โปรโตคอลการเพาะปลูกและการกําจัดฟิล์มชีวภาพ Staphylococcus
วิธีการที่ได้มาตรฐานเป็นสิ่งสําคัญสําหรับผลการวิจัยที่เชื่อถือได้ คุณสามารถค้นหาโปรโตคอลการเพาะปลูกและการแยกสําหรับฟิล์มชีวภาพของหินแหลม โปรโตคอลนี้มุ่งเน้นไปที่การเตรียมตัวอย่างที่มีปริมาณงานสูงอย่างคล่องตัวโดยใช้เครื่อง sonicator แบบเพลทหลายหลุม UIP400MTP สําหรับการถอดฟิล์มชีวภาพที่มีประสิทธิภาพและมีปริมาณงานสูงในแผ่น 96 หลุม โปรโตคอลนี้ยังมีขั้นตอนสําคัญสําหรับการเพาะเลี้ยง การล้าง และการสร้างภาพไบโอฟิล์ม โดยมุ่งเน้นไปที่การลดความแปรปรวนและรับประกันความสามารถในการทําซ้ํา
การวิจัยไบโอฟิล์มและยาปฏิชีวนะ Staphylococcus
ฟิล์มชีวภาพ Staphylococcus มีบทบาทสําคัญในการติดเชื้อถาวรเนื่องจากความต้านทานต่อยาปฏิชีวนะและการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน การสร้างไบโอฟิล์มให้สภาพแวดล้อมที่ป้องกันแบคทีเรียทําให้การติดเชื้อรักษาได้ยาก การวิจัยเกี่ยวกับไบโอฟิล์มมักมุ่งเน้นไปที่การทําความเข้าใจการก่อตัว พฤติกรรม และความอ่อนไหวต่อยาต้านจุลชีพ โดยเน้นที่วิธีการที่มีปริมาณงานสูงเพื่อปรับปรุงเวิร์กโฟลว์การทดลอง
เครื่อง sonicator แบบหลายหลุม UIP400MTP มีข้อได้เปรียบที่สําคัญในการวิจัยไบโอฟิล์มโดยช่วยให้สามารถถอดไบโอฟิล์มออกจากแผ่น 96 หลุมได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ อุปกรณ์นี้ให้พลังงานอัลตราโซนิกที่สม่ําเสมอกับหลุมทั้งหมดเพื่อให้มั่นใจได้ผลลัพธ์ที่สม่ําเสมอในขณะที่ลดความแปรปรวนให้เหลือน้อยที่สุด
โปรโตคอลสําหรับการเพาะปลูกและปลดฟิล์มชีวภาพ Staphylococcus
ด้านล่างนี้ เราจะแนะนําคุณด้วยคําแนะนําทีละขั้นตอนผ่านกระบวนการเพาะเลี้ยงและถอดฟิล์มชีวภาพ Staphylococcus ในฐานะที่เป็นขั้นตอนการวิเคราะห์ที่เป็นแบบอย่างเราแสดงวิธีหาปริมาณมวลชีวภาพที่เพาะปลูกด้วยสเปกโตรโฟโตเมตริกโดยการย้อมสีคริสตัลไวโอเล็ต
การเพาะปลูก Staphylococcus Biofilm
วัสดุที่ต้องการ:
- แผ่นไมโครไทเตอร์ที่ผ่านการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อโพลีสไตรีน 96 หลุมที่ผ่านการบําบัดด้วยไขมันพร้อมฝาปิด
- น้ําซุปถั่วเหลืองทริปติก (TSB) ที่มีกลูโคส 0.25%
- ตู้นิรภัยทางชีวภาพ
กระได:
- เตรียมสภาพแวดล้อมการทํางานที่ปลอดเชื้อในตู้นิรภัยทางชีวภาพเพื่อลดการปนเปื้อน
- เพิ่ม TSB ที่มีกลูโคส 0.25% ลงในหลุมแผ่นไมโครไทเตอร์ โดยทั่วไปแล้ว TSB ที่ไม่มีกลูโคสไม่สนับสนุนการสร้างไบโอฟิล์ม และควรใช้เป็นตัวควบคุมหากจําเป็นเท่านั้น
- ฉีดวัคซีนในหลุมด้วยสายพันธุ์แบคทีเรียที่เตรียมไว้ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง:
- เตรียมสารแขวนลอยของแบคทีเรียเพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีกลุ่มเซลล์ที่มีอยู่ก่อนโดยการทําให้สารแขวนลอยเป็นเนื้อเดียวกันโดยใช้การ sonication หรือโดยการสลายคลัสเตอร์ด้วยเข็ม 23 เกจและการหมุนเวียนสั้น ๆ
- ปิดผนึกจานด้วยฝาปิดและฟักไข่ภายใต้สภาวะที่เหมาะสมที่สุดสําหรับการสร้างไบโอฟิล์ม (เช่น 37°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง)
- ทําการทดลองเป็นสามเท่าสําหรับแบคทีเรียแต่ละสายพันธุ์ (สามหลุมต่อสายพันธุ์) เพื่อให้มั่นใจในความน่าเชื่อถือ
- จัดสรรหกหลุมต่อจานสําหรับการควบคุมเชิงลบ สามารถทดสอบได้ถึง 30 สายพันธุ์ต่อเพลต 96 หลุม
การสร้างภาพและการล้างไบโอฟิล์ม
- หลังจากการฟักตัว ให้ทิ้งสื่ออย่างระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงการรบกวนไบโอฟิล์ม
- ล้างแต่ละบ่อสี่ครั้งด้วยน้ําเกลือทางสรีรวิทยาเพื่อกําจัดแบคทีเรียแพลงก์ตอน
- ตรวจสอบด้านล่างของหลุมเพื่อหาหย่อมสีขาวที่บ่งบอกถึงการมีอยู่ของไบโอฟิล์ม
การถอดฟิล์มชีวภาพโดยใช้ Multi-Well Plate Sonicator UIP400MTP
การตั้งค่าอุปกรณ์และพารามิเตอร์:
- UIP400MTP เครื่องสะท้อนเสียงแบบแผ่นหลายหลุม
- การตั้งค่าการทํางาน: 60% amplitude, โหมดรอบเปิด 60 วินาที / ปิด 30 วินาที
กระได:
- วางแผ่นไมโครไทเตอร์ที่ล้างแล้วลงบนแท่น UIP400MTP
- Sonicate samp ที่การตั้งค่าที่แนะนํา (60% amplitude, เปิด 60 วินาที, ปิด 30 วินาที) ปรับการตั้งค่าให้เข้ากับสายพันธุ์ของแบคทีเรีย
- เริ่มกระบวนการ sonication เพื่อถอดฟิล์มชีวภาพ คลื่นอัลตราโซนิกขัดขวางเมทริกซ์ไบโอฟิล์มปล่อยแบคทีเรียที่เกาะติด
- UIP400MTP ช่วยให้มั่นใจได้ถึงการเปิดรับแสงที่สม่ําเสมอในทุกหลุมเพื่อผลลัพธ์การถอดที่สม่ําเสมอ
แบคทีเรีย Staphylococcus
ขั้นตอนการวิเคราะห์: การหาปริมาณชีวมวล Staphylococcus Biofilm ที่แยกออกโดยใช้คริสตัลไวโอเล็ต (CV)
วัสดุที่ต้องการ:
- 0สารละลายคริสตัลไวโอเล็ต (CV) .1%
- เอทานอล 95% หรือกรดอะซิติก 30% (สําหรับการละลาย)
- เครื่องอ่านไมโครเพลทสามารถอ่านที่ความเร็ว 570 นาโนเมตร
- แผ่นไมโครไทเตอร์ปลอดเชื้อสําหรับการย้อมสี
กระได:
- การเตรียมแผ่นย้อมสี: ถ่ายโอนสารแขวนลอยไบโอฟิล์มที่แยกออก 100 μL จากแต่ละหลุมของแผ่น sonicated ลงในหลุมที่สอดคล้องกันของแผ่นไมโครไทเตอร์ 96 หลุมที่สะอาดและปลอดเชื้อ สิ่งนี้ทําให้มั่นใจได้ถึงสภาพแวดล้อมที่ชัดเจนและสม่ําเสมอสําหรับการย้อมสี
- การย้อมสีไบโอฟิล์มที่แยกออก: เติมสารละลายคริสตัลไวโอเล็ต 0.1% 150 μL ลงในแต่ละหลุมที่มีสารแขวนลอยไบโอฟิล์มที่แยกออก ปิเปตเบา ๆ เพื่อให้แน่ใจว่ามีส่วนผสมของสารแขวนลอยไบโอฟิล์มและคริสตัลไวโอเล็ตอย่างสม่ําเสมอ
- การฟักไข่: ปล่อยให้เพลตฟักตัวที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาทีเพื่อให้คริสตัลไวโอเล็ตสามารถย้อมสีชีวมวลได้อย่างมีประสิทธิภาพ
- การซัก: หลังจากการฟักไข่ให้ทิ้งสารละลายคริสตัลไวโอเล็ตออกจากบ่อน้ําอย่างระมัดระวังโดยไม่รบกวนชีวมวล ล้างแต่ละหลุมสามครั้งด้วยน้ําเกลือทางสรีรวิทยาที่ปราศจากเชื้อเพื่อขจัดคราบที่ไม่ผูกมัด
- การอบแห้ง: ปล่อยให้จานผึ่งลมให้แห้งที่อุณหภูมิห้องหรือภายใต้เครื่องดูดควันอากาศที่ปลอดเชื้อ หลีกเลี่ยงการให้ความร้อน เพราะอาจทําให้ผลลัพธ์เปลี่ยนไปได้
- การละลาย: เติมเอทานอล 200% 95% (หรือกรดอะซิติก 30% ขึ้นอยู่กับแนวทางปฏิบัติในห้องปฏิบัติการมาตรฐาน) ลงในแต่ละหลุมเพื่อละลายคริสตัลไวโอเล็ตที่ผูกมัด ผสมเบา ๆ โดยการปิเปตหรือเขย่าจานเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง
- การวัด: วัดความหนาแน่นของแสง (OD) ของสารละลายคริสตัลไวโอเล็ตที่ละลายได้ที่ 570 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท
- การวิเคราะห์ข้อมูล: ลบค่าเฉลี่ย OD570 ของกลุ่มควบคุมเชิงลบ (หลุมที่มี TSB แต่ไม่มีเชื้อแบคทีเรีย) จากหลุมทดลองเพื่อพิจารณาการย้อมสีพื้นหลัง บันทึกและวิเคราะห์ข้อมูล
หมายเหตุ: ทําการทดลองเป็นสามครั้งสําหรับแต่ละเงื่อนไขเพื่อให้แน่ใจว่าสามารถทําซ้ําได้ ตรวจสอบให้แน่ใจว่ามีการจัดการคริสตัลไวโอเล็ตและเอทานอลอย่างเหมาะสม โดยปฏิบัติตามโปรโตคอลความปลอดภัยและการกําจัด
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
ประโยชน์หลักของ UIP400MTP โดยย่อ:
- การประมวลผลปริมาณงานสูง: ออกแบบมาโดยเฉพาะสําหรับเพลตหลายหลุม ช่วยให้คุณสามารถประมวลผลตัวอย่างหลายตัวอย่างพร้อมกันได้
- การกระจายอัลตราโซนิกสม่ําเสมอ: รับประกันความเข้มของอัลตราโซนิกที่เท่ากันทั่วทั้งหลุม ให้ผลลัพธ์ที่สม่ําเสมอในทุกตัวอย่าง
- ใช้แผ่นมาตรฐานใด ๆ : UIP400MTP สามารถรองรับแผ่นหลายหลุมมาตรฐาน จานเพาะเชื้อ และชั้นวางท่อ ไม่จําเป็นต้องใช้เพลทที่เป็นกรรมสิทธิ์ราคาแพง!
- ส่วนต่อประสานที่ใช้งานง่าย: ติดตั้งและควบคุมได้ง่าย ทําให้เป็นเครื่องมือที่ยอดเยี่ยมในการเพิ่มประสิทธิภาพการทํางานของห้องปฏิบัติการ การตั้งค่าที่ตั้งโปรแกรมได้และระบบอัตโนมัติช่วยอํานวยความสะดวกในการกําหนดมาตรฐานกระบวนการ!
การลอกฟิล์มชีวภาพที่มีปริมาณงานสูง ด้วยเครื่องสะท้อนเสียงแบบแผ่น 96 หลุม UIP400MTP
วรรณกรรม / อ้างอิง
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
คําถามที่พบบ่อย
สารพอลิเมอร์นอกเซลล์ (EPS) คืออะไร?
สารโพลีเมอร์นอกเซลล์ (EPS) เป็นส่วนผสมที่ซับซ้อนของไบโอพอลิเมอร์ ซึ่งส่วนใหญ่ประกอบด้วยโพลีแซ็กคาไรด์ โปรตีน กรดนิวคลีอิก และไขมัน ที่หลั่งโดยจุลินทรีย์ในไบโอฟิล์ม EPS สร้างเมทริกซ์ป้องกันที่ห่อหุ้มชุมชนจุลินทรีย์ ให้ความสมบูรณ์ของโครงสร้าง ไกล่เกลี่ยการยึดเกาะกับพื้นผิว และป้องกันเซลล์จากความเครียดจากสิ่งแวดล้อม รวมถึงยาปฏิชีวนะและการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน
แบคทีเรียแพลงก์ตอนหมายถึงอะไร?
แบคทีเรียแพลงก์ตอนเป็นจุลินทรีย์เซลล์เดียวที่ลอยอยู่อย่างอิสระซึ่งมีอยู่ในสารแขวนลอย เช่น ในการเพาะเลี้ยงของเหลวหรือของเหลวในร่างกาย แทนที่จะยึดติดกับพื้นผิวหรือสร้างชุมชนที่มีโครงสร้าง เช่น ไบโอฟิล์ม
ไบโอฟิล์มและแบคทีเรียแพลงก์ตอนต่างกันอย่างไร?
ความแตกต่างที่สําคัญระหว่างไบโอฟิล์มและแบคทีเรียแพลงก์ตอนอยู่ที่องค์กรของพวกมัน ไบโอฟิล์มเป็นชุมชนแบคทีเรียที่มีโครงสร้างและติดอยู่กับพื้นผิวที่ฝังอยู่ในเมทริกซ์สารพอลิเมอร์นอกเซลล์ (EPS) ในขณะที่แบคทีเรียแพลงก์ตอนลอยตัวอย่างอิสระและขาดโครงสร้างดังกล่าว
แบคทีเรียในไบโอฟิล์มรักษาด้วยยาปฏิชีวนะยากกว่าแบคทีเรียแพลงก์ตอนหรือไม่?
แบคทีเรียในไบโอฟิล์มรักษาด้วยยาปฏิชีวนะได้ยากกว่าอย่างมีนัยสําคัญเมื่อเทียบกับแบคทีเรียแพลงก์ตอน เมทริกซ์ไบโอฟิล์มทําหน้าที่เป็นเกราะป้องกันทางกายภาพ และแบคทีเรียภายในแสดงสถานะการเผาผลาญที่เปลี่ยนแปลงและความต้านทานต่อความเครียดที่เพิ่มขึ้น ซึ่งส่งผลให้ประสิทธิภาพของยาปฏิชีวนะลดลง
ไบโอฟิล์มสามารถฆ่าด้วยยาปฏิชีวนะได้หรือไม่?
ไบโอฟิล์มบางครั้งสามารถกําจัดได้ด้วยยาปฏิชีวนะ แต่นี่เป็นความท้าทาย การรักษาที่มีประสิทธิภาพมักต้องใช้ความเข้มข้นของยาปฏิชีวนะสูง การผสมผสานเฉพาะ หรือการบําบัดเสริม เนื่องจากเมทริกซ์ EPS และกลไกการดื้อยาของแบคทีเรียจะป้องกันไบโอฟิล์ม
Staphylococcus เป็นแบคทีเรียที่ยึดติดหรือไม่?
แบคทีเรีย Staphylococcus เป็นที่รู้จักกันดีในด้านความสามารถในการยึดเกาะ พวกมันติดกับพื้นผิวได้ง่าย ก่อตัวเป็นฟิล์มชีวภาพ โดยเฉพาะอย่างยิ่งบนอุปกรณ์ทางการแพทย์หรือเนื้อเยื่อโฮสต์ ทําให้พวกมันมีส่วนสําคัญในการติดเชื้อถาวร
แบคทีเรีย Staphylococcus มีกี่ประเภท?
แบคทีเรีย Staphylococcus มีหลายประเภท โดยที่โดดเด่นที่สุดคือ Staphylococcus aureus และ Staphylococcus epidermidis S. aureus เป็นโรคและอาจทําให้เกิดการติดเชื้อรุนแรง ในขณะที่ S. epidermidis มักเกี่ยวข้องกับการติดเชื้ออุปกรณ์ที่เกี่ยวข้องกับไบโอฟิล์ม
คริสตัลไวโอเล็ตคืออะไร?
คริสตัลไวโอเล็ตเป็นสีย้อมพื้นฐานที่ใช้กันทั่วไปในการย้อมสีวัสดุชีวภาพ ในจุลชีววิทยา ใช้เพื่อประเมินการสร้างไบโอฟิล์มโดยการย้อมสีชีวมวล ซึ่งสามารถวัดปริมาณได้ทางสเปกโตรโฟโตเมตริก
Hielscher Ultrasonics ผลิตโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงจาก ห้องทดลอง ถึง ขนาดอุตสาหกรรม