โปรโตคอลการทดสอบความเข้มข้นยับยั้งขั้นต่ํา (MIC)

การทดสอบความเข้มข้นของการยับยั้งขั้นต่ํา (MIC) ที่ใช้ไบโอฟิล์มเป็นวิธีสําคัญในการประเมินประสิทธิภาพของสารต้านจุลชีพต่อจุลินทรีย์ที่เกี่ยวข้องกับไบโอฟิล์ม ซึ่งแสดงความต้านทานที่สูงขึ้นเนื่องจากเมทริกซ์นอกเซลล์ป้องกัน ขั้นตอนสําคัญในการทดสอบนี้คือการหยุดชะงักของโครงสร้างไบโอฟิล์มเพื่อปล่อยเซลล์ที่ฝังตัวเพื่อการประเมินความมีชีวิตที่แม่นยํา เครื่อง sonicator แบบหลายหลุม UIP400MTP ช่วยอํานวยความสะดวกในกระบวนการนี้โดยใช้อัลตราซาวนด์ที่โฟกัสเพื่อสร้างโพรงอากาศที่ควบคุมการแยกเซลล์ไบโอฟิล์มได้อย่างมีประสิทธิภาพและกระจายตัวลงในสารแขวนลอยที่สม่ําเสมอ การหยุดชะงักของไบโอฟิล์มที่แม่นยําและทําซ้ําได้นี้ช่วยเพิ่มความน่าเชื่อถือและปริมาณงานของการทดสอบ MIC ทําให้ UIP400MTP เป็นเครื่องมือสําคัญในการพัฒนาการวิจัยไบโอฟิล์ม

Sonication สําหรับการแยกฟิล์มชีวภาพ

โดยทั่วไปแล้ว Biofilm-Based MIC Assay จะวัดความมีชีวิตของแบคทีเรียหรือการยับยั้งการเจริญเติบโตโดยใช้วิธีการต่างๆ เช่น การชุบ การนับโคโลนี หรือการวัดความหนาแน่นของแสง Sonication เป็นขั้นตอนสําคัญในการทดสอบ MIC ที่ใช้ไบโอฟิล์มเมื่อประเมินความไวต่อยาต้านจุลชีพของจุลินทรีย์ที่เกี่ยวข้องกับไบโอฟิล์ม หน้าที่หลักคือการแยกและกระจายเซลล์ที่ฝังอยู่ในเมทริกซ์ไบโอฟิล์มให้เป็นสารแขวนลอยที่สม่ําเสมอเพื่อการวิเคราะห์ที่แม่นยํา
ไบโอฟิล์มมีความต้านทานต่อสารต้านจุลชีพมากกว่าอย่างมีนัยสําคัญเมื่อเทียบกับเซลล์แพลงก์ตอน ในระหว่างกระบวนการนี้คลื่นอัลตราโซนิกจะสร้างโพรงอากาศที่ควบคุมได้แยกเมทริกซ์ไบโอฟิล์มออกจากกันและปล่อยเซลล์ที่ฝังอยู่ในสารแขวนลอยที่สม่ําเสมอภายในตัวกลางการกู้คืน ขั้นตอนนี้ช่วยให้สามารถประเมินความมีชีวิตของเซลล์ที่กระจายตัวของไบโอฟิล์มได้อย่างแม่นยําผ่านวิธีการต่างๆ เช่น การชุบ การเจือจาง และการนับโคโลนี การหยุดชะงักของไบโอฟิล์มที่เหมาะสมผ่านการ sonication ช่วยป้องกันส่วนประกอบเมทริกซ์ที่ตกค้างจากการป้องกันเซลล์ซึ่งอาจนําไปสู่การประเมินกิจกรรมต้านจุลชีพต่ําเกินไป UIP400MTP sonicator แบบหลายหลุมเหมาะอย่างยิ่งสําหรับจุดประสงค์นี้โดยให้เงื่อนไข sonication ที่แม่นยําและทําซ้ําได้เพื่อให้แน่ใจว่าการเตรียมแผ่นทดสอบที่เชื่อถือได้และมีปริมาณงานสูง

เหตุใด Sonication จึงจําเป็นในการทดสอบความเข้มข้นของสารยับยั้งขั้นต่ําที่ใช้ไบโอฟิล์ม

สําหรับการวัดความมีชีวิตและการนับเซลล์จําเป็นต้องมีการแยกและกระจายเซลล์เดี่ยวที่สมบูรณ์และเชื่อถือได้ UIP400MTP ส่งเสริมการหลุดฟิล์มชีวภาพที่สม่ําเสมอและไม่ทําลายและการกระจายตัวของเซลล์เพื่อผลการทดสอบที่มีประสิทธิภาพ

• ความซับซ้อนของไบโอฟิล์ม: ไบโอฟิล์มเป็นชุมชนจุลินทรีย์ที่มีโครงสร้างซึ่งห่อหุ้มอยู่ในเมทริกซ์สารพอลิเมอร์นอกเซลล์ (EPS) ซึ่งช่วยปกป้องจุลินทรีย์และทําให้ทนต่อสารต้านจุลชีพได้มากขึ้น
• การกระจายตัวสม่ําเสมอ: ในการวัดความมีชีวิตของเซลล์ที่ฝังไบโอฟิล์มหรือความไวต่อยาต้านจุลชีพได้อย่างแม่นยําก่อนอื่นจะต้องหลุดออกจากไบโอฟิล์มและย่อยสลายเป็นสารแขวนลอยที่เป็นเนื้อเดียวกัน

โปรโตคอลการทดสอบความเข้มข้นยับยั้งขั้นต่ําที่ใช้ไบโอฟิล์ม

การทดสอบความเข้มข้นยับยั้งขั้นต่ํา (MIC) กําหนดความเข้มข้นต่ําสุดของสารต้านจุลชีพที่จําเป็นในการยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ที่มองเห็นได้ โปรโตคอลนี้ออกแบบมาสําหรับจุลินทรีย์ที่เกี่ยวข้องกับไบโอฟิล์มโดยใช้เครื่อง sonicator แบบหลายหลุม UIP400MTP สําหรับการหยุดชะงักของไบโอฟิล์ม

ขั้นตอนที่ 1: การเตรียมเชื้อแบคทีเรีย

1. เตรียมสารแขวนลอยของแบคทีเรีย:
   ปลูกแบคทีเรียในสื่อที่เหมาะสมจนถึงระยะลอการิทึมกลาง
   เจือจางการเพาะเลี้ยงเพื่อให้ได้ความหนาแน่นของเซลล์ที่ได้มาตรฐาน (เช่น มาตรฐาน 0.5 McFarland หรือ OD600 ~0.1)
2. เตรียมสารละลายต้านจุลชีพ:
   เจือจางสารต้านจุลชีพในอาหารที่เหมาะสมเพื่อสร้างช่วงความเข้มข้น (เช่น การเจือจางแบบอนุกรมสองเท่า)
3. จ่ายลงในแผ่น 96well:
   เติมสารละลายต้านจุลชีพลงในหลุมของแผ่นมาตรฐาน 96 หลุม โดยมีปริมาตรหลุมสุดท้าย ~150–200 μL
   รวมการควบคุมการเจริญเติบโต (ไม่มียาต้านจุลชีพ) และการควบคุมความเป็นหมัน (ไม่มีการฉีดวัคซีนจากแบคทีเรีย)

ขั้นตอนที่ 2: การสร้างไบโอฟิล์มบนฝาหมุด

• ติดฝาหมุด:
  วางฝาหมุดพิเศษลงบนบ่อที่ฉีดวัคซีน เพื่อให้แน่ใจว่าหมุดจมอยู่ในสารแขวนลอยของแบคทีเรียจนสุด
• บ่มจาน:
  ฟักไข่ที่อุณหภูมิที่เหมาะสม (เช่น 37°C) เป็นระยะเวลาที่กําหนด (เช่น 24 ชั่วโมง) ภายใต้สภาวะคงที่เพื่อให้เกิดฟิล์มชีวภาพบนหมุด

ขั้นตอนที่ 3: การสัมผัสสารต้านจุลชีพ

• ล้างหมุด:
  ถอดฝาหมุดออกจากสารแขวนลอยของแบคทีเรียและล้างเบา ๆ ด้วยน้ําเกลือปลอดเชื้อหรือ PBS เพื่อขจัดเซลล์แพลงก์ตอนที่ติดอยู่หลวม ๆ
• สัมผัสกับยาต้านจุลชีพ:
  ย้ายฝาหมุดลงในแผ่น 96well ใหม่ที่มีการเจือจางต้านจุลชีพที่เตรียมไว้ก่อนหน้านี้
  ฟักไข่เป็นระยะเวลาที่กําหนด (เช่น 24 ชั่วโมง) ภายใต้สภาวะคงที่เพื่อให้สารต้านจุลชีพออกฤทธิ์กับไบโอฟิล์ม

ขั้นตอนที่ 4: Sonication ด้วย Microplate Sonicator UIP400MTP

ขั้นตอนการ sonication มีความสําคัญต่อการถอดฟิล์มชีวภาพออกจากฝาหมุดเพื่อประเมินความมีชีวิต ทําตามขั้นตอนเหล่านี้สําหรับเครื่อง UIP400MTP เสียง:

1. เตรียมการตั้งค่า:
   เติมจานสด 96 หลุมด้วยอาหารเพื่อการกู้คืน (เช่น น้ําซุปที่ทําให้เป็นกลางหรืออาหารเพื่อการเจริญเติบโตที่ปราศจากเชื้อ) ในแต่ละหลุม
2. โอนฝาหมุด:
   ถอดฝาหมุดออกจากแผ่นบําบัดต้านจุลชีพ
   ล้างฝาหมุดด้วยน้ําเกลือปลอดเชื้อหรือ PBS เพื่อขจัดสารต้านจุลชีพที่ตกค้าง
3. วางเพลตในเครื่องโซนิคเตอร์:
   ติดฝาหมุดเข้ากับแผ่นสื่อการกู้คืน
   วางแผ่นสื่อการกู้คืนลงในเครื่องสะท้อนเสียง UIP400MTP ตรวจสอบให้แน่ใจว่าแผ่นอยู่ตรงกลางและมั่นคงตามที่อธิบายไว้ในคู่มือ
4. ปรับพารามิเตอร์ sonication:
   ตั้งค่าพารามิเตอร์ sonication ที่ UIP400MTP (การตั้งค่าอาจปรับให้เข้ากับไบโอฟิล์ม):
   แอมพลิจูด: 70–100%
   เวลาในการ Sonication: 1-3 นาที (ปรับตามโครงสร้างไบโอฟิล์ม) ที่โหมดวงจร
5. โซนิเคต:
   เริ่มกระบวนการ sonication คลื่นอัลตราโซนิกจะขัดขวางเมทริกซ์ไบโอฟิล์มและขับเซลล์ออกสู่ตัวกลางการกู้คืน
6. ตรวจสอบกระบวนการ:
   ใช้เซ็นเซอร์อุณหภูมิแบบเสียบได้เพื่อตรวจสอบ samp อุณหภูมิในหลุม UIP400MTP สามารถเชื่อมต่อกับเครื่องทําความเย็นในห้องปฏิบัติการเพื่อทําความเย็นได้
7. การจัดการหลังการ sonication:
   ถ่ายโอนสื่อการกู้คืนที่มีไบโอฟิล์มที่แยกออกลงในแผ่นปลอดเชื้อใหม่ทันทีเพื่อการวิเคราะห์ในภายหลัง

(A) แผ่นที่มี TSB ที่มีกลูโคส 2% ที่ใช้สําหรับการสร้างไบโอฟิล์ม การกู้คืนเซลล์ และการกําหนด MIC และ MBEC (B) ฝาปิดพร้อมหมุดสําหรับการสร้างฟิล์มชีวภาพ Staphylococcal
เซลล์ไบโอฟิล์มที่เกิดขึ้นบนหมุดถูกหลุดออกโดยการ sonication (Hielscher Ultrasound Technology) เป็นเวลา 5 นาทีในแผ่น 96 หลุมที่มีอาหารเลี้ยงสดเพื่อการกู้คืนเซลล์
(ภาพและการศึกษา: ©de Oliveira et al., 2016)

ขั้นตอนที่ 4: การประเมินความมีชีวิต

แผ่นและวัฒนธรรมชีวภาพที่แยกจากกัน:

1. ทําการเจือจางแบบอนุกรมของอาหารที่กู้คืนและชุบลงบนวุ้นเพื่อแจกแจงหน่วยสร้างอาณานิคม (CFU)
2. ประเมินไมค์:
   กําหนด MIC เป็นความเข้มข้นของสารต้านจุลชีพต่ําสุดที่ยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ที่มองเห็นได้ในอาหารเพื่อการกู้คืนอย่างสมบูรณ์

ความเข้มข้นของการยับยั้งขั้นต่ําของ MIC: ตัวอย่างของแผ่นไมโครไทเตอร์และการตีความผลการเจือจางขนาดเล็ก
(การศึกษาและภาพ: ©Jaskiewicz et al. 2019)

การออกแบบ การผลิต และการให้คําปรึกษา – คุณภาพ ผลิตในประเทศเยอรมนี

เครื่องอัลตราโซนิก Hielscher เป็นที่รู้จักกันดีในด้านคุณภาพและมาตรฐานการออกแบบสูงสุด ความทนทานและใช้งานง่ายช่วยให้สามารถรวมเครื่องอัลตราโซนิกของเราเข้ากับโรงงานอุตสาหกรรมได้อย่างราบรื่น สภาพที่ขรุขระและสภาพแวดล้อมที่ต้องการสามารถจัดการได้อย่างง่ายดายโดยเครื่องสะท้อนเสียง Hielscher

Hielscher Ultrasonics เป็น บริษัท ที่ได้รับการรับรองมาตรฐาน ISO และให้ความสําคัญเป็นพิเศษกับเครื่องอัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงที่มีเทคโนโลยีล้ําสมัยและเป็นมิตรกับผู้ใช้ แน่นอนว่าเครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher เป็นไปตามมาตรฐาน CE และตรงตามข้อกําหนดของ UL, CSA และ RoHs

อ่านที่นี่ว่า UIP400MTP ใช้สําหรับการถอดไบโอฟิล์มในโปรโตคอล ASTM E2799 อย่างไร – การทดสอบประสิทธิภาพของสารฆ่าเชื้อต่อไบโอฟิล์ม Pseudomonas aeruginosa โดยใช้การทดสอบ MBEC