การเตรียมพลาสมิดด้วยอัลตราโซนิก

การใช้อัลตราโซนิกเป็นเทคนิคที่เชื่อถือได้ในการทำให้ DNA พลาสมิดแตกเป็นชิ้นส่วน แอมพลิจูดที่ควบคุมได้อย่างแม่นยำ โหมดพัลส์ และการควบคุมอุณหภูมิเป็นคุณสมบัติที่สำคัญที่สุดของเครื่องอัลตราโซนิกสำหรับการทำให้พลาสมิดแตกเป็นชิ้นส่วนโดยไม่เกิดความเสียหาย นอกจากนี้ การใช้สารบางชนิดยังช่วยป้องกันการเสื่อมสลายของพลาสมิด Hielscher Ultrasonics มีโซลูชันหลากหลายสำหรับการทำให้พลาสมิดแตกเป็นชิ้นส่วนอย่างควบคุมได้ ตั้งแต่ตัวอย่างในขวดเดี่ยว การใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับตัวอย่างจำนวนมากพร้อมกัน ไปจนถึงเพลตหลายหลุม เรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับการทำให้พลาสมิดแตกเป็นชิ้นส่วนด้วยอัลตราโซนิกอย่างได้ผล!

การเฉือนพลาสมิดด้วยอัลตราโซนิก

เมื่อตัวอย่าง DNA ได้รับคลื่นอัลตราโซนิก การสั่นสะเทือนที่เกิดจากอัลตราโซนิกจะก่อให้เกิดคาวิเทชันทางเสียงในของเหลว ซึ่งเฉือนหรือทำให้โมเลกุล DNA ที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงแตกด้วยแรงเชิงกล การใช้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นวิธีที่ใช้แพร่หลายที่สุดในการทดลองเฉือน DNA ในปริมาณมาก รวมถึงการประยุกต์ใช้ เช่น การตกตะกอนโครมาตินด้วยภูมิคุ้มกัน (Chromatin Immunoprecipitation; ChIP) ซึ่งขนาดชิ้นส่วนที่เล็กมีความจำเป็นอย่างยิ่งเพื่อให้ได้ความละเอียดสูง (เทียบกับ Tseng et al., 2012)
DNA พลาสมิด (pDNA) เป็น DNA รูปแบบเฉพาะที่มีลักษณะเป็นวงแหวน และพบในแบคทีเรียและยูคาริโอตบางชนิด
pDNA แบบขดเกลียวยิ่งยวดเป็นรูปแบบ DNA พลาสมิดที่ต้องการ เนื่องจากให้ผลดีที่สุดในกระบวนการปลายทาง เช่น การหาลำดับเบสแบบอัตโนมัติและการทรานส์เฟกชัน การใช้อัลตราโซนิกเหมาะสำหรับการทำให้ pDNA รวมถึง pDNA แบบขดเกลียวยิ่งยวดแตกเป็นชิ้นส่วนได้อย่างได้ผล
Thompson et al. (2008) แสดงให้เห็นว่าการใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับพลาสมิด ซึ่งเป็นที่ทราบว่าสามารถทำให้ DNA แบบขดเกลียวยิ่งยวดแตกเป็นชิ้นส่วนได้ เป็นวิธีที่มีประสิทธิผลในการเพิ่มความยาวของลำดับเบสที่อ่านได้ที่ระดับ phred20 จนไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากแม่แบบควบคุมของ Beckman Coulter หรือพลาสมิดที่ทำให้เป็นเส้นตรงด้วยเอนไซม์

การใช้เวกเตอร์พลาสมิด

พลาสมิดมักใช้เป็นเครื่องมือในการโคลน ถ่ายโอน และดัดแปลงยีน เมื่อใช้พลาสมิดในการทดลองเพื่อวัตถุประสงค์เหล่านี้ จะเรียกพลาสมิดว่าเวกเตอร์ สามารถแทรกชิ้นส่วน DNA หรือยีนเข้าไปในเวกเตอร์พลาสมิด ทำให้เกิดสิ่งที่เรียกว่าพลาสมิดรีคอมบิแนนท์ เวกเตอร์พลาสมิดใช้เป็นพาหะนำ DNA รีคอมบิแนนท์เข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน และเป็นองค์ประกอบสำคัญของการโคลนระดับโมเลกุล
“เวกเตอร์ที่ไม่ใช่ไวรัสกำลังได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางถึงศักยภาพในการใช้ยีนบำบัดเพื่อรักษาโรคซับซ้อนหลากหลายชนิด เวกเตอร์ที่ไม่ใช่ไวรัสปกป้อง DNA พลาสมิดจากการเสื่อมสลายทางกายภาพ ทางเคมี และจากเอนไซม์ และนำส่งโมเลกุล DNA ไปยังตำแหน่งเป้าหมาย ตัวอย่างเช่น ไลโปโซมประจุบวก ไคโตซาน และอนุภาคนาโนประจุบวกชนิดอื่น ๆ เกิดเป็นสารเชิงซ้อนกับ DNA พลาสมิดผ่านอันตรกิริยาทางไฟฟ้าสถิต อย่างไรก็ตาม สารเชิงซ้อนไลโปโซมประจุบวก/DNA พลาสมิดที่ก่อตัวได้ง่ายมีขนาดค่อนข้างใหญ่ (กล่าวคือ 300–400 nm) และมีลักษณะไม่เป็นเนื้อเดียวกัน ทำให้ใช้ในการประยุกต์ทางเภสัชกรรมได้ยาก สารเชิงซ้อน DNA พลาสมิด/ไลโปโซม DNA พลาสมิด/ละอองลอย และ DNA พลาสมิด/เปปไทด์ที่มีขนาดใหญ่และไม่เป็นเนื้อเดียวกัน สามารถลดขนาดให้เป็นอนุภาคที่เล็กลงและเป็นเนื้อเดียวกันได้ด้วยอัลตราโซนิก” (Sarker et al., 2019)
ตัวอย่างที่โดดเด่นของการใช้เวกเตอร์พลาสมิดคือ CRISPR–Cas9 โดยทั่วไป ระบบ CRISPR–Cas9 จะถูกนำส่งเข้าสู่เซลล์ในรูปของพลาสมิดขนาดใหญ่เพียงตัวเดียวหรือพลาสมิดขนาดเล็กหลายตัวที่เข้ารหัสลำดับเป้าหมาย ตัวนำทาง CRISPR และ Cas9

การเตรียมอนุภาคนาโน PLGA ที่บรรจุ DNA ด้วยอัลตราโซนิกโดยการตกตะกอนระดับนาโน

Jo et al. (2020) ใช้ poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) เพื่อสร้างพาหะอนุภาคนาโนสำหรับนำส่งพลาสมิด CRISPR–Cas9 ต้นแบบเข้าสู่แมโครฟาจปฐมภูมิที่ได้จากไขกระดูก ในการตกตะกอนระดับนาโนเพื่อสร้างอนุภาคนาโน PLGA ได้ใช้ PLGA ที่มีหมู่ปลายสองชนิดต่างกัน (หมู่เอสเทอร์และหมู่เอมีน) โดยมีเป้าหมายให้หมู่เอมีนประจุบวกที่ปลายเพิ่มประสิทธิภาพการห่อหุ้มและการบรรจุ เนื่องจากอันตรกิริยาระหว่างประจุของหมู่ดังกล่าวกับโครงสายหลักของ DNA ที่มีประจุลบ ละลาย Pluronic F127 ปริมาณ 100 mg ในน้ำปราศจากไอออน (DI) ที่ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อด้วยหม้อนึ่งความดัน ปริมาตร 20 mL ภายในหลอดปั่นเหวี่ยงทรงกรวยที่ทำจากพอลิโพรพิลีนขนาด 50 mL โดยผสมด้วยเครื่องวอร์เทกซ์ แล้วใช้คลื่นอัลตราโซนิกอย่างอ่อนโยนเป็นเวลา 30 min ด้วยอ่างอัลตราโซนิก (ดู CupHorn) เติมแท่งกวนแม่เหล็กที่ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อด้วยหม้อนึ่งความดัน และผสมสารละลายที่ 600 RPM เป็นเวลา 30 min ระหว่างเตรียมสารละลายอื่น ๆ ใช้อุปกรณ์ห้องปฏิบัติการที่ทำจากพลาสติกแทนเครื่องแก้วตลอดกระบวนการ เพื่อลดการดูดซับ DNA แบบไม่จำเพาะให้น้อยที่สุด เตรียมสารละลาย PLGA ใน DMF (44.48 mg/ ml) และสารละลาย TIPS pentacene ใน THF (0.667 mg/ml) แยกกัน ปล่อย PLGA ไว้นิ่ง ๆ ให้เปียกชุ่มใน DMF เป็นเวลา 30 min ก่อนใช้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นเวลา 30 min (ดูขั้นตอนฉบับเต็มใน Jo et al., 2020)

การปกป้อง DNA พลาสมิดระหว่างการใช้คลื่นอัลตราโซนิก

DNA รวมถึงพลาสมิดและพลาสมิดแบบขดเกลียวยิ่งยวดไวต่อการเสื่อมสลายอย่างมาก วิธีการทำให้แตกเป็นชิ้นส่วนที่มีอยู่ทั้งหมดมีข้อเสียบางประการซึ่งเป็นที่ทราบกัน การทำให้ DNA แตกเป็นชิ้นส่วนด้วยอัลตราโซนิกเป็นวิธีหนึ่งที่ได้รับความนิยม เนื่องจากการใช้คลื่นอัลตราโซนิกอย่างควบคุมได้ร่วมกับมาตรการป้องกันช่วยลดความเสียหายของสาย DNA ที่เกิดจากแรงเฉือนและความร้อนได้
นอกเหนือจากการตั้งค่าแอมพลิจูดต่ำ โหมดพัลส์ และการควบคุมอุณหภูมิระหว่างการเฉือน DNA ด้วยอัลตราโซนิกแล้ว การใช้สารบางชนิดยังแสดงผลในการป้องกันการเสื่อมสลายของ DNA อย่างมีนัยสำคัญ ตัวอย่างเช่น พอลิเมอร์ เปปไทด์ และลิพิดหลายชนิดช่วยปกป้อง DNA พลาสมิดระหว่างการใช้คลื่นอัลตราโซนิก

ศึกษาความเสถียรของ DNA พลาสมิดและสารเชิงซ้อนนาโน DNA พลาสมิด/IL ต่อความเค้นเฉือนจากอัลตราโซนิกด้วยการทดสอบอิเล็กโทรโฟรีซิสบนเจลอะกาโรส ทั้ง DNA พลาสมิดและสารเชิงซ้อนนาโน DNA พลาสมิด/IL ได้รับความเค้นเฉือนจากอัลตราโซนิกเป็นระยะเวลาต่าง ๆ โดย DNA พลาสมิดได้รับความเค้นเฉือนจากอัลตราโซนิกเป็นเวลา 0, 10, 20, 30 และ 40 นาที ส่วนสารเชิงซ้อนนาโน DNA พลาสมิด/IL ได้รับความเค้นเฉือนจากอัลตราโซนิกเป็นเวลา 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 และ 120 นาที
(การศึกษาและภาพ: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) แสดงให้เห็นว่า เมื่อโครงสร้างนาโน DNA พลาสมิด / ของเหลวไอออนิก (pDNA/IL) ได้รับความเค้นเฉือนจากอัลตราโซนิกเป็นเวลา 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 และ 120 min แล้วนำมาสร้างสารเชิงซ้อนกับ lipofectamine ซึ่งเป็นสารนำส่งยีนประจุบวกที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ ร้อยละของเซลล์ที่ให้ผลบวกต่อการเรืองแสงเท่ากับ 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% และ 50% ตามลำดับ (ดูแผนภูมิด้านล่าง) ร้อยละของเซลล์ที่ให้ผลบวกต่อการเรืองแสงเพิ่มขึ้นเมื่อโครงสร้างนาโนได้รับความเค้นเฉือนจากอัลตราโซนิกเป็นเวลา 10 และ 20 min และหลังจากนั้นค่อย ๆ ลดลง

อิทธิพลของของเหลวไอออนิก [Bmim][PF6] ต่อการนำส่ง DNA พลาสมิดเข้าสู่เซลล์ COS7 สารเชิงซ้อนนาโน DNA พลาสมิด/IL (ของเหลวไอออนิก) ได้รับความเค้นเฉือนจากอัลตราโซนิกเป็นเวลาสูงสุด 120 นาที และนำมาสร้างสารเชิงซ้อนกับ LA ก่อนนำส่งเข้าสู่เซลล์ COS7 ข้อมูลแสดงจำนวนเฉลี่ย (%) ของเซลล์ HeLa ที่ให้ผลบวกต่อ GFP ซึ่งนับจากบริเวณภาพภายใต้กล้องจุลทรรศน์ที่แตกต่างกัน 10 บริเวณ และทำการทดลองซ้ำหลายครั้งในสามวันที่ต่างกัน (การศึกษาและแผนภูมิ: ©Sarker et al., 2019)

การเตรียมไลเสตด้วยอัลตราโซนิก

ขั้นตอนการสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิก
เริ่มจากตัวอย่างที่เพิ่มสัดส่วนเซลล์ที่ต้องการ ซึ่งเตรียมด้วยวิธีแยกเซลล์ (เช่น การแยกเซลล์ด้วยภูมิคุ้มกันร่วมกับแม่เหล็ก การคัดแยกเซลล์โดยอาศัยการเรืองแสง (FACS) การปั่นเหวี่ยงแบบไล่ระดับความหนาแน่น การแยกเซลล์ด้วยวิธีภูมิคุ้มกันร่วมกับความหนาแน่น)
ตัวอย่างเซลล์ต้องมีปริมาตรบัฟเฟอร์สลายเซลล์ที่เหมาะสมกับเป้าหมายการทดลองและเครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบ
ควรเลือกใช้บัฟเฟอร์ไฮโปโทนิก เนื่องจากช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิก สิ่งสำคัญคือการใช้สารเติมแต่งและความเข้มข้นของเกลืออย่างเหมาะสม
เลือกอุปกรณ์สลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิก: สำหรับการใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับตัวอย่างในขวดแบบอ้อม แนะนำให้ใช้ VialTweeter หรือ CupHorn สำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP เป็นเครื่องอัลตราโซนิกที่เหมาะอย่างยิ่ง ส่วนการใช้คลื่นอัลตราโซนิกชนิดโพรบแบบดั้งเดิม เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิก เช่น UP100H หรือ UP200Ht ที่มีปลายโพรบขนาดเล็กเหมาะสมที่สุด
ขั้นตอนการใช้คลื่นอัลตราโซนิกชนิดโพรบ: จุ่มโพรบของเครื่องอัลตราโซนิกลงในตัวอย่างภายในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ และใช้คลื่นอัลตราโซนิกประมาณ 10 วินาที อาจใช้คลื่นอัลตราโซนิกซ้ำอีกหนึ่งหรือสองครั้ง ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับตัวอย่าง DNA พลังงานอัลตราโซนิกที่ต้องป้อน (Ws/mL) ขึ้นอยู่กับความหนืดของตัวอย่างและชนิดของ DNA การทำความเย็นด้วยอ่างน้ำแข็งและโหมดพัลส์ของเครื่องอัลตราโซนิกช่วยป้องกันการเสื่อมสลายของตัวอย่างจากความร้อน
หลังการสลายเซลล์ด้วยอัลตราโซนิก ให้นำตัวอย่างไปปั่นเหวี่ยงเพื่อแยกเศษตกตะกอน (ซึ่งประกอบด้วยเซลล์ที่ยังไม่สลาย นิวเคลียส และออร์แกเนลล์ที่ยังไม่สลาย)
หากไม่ดำเนินการกับตัวอย่างต่อทันที สามารถ สามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิที่เหมาะสมเพื่อรักษาความสามารถในการมีชีวิตของตัวอย่าง

เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับการทำให้ DNA แตกเป็นชิ้นส่วน

Hielscher Ultrasonics มีแพลตฟอร์มที่ใช้อัลตราโซนิกหลากหลายสำหรับการทำให้ DNA, RNA และโครมาตินแตกเป็นชิ้นส่วน แพลตฟอร์มเหล่านี้ประกอบด้วยโพรบอัลตราโซนิก (โซโนโทรด) โซลูชันการใช้คลื่นอัลตราโซนิกแบบอ้อมสำหรับการเตรียมตัวอย่างในหลอดหลายหลอดหรือเพลตหลายหลุมพร้อมกัน (เช่น เพลต 96 หลุม เพลตไมโครไทเทอร์) เครื่องปฏิกรณ์อัลตราโซนิก และ CupHorn อัลตราโซนิก แพลตฟอร์มทั้งหมดสำหรับการเฉือน DNA ขับเคลื่อนด้วยเครื่องประมวลผลอัลตราโซนิกสมรรถนะสูงที่ปรับจูนความถี่ ซึ่งควบคุมได้อย่างแม่นยำและให้ผลลัพธ์ที่ทำซ้ำได้

เครื่องประมวลผลอัลตราโซนิกสำหรับตัวอย่างทุกจำนวนและทุกขนาด

เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับตัวอย่างหลายตัวอย่างของ Hielscher ได้แก่ VialTweeter (สำหรับหลอดทดลองสูงสุด 10 หลอด) และ UIP400MTP (สำหรับไมโครเพลต/เพลตหลายหลุม) ช่วยให้ลดเวลาในการดำเนินการกับตัวอย่างได้อย่างง่ายดาย ด้วยการใช้คลื่นอัลตราโซนิกที่เข้มข้นและควบคุมได้อย่างแม่นยำ พร้อมทั้งให้การกระจายขนาดชิ้นส่วน DNA และผลได้ตามต้องการ การทำให้ DNA แตกเป็นชิ้นส่วนด้วยอัลตราโซนิกช่วยให้ขั้นตอนการเตรียมพลาสมิดมีประสิทธิภาพ เชื่อถือได้ และปรับขนาดการดำเนินการได้ สามารถขยายขั้นตอนจากตัวอย่างเดียวไปสู่ตัวอย่างจำนวนมากได้แบบเชิงเส้น โดยใช้พารามิเตอร์อัลตราโซนิกคงที่
เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบที่มีแขนโพรบหนึ่งถึงห้าแขนเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการเตรียมตัวอย่างจำนวนน้อย เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับห้องปฏิบัติการของ Hielscher มีให้เลือกหลายระดับกำลัง เพื่อให้คุณเลือกเครื่องสลายด้วยอัลตราโซนิกที่เหมาะอย่างยิ่งกับการประยุกต์ใช้งานด้าน DNA ของคุณ