วิธีปฏิบัติในการเพาะเลี้ยงและแยกไบโอฟิล์มของ Staphylococcus ออกจากพื้นผิว
วิธีการที่เป็นมาตรฐานมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อผลการวิจัยที่เชื่อถือได้ ที่นี่คุณจะพบวิธีปฏิบัติในการเพาะเลี้ยงและแยกไบโอฟิล์มของ Staphylococcus ออกจากพื้นผิว วิธีปฏิบัตินี้มุ่งเน้นการเตรียมตัวอย่างจำนวนมากอย่างคล่องตัวโดยใช้เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP เพื่อแยกไบโอฟิล์มออกจากพื้นผิวในเพลต 96 หลุมอย่างมีประสิทธิภาพและรองรับตัวอย่างจำนวนมาก วิธีปฏิบัตินี้ยังประกอบด้วยขั้นตอนสำคัญในการเพาะเลี้ยง การล้าง และการตรวจดูไบโอฟิล์ม โดยมุ่งเน้นการลดความแปรปรวนและการทำให้สามารถทำซ้ำได้
การวิจัยไบโอฟิล์มของ Staphylococcus และยาปฏิชีวนะ
ไบโอฟิล์มของ Staphylococcus มีบทบาทสำคัญในการติดเชื้อเรื้อรังเนื่องจากทนต่อยาปฏิชีวนะและการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน การก่อตัวของไบโอฟิล์มสร้างสภาพแวดล้อมที่ปกป้องแบคทีเรีย ทำให้การติดเชื้อรักษาได้ยาก การวิจัยไบโอฟิล์มมักมุ่งเน้นการทำความเข้าใจการก่อตัว พฤติกรรม และความไวต่อสารต้านจุลชีพ โดยเน้นวิธีการที่รองรับตัวอย่างจำนวนมากเพื่อให้ขั้นตอนการทดลองคล่องตัวขึ้น
เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP ให้ข้อได้เปรียบอย่างมากในการวิจัยไบโอฟิล์ม โดยช่วยให้แยกไบโอฟิล์มออกจากพื้นผิวของเพลต 96 หลุมได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ อุปกรณ์นี้จ่ายพลังงานอัลตราโซนิกให้ทุกหลุมอย่างสม่ำเสมอ ทำให้ได้ผลลัพธ์ที่สอดคล้องกันพร้อมกับลดความแปรปรวน
วิธีปฏิบัติในการเพาะเลี้ยงและแยกไบโอฟิล์มของ Staphylococcus ออกจากพื้นผิว
ด้านล่างนี้ เราจะแนะนำกระบวนการเพาะเลี้ยงและแยกไบโอฟิล์มของ Staphylococcus ออกจากพื้นผิวทีละขั้นตอน สำหรับตัวอย่างขั้นตอนการวิเคราะห์ เราจะแสดงวิธีหาปริมาณชีวมวลที่เพาะเลี้ยงด้วยวิธีสเปกโทรโฟโตเมตรีโดยใช้การย้อมด้วย crystal violet
การเพาะเลี้ยงไบโอฟิล์มของ Staphylococcus
วัสดุและอุปกรณ์ที่ต้องใช้:
- ไมโครไทเทอร์เพลตพอลิสไตรีน 96 หลุม ก้นแบน ปลอดเชื้อ ผ่านการปรับสภาพพื้นผิวสำหรับเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ พร้อมฝาปิด
- อาหารเลี้ยงเชื้อ Tryptic Soy Broth (TSB) ที่มีกลูโคส 0.25%
- ตู้ชีวนิรภัย
ขั้นตอน:
- เตรียมสภาพแวดล้อมการทำงานที่ปลอดเชื้อภายในตู้ชีวนิรภัยเพื่อลดการปนเปื้อน
- เติม TSB ที่มีกลูโคส 0.25% ลงในหลุมของไมโครไทเทอร์เพลต โดยทั่วไป TSB ที่ไม่มีกลูโคสไม่ส่งเสริมการก่อตัวของไบโอฟิล์ม และควรใช้เป็นชุดควบคุมเท่านั้นหากจำเป็น
- ใส่เชื้อแบคทีเรียสายพันธุ์ต่าง ๆ ที่เตรียมตามคำอธิบายด้านล่างลงในหลุม:
- เตรียมสารแขวนลอยแบคทีเรีย โดยทำให้แน่ใจว่าไม่มีกลุ่มเซลล์ที่เกาะรวมกันอยู่ก่อนแล้ว ด้วยการทำให้สารแขวนลอยเป็นเนื้อเดียวกันโดยใช้คลื่นอัลตราโซนิก หรือสลายกลุ่มเซลล์ด้วยเข็มขนาด 23 เกจและผสมด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์เป็นเวลาสั้น ๆ
- ปิดเพลตให้สนิทด้วยฝาของเพลตและบ่มภายใต้สภาวะที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการก่อตัวของไบโอฟิล์ม (เช่น 37°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง)
- ทำการทดลองซ้ำสามชุดสำหรับแบคทีเรียแต่ละสายพันธุ์ (สามหลุมต่อสายพันธุ์) เพื่อให้มั่นใจในความน่าเชื่อถือ
- จัดสรรหกหลุมต่อเพลตสำหรับชุดควบคุมลบ สามารถทดสอบได้สูงสุด 30 สายพันธุ์ต่อเพลต 96 หลุม
การตรวจดูและการล้างไบโอฟิล์ม
- หลังการบ่ม ให้ทิ้งอาหารเลี้ยงเชื้ออย่างระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงการรบกวนไบโอฟิล์ม
- ล้างแต่ละหลุมสี่ครั้งด้วยน้ำเกลือทางสรีรวิทยาเพื่อกำจัดแบคทีเรียที่ลอยอิสระ
- ตรวจดูก้นหลุมว่ามีบริเวณสีขาวที่บ่งชี้ถึงการมีไบโอฟิล์มหรือไม่
การแยกไบโอฟิล์มออกจากพื้นผิวโดยใช้เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP
การตั้งค่าอุปกรณ์และพารามิเตอร์:
- เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP
- การตั้งค่าการทำงาน: แอมพลิจูด 60% โหมดทำงานเป็นรอบ โดยเปิด 60 วินาที / ปิด 30 วินาที
ขั้นตอน:
- วางไมโครไทเทอร์เพลตที่ล้างแล้วลงบนแท่นของ UIP400MTP
- ใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับตัวอย่างตามการตั้งค่าที่แนะนำ (แอมพลิจูด 60% เปิด 60 วินาที ปิด 30 วินาที) ปรับการตั้งค่าให้เหมาะกับสายพันธุ์แบคทีเรีย
- เริ่มกระบวนการใช้คลื่นอัลตราโซนิกเพื่อแยกไบโอฟิล์มออกจากพื้นผิว คลื่นอัลตราโซนิกจะทำลายโครงข่ายเมทริกซ์ของไบโอฟิล์มและปลดปล่อยแบคทีเรียที่ยึดเกาะอยู่
- UIP400MTP ทำให้ทุกหลุมได้รับคลื่นอัลตราโซนิกอย่างสม่ำเสมอ เพื่อให้ได้ผลการแยกออกจากพื้นผิวที่สอดคล้องกัน
แบคทีเรีย Staphylococcus
ขั้นตอนการวิเคราะห์: การหาปริมาณชีวมวลของไบโอฟิล์ม Staphylococcus ที่แยกออกจากพื้นผิวโดยใช้ crystal violet (CV)
วัสดุและอุปกรณ์ที่ต้องใช้:
- สารละลาย crystal violet (CV) 0.1%
- เอทานอล 95% หรือกรดแอซีติก 30% (สำหรับการทำให้ละลาย)
- เครื่องอ่านไมโครเพลตที่สามารถอ่านค่าที่ 570 nm
- ไมโครไทเทอร์เพลตปลอดเชื้อสำหรับการย้อม
ขั้นตอน:
- การเตรียมเพลตสำหรับย้อม: ถ่ายสารแขวนลอยไบโอฟิล์มที่แยกออกจากพื้นผิวปริมาตร 100 µL จากแต่ละหลุมของเพลตที่ผ่านการใช้คลื่นอัลตราโซนิกไปยังหลุมตำแหน่งเดียวกันในไมโครไทเทอร์เพลต 96 หลุมที่สะอาดและปลอดเชื้อ วิธีนี้ทำให้มีสภาพแวดล้อมที่สะอาดและสม่ำเสมอสำหรับการย้อม
- การย้อมไบโอฟิล์มที่แยกออกจากพื้นผิว: เติมสารละลาย crystal violet 0.1% ปริมาตร 150 µL ลงในแต่ละหลุมที่มีสารแขวนลอยไบโอฟิล์มที่แยกออกจากพื้นผิว ใช้ปิเปตดูดและปล่อยอย่างเบามือเพื่อให้สารแขวนลอยไบโอฟิล์มและ crystal violet ผสมกันอย่างสม่ำเสมอ
- การบ่ม: บ่มเพลตที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที เพื่อให้ crystal violet ย้อมชีวมวลได้อย่างมีประสิทธิภาพ
- การล้าง: หลังการบ่ม ให้ทิ้งสารละลาย crystal violet ออกจากหลุมอย่างระมัดระวังโดยไม่รบกวนชีวมวล ล้างแต่ละหลุมสามครั้งด้วยน้ำเกลือทางสรีรวิทยาที่ปลอดเชื้อเพื่อกำจัดสีย้อมที่ไม่ได้จับกับชีวมวล
- การทำให้แห้ง: ปล่อยให้เพลตแห้งด้วยอากาศที่อุณหภูมิห้อง หรือภายใต้ตู้ที่มีการไหลของอากาศปลอดเชื้อ หลีกเลี่ยงการให้ความร้อน เนื่องจากอาจทำให้ผลลัพธ์เปลี่ยนแปลง
- การทำให้ละลาย: เติมเอทานอล 95% ปริมาตร 200 µL (หรือกรดแอซีติก 30% ตามแนวปฏิบัติมาตรฐานของห้องปฏิบัติการ) ลงในแต่ละหลุมเพื่อละลาย crystal violet ที่จับกับชีวมวล ผสมอย่างเบามือโดยใช้ปิเปตดูดและปล่อย หรือเขย่าเพลตเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง
- การวัด: วัดค่าความหนาแน่นเชิงแสง (OD) ของสารละลาย crystal violet ที่ละลายแล้วที่ 570 nm โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลต
- การวิเคราะห์ข้อมูล: หักค่าเฉลี่ย OD570 ของชุดควบคุมลบ (หลุมที่มี TSB แต่ไม่ได้ใส่เชื้อแบคทีเรีย) ออกจากค่าของหลุมทดลองเพื่อชดเชยการย้อมสีพื้นหลัง บันทึกและวิเคราะห์ข้อมูล
หมายเหตุ: ทำการทดลองซ้ำสามชุดสำหรับแต่ละสภาวะเพื่อให้มั่นใจว่าสามารถทำซ้ำได้ จัดการ crystal violet และเอทานอลอย่างเหมาะสม โดยปฏิบัติตามระเบียบด้านความปลอดภัยและการกำจัดของเสีย
ประโยชน์หลักของ UIP400MTP โดยสังเขป:
- การประมวลผลตัวอย่างจำนวนมาก: ออกแบบมาโดยเฉพาะสำหรับเพลตหลายหลุม ช่วยให้คุณประมวลผลตัวอย่างหลายตัวอย่างได้พร้อมกัน
- การกระจายคลื่นอัลตราโซนิกอย่างสม่ำเสมอ: ทำให้ความเข้มของคลื่นอัลตราโซนิกเท่ากันทั่วทุกหลุม ส่งผลให้ได้ผลลัพธ์ที่สอดคล้องกันในทุกตัวอย่าง
- ใช้เพลตมาตรฐานได้ทุกชนิด: UIP400MTP สามารถใช้กับเพลตหลายหลุมมาตรฐานทุกชนิด จานเพาะเชื้อ และชั้นวางหลอดได้ ไม่จำเป็นต้องใช้เพลตเฉพาะของผู้ผลิตที่มีราคาแพง!
- ส่วนติดต่อผู้ใช้ที่ใช้งานง่าย: ตั้งค่าและควบคุมได้ง่าย จึงเป็นเครื่องมือที่ยอดเยี่ยมสำหรับเพิ่มผลิตภาพของห้องปฏิบัติการ การตั้งค่าที่ตั้งโปรแกรมได้และระบบอัตโนมัติช่วยให้กำหนดกระบวนการเป็นมาตรฐานได้สะดวกขึ้น!
การแยกไบโอฟิล์มออกจากพื้นผิวสำหรับตัวอย่างจำนวนมาก ด้วยเครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลต 96 หลุม UIP400MTP
วรรณกรรม / เอกสารอ้างอิง
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
คำถามที่พบบ่อย
สารพอลิเมอร์นอกเซลล์ (EPS) คืออะไร?
สารพอลิเมอร์นอกเซลล์ (EPS) เป็นส่วนผสมที่ซับซ้อนของพอลิเมอร์ชีวภาพ ซึ่งส่วนใหญ่ประกอบด้วยพอลิแซ็กคาไรด์ โปรตีน กรดนิวคลีอิก และลิพิด ที่จุลินทรีย์ในไบโอฟิล์มหลั่งออกมา EPS สร้างเมทริกซ์ป้องกันที่ห่อหุ้มชุมชนจุลินทรีย์ ช่วยให้โครงสร้างคงสภาพ เป็นตัวกลางในการยึดเกาะกับพื้นผิว และปกป้องเซลล์จากปัจจัยเครียดจากสิ่งแวดล้อม รวมถึงยาปฏิชีวนะและการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน
แบคทีเรียที่ลอยอิสระหมายถึงอะไร?
แบคทีเรียที่ลอยอิสระเป็นจุลินทรีย์เซลล์เดียวที่ลอยอย่างอิสระอยู่ในสารแขวนลอย เช่น ในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวหรือของเหลวในร่างกาย แทนที่จะยึดเกาะกับพื้นผิวหรือก่อตัวเป็นชุมชนที่มีโครงสร้างอย่างไบโอฟิล์ม
ไบโอฟิล์มกับแบคทีเรียที่ลอยอิสระแตกต่างกันอย่างไร?
ความแตกต่างหลักระหว่างไบโอฟิล์มกับแบคทีเรียที่ลอยอิสระอยู่ที่การจัดระเบียบ ไบโอฟิล์มเป็นชุมชนแบคทีเรียที่มีโครงสร้างและยึดเกาะกับพื้นผิว โดยฝังอยู่ในเมทริกซ์ของสารพอลิเมอร์นอกเซลล์ (EPS) ส่วนแบคทีเรียที่ลอยอิสระจะลอยอย่างอิสระและไม่มีการจัดระเบียบเชิงโครงสร้างดังกล่าว
แบคทีเรียในไบโอฟิล์มรักษาด้วยยาปฏิชีวนะได้ยากกว่าแบคทีเรียที่ลอยอิสระหรือไม่?
แบคทีเรียในไบโอฟิล์มรักษาด้วยยาปฏิชีวนะได้ยากกว่าแบคทีเรียที่ลอยอิสระอย่างมาก เมทริกซ์ของไบโอฟิล์มทำหน้าที่เป็นสิ่งกีดขวางทางกายภาพ และแบคทีเรียภายในมีสภาวะเมแทบอลิซึมที่เปลี่ยนไปและมีความทนต่อความเครียดเพิ่มขึ้น ซึ่งส่งผลให้ประสิทธิผลของยาปฏิชีวนะลดลง
ยาปฏิชีวนะสามารถฆ่าไบโอฟิล์มได้หรือไม่?
บางครั้งยาปฏิชีวนะสามารถกำจัดไบโอฟิล์มได้ แต่ทำได้ยาก การรักษาที่มีประสิทธิผลมักต้องใช้ยาปฏิชีวนะที่มีความเข้มข้นสูง การใช้ยาร่วมกันในรูปแบบเฉพาะ หรือการรักษาเสริม เนื่องจากเมทริกซ์ EPS และกลไกการดื้อยาของแบคทีเรียช่วยปกป้องไบโอฟิล์ม
Staphylococcus เป็นแบคทีเรียที่ยึดเกาะได้หรือไม่?
แบคทีเรีย Staphylococcus เป็นที่รู้จักกันดีในด้านความสามารถในการยึดเกาะ แบคทีเรียเหล่านี้ยึดเกาะกับพื้นผิวได้ง่ายและก่อตัวเป็นไบโอฟิล์ม โดยเฉพาะบนอุปกรณ์ทางการแพทย์หรือเนื้อเยื่อของโฮสต์ จึงเป็นปัจจัยสำคัญที่ทำให้เกิดการติดเชื้อเรื้อรัง
แบคทีเรีย Staphylococcus มีชนิดใดบ้าง?
แบคทีเรีย Staphylococcus มีหลายชนิด โดยชนิดที่โดดเด่นที่สุดคือ Staphylococcus aureus และ Staphylococcus epidermidis โดย S. aureus เป็นเชื้อก่อโรคและอาจทำให้เกิดการติดเชื้อรุนแรง ส่วน S. epidermidis มักเกี่ยวข้องกับการติดเชื้อที่อุปกรณ์ซึ่งสัมพันธ์กับไบโอฟิล์ม
crystal violet คืออะไร?
crystal violet เป็นสีย้อมชนิดเบสที่ใช้กันทั่วไปในการย้อมวัสดุชีวภาพ ในทางจุลชีววิทยา ใช้ประเมินการก่อตัวของไบโอฟิล์มโดยย้อมชีวมวล ซึ่งจากนั้นสามารถหาปริมาณด้วยวิธีสเปกโทรโฟโตเมตรีได้
Hielscher Ultrasonics ผลิตเครื่องทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยคลื่นอัลตราโซนิกสมรรถนะสูง ตั้งแต่ขนาด ห้องปฏิบัติการ ไปจนถึง ขนาดอุตสาหกรรม