โปรโตคอลที่ใช้ Hielscher Multi-Sample Sonicators ในการวิเคราะห์ไบโอฟิล์มและโปรตีโอมิกส์

การใช้เครื่องโซนิคเตอร์แบบหลายตัวอย่าง เช่น VialTweeter Multi-Tube Sonicator และ UIP400MTP Microplate Sonicator ช่วยเพิ่มความคล่องตัวให้กับเวิร์กโฟลว์ในห้องปฏิบัติการสําหรับการใช้งานที่มีปริมาณงานสูง อุปกรณ์ทั้งสองช่วยให้สามารถประมวลผลอัลตราโซนิกได้อย่างแม่นยําและสม่ําเสมอในหลายตัวอย่างลดความแปรปรวนและเพิ่มความสามารถในการทําซ้ํา สิ่งนี้เป็นประโยชน์อย่างยิ่งในการทดลองที่ต้องการการสลายตัวอย่างที่สม่ําเสมอการแยกไบโอฟิล์มการสกัดโปรตีนหรือการย่อยโปรตีนซึ่งวิธีการแบบแมนนวลหรือตัวอย่างเดียวมีประสิทธิภาพน้อยกว่าและมีแนวโน้มที่จะเกิดความไม่สอดคล้องกัน

ปรับปรุงเวิร์กโฟลว์ด้วยเครื่องโซนิคเตอร์หลายตัวอย่าง

ตัวอย่างเช่น UIP400MTP ช่วยให้สามารถบําบัดด้วยอัลตราโซนิกของหลุมไมโครเพลทได้พร้อมกัน เพื่อให้มั่นใจได้ถึงการแยกฟิล์มชีวภาพหรือวัสดุเซลล์อย่างสม่ําเสมอ ในขณะเดียวกัน VialTweeter ให้การสลายที่แม่นยําและการทําให้เป็นเนื้อเดียวกันของตัวอย่างหลอดหลายหลอดโดยไม่มีการปนเปื้อนข้าม เครื่องสะท้อนเสียงเหล่านี้ช่วยลดเวลาในการประมวลผลได้อย่างมาก ปรับปรุงความสามารถในการทําซ้ําในการทดลอง และรักษาความสมบูรณ์ของตัวอย่างให้สูง ทําให้เป็นเครื่องมือที่ขาดไม่ได้ในการวิจัยทางจุลชีววิทยา โปรตีโอมิกส์ และชีววิทยาโมเลกุล
ด้านล่างนี้คือโปรโตคอลโดยละเอียดที่แสดงตัวอย่างการใช้โมเดล Hielscher multi-sample sonicator, VialTweeter Multi-Tube Sonicator และ Microplate Sonicator UIP400MTP ในการศึกษาที่เกี่ยวข้องกับการสร้างฟิล์มชีวภาพ. coli และการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ในภายหลัง

โปรโตคอล: การสร้างฟิล์มชีวภาพ การแยก และการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์โดยใช้ Hielscher Multi-Sample Sonicators

1. การเตรียมการเพาะเชื้อแบคทีเรีย

• เพาะเลี้ยงแบคทีเรีย. coli (สายพันธุ์ W3110) ที่อุณหภูมิ 30°C ซึ่งเป็นอุณหภูมิที่เอื้ออํานวยต่อการก่อตัวของไบโอฟิล์ม. coli ในอาหารกลางน้ําซุปทริปโตน (TB) ที่มี:
  – ทริปโตน 10 ก./ลิตร
  – 5 ก./ลิตร NaCl
• เสริมด้วยยาปฏิชีวนะตามความจําเป็นเพื่อให้แน่ใจว่ามีการกักเก็บพลาสมิด
• สําหรับการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์และกิจกรรมของโปรโมเตอร์ ให้ใช้สายพันธุ์ W3110. coli กับผู้รายงาน GFP ที่ได้รับการปรับปรุงแบบจีโนม (eGFP) ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ rplL
• ใช้พลาสมิดผู้รายงาน GFP สําหรับโปรโมเตอร์ต่างๆ (เช่น csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) เพื่อวัดกิจกรรมของผู้สนับสนุน

2. การเพาะปลูกและปลดปล่อยไบโอฟิล์ม

• เพาะเชื้อแบคทีเรียเจือจาง 1.5 มล. ต่อหลุมลงในจาน 12 หลุม (แผ่น CellStar 12 หลุม, Greiner Bio-One)
• ฟักไข่เพื่อให้เกิดไบโอฟิล์ม
• นําวัฒนธรรมแพลงก์ตอน (ไม่ยึดติด) ออกอย่างระมัดระวัง

– ล้างแต่ละหลุมด้วย PBS 500 μL
– ถอดเซลล์ที่แนบมาโดยการ sonicing แผ่น 12 หลุมในเครื่อง sonicator ไมโครเพลท UIP400MTP UIP400MTP ช่วยให้มั่นใจได้ถึงการปลดออกที่สม่ําเสมอโดยการส่งมอบพลังงานอัลตราโซนิกที่สม่ําเสมอในทุกหลุม
– การตั้งค่า Sonication: 60% amplitude, โหมดรอบ: เปิด 60 วินาที / ปิด 30 วินาที

3. การเก็บเกี่ยวเซลล์และการสลาย

• หมุนเหวี่ยงเซลล์ไบโอฟิล์มที่ถอดออกที่ 4,500 กรัมเป็นเวลา 5 นาที
• ล้างเซลล์เม็ดด้วย PBS
• ระงับเซลล์อีกครั้งในโซเดียมลอโรอิลซาร์โคซิเนต (SLS) 2% 100 μL และบ่มที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 15 นาที
• Sonicate โดยใช้ VialTweeter Multi-Tube Sonicator เพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์สลายอย่างสมบูรณ์
  – การตั้งค่า Sonication: 100% amplitude, 50 วินาที ON / 10 s OFF เป็นเวลาทํางานทั้งหมด 10 นาที เก็บตัวอย่างไว้บนน้ําแข็ง

4. การลดและอัลคิลเลชั่น

• เติม Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) 5 mM เพื่อลดพันธะไดซัลไฟด์และบ่มที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 15 นาที
• โปรตีนอัลคิลเลตที่มีไอโอโดอะซิตาไมด์ 10 mM เป็นเวลา 30 นาทีที่ 25°C

5. ปริมาณโปรตีนและการย่อยอาหาร

• เครื่องหมุนเหวี่ยงไลเซตเพื่อล้างเศษขยะ
• วัดปริมาณโปรตีนทั้งหมดโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน Pierce BCA
• ย่อยโปรตีนทั้งหมด 50 ไมโครกรัมกับทริปซิน 1 ไมโครกรัมในสารละลายที่มี SLS 2% และแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 100 มิลลิเมตร
• บ่มปฏิกิริยาการย่อยอาหารค้างคืนที่อุณหภูมิ 30°C

6. การทําให้บริสุทธิ์เปปไทด์

• ตกตะกอน SLS โดยเติมกรดไตรฟลูออโรอะซิติก (TFA) 1.5% จากนั้นหมุนเหวี่ยง
• ทําให้เปปไทด์บริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์ไมโครสปิน C18
• ทําให้เปปไทด์บริสุทธิ์แห้งและระงับใน TFA 0.1%

7. โครมาโตกราฟีเหลว-แมสสเปกโตรเมตรี (LC-MS/MS)

• วิเคราะห์เปปไทด์บนแมสสเปกโตรมิเตอร์ Q-Exactive Plus ควบคู่ไปกับระบบนาโน Ultimate 3000 RSLC
• แยกเปปไทด์โดยใช้คอลัมน์ HPLC แบบย้อนกลับเฟส (75 μm × 42 ซม.) ที่บรรจุด้วยเรซิน C18 (2.4 μm)
• ใช้การไล่ระดับสีตัวทําละลาย B (อะซิโทไนไตรล์ที่มีกรดฟอร์มิก 0.15%) เป็นเวลา 140 นาที
• รับข้อมูลโดยใช้การสแกน MS ความละเอียดสูงตามด้วยการสแกน MS/MS ควบคู่ของไอออนที่เข้มข้นที่สุด 10 ชนิด

8. การวิเคราะห์ข้อมูล

• ประมวลผลข้อมูล LC-MS ดิบโดยใช้ซอฟต์แวร์ Progenesis
• ส่งออกไฟล์ .mgf และวิเคราะห์ด้วย MASCOT
• ดําเนินการหาปริมาณเปปไทด์โดยใช้ SafeQuant เพื่อการควบคุมคุณภาพและการปรับการค้นพบที่ผิดพลาด
• ทําการทดลองทั้งหมดซ้ํากันหรือสามครั้งเพื่อให้แน่ใจว่าสามารถทําซ้ําได้

เครื่องโซนิคเตอร์หลายตัวอย่างสําหรับการเตรียมตัวอย่างที่มีปริมาณงานสูง

โมเดลเครื่องสะท้อนเสียงหลายตัวอย่าง VialTweeter และ UIP400MTP ช่วยเพิ่มความแม่นยําและประสิทธิภาพของเวิร์กโฟลว์การทดลองได้อย่างมีนัยสําคัญโดยเฉพาะอย่างยิ่งในการวิจัยไบโอฟิล์มและโปรตีโอมิกส์ ความสามารถในการประมวลผลตัวอย่างหลายตัวอย่างอย่างสม่ําเสมอช่วยให้มั่นใจได้ถึงความสามารถในการรับส่งข้อมูลสูงโดยไม่ลดทอนคุณภาพของข้อมูล ประโยชน์เหล่านี้รวมกับเวิร์กโฟลว์ที่คล่องตัวที่ระบุไว้ข้างต้นทําให้เครื่อง sonicators หลายตัวอย่างของ Hielscher เป็นเครื่องมือที่จําเป็นสําหรับการวิจัยทางชีววิทยาสมัยใหม่

การออกแบบ การผลิต และการให้คําปรึกษา – คุณภาพ ผลิตในประเทศเยอรมนี

เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher เป็นที่รู้จักกันดีในด้านคุณภาพและมาตรฐานการออกแบบสูงสุด ความทนทานและใช้งานง่ายช่วยให้สามารถรวมเครื่องอัลตราโซนิกของเราเข้ากับโรงงานอุตสาหกรรมได้อย่างราบรื่น สภาพที่ขรุขระและสภาพแวดล้อมที่ต้องการสามารถจัดการได้ง่ายโดยเครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher

Hielscher Ultrasonics เป็น บริษัท ที่ได้รับการรับรองมาตรฐาน ISO และให้ความสําคัญเป็นพิเศษกับเครื่องอัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงที่มีเทคโนโลยีล้ําสมัยและเป็นมิตรกับผู้ใช้ แน่นอนว่าเครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher เป็นไปตามมาตรฐาน CE และตรงตามข้อกําหนดของ UL, CSA และ RoHs