิภาพ โดยใช้สิ่งมีชีวิตจุลินทรีย์เพื่อผลิตเมแทบอไลต์ทั้งที่มีอยู่ตามธรรมชาติและที่ไม่มีอยู่ตามธรรมชาติในจุลินทรีย์นั้นให้ได้ผลผลิตสูง ผ่านวิศวกรรมชีวภาพด้านเมแทบอลิซึมของจุลินทรีย์ เช่น แบคทีเรีย ยีสต์ รา เป็นต้น ตัวอย่างเช่น เอนไซม์ปริมาณมากผลิตโดยใช้จุลินทรีย์ เช่น Aspergillus oryzae รา และแบคทีเรีย เอนไซม์ที่ผลิตในปริมาณมากเหล่านี้ใช้ในการผลิตอาหารและเครื่องดื่ม รวมถึงในการเกษตร พลังงานชีวภาพ และการดูแลบ้านเรือน
แบคทีเรียบางชนิด เช่น Acetobacter xylinum และ Gluconacetobacter xylinus ผลิตเซลลูโลสระหว่างกระบวนการหมัก ซึ่งเส้นใยนาโนจะถูกสังเคราะห์ผ่านกระบวนการจากล่างขึ้นบน เซลลูโลสจากแบคทีเรีย (หรือที่เรียกว่าเซลลูโลสจากจุลินทรีย์) มีองค์ประกอบทางเคมีเทียบเท่ากับเซลลูโลสจากพืช แต่มีระดับความเป็นผลึกสูงและมีความบริสุทธิ์สูง (ปราศจากลิกนิน เฮมิเซลลูโลส เพกทิน และองค์ประกอบอื่น ๆ ที่มีต้นกำเนิดทางชีวภาพ) รวมถึงมีโครงสร้างเฉพาะเป็นโครงข่ายตาข่ายสามมิติ (3D) ที่ถักทอจากเส้นใยนาโนเซลลูโลส (ดู Zhong, 2020) เมื่อเปรียบเทียบกับเซลลูโลสที่ได้จากพืช เซลลูโลสจากแบคทีเรียมีความยั่งยืนมากกว่า และเซลลูโลสที่ผลิตได้มีความบริสุทธิ์โดยไม่ต้องใช้ขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ที่ซับซ้อน การใช้อัลตราซาวนด์และการสกัดด้วยตัวทำละลายโดยใช้ NaOH หรือ SDS (โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต) มีประสิทธิภาพมากในการแยกเซลลูโลสจากแบคทีเรียออกจากเซลล์แบคทีเรีย

ชีวโมเลกุลจากโรงงานเซลล์สำหรับการผลิตยาและวัคซีน

หนึ่งในผลิตภัณฑ์ยาที่โดดเด่นที่สุดที่ได้จากโรงงานเซลล์คืออินซูลินของมนุษย์ การผลิตอินซูลินด้วยวิศวกรรมชีวภาพใช้ E. coli และ Saccharomyces cerevisiae เป็นหลัก เนื่องจากโมเลกุลขนาดนาโนที่สังเคราะห์ทางชีวภาพมีความเข้ากันได้ทางชีวภาพสูง อนุภาคนาโนทางชีวภาพ เช่น เฟอร์ริติน จึงเป็นประโยชน์ต่อการประยุกต์ใช้ในการผลิตทางชีวภาพหลายรูปแบบ นอกจากนี้ การผลิตในจุลินทรีย์ที่ผ่านวิศวกรรมเมแทบอลิซึมมักมีประสิทธิผลสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญในแง่ผลผลิตที่ได้ ตัวอย่างเช่น การผลิต artemisinic acid, resveratrol และ lycopene เพิ่มขึ้นตั้งแต่สิบเท่าถึงหลายร้อยเท่า และมีการนำไปใช้ในการผลิตระดับอุตสาหกรรมแล้ว หรืออยู่ระหว่างการพัฒนาไปสู่การผลิตระดับอุตสาหกรรม (ดู Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
ตัวอย่างเช่น ชีวโมเลกุลขนาดนาโนที่มีโปรตีนเป็นองค์ประกอบหลักและมีคุณสมบัติประกอบตัวเอง เช่น เฟอร์ริตินและอนุภาคคล้ายไวรัส มีความน่าสนใจเป็นพิเศษสำหรับการพัฒนาวัคซีน เนื่องจากเลียนแบบทั้งขนาดและโครงสร้างของเชื้อก่อโรค และสามารถเชื่อมแอนติเจนเข้ากับพื้นผิวเพื่อส่งเสริมปฏิสัมพันธ์กับเซลล์ภูมิคุ้มกัน โมเลกุลเหล่านี้มีการแสดงออกในสิ่งที่เรียกว่าโรงงานเซลล์ (เช่น สายพันธุ์ E. coli ที่ผ่านการปรับแต่งทางวิศวกรรม) ซึ่งผลิตโมเลกุลเป้าหมายชนิดหนึ่ง

ขั้นตอนการสลาย E. coli BL21 ด้วยอัลตราซาวนด์เพื่อปลดปล่อยเฟอร์ริติน

เฟอร์ริตินเป็นโปรตีนที่มีหน้าที่หลักในการเก็บสะสมเหล็ก เฟอร์ริตินแสดงศักยภาพที่น่าสนใจในการเป็นอนุภาคนาโนที่ประกอบตัวเองสำหรับวัคซีน โดยใช้เป็นพาหนะนำส่งวัคซีน (เช่น โปรตีนหนามของ SARS-Cov-2) งานวิจัยทางวิทยาศาสตร์ของ Sun และคณะ (2016) แสดงว่าเฟอร์ริตินรีคอมบิแนนท์สามารถถูกปลดปล่อยจาก Escherichia coli ในรูปที่ละลายได้ที่ความเข้มข้น NaCl ต่ำ (≤50 mmol/L) เพื่อให้เกิดการแสดงออกของเฟอร์ริตินใน E. coli BL21 และปลดปล่อยเฟอร์ริติน ได้ใช้ขั้นตอนต่อไปนี้อย่างประสบความสำเร็จ พลาสมิดรีคอมบิแนนท์ pET-28a/ferritin ถูกนำเข้าสู่สายพันธุ์ E coli BL21 (DE3) โดยการทรานส์ฟอร์เมชัน เซลล์ E coli BL21 (DE3) ที่ผลิตเฟอร์ริตินถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ LB ที่มีคานามัยซิน 0.5% ที่ 37°C และถูกเหนี่ยวนำเมื่อค่า OD600 เท่ากับ 0.6 ด้วย isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside 0.4% เป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 37°C จากนั้นเก็บเซลล์จากการเพาะเลี้ยงขั้นสุดท้ายโดยปั่นเหวี่ยงที่ 8000g เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4°C และเก็บตะกอนเซลล์ แล้วนำตะกอนเซลล์กลับมาแขวนลอยในอาหารเลี้ยงเชื้อ LB (NaCl 1%, Typone 1%, สารสกัดจากยีสต์ 0.5%)/บัฟเฟอร์สำหรับสลายเซลล์ (Tris 20 mmol/L, NaCl 50 mmol/L, EDTA 1 mmol/L, pH 7.6) และสารละลาย NaCl ที่ความเข้มข้นต่าง ๆ (0, 50, 100, 170 และ 300 mmol/L) ตามลำดับ สำหรับการสลายเซลล์แบคทีเรีย ใช้อัลตราซาวนด์ในโหมดพัลส์ เช่น ใช้ เครื่องอัลตราซาวนด์ UP400St ที่แอมพลิจูด 100% โดยมีรอบการทำงานเปิด 5 วินาที ปิด 10 วินาที จำนวน 40 รอบ) จากนั้นปั่นเหวี่ยงที่ 10 000g เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4°C ของเหลวส่วนใสเหนือตะกอนและตะกอนถูกวิเคราะห์ด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสในเจลพอลิอะคริลาไมด์ที่มีโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS-PAGE) เจลทั้งหมดที่ย้อมด้วยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟตถูกสแกนด้วยเครื่องสแกนความละเอียดสูง ภาพเจลถูกวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ Magic Chemi 1D เพื่อให้ได้ความชัดเจนสูงสุด มีการตรวจหาแถบโปรตีนโดยปรับพารามิเตอร์ ข้อมูลของแถบโปรตีนได้จากการทำซ้ำทางเทคนิคสามครั้ง (ดู Sun et al., 2016)

เครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์สำหรับการสลายโรงงานเซลล์ระดับอุตสาหกรรม

การสลายเซลล์และการสกัดด้วยอัลตราซาวนด์เป็นวิธีที่เชื่อถือได้และสะดวกในการปลดปล่อยเมแทบอไลต์จากโรงงานเซลล์ จึงช่วยให้ผลิตโมเลกุลเป้าหมายได้อย่างมีประสิทธิผล เครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์มีให้เลือกตั้งแต่ขนาดห้องปฏิบัติการถึงขนาดอุตสาหกรรม และสามารถขยายขนาดกระบวนการได้แบบเชิงเส้นอย่างสมบูรณ์
Hielscher Ultrasonics เป็นพันธมิตรที่มีความเชี่ยวชาญด้านเครื่องทำลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์สมรรถนะสูง และมีประสบการณ์ยาวนานในการติดตั้งระบบอัลตราซาวนด์สำหรับการใช้งานบนโต๊ะปฏิบัติการและในอุตสาหกรรม
ในด้านฮาร์ดแวร์และซอฟต์แวร์ที่มีความซับซ้อน ระบบทำลายเซลล์ของ Hielscher Ultrasonics ตอบสนองข้อกำหนดทั้งหมดสำหรับการควบคุมกระบวนการอย่างเหมาะสมที่สุด การใช้งานที่ง่าย และความสะดวกสำหรับผู้ใช้ ลูกค้าและผู้ใช้เครื่องอัลตราซาวนด์ของ Hielscher ให้คุณค่ากับข้อดีที่เครื่องทำลายเซลล์และเครื่องสกัดด้วยอัลตราซาวนด์ของ Hielscher ช่วยให้ติดตามและควบคุมกระบวนการได้อย่างแม่นยำ – ผ่านจอสัมผัสแบบดิจิทัลและการควบคุมระยะไกลผ่านเบราว์เซอร์ ข้อมูลการใช้อัลตราซาวนด์ที่สำคัญทั้งหมด (เช่น พลังงานสุทธิ พลังงานรวม แอมพลิจูด ระยะเวลา อุณหภูมิ ความดัน) จะถูกบันทึกโดยอัตโนมัติเป็นไฟล์ CSV ลงในการ์ด SD ที่ติดตั้งภายใน ซึ่งช่วยให้ได้ผลลัพธ์ที่ทำซ้ำได้ทั้งภายใต้สภาวะที่แตกต่างกันและสภาวะเดิม และอำนวยความสะดวกในการกำหนดมาตรฐานกระบวนการ รวมถึงการปฏิบัติตามหลักเกณฑ์วิธีการที่ดีในการผลิต (cGMP)
แน่นอนว่าเครื่องประมวลผลด้วยอัลตราซาวนด์ของ Hielscher ถูกสร้างขึ้นสำหรับการทำงาน 24/7 ภายใต้ภาระเต็มกำลัง จึงสามารถใช้งานได้อย่างเชื่อถือได้ในสภาพแวดล้อมการผลิตระดับอุตสาหกรรม เนื่องจากมีความทนทานสูงและต้องการการบำรุงรักษาน้อย ระยะเวลาหยุดทำงานของอุปกรณ์อัลตราซาวนด์จึงต่ำมาก คุณสมบัติ CIP (การทำความสะอาดในที่) และ SIP (การทำให้ปราศจากเชื้อในที่) ช่วยลดงานทำความสะอาดที่ใช้แรงงานมาก โดยเฉพาะเนื่องจากชิ้นส่วนทั้งหมดที่สัมผัสของเหลวเป็นพื้นผิวโลหะเรียบ (ไม่มีรูเปิดหรือหัวฉีดที่ซ่อนอยู่)

ตารางด้านล่างแสดงกำลังการประมวลผลโดยประมาณของเครื่องอัลตราซาวนด์ของเรา: