Ultrasonication เป็นเทคนิคที่เชื่อถือได้ในการแยกส่วนพลาสมิดดีเอ็นเอ แอมพลิจูดที่ควบคุมได้อย่างแม่นยําโหมดการเต้นเป็นจังหวะและการควบคุมอุณหภูมิเป็นคุณสมบัติที่สําคัญที่สุดของ ultrasonicator สําหรับการกระจายตัวของพลาสมิดที่ไม่ทําลาย นอกจากนี้การใช้สารบางชนิดช่วยป้องกันการย่อยสลายพลาสมิด Hielscher Ultrasonics นําเสนอโซลูชั่นต่าง ๆ สําหรับการกระจายตัวของพลาสมิดที่ควบคุมได้จากขวดเดียวพร้อมกัน sonication ของตัวอย่างจํานวนมากเช่นเดียวกับแผ่นหลายหลุม เรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับการกระจายตัวของพลาสมิดอัลตราโซนิกที่ประสบความสําเร็จ!

พลาสมิดตัดโดยใช้อัลตราโซนิก

เมื่อตัวอย่างดีเอ็นเออยู่ภายใต้คลื่นอัลตราโซนิคการสั่นสะเทือนที่สร้างขึ้น ultrasonically สร้าง cavitation อะคูสติกในของเหลวที่เฉือนหรือทําลายโมเลกุลดีเอ็นเอน้ําหนักโมเลกุลสูงผ่านแรงทางกล Sonication เป็นวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสําหรับการทดลองตัดดีเอ็นเอจํานวนมากรวมถึงการใช้งานเช่น Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) ซึ่งชิ้นส่วนขนาดเล็กมีความสําคัญอย่างยิ่งเพื่อให้ได้ความละเอียดสูง (cf เลย Tseng et al., 2012)
พลาสมิดดีเอ็นเอ (pDNA) เป็นรูปแบบเฉพาะของดีเอ็นเอโดดเด่นด้วยรูปวงแหวนและพบได้ในแบคทีเรียและยูคาริโอตบางชนิด
Supercoiled pDNA เป็นรูปแบบที่ต้องการของดีเอ็นเอพลาสมิดเนื่องจากแสดงผลลัพธ์ที่ดีที่สุดในกระบวนการลงสตรีมเช่นการจัดลําดับอัตโนมัติและการแปลงสภาพ Ultrasonication เหมาะสําหรับชิ้นส่วน pDNA รวมถึง pDNA ที่เคลือบด้วยความเย็นจัดได้สําเร็จ
Thompson et al. (2008) แสดงให้เห็นว่า plasmid sonication ซึ่งเป็นที่ทราบกันดีว่าแยกส่วนดีเอ็นเอ supercoiled เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพในการปรับปรุงความยาวการอ่านลําดับ phred20 จนถึงจุดที่พวกเขาไม่แตกต่างจากเทมเพลตการควบคุมของ Beckman Coulter หรือพลาสมิดเชิงเส้นที่เป็นเอนไซม์อย่างมีนัยสําคัญ

การใช้พลาสมิดเวกเตอร์

พลาสมิดมักใช้เป็นเครื่องมือในการโคลนถ่ายโอนและจัดการยีน เมื่อใช้พลาสมิดทดลองเพื่อจุดประสงค์เหล่านี้พวกมันจะถูกเรียกว่าเวกเตอร์ ชิ้นส่วนดีเอ็นเอหรือยีนสามารถแทรกลงในเวกเตอร์พลาสมิดสร้างพลาสมิดที่เรียกว่า recombinant พลาสมิด พลาสมิดเวกเตอร์ถูกใช้เป็นยานพาหนะในการขับ DNA ของ recombinant เข้าไปในเซลล์โฮสต์และเป็นองค์ประกอบสําคัญของการโคลนนิ่งโมเลกุล
“เวกเตอร์ที่ไม่ใช่ไวรัสกําลังได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางสําหรับการใช้งานที่มีศักยภาพในการบําบัดด้วยยีนเพื่อรักษาโรคที่ซับซ้อนต่างๆ เวกเตอร์ที่ไม่ใช่ไวรัสปกป้อง DNA พลาสมิดจากการย่อยสลายทางกายภาพ เคมี และเอนไซม์ และส่งโมเลกุลดีเอ็นเอไปยังไซต์เป้าหมาย ตัวอย่างเช่นไลโปโซมประจุบวกไคโตซานและอนุภาคนาโนที่มีประจุบวกอื่น ๆ ก่อตัวเป็นคอมเพล็กซ์ที่มี DNA พลาสมิดผ่านปฏิกิริยาไฟฟ้าสถิต อย่างไรก็ตามไลโปโซมประจุบวก / คอมเพล็กซ์ดีเอ็นเอพลาสมิดที่เกิดขึ้นได้ง่ายมีขนาดค่อนข้างใหญ่ (เช่น 300–400 นาโนเมตร) และแตกต่างกันในธรรมชาติทําให้ยากต่อการใช้ในการใช้ยา ดีเอ็นเอ/ไลโปโซมพลาสมิดขนาดใหญ่และแตกต่างกัน, พลาสมิดดีเอ็นเอ/ละอองลอย, และพลาสมิดดีเอ็นเอ/เปปไทด์คอมเพล็กซ์สามารถลดลงเป็นอนุภาคขนาดเล็กและเป็นเนื้อเดียวกันโดยใช้ ultrasonication.” (Sarker et al., 2019)
ตัวอย่างที่โดดเด่นสําหรับการใช้เวกเตอร์พลาสมิดคือ CRISPR–Cas9 ระบบ CRISPR–Cas9 มักจะถูกส่งไปยังเซลล์เป็นพลาสมิดขนาดใหญ่เพียงตัวเดียวหรือพลาสมิดขนาดเล็กหลายตัวที่เข้ารหัสลําดับเป้าหมาย คู่มือ CRISPR และ Cas9

การเตรียมอัลตราโซนิกของอนุภาคนาโน PLGA ที่โหลดดีเอ็นเอโดยการตกตะกอนนาโน

Jo et al. (2020) ใช้โพลี (กรดแลคติก-โค-ไกลโคลิก) (PLGA) เพื่อสร้างพาหะของอนุภาคนาโนสําหรับการส่งมอบพลาสมิดรุ่น CRISPR–Cas9 ลงในแมคโครฟาจที่ได้จากไขกระดูกปฐมภูมิ สําหรับการตกตะกอนนาโนของอนุภาคนาโน PLGA PLGA ที่มีกลุ่มปลายสองกลุ่มที่แตกต่างกัน (กลุ่มเอสเทอร์และเอมีน) ถูกนํามาใช้โดยมีวัตถุประสงค์เพื่อให้ฝาท้ายเอมีนที่มีประจุบวกเพิ่มประสิทธิภาพการห่อหุ้มและการโหลดเนื่องจากปฏิกิริยาของประจุระหว่างมันกับกระดูกสันหลังที่มีประจุลบของดีเอ็นเอ ในหลอดหมุนเหวี่ยงรูปกรวยโพลีโพรพีลีน 50 มล. Pluronic F127 100 มก. ถูกละลายในน้ํา DI ที่นึ่งด้วย 20 มล. โดยการผสมกระแสน้ําวนตามด้วย sonication อ่อนโยน 30 นาทีโดยใช้อ่างอัลตราโซนิก (ดู คัพฮอร์น). มีการเพิ่มแถบกวนแม่เหล็กแบบนึ่งฆ่าเชื้อและสารละลายถูกผสมที่ 600 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาทีในขณะที่ทําสารละลายอื่น ๆ เครื่องใช้ในห้องปฏิบัติการพลาสติกถูกนํามาใช้แทนเครื่องแก้วตลอดเพื่อลดการดูดซับดีเอ็นเอที่ไม่เฉพาะเจาะจง สารละลาย PLGA ที่ละลายใน DMF (44.48 มก. / มล.) และ TIP pentacene ที่ละลายใน THF (0.667 มก. / มล.) ทําแยกต่างหาก PLGA ถูกทิ้งให้เปียกโชกใน DMF เป็นเวลา 30 นาทีก่อนที่จะถูก sonicated เป็นเวลา 30 นาที (สําหรับโปรโตคอลเต็มรูปแบบดู Jo et al., 2020)

การป้องกันดีเอ็นเอพลาสมิดในระหว่างการ Sonication

ดีเอ็นเอรวมถึงพลาสมิดและพลาสมิดที่เคลือบด้วยความเย็นนั้นเป็นการย่อยสลายที่มีความไวสูง วิธีการกระจายตัวทั้งหมดที่มีอยู่เป็นที่ทราบกันดีถึงข้อเสียบางประการ การกระจายตัวของดีเอ็นเออัลตราโซนิกเป็นหนึ่งในวิธีการที่ต้องการเนื่องจากการควบคุม sonication ร่วมกับมาตรการป้องกันช่วยลดแรงเฉือนและความร้อนที่เกิดจากความเสียหายของเส้นดีเอ็นเอ
นอกจากการตั้งค่าแอมพลิจูดต่ําโหมดการเต้นเป็นจังหวะและการควบคุมอุณหภูมิในระหว่างการตัดดีเอ็นเออัลตราโซนิกการใช้สารบางชนิดยังแสดงผลการป้องกันอย่างมีนัยสําคัญต่อการเสื่อมสภาพของดีเอ็นเอ ตัวอย่างเช่นโพลีเมอร์เปปไทด์และไขมันต่าง ๆ ช่วยปกป้อง DNA พลาสมิดในระหว่างการอัลตราโซนิก

ความเสถียรของดีเอ็นเอพลาสมิดและพลาสมิดดีเอ็นเอ / IL นาโนคอมเพล็กซ์กับความเครียดเฉือนอัลตราโซนิกได้รับการตรวจสอบโดยใช้การทดสอบอิเล็กโทรโฟเรซิสเจลอะกาโรส ทั้งพลาสมิดดีเอ็นเอและพลาสมิดดีเอ็นเอ / นาโนคอมเพล็กซ์ IL อยู่ภายใต้ความเครียดเฉือนอัลตราโซนิกสําหรับจุดเวลาที่แตกต่างกัน พลาสมิดดีเอ็นเอสัมผัสกับความเครียดเฉือนอัลตราโซนิกเป็นเวลา 0, 10, 20, 30 และ 40 นาที อย่างไรก็ตามพลาสมิดดีเอ็นเอ / นาโนคอมเพล็กซ์ IL สัมผัสกับความเครียดจากแรงเฉือนอัลตราโซนิกเป็นเวลา 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 และ 120 นาที
(การศึกษาและภาพ: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) แสดงให้เห็นว่าเมื่อโครงสร้างนาโน plasmid DNA / ionic DNA / ionic liquid (pDNA / IL) อยู่ภายใต้ความเครียดจากแรงเฉือนอัลตราโซนิกสําหรับ 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 และ 120 นาทีและซับซ้อนด้วย lipofectamine ตัวแทนจัดส่งยีนประจุบวกที่มีจําหน่ายทั่วไปเปอร์เซ็นต์ของเซลล์บวกเรืองแสงคือ 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65% 65% และ 50% ตามลําดับ (ดูแผนภูมิด้านล่าง) เปอร์เซ็นต์ของเซลล์บวกฟลูออเรสเซนต์เพิ่มขึ้นเมื่อโครงสร้างนาโนอยู่ภายใต้ความเครียดเฉือนอัลตราโซนิกเป็นเวลา 10 และ 20 นาทีและหลังจากนั้นก็ลดลงอย่างช้าๆ

อิทธิพลของของเหลวไอออนิก [Bmim][PF6] ต่อการส่งดีเอ็นเอพลาสมิดไปยังเซลล์ COS7 พลาสมิดดีเอ็นเอ / IL (ของเหลวไอออนิก) nanocomplexes ถูกภายใต้ความเครียดเฉือนอัลตราโซนิกได้นานถึง 120 นาทีและซับซ้อนด้วย LA ก่อนที่จะส่งไปยังเซลล์ COS7 ข้อมูลแสดงจํานวนเฉลี่ย (%) ของเซลล์ HeLa บวก GFP ที่นับใน 10 เขตข้อมูลกล้องจุลทรรศน์ที่แตกต่างกันและการทดลองได้ดําเนินการหลายครั้งในสามวันที่แตกต่างกัน (การศึกษาและแผนภูมิ: ©Sarker et al., 2019)

การเตรียมไลเสทอัลตราโซนิก

โปรโตคอลการสลายเซลล์อัลตราโซนิก
เริ่มต้นด้วยตัวอย่างที่สมบูรณ์ของเซลล์ที่จัดทําขึ้นผ่านวิธีการแยกเซลล์ (เช่น การแยกเซลล์อิมมูโนแมกเนติก, การเรียงลําดับเซลล์ที่เปิดใช้งานการเรืองแสง (FACS), การปั่นแยกการไล่ระดับความหนาแน่น, การแยกเซลล์ภูมิคุ้มกัน)
ตัวอย่างเซลล์จะต้องแสดงปริมาตรของบัฟเฟอร์สลายที่เหมาะสมสําหรับเป้าหมายการทดลองและ ultrasonicator ชนิดโพรบ
บัฟเฟอร์ Hypotonic เป็นที่ต้องการเนื่องจากช่วยเพิ่มการสลายเซลล์อัลตราโซนิก มันเป็นสิ่งสําคัญที่จะใช้สารเติมแต่งและความเข้มข้นของเกลือในลักษณะที่เหมาะสม
เลือกอุปกรณ์สลายอัลตราโซนิกของคุณ: สําหรับ sonication ทางอ้อมของขวดแนะนําให้ใช้ VialTweeter หรือ CupHorn สําหรับแผ่นมัลติเวลล์ UIP400MTP เป็นเครื่องอัลตราโซนิกในอุดมคติ และ sonication ประเภทโพรบคลาสสิก, homogenizer ล้ําเสียงเป็น UP100H หรือ UP200Ht กับปลายขนาดเล็กที่เหมาะสมที่สุด
โปรโตคอลสําหรับ sonication ประเภทโพรบ: วางหัววัดอัลตราโซนิกลงในปริมาตรตัวอย่างในหลอด microcentrifuge และ sonicate ประมาณ 10 วินาที ขึ้นอยู่กับตัวอย่างดีเอ็นเอ sonication อาจจะทําซ้ําหนึ่งหรือสองครั้งมากขึ้น อินพุตพลังงานอัลตราโซนิกที่ต้องการ (Ws / mL) ขึ้นอยู่กับความหนืดของตัวอย่างและชนิดของดีเอ็นเอ การระบายความร้อนผ่านอ่างน้ําแข็งและโหมดการเต้นเป็นจังหวะของ ultrasonicator ช่วยป้องกันไม่ให้ตัวอย่างถูกย่อยสลายด้วยความร้อน
หลังจากการสลายด้วยคลื่นเสียงอัลตราโซนิกตัวอย่างจะถูกหมุนเหวี่ยงเพื่อแยกเศษเม็ด (ประกอบด้วยเซลล์ที่ไม่มีลี่นิวเคลียสและออร์แกเนลล์ที่ไม่ได้ผ่าตัด)
หากตัวอย่างไม่ได้รับการประมวลผลเพิ่มเติมในทันทีสามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิที่เหมาะสมเพื่อรักษาความมีชีวิตของมัน

เครื่องอัลตราโซนิกสําหรับการกระจายตัวของดีเอ็นเอ

Hielscher Ultrasonics นําเสนอแพลตฟอร์มอัลตราซาวนด์ต่างๆสําหรับ DNA, RNA และการกระจายตัวของโครมาติน แพลตฟอร์มที่แตกต่างกันเหล่านี้รวมถึงโพรบอัลตราโซนิก (sonotrodes), โซลูชั่น sonication ทางอ้อมสําหรับการเตรียมตัวอย่างพร้อมกันของหลายหลอดหรือแผ่นหลายดี (เช่น, แผ่น 96 ดี, แผ่นจุลทรรศน์), sonoreactors และ cuphorns ล้ํา แพลตฟอร์มทั้งหมดสําหรับการป้องกันดีเอ็นเอขับเคลื่อนด้วยโปรเซสเซอร์อัลตราโซนิกที่ปรับความถี่และมีประสิทธิภาพสูงซึ่งสามารถควบคุมได้อย่างแม่นยําและให้ผลลัพธ์ที่ทําซ้ําได้

โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิกสําหรับจํานวนตัวอย่างและขนาดใด ๆ

ด้วยเครื่องอัลตราโซนิกหลายตัวอย่างของ Hielscher VialTweeter (สําหรับหลอดทดลองสูงสุด 10 หลอด) และ UIP400MTP (สําหรับไมโครเพลท / แผ่นมัลติเวลล์) มันเป็นไปได้ง่ายที่จะลดเวลาในการประมวลผลตัวอย่างเนื่องจาก ultrasonication ที่รุนแรงและควบคุมได้อย่างแม่นยําในขณะที่ได้รับการกระจายขนาดชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ต้องการและผลผลิต การกระจายตัวของดีเอ็นเออัลตราโซนิกทําให้ขั้นตอนการเตรียมพลาสมิดมีประสิทธิภาพเชื่อถือได้และปรับขนาดได้ โปรโตคอลสามารถปรับขนาดเชิงเส้นจากตัวอย่างหนึ่งไปยังตัวอย่างจํานวนมากโดยใช้พารามิเตอร์อัลตร้าซาวด์คงที่
โพรบ ultrasonicators ด้วยหนึ่งถึงห้านิ้วเหมาะสําหรับการเตรียมจํานวนตัวอย่างที่น้อยลง ultrasonicators ห้องปฏิบัติการของ Hielscher สามารถใช้ได้กับระดับพลังงานที่แตกต่างกันเพื่อให้คุณสามารถเลือก disruptor ล้ําเสียงที่เหมาะสําหรับการประยุกต์ใช้ดีเอ็นเอของคุณ