วิธีปฏิบัติสำหรับการทดสอบความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์ (MIC)

การทดสอบความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์ (MIC) โดยใช้ไบโอฟิล์มเป็นวิธีสำคัญในการประเมินประสิทธิผลของสารต้านจุลชีพต่อจุลินทรีย์ที่เกี่ยวข้องกับไบโอฟิล์ม ซึ่งมีความต้านทานสูงขึ้นเนื่องจากมีเมทริกซ์นอกเซลล์ช่วยปกป้อง ขั้นตอนสำคัญในการทดสอบนี้คือการแยกโครงสร้างไบโอฟิล์มออกเพื่อปลดปล่อยเซลล์ที่ฝังอยู่ภายในสำหรับการประเมินความมีชีวิตอย่างแม่นยำ เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP ช่วยให้กระบวนการนี้ดำเนินไปได้โดยใช้คลื่นอัลตราซาวนด์แบบรวมจุดเพื่อสร้างคาวิเทชันที่ควบคุมได้ ทำให้เซลล์ไบโอฟิล์มหลุดออกอย่างมีประสิทธิภาพและกระจายเป็นสารแขวนลอยที่สม่ำเสมอ การทำลายโครงสร้างไบโอฟิล์มที่แม่นยำและทำซ้ำได้เช่นนี้ช่วยเพิ่มความน่าเชื่อถือและปริมาณงานทดสอบ MIC ที่ทำได้ ทำให้ UIP400MTP เป็นเครื่องมือสำคัญในการพัฒนางานวิจัยไบโอฟิล์ม

เหตุใดจึงควรใช้คลื่นอัลตราโซนิกระหว่างการทดสอบ MIC?

• ข้อมูลที่แม่นยำและทำซ้ำได้: ได้สารแขวนลอยของเซลล์ที่สม่ำเสมอซึ่งขจัดการปกป้องจากเมทริกซ์ ทำให้จำนวนโคโลนีและค่าความหนาแน่นเชิงแสงที่วัดได้สะท้อนประสิทธิผลของสารต้านจุลชีพอย่างแท้จริง
• ประสิทธิภาพในการประมวลผลตัวอย่างปริมาณมาก: ประมวลผลเพลต 96 หลุมทั้งเพลตพร้อมกันได้ในเวลาเพียง 1–3 นาที แทนที่การขูดด้วยมือที่ช้าและไม่สม่ำเสมอด้วยขั้นตอนการทำงานที่คล่องตัว
• รักษาความมีชีวิตของเซลล์: ทำให้เซลล์ที่ฝังอยู่หลุดออกอย่างอ่อนโยนโดยไม่เกิดความเสียหายทางกายภาพจากการขูด รักษาอัตราการรอดชีวิตที่สูงกว่าเพื่อให้การคำนวณ MIC/MBEC เชื่อถือได้
• ไม่มีความเสี่ยงต่อการปนเปื้อนข้าม: ได้รับประโยชน์จากการออกแบบฮอร์นอัลตราโซนิกทรงถ้วยแบบไม่สัมผัส ซึ่งประมวลผลทุกหลุมอย่างสม่ำเสมอโดยไม่มีโพรบสัมผัสกับตัวอย่างหรือหลุมแต่ละหลุม
• พร้อมปฏิบัติตามมาตรฐาน: ปรับวิธีการของคุณให้สอดคล้องกับวิธีปฏิบัติในอุตสาหกรรมที่ผ่านการตรวจสอบความใช้ได้ เช่น ASTM E2799-22 เพื่อเพิ่มความน่าเชื่อถือของข้อมูลสำหรับการใช้ตามข้อกำหนดของหน่วยงานกำกับดูแลหรือการตีพิมพ์
• คัดกรองยาและการรักษาอย่างมั่นใจ: เชื่อมั่นในผลการทดสอบความไวต่อสารต้านจุลชีพเพื่อประกอบการตัดสินใจที่รอบคอบยิ่งขึ้นเกี่ยวกับประสิทธิผลของสารต้านจุลชีพ การจัดทำข้อมูลลักษณะการดื้อสารต้านจุลชีพ หรือการพัฒนาการรักษา

การใช้คลื่นอัลตราโซนิกเพื่อแยกไบโอฟิล์มออก

โดยทั่วไป การทดสอบ MIC โดยใช้ไบโอฟิล์มวัดความมีชีวิตของแบคทีเรียหรือการยับยั้งการเจริญด้วยวิธีต่าง ๆ เช่น การเพาะเชื้อบนเพลต การนับโคโลนี หรือการวัดความหนาแน่นเชิงแสง การใช้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นขั้นตอนสำคัญในการทดสอบ MIC โดยใช้ไบโอฟิล์ม เมื่อประเมินความไวต่อสารต้านจุลชีพของจุลินทรีย์ที่เกี่ยวข้องกับไบโอฟิล์ม หน้าที่หลักคือแยกและกระจายเซลล์ที่ฝังอยู่ในเมทริกซ์ของไบโอฟิล์มให้เป็นสารแขวนลอยที่สม่ำเสมอเพื่อการวิเคราะห์อย่างแม่นยำ
ไบโอฟิล์มมีความต้านทานต่อสารต้านจุลชีพสูงกว่าเซลล์ที่ลอยอิสระอย่างมาก การแยกออกอย่างเหมาะสมจึงมีความสำคัญต่อการวิเคราะห์อย่างแม่นยำ ระหว่างกระบวนการนี้ คลื่นอัลตราโซนิกสร้างคาวิเทชันที่ควบคุมได้ ทำให้เมทริกซ์ของไบโอฟิล์มแตกตัวและปลดปล่อยเซลล์ที่ฝังอยู่ให้เป็นสารแขวนลอยที่สม่ำเสมอในอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับฟื้นฟูเซลล์ ขั้นตอนนี้ช่วยให้ประเมินความมีชีวิตของเซลล์ที่กระจายออกจากไบโอฟิล์มได้อย่างแม่นยำด้วยวิธีต่าง ๆ เช่น การเพาะเชื้อบนเพลต การเจือจาง และการนับโคโลนี การทำลายโครงสร้างไบโอฟิล์มอย่างเหมาะสมด้วยคลื่นอัลตราโซนิกป้องกันไม่ให้องค์ประกอบเมทริกซ์ที่ตกค้างปกป้องเซลล์ ซึ่งมิฉะนั้นอาจทำให้ประเมินฤทธิ์ต้านจุลชีพต่ำกว่าความเป็นจริง เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP เหมาะเป็นพิเศษสำหรับวัตถุประสงค์นี้ โดยให้สภาวะการใช้คลื่นอัลตราโซนิกที่แม่นยำและทำซ้ำได้ เพื่อให้มั่นใจว่าการเตรียมเพลตทดสอบมีความน่าเชื่อถือและรองรับตัวอย่างปริมาณมาก

เหตุใดการใช้คลื่นอัลตราโซนิกจึงจำเป็นในการทดสอบความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์โดยใช้ไบโอฟิล์ม

การวัดความมีชีวิตและการนับเซลล์ต้องอาศัยการแยกออกและการกระจายเป็นเซลล์เดี่ยวอย่างสมบูรณ์และเชื่อถือได้ UIP400MTP ช่วยให้แยกไบโอฟิล์มออกและกระจายเซลล์ได้อย่างสม่ำเสมอโดยไม่ก่อความเสียหาย เพื่อให้ได้ผลการทดสอบที่น่าเชื่อถือ

• ความซับซ้อนของไบโอฟิล์ม: ไบโอฟิล์มเป็นชุมชนจุลินทรีย์ที่มีโครงสร้างและถูกห่อหุ้มอยู่ในเมทริกซ์ของสารพอลิเมอร์นอกเซลล์ (EPS) ซึ่งปกป้องจุลินทรีย์และทำให้มีความต้านทานต่อสารต้านจุลชีพสูงขึ้น
• การกระจายตัวอย่างสม่ำเสมอ: เพื่อวัดความมีชีวิตของเซลล์ที่ฝังอยู่ในไบโอฟิล์มหรือความไวต่อสารต้านจุลชีพของเซลล์เหล่านี้อย่างแม่นยำ ต้องทำให้ไบโอฟิล์มหลุดออกและแตกตัวเป็นสารแขวนลอยเนื้อเดียวกันก่อน

วิธีปฏิบัติสำหรับการทดสอบความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์โดยใช้ไบโอฟิล์ม

การทดสอบความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์ (MIC) ใช้หาความเข้มข้นต่ำสุดของสารต้านจุลชีพที่จำเป็นต่อการยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์ที่มองเห็นได้ วิธีปฏิบัตินี้ออกแบบมาสำหรับจุลินทรีย์ที่เกี่ยวข้องกับไบโอฟิล์ม โดยใช้เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP เพื่อทำลายโครงสร้างไบโอฟิล์ม

ขั้นตอนที่ 1: การเตรียมเชื้อแบคทีเรียสำหรับใส่ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ

1. เตรียมสารแขวนลอยแบคทีเรีย:
   เพาะเลี้ยงแบคทีเรียในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสมจนถึงช่วงกลางของระยะการเจริญแบบลอการิทึม
   เจือจางเชื้อที่เพาะเลี้ยงเพื่อให้ได้ความหนาแน่นของเซลล์ตามมาตรฐาน (เช่น มาตรฐาน McFarland 0.5 หรือ OD600 ~0.1)
2. เตรียมสารละลายต้านจุลชีพ:
   เจือจางสารต้านจุลชีพในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสมเพื่อให้ได้ความเข้มข้นหลายระดับ (เช่น การเจือจางแบบอนุกรมครั้งละสองเท่า)
3. จ่ายสารละลายลงในเพลต 96 หลุม:
   เติมสารละลายต้านจุลชีพลงในหลุมของเพลตมาตรฐาน 96 หลุม โดยให้ปริมาตรสุดท้ายในแต่ละหลุมเป็น ~150–200 µL
   จัดให้มีชุดควบคุมการเจริญ (ไม่มีสารต้านจุลชีพ) และชุดควบคุมความปราศจากเชื้อ (ไม่มีเชื้อแบคทีเรียที่ใส่ลงไป)

ขั้นตอนที่ 2: การสร้างไบโอฟิล์มบนฝาที่มีหมุด

• ติดฝาที่มีหมุด:
  วางฝาที่มีหมุดซึ่งออกแบบมาเฉพาะบนหลุมที่ใส่เชื้อแล้ว โดยให้แน่ใจว่าหมุดจมอยู่ในสารแขวนลอยแบคทีเรียทั้งหมด
• บ่มเพลต:
  บ่มที่อุณหภูมิที่เหมาะสม (เช่น 37°C) เป็นระยะเวลาที่กำหนด (เช่น 24 ชั่วโมง) ภายใต้สภาวะนิ่งเพื่อให้เกิดไบโอฟิล์มบนหมุด

ขั้นตอนที่ 3: การให้ไบโอฟิล์มสัมผัสสารต้านจุลชีพ

• ล้างหมุด:
  นำฝาที่มีหมุดออกจากสารแขวนลอยแบคทีเรีย แล้วล้างอย่างอ่อนโยนในน้ำเกลือปราศจากเชื้อหรือ PBS เพื่อกำจัดเซลล์ที่ลอยอิสระซึ่งเกาะติดอย่างหลวม ๆ
• ให้สัมผัสสารต้านจุลชีพ:
  ย้ายฝาที่มีหมุดไปยังเพลต 96 หลุมใหม่ที่มีสารต้านจุลชีพซึ่งเจือจางไว้ก่อนหน้านี้
  บ่มเป็นระยะเวลาที่กำหนด (เช่น 24 ชั่วโมง) ภายใต้สภาวะนิ่งเพื่อให้สารต้านจุลชีพออกฤทธิ์ต่อไบโอฟิล์ม

ขั้นตอนที่ 4: การใช้คลื่นอัลตราโซนิกด้วยเครื่องอัลตราโซนิกสำหรับไมโครเพลต UIP400MTP

ขั้นตอนการใช้คลื่นอัลตราโซนิกมีความสำคัญต่อการแยกไบโอฟิล์มออกจากฝาที่มีหมุดเพื่อประเมินความมีชีวิต ปฏิบัติตามขั้นตอนต่อไปนี้สำหรับเครื่องอัลตราโซนิก UIP400MTP:

1. เตรียมอุปกรณ์:
   เติมอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับฟื้นฟูเซลล์ (เช่น อาหารเลี้ยงเชื้อเหลวที่ทำให้สารต้านจุลชีพหมดฤทธิ์ หรืออาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับการเจริญที่ปราศจากเชื้อ) ลงในแต่ละหลุมของเพลต 96 หลุมใหม่
2. ย้ายฝาที่มีหมุด:
   นำฝาที่มีหมุดออกจากเพลตที่ใช้ให้สารต้านจุลชีพ
   ล้างฝาที่มีหมุดในน้ำเกลือปราศจากเชื้อหรือ PBS เพื่อกำจัดสารต้านจุลชีพที่ตกค้าง
3. จัดวางเพลตในเครื่องอัลตราโซนิก:
   ติดฝาที่มีหมุดเข้ากับเพลตที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับฟื้นฟูเซลล์
   วางเพลตที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับฟื้นฟูเซลล์ลงในเครื่องอัลตราโซนิก UIP400MTP โดยให้แน่ใจว่าเพลตอยู่ตรงกลางและมั่นคงตามที่อธิบายไว้ในคู่มือ
4. ปรับพารามิเตอร์การใช้คลื่นอัลตราโซนิก:
   ตั้งพารามิเตอร์การใช้คลื่นอัลตราโซนิกที่ UIP400MTP (อาจปรับการตั้งค่าให้เหมาะกับไบโอฟิล์ม):
   แอมพลิจูด: 70–100%.
   ระยะเวลาการใช้คลื่นอัลตราโซนิก: 1–3 นาที (ปรับตามโครงสร้างไบโอฟิล์ม) ในโหมดทำงานเป็นรอบ
5. ใช้คลื่นอัลตราโซนิก:
   เริ่มกระบวนการใช้คลื่นอัลตราโซนิก คลื่นอัลตราโซนิกจะทำลายเมทริกซ์ของไบโอฟิล์มและทำให้เซลล์หลุดออกสู่อาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับฟื้นฟูเซลล์
6. ติดตามกระบวนการ:
   ใช้เซนเซอร์อุณหภูมิแบบเสียบต่อเพื่อติดตามอุณหภูมิตัวอย่างในหลุม สามารถเชื่อมต่อ UIP400MTP กับเครื่องทำความเย็นสำหรับห้องปฏิบัติการเพื่อระบายความร้อนได้
7. การจัดการหลังใช้คลื่นอัลตราโซนิก:
   ย้ายอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับฟื้นฟูเซลล์ที่มีไบโอฟิล์มซึ่งหลุดออกแล้วไปยังเพลตปราศจากเชื้อใหม่ทันทีเพื่อการวิเคราะห์ต่อไป

(A) เพลตที่มี TSB ผสมกลูโคส 2% ใช้สำหรับการสร้างไบโอฟิล์ม การเก็บเซลล์กลับคืน และการหาค่า MIC และ MBEC; (B) ฝาที่มีหมุดสำหรับการสร้างไบโอฟิล์มของแบคทีเรียสแตฟิโลค็อกคัส
เซลล์ไบโอฟิล์มที่ก่อตัวบนหมุดถูกทำให้หลุดออกด้วยคลื่นอัลตราโซนิก (Hielscher Ultrasound Technology) เป็นเวลา 5 min ในเพลต 96 หลุมที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อใหม่เพื่อเก็บเซลล์กลับคืน
(ภาพและการศึกษา: ©de Oliveira et al., 2016)

ขั้นตอนที่ 4: การประเมินความมีชีวิต

นำไบโอฟิล์มที่แยกออกแล้วลงเพลตและเพาะเลี้ยง:

1. เจือจางอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับฟื้นฟูเซลล์แบบอนุกรมและเพาะบนอาหารวุ้นเพื่อนับหน่วยก่อโคโลนี (CFU)
2. ประเมิน MIC:
   กำหนดค่า MIC เป็นความเข้มข้นต่ำสุดของสารต้านจุลชีพที่ยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์ที่มองเห็นได้ในอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับฟื้นฟูเซลล์อย่างสมบูรณ์

MIC ความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์: ตัวอย่างเพลตไมโครไทเทอร์และการแปลผลการเจือจางระดับไมโคร
(การศึกษาและภาพ: ©Jaskiewicz et al. 2019)

ใครได้รับประโยชน์จากการใช้คลื่นอัลตราโซนิกระหว่างการทดสอบ MIC?

• ผู้ผลิตเครื่องมือแพทย์: เพื่อทดสอบประสิทธิผลของสารเคลือบผิวและตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีปฏิบัติในการทำความสะอาดอุปกรณ์ที่มีแนวโน้มเกิดไบโอฟิล์ม
• นักจุลชีววิทยาคลินิก: เพื่อวินิจฉัยการติดเชื้อที่เกี่ยวข้องกับอุปกรณ์ฝังในร่างกาย (เช่น PJI) อย่างแม่นยำ โดยเก็บแบคทีเรียกลับคืนจากอุปกรณ์ทางการแพทย์
• ผู้พัฒนายา: เพื่อประเมินประสิทธิผลของสารต้านจุลชีพชนิดใหม่ต่อเชื้อก่อโรคที่ทนทานและฝังอยู่ในไบโอฟิล์ม
• นักวิจัยในสถาบันการศึกษา: เพื่อดำเนินการศึกษาชีววิทยาของไบโอฟิล์มและกลไกการดื้อสารต้านจุลชีพที่รองรับตัวอย่างปริมาณมากและทำซ้ำได้
• ทีมควบคุมคุณภาพในอุตสาหกรรม: เพื่อประเมินการเกาะสะสมทางชีวภาพและประสิทธิผลของสารฆ่าเชื้อในสภาพแวดล้อมอุตสาหกรรม (เช่น โดยใช้มาตรฐาน ASTM E2799-22)

การออกแบบ การผลิต และการให้คำปรึกษา – คุณภาพที่ผลิตในเยอรมนี

เครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher เป็นที่รู้จักอย่างดีในด้านคุณภาพและมาตรฐานการออกแบบที่สูงที่สุด ความทนทานและการใช้งานที่ง่ายช่วยให้ผสานเครื่องอัลตราโซนิกของเราเข้ากับโรงงานอุตสาหกรรมได้อย่างราบรื่น เครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher รับมือกับสภาวะที่รุนแรงและสภาพแวดล้อมที่มีข้อเรียกร้องสูงได้อย่างง่ายดาย

Hielscher Ultrasonics เป็นบริษัทที่ได้รับการรับรอง ISO และให้ความสำคัญเป็นพิเศษกับเครื่องอัลตราโซนิกสมรรถนะสูงที่ใช้เทคโนโลยีล้ำสมัยและใช้งานง่าย แน่นอนว่าเครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher เป็นไปตามข้อกำหนด CE และตรงตามข้อกำหนดของ UL, CSA และ RoHs

อ่านที่นี่ว่า UIP400MTP ใช้แยกไบโอฟิล์มออกในวิธีปฏิบัติ ASTM E2799 อย่างไร – การทดสอบประสิทธิผลของสารฆ่าเชื้อต่อไบโอฟิล์มของ Pseudomonas aeruginosa โดยใช้การทดสอบ MBEC