การเตรียมพลาสมิดโดยใช้อัลตราโซนิก

อัลตราโซนิกเป็นเทคนิคที่เชื่อถือได้ในการแยกส่วนพลาสมิดดีเอ็นเอ แอมพลิจูดที่ควบคุมได้อย่างแม่นยําโหมดการเต้นเป็นจังหวะและการควบคุมอุณหภูมิเป็นคุณสมบัติที่สําคัญที่สุดของเครื่องอัลตราโซนิกสําหรับการกระจายตัวของพลาสมิดที่ไม่สร้างความเสียหาย นอกจากนี้ การใช้สารบางชนิดยังช่วยป้องกันการย่อยสลายพลาสมิด Hielscher Ultrasonics นําเสนอโซลูชั่นต่างๆสําหรับการกระจายตัวของพลาสมิดที่ควบคุมได้จากขวดเดียวพร้อมกัน sonication ของตัวอย่างจํานวนมากรวมถึงแผ่นหลายหลุม เรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับการกระจายพลาสมิดอัลตราโซนิกที่ประสบความสําเร็จ!

การตัดพลาสมิดโดยใช้อัลตราโซนิก

เมื่อตัวอย่างดีเอ็นเออยู่ภายใต้คลื่นอัลตราโซนิกการสั่นสะเทือนที่สร้างขึ้นด้วยอัลตราโซนิกจะสร้างโพรงอากาศอะคูสติกในของเหลวที่ตัดหรือทําลายโมเลกุลดีเอ็นเอที่มีน้ําหนักโมเลกุลสูงผ่านแรงเชิงกล Sonication เป็นวิธีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสําหรับการทดลองตัดดีเอ็นเอจํานวนมากรวมถึงการใช้งานเช่น Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) ซึ่งขนาดชิ้นส่วนขนาดเล็กมีความสําคัญอย่างยิ่งเพื่อให้ได้ความละเอียดสูง (อ้างอิง Tseng et al., 2012)
พลาสมิดดีเอ็นเอ (pDNA) เป็นรูปแบบเฉพาะของ DNA ซึ่งมีลักษณะเป็นวงแหวนและพบได้ในแบคทีเรียและยูคาริโอตบางชนิด
Supercoiled pDNA เป็นรูปแบบที่ต้องการของ DNA พลาสมิด เนื่องจากแสดงผลลัพธ์ที่ดีที่สุดในกระบวนการปลายน้ํา เช่น การจัดลําดับอัตโนมัติและการถ่ายทอด Ultrasonication เหมาะสําหรับการแยกส่วน pDNA รวมถึง pDNA supercoiled ได้สําเร็จ
Thompson et al. (2008) แสดงให้เห็นว่าพลาสมิด sonication ซึ่งเป็นที่ทราบกันดีว่าแยกส่วน supercoiled DNA เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพในการปรับปรุงความยาวการอ่านลําดับ phred20 จนถึงจุดที่ไม่แตกต่างอย่างมีนัยสําคัญจากแม่แบบควบคุมของ Beckman Coulter หรือพลาสมิดเชิงเส้นของเอนไซม์

การใช้เวกเตอร์พลาสมิด

พลาสมิดมักใช้เป็นเครื่องมือในการโคลน ถ่ายโอน และจัดการยีน เมื่อใช้พลาสมิดในการทดลองเพื่อจุดประสงค์เหล่านี้จะเรียกว่าเวกเตอร์ ชิ้นส่วนหรือยีนของดีเอ็นเอสามารถแทรกลงในเวกเตอร์พลาสมิดสร้างพลาสมิดที่เรียกว่าพลาสมิดรีคอมบิแนนท์ เวกเตอร์พลาสมิดใช้เป็นพาหนะในการขับเคลื่อนดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์เข้าไปในเซลล์โฮสต์และเป็นองค์ประกอบสําคัญของการโคลนโมเลกุล
“เวกเตอร์ที่ไม่ใช่ไวรัสกําลังได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางสําหรับศักยภาพในการบําบัดด้วยยีนเพื่อรักษาโรคที่ซับซ้อนต่างๆ เวกเตอร์ที่ไม่ใช่ไวรัสช่วยปกป้องพลาสมิดดีเอ็นเอจากการย่อยสลายทางกายภาพ เคมี และเอนไซม์ และส่งโมเลกุลดีเอ็นเอไปยังตําแหน่งเป้าหมาย ตัวอย่างเช่นไลโปโซมประจุบวกไคโตซานและอนุภาคนาโนที่มีประจุบวกอื่น ๆ ก่อตัวเป็นคอมเพล็กซ์กับพลาสมิดดีเอ็นเอผ่านปฏิกิริยาไฟฟ้าสถิต อย่างไรก็ตาม ไลโปโซมประจุบวก/พลาสมิด DNA คอมเพล็กซ์ที่ก่อตัวได้ง่ายนั้นค่อนข้างใหญ่ (เช่น 300–400 นาโนเมตร) และมีลักษณะต่างกันทําให้ยากต่อการใช้งานทางเภสัชกรรม พลาสมิด DNA / ไลโปโซมพลาสมิด DNA / ละอองลอยและพลาสมิด DNA / เปปไทด์คอมเพล็กซ์สามารถลดลงเหลืออนุภาคขนาดเล็กและเป็นเนื้อเดียวกันได้โดยใช้อัลตราโซนิก” (Sarker et al., 2019)
ตัวอย่างที่โดดเด่นสําหรับการใช้เวกเตอร์พลาสมิดคือ CRISPR–Cas9 โดยทั่วไปแล้ว ระบบ CRISPR–Cas9 จะถูกส่งไปยังเซลล์เป็นพลาสมิดขนาดใหญ่ตัวเดียวหรือพลาสมิดขนาดเล็กหลายตัวที่เข้ารหัสลําดับเป้าหมาย

การเตรียมอัลตราโซนิกของอนุภาคนาโน PLGA ที่โหลด DNA โดยการตกตะกอนนาโน

Jo et al. (2020) ใช้โพลี (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) เพื่อสร้างตัวพาอนุภาคนาโนสําหรับการส่งมอบพลาสมิดแบบจําลอง CRISPR–Cas9 ลงในมาโครฟาจที่ได้จากไขกระดูกปฐมภูมิ สําหรับการตกตะกอนนาโนของอนุภาคนาโน PLGA มีการใช้ PLGA ที่มีกลุ่มปลายที่แตกต่างกันสองกลุ่ม (กลุ่มเอสเทอร์และเอมีน) โดยมีวัตถุประสงค์เพื่อให้ฝาท้ายเอมีนที่มีประจุบวกเพิ่มประสิทธิภาพการห่อหุ้มและการโหลดเนื่องจากปฏิสัมพันธ์ของประจุระหว่างมันกับกระดูกสันหลังที่มีประจุลบของ DNA ในหลอดหมุนเหวี่ยงทรงกรวยโพลีโพรพีลีนขนาด 50 มล. Pluronic F100 127 มก. ถูกละลายในน้ํา DI นึ่งฆ่าเชื้อ 20 มล. โดยการผสมกระแสน้ําวนตามด้วยการ sonication อย่างอ่อนโยน 30 นาทีโดยใช้อ่างอัลตราโซนิก (ดู CupHorn). มีการเพิ่มแท่งกวนแม่เหล็กนึ่งฆ่าเชื้อและผสมสารละลายที่ 600 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาทีในขณะที่ทําสารละลายอื่น ๆ ใช้เครื่องแล็บพลาสติกแทนเครื่องแก้วตลอดเพื่อลดการดูดซับ DNA ที่ไม่จําเพาะ สารละลายของ PLGA ที่ละลายใน DMF (44.48 มก./มล.) และ TIPS pentacene ที่ละลายใน THF (0.667 มก./มล.) ถูกทําแยกกัน PLGA ถูกปล่อยให้เปียกนิ่งใน DMF เป็นเวลา 30 นาทีก่อนที่จะได้รับการ sonicated เป็นเวลา 30 นาที (สําหรับโปรโตคอลฉบับเต็มโปรดดู Jo et al., 2020)

การป้องกันพลาสมิดดีเอ็นเอระหว่างการ Sonication

ดีเอ็นเอรวมถึงพลาสมิดและพลาสมิดซุปเปอร์คอยล์มีการย่อยสลายที่มีความไวสูง วิธีการแยกส่วนทั้งหมดที่มีอยู่เป็นที่ทราบกันดีว่ามีข้อเสียบางประการ การกระจายตัวของดีเอ็นเออัลตราโซนิกเป็นหนึ่งในวิธีการที่ต้องการเนื่องจากการควบคุม sonication ร่วมกับมาตรการป้องกันช่วยลดความเสียหายที่เกิดจากแรงเฉือนและความร้อนของสาย DNA
นอกเหนือจากการตั้งค่าแอมพลิจูดต่ําโหมดการเต้นเป็นจังหวะและการควบคุมอุณหภูมิระหว่างการตัด DNA แบบอัลตราโซนิกแล้วการใช้สารบางชนิดยังแสดงผลการป้องกันอย่างมีนัยสําคัญต่อการเสื่อมสภาพของ DNA ตัวอย่างเช่นโพลีเมอร์เปปไทด์และไขมันต่างๆช่วยปกป้อง DNA พลาสมิดในระหว่างอัลตราโซนิก

ตรวจสอบความเสถียรของพลาสมิดดีเอ็นเอและพลาสมิดดีเอ็นเอ/IL นาโนคอมเพล็กซ์ต่อความเครียดเฉือนอัลตราโซนิกโดยใช้การทดสอบอิเล็กโทรโฟรีซิสเจลอะกาโรส ทั้งพลาสมิดดีเอ็นเอและพลาสมิดดีเอ็นเอ / IL นาโนคอมเพล็กซ์อยู่ภายใต้ความเครียดเฉือนอัลตราโซนิกสําหรับช่วงเวลาที่แตกต่างกัน พลาสมิดดีเอ็นเอสัมผัสกับความเครียดเฉือนอัลตราโซนิกเป็นเวลา 0, 10, 20, 30 และ 40 นาที อย่างไรก็ตาม นาโนคอมเพล็กซ์พลาสมิด DNA/IL สัมผัสกับความเครียดเฉือนอัลตราโซนิกเป็นเวลา 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 และ 120 นาที
(การศึกษาและรูปภาพ: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) แสดงให้เห็นว่าเมื่อโครงสร้างนาโนพลาสมิดดีเอ็นเอ / ของเหลวไอออนิก (pDNA/IL) อยู่ภายใต้ความเครียดเฉือนอัลตราโซนิกเป็นเวลา 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 และ 120 นาที และซับซ้อนกับสารส่งพันธะยีนประจุบวกที่มีจําหน่ายทั่วไป lipofectamine เปอร์เซ็นต์ของเซลล์บวกเรืองแสงคือ 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65% 65% และ 50% ตามลําดับ (ดูแผนภูมิด้านล่าง) เปอร์เซ็นต์ของเซลล์บวกเรืองแสงเพิ่มขึ้นเมื่อโครงสร้างนาโนอยู่ภายใต้ความเครียดเฉือนอัลตราโซนิกเป็นเวลา 10 และ 20 นาทีและหลังจากนั้นก็ลดลงอย่างช้าๆ

อิทธิพลของของเหลวไอออนิก [Bmim] [PF6] ต่อการส่งพลาสมิดดีเอ็นเอไปยังเซลล์ COS7 นาโนคอมเพล็กซ์พลาสมิด DNA/IL (ของเหลวไอออนิก) อยู่ภายใต้ความเครียดเฉือนอัลตราโซนิกนานถึง 120 นาทีและผสมกับ LA ก่อนที่จะส่งไปยังเซลล์ COS7 ข้อมูลแสดงจํานวนเฉลี่ย (%) ของเซลล์ HeLa ที่เป็นบวกของ GFP ที่นับในเขตจุลทรรศน์ที่แตกต่างกัน 10 แห่ง และการทดลองดําเนินการหลายครั้งในสามวันที่แตกต่างกัน (การศึกษาและแผนภูมิ: ©Sarker et al., 2019)

การเตรียมอัลตราโซนิกไลเสท

โปรโตคอลการสลายเซลล์อัลตราโซนิก
เริ่มต้นด้วยตัวอย่างเซลล์ที่อุดมไปด้วยที่เตรียมด้วยวิธีการแยกเซลล์ (เช่น การแยกเซลล์อิมมูโนแมกเนติก, การคัดแยกเซลล์ที่กระตุ้นด้วยเรืองแสง (FACS), การหมุนเหวี่ยงการไล่ระดับความหนาแน่น, การแยกเซลล์ความหนาแน่นของภูมิคุ้มกัน)
ตัวอย่างเซลล์ต้องแสดงปริมาตรของบัฟเฟอร์การสลายที่เหมาะสมกับเป้าหมายการทดลองและเครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบ
บัฟเฟอร์ Hypotonic เป็นที่ต้องการเนื่องจากช่วยเพิ่มการสลายเซลล์อัลตราโซนิก สิ่งสําคัญคือต้องใช้สารเติมแต่งและความเข้มข้นของเกลือในลักษณะที่เหมาะสม
เลือกอุปกรณ์สลายอัลตราโซนิกของคุณ: สําหรับการ sonication ทางอ้อมของขวดแนะนําให้ใช้ VialTweeter หรือ CupHorn สําหรับแผ่นมัลติเวลล์ UIP400MTP เป็นเครื่องอัลตราโซนิกในอุดมคติ และ sonication แบบโพรบแบบคลาสสิก homogenizer อัลตราโซนิกเป็น UP100H หรือ UP200Ht ที่มีไมโครทิปเหมาะสมที่สุด
โปรโตคอลสําหรับ sonication ชนิดโพรบ: วางโพรบอัลตราโซนิกลงในปริมาตรตัวอย่างในหลอดไมโครเซนตอริ่งเวทีและคลื่นเสียงประมาณ 10 วินาที ขึ้นอยู่กับตัวอย่างดีเอ็นเอการ sonication อาจทําซ้ําอีกหนึ่งหรือสองครั้ง อินพุตพลังงานอัลตราโซนิกที่ต้องการ (Ws/mL) ขึ้นอยู่กับความหนืดของตัวอย่างและประเภทดีเอ็นเอ การระบายความร้อนผ่านอ่างน้ําแข็งและโหมดการเต้นเป็นจังหวะของเครื่องอัลตราโซนิกช่วยป้องกันไม่ให้ตัวอย่างเสื่อมสภาพทางความร้อน
หลังจากการสลายอัลตราโซนิกตัวอย่างจะถูกหมุนเหวี่ยงเพื่อแยกเศษเม็ด (ประกอบด้วยเซลล์ที่ไม่ละลายนิวเคลียสและออร์แกเนลล์ที่ไม่สลาย)
หากตัวอย่างไม่ได้รับการแปรรูปเพิ่มเติมในทันที ก็สามารถเก็บไว้ในอุณหภูมิที่เหมาะสมเพื่อรักษาความมีชีวิตได้

เครื่องอัลตราโซนิกสําหรับการกระจายตัวของดีเอ็นเอ

Hielscher Ultrasonics นําเสนอแพลตฟอร์มอัลตราซาวนด์ที่หลากหลายสําหรับการกระจายตัวของ DNA, RNA และโครมาติน แพลตฟอร์มที่แตกต่างกันเหล่านี้รวมถึงโพรบอัลตราโซนิก (sonotrodes) โซลูชัน sonication ทางอ้อมสําหรับการเตรียมตัวอย่างพร้อมกันของหลายหลอดหรือแผ่นหลายหลุม (เช่นแผ่น 96 หลุมแผ่นไมโครไทเตอร์) sonoreactor และอัลตราโซนิกคัพฮอร์น แพลตฟอร์มทั้งหมดสําหรับการตัด DNA ขับเคลื่อนโดยโปรเซสเซอร์อัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงที่ปรับความถี่ซึ่งสามารถควบคุมได้อย่างแม่นยําและให้ผลลัพธ์ที่ทําซ้ําได้

โปรเซสเซอร์อัลตราโซนิกสําหรับจํานวนตัวอย่างและขนาดใด ๆ

ด้วยเครื่องอัลตราโซนิกหลายตัวอย่างของ Hielscher VialTweeter (สําหรับหลอดทดลองสูงสุด 10 หลอด) และ UIP400MTP (สําหรับไมโครเพลท / แผ่นมัลติเวลล์) ทําให้สามารถลดเวลาในการประมวลผลตัวอย่างได้อย่างง่ายดายเนื่องจากอัลตราโซนิกที่เข้มข้นและควบคุมได้อย่างแม่นยําในขณะที่ได้รับการกระจายขนาดชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ต้องการและผลผลิต การกระจายตัวของดีเอ็นเออัลตราโซนิกทําให้ขั้นตอนการเตรียมพลาสมิดมีประสิทธิภาพเชื่อถือได้และปรับขนาดได้ โปรโตคอลสามารถปรับขนาดเป็นเส้นตรงจากตัวอย่างหนึ่งเป็นจํานวนมากโดยใช้พารามิเตอร์อัลตราซาวนด์คงที่
เครื่องอัลตราโซนิกโพรบที่มีนิ้วเดียวถึงห้านิ้วเหมาะอย่างยิ่งสําหรับการเตรียมจํานวนตัวอย่างที่เล็กลง เครื่องอัลตราโซนิกในห้องปฏิบัติการของ Hielscher มีระดับพลังงานที่แตกต่างกันเพื่อให้คุณสามารถเลือกเครื่องรบกวนอัลตราโซนิกที่เหมาะสําหรับการใช้งานที่เกี่ยวข้องกับดีเอ็นเอของคุณ