ระเบียบวิธี ASTM E2799-22 สำหรับการประเมินฤทธิ์ต้านจุลชีพ

Hielscher UIP400MTP เป็นเครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลตหลายหลุมที่ทรงพลังและมีประสิทธิภาพ ออกแบบมาเพื่อให้ขั้นตอนการใช้คลื่นอัลตราโซนิกในระเบียบวิธี ASTM E2799-22 ดำเนินไปอย่างคล่องตัว ด้วยการส่งพลังงานอัลตราโซนิกอย่างสม่ำเสมอทั่วทั้งไมโครไทเทอร์เพลต UIP400MTP จึงช่วยให้ไบโอฟิล์มหลุดออกจากฝาที่มีหมุดได้อย่างสม่ำเสมอและเชื่อถือได้ โดยไม่ทำให้เซลล์เสียหายหรือกระทบต่อความสมบูรณ์ของตัวอย่าง ความสามารถในการประมวลผลตัวอย่างจำนวนมากและการใช้งานที่สะดวกช่วยลดเวลาในการประมวลผลได้อย่างมีนัยสำคัญ พร้อมทั้งเพิ่มความสามารถในการทำซ้ำให้ได้ผลเดิม จึงเป็นโซลูชันที่เหมาะอย่างยิ่งสำหรับห้องปฏิบัติการที่ทดสอบความมีชีวิตของไบโอฟิล์มและประสิทธิผลของสารต้านจุลชีพ

ASTM E2799

ASTM E2799 เป็นวิธีทดสอบมาตรฐานที่ออกแบบมาเพื่อประเมินประสิทธิผลของสารต้านจุลชีพต่อไบโอฟิล์ม โดยมุ่งเน้นที่ Pseudomonas aeruginosa โดยเฉพาะ ไบโอฟิล์มเป็นชุมชนจุลินทรีย์ที่ซับซ้อนซึ่งยึดเกาะกับพื้นผิวและมีความต้านทานต่อการใช้สารต้านจุลชีพสูงขึ้น จึงเป็นปัญหาท้าทายอย่างมากในบริบทด้านการดูแลสุขภาพ อุตสาหกรรม และสิ่งแวดล้อม วิธีนี้ใช้การทดสอบความเข้มข้นต่ำสุดที่กำจัดไบโอฟิล์มได้ (MBEC) เพื่อให้กรอบการทดสอบสารฆ่าเชื้อที่เชื่อถือได้และทำซ้ำให้ได้ผลเดิมได้ ภายใต้สภาวะไบโอฟิล์มที่สมจริง

การใช้คลื่นอัลตราโซนิกมีส่วนช่วยใน ASTM E2799 อย่างไร?

การใช้คลื่นอัลตราโซนิกมีบทบาทสำคัญในระเบียบวิธี ASTM E2799 โดยช่วยให้ไบโอฟิล์มหลุดออกจากพื้นผิวทดสอบ ทำให้ประเมินความมีชีวิตของจุลินทรีย์หลังการใช้สารได้อย่างถูกต้อง ด้วยการใช้พลังงานอัลตราโซนิกที่มีการควบคุม ระเบียบวิธีนี้จึงทำให้ไบโอฟิล์มแตกตัวได้อย่างมีประสิทธิภาพและสม่ำเสมอโดยไม่ทำให้เซลล์เสียหาย ส่งผลให้ได้ผลลัพธ์ที่แม่นยำและทำซ้ำให้ได้ผลเดิมได้ จึงทำให้ ASTM E2799 เป็นเครื่องมือที่จำเป็นต่อการผลักดันงานวิจัยไบโอฟิล์มและการพัฒนากลยุทธ์ต้านจุลชีพที่มีประสิทธิผล

วิธีดำเนินการทดสอบ MBEC ตาม ASTM E2799-22

ระเบียบวิธี ASTM E2799-22 ระบุขั้นตอนสำหรับการประเมินประสิทธิผลของสารต้านจุลชีพต่อไบโอฟิล์ม เมื่อใช้เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับไมโครไทเทอร์เพลต Hielscher UIP400MTP สามารถปรับระเบียบวิธีให้รวมวิธีการใช้คลื่นอัลตราโซนิกขั้นสูงนี้สำหรับการทำให้ไบโอฟิล์มหลุดออกได้ ด้านล่างเป็นคำอธิบายขั้นตอนที่ปรับให้เหมาะกับการใช้เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับไมโครเพลต UIP400MTP:

1. การเตรียมไบโอฟิล์ม
   เตรียมไมโครไทเทอร์เพลต 96 หลุมที่ปราศจากเชื้อพร้อมฝาที่มีหมุดแบบถอดได้
   เติมเชื้อลงในหลุมโดยใช้สารแขวนลอยแบคทีเรียที่ปรับให้ได้มาตรฐานในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสม
   วางฝาที่มีหมุดลงบนเพลต โดยตรวจสอบให้แน่ใจว่าหมุดจมอยู่ในสารแขวนลอยแบคทีเรียทั้งหมด
   บ่มเพลตภายใต้สภาวะที่มีการควบคุม (เช่น อุณหภูมิและเวลา) เพื่อให้เกิดไบโอฟิล์มบนหมุด
2. การใช้สารต้านจุลชีพ
   หลังจากเกิดไบโอฟิล์มแล้ว ให้เปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อเป็นอาหารเลี้ยงเชื้อใหม่ที่มีสารต้านจุลชีพที่ต้องการทดสอบในความเข้มข้นต่าง ๆ
   ใส่ฝาที่มีหมุดกลับเข้าที่และบ่มภายใต้สภาวะที่กำหนดไว้ในการออกแบบการทดสอบ
3. การเตรียมสำหรับการทำให้ไบโอฟิล์มหลุดออก
   หลังการใช้สาร ให้ล้างฝาที่มีหมุดโดยจุ่มลงในสารละลายล้างที่ปราศจากเชื้อ เพื่อกำจัดสารต้านจุลชีพที่ตกค้างและเซลล์แพลงก์โทนิกที่ยึดเกาะอย่างหลวม ๆ
4. การทำให้ไบโอฟิล์มหลุดออกโดยใช้เครื่องอัลตราโซนิก UIP400MTP
   เตรียมไมโครไทเทอร์เพลต 96 หลุมอันใหม่ที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับการฟื้นสภาพ (เช่น อาหารเลี้ยงเชื้อเหลวที่ทำให้สารต้านจุลชีพหมดฤทธิ์)
   ทำให้ไบโอฟิล์มหลุดออกโดยวางฝาที่มีหมุดลงในหลุมของเพลตที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับการฟื้นสภาพ
   ใส่เพลตลงในเครื่องอัลตราโซนิก UIP400MTP โดยตรวจสอบให้แน่ใจว่าฝาและเพลตอยู่ในแนวที่ถูกต้อง
   ตั้งค่าแอมพลิจูดของเครื่องอัลตราโซนิกเป็น 70%–80% และใช้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นเวลา 3–4 นาทีในโหมดการทำงานแบบเป็นรอบ เพื่อให้ไบโอฟิล์มหลุดออกอย่างสม่ำเสมอโดยไม่เกิดการสลายของเซลล์
5. การประเมินความมีชีวิตของไบโอฟิล์ม
   หลังการใช้คลื่นอัลตราโซนิก ให้นำอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับการฟื้นสภาพที่มีเซลล์ไบโอฟิล์มซึ่งหลุดออกมาไปดำเนินการด้วยเทคนิคมาตรฐานทางจุลชีววิทยาหรือเทคนิคการวิเคราะห์ เช่น:
   • การนับหน่วยก่อโคโลนี (CFU): เจือจางแบบลำดับส่วนและเพาะบนอาหารวุ้นเพื่อนับจำนวนเซลล์ที่มีชีวิต
   • การวัดความหนาแน่นเชิงแสง (OD): ใช้การวิเคราะห์ด้วยสเปกโทรโฟโตเมตรีเพื่อประเมินความหนาแน่นของเซลล์
   • การทดสอบความมีชีวิตโดยอาศัยการเรืองแสง: วัดปริมาณเซลล์ที่มีชีวิตและเซลล์ที่ตายโดยใช้สีย้อมเรืองแสง
6. การวิเคราะห์ข้อมูล
   เปรียบเทียบข้อมูลความมีชีวิตของไบโอฟิล์มที่ผ่านและไม่ผ่านการใช้สาร เพื่อหาประสิทธิผลของสารต้านจุลชีพ
   คำนวณความเข้มข้นต่ำสุดที่กำจัดไบโอฟิล์มได้ (MBEC) โดยอาศัยความเข้มข้นที่จำเป็นต่อการกำจัดเซลล์ไบโอฟิล์มที่มีชีวิต
7. การควบคุมคุณภาพ
   รักษาสภาวะการใช้คลื่นอัลตราโซนิกให้สม่ำเสมอโดยสอบเทียบ UIP400MTP เป็นประจำ และตรวจสอบว่ากระบวนการทำให้ไบโอฟิล์มหลุดออกไม่ทำให้เกิดการสลายหรือการทำลายเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ
   รวมชุดควบคุมที่เหมาะสม เช่น ไบโอฟิล์มที่ไม่ผ่านการใช้สารและแบลงก์ที่มีเฉพาะอาหารเลี้ยงเชื้อ เพื่อยืนยันความถูกต้องของผลลัพธ์

เซลล์ไบโอฟิล์มที่ก่อตัวบนหมุดถูกทำให้หลุดออกด้วยคลื่นอัลตราโซนิก (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, เยอรมนี, UIP250MTP) เป็นเวลา 5 min ในเพลต 96 หลุมที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อใหม่เพื่อฟื้นสภาพเซลล์
(ภาพและการศึกษา: ©de Oliveira et al., 2016)

การผนวก UIP400MTP เข้ากับขั้นตอนการทำงานตาม ASTM E2799-22 ช่วยปรับกระบวนการทำให้ไบโอฟิล์มหลุดออกให้เหมาะสมที่สุดด้านความสม่ำเสมอ ประสิทธิภาพ และการใช้งานที่ประมวลผลตัวอย่างจำนวนมาก