กระบวนการทำงานด้านโปรตีโอมิกส์ด้วยการย่อยโปรตีนที่รองรับตัวอย่างจำนวนมาก

โปรตีโอมิกส์เป็นสาขาที่สำคัญยิ่งต่อการทำความเข้าใจกระบวนการและระบบทางชีววิทยา โดยการย่อยโปรตีนเป็นขั้นตอนสำคัญในกระบวนการทำงานของสาขานี้ ตามวิธีดั้งเดิม การย่อยโปรตีนดำเนินการในสารละลายโดยใช้เอนไซม์ย่อยโปรตีน เช่น ทริปซิน ซึ่งไฮโดรไลซ์พันธะเพปไทด์ที่ตำแหน่งกรดอะมิโน lysine และ arginine อย่างจำเพาะ กระบวนการนี้ให้เพปไทด์ที่เหมาะสำหรับการทำให้เกิดไอออนและการแตกเป็นชิ้นส่วนในการประยุกต์ใช้แมสสเปกโทรเมทรี (MS) อย่างไรก็ตาม วิธีการย่อยแบบทั่วไปต้องใช้เวลา 12–24 ชั่วโมงจึงจะเสร็จสมบูรณ์ ทำให้เกิดคอขวดที่สำคัญในกระบวนการทำงานด้านโปรตีโอมิกส์
การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์เป็นทางเลือกที่ทรงประสิทธิภาพ โดยลดระยะเวลาการย่อยลงอย่างมากจากหลายชั่วโมงเหลือเพียงไม่กี่นาที เมื่อใช้ร่วมกับเครื่องอัลตราโซนิกสำหรับหลายตัวอย่างที่มีเทคโนโลยีขั้นสูง เช่น Hielscher CupHorn, VialTweeter และเครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลต 96 หลุม UIP400MTP การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ช่วยให้ดำเนินงานด้านโปรตีโอมิกส์ได้เร็วขึ้นและรองรับตัวอย่างจำนวนมาก เทคโนโลยีเหล่านี้ทำให้กระบวนการทำงานคล่องตัวขึ้น ลดเวลาเตรียมตัวอย่าง และเพิ่มประสิทธิภาพโดยไม่ลดทอนความสามารถในการให้ผลซ้ำหรือคุณภาพข้อมูล

บทบาทของพลังงานอัลตราซาวนด์ในการย่อยโปรตีน

การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์อาศัยคลื่นอัลตราซาวนด์แบบรวมจุดเพื่อสร้างคาวิเทชัน – ฟองขนาดจุลภาคที่เกิดขึ้นเฉพาะบริเวณและยุบตัวจนก่อให้เกิดแรงเฉือนรุนแรง ปรากฏการณ์นี้เพิ่มการถ่ายเทมวล ส่งเสริมการผสมเอนไซม์กับสารตั้งต้น และคลายโครงสร้างโปรตีน ทำให้เอนไซม์ย่อยโปรตีน เช่น ทริปซิน เข้าถึงตำแหน่งตัดได้
ผลลัพธ์คืออะไร? ระยะเวลาการย่อยลดลงอย่างมีนัยสำคัญโดยไม่ลดทอนประสิทธิภาพหรือความสามารถในการให้ผลซ้ำ

การย่อยโปรตีนที่เสริมประสิทธิภาพด้วยอัลตราซาวนด์: วิธีการและผลลัพธ์

โพรโทคอลการย่อยแบบเร่ง

การย่อยโดยใช้อัลตราซาวนด์ช่วยผสานเอนไซม์ย่อยโปรตีนกับพลังงานอัลตราซาวนด์เพื่อเร่งกระบวนการทำงาน ตัวอย่างเช่น เมื่อใช้ Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) กระบวนการย่อยดำเนินการดังนี้:

1. การรีดักชัน: เติม DTT (2 µL, 110 mM) ลงในตัวอย่างโปรตีน (0.5 mg/mL, 20 µL) ในบัฟเฟอร์ ammonium bicarbonate (12.5 mM) ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ที่แอมพลิจูด 50% เป็นเวลา 5 นาที
2. การแอลคิเลชัน: หลังจากเติม IAA (2 µL, 400 mM) ให้ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ซ้ำภายใต้สภาวะเดียวกัน
3. การย่อย: เจือจางตัวอย่างและบ่มร่วมกับอนุภาคนาโนที่ตรึงทริปซินไว้ การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์รอบสุดท้าย (5 นาที) ทำให้การย่อยเสร็จสมบูรณ์ แยกเพปไทด์ ทำให้แห้ง และเก็บไว้สำหรับการวิเคราะห์ด้วย MS

วิธีใช้อัลตราซาวนด์นี้ลดเวลาเตรียมทั้งหมดจาก 12 ชั่วโมงเหลือน้อยกว่า 30 นาที แม้กระบวนการจะเร็วขึ้น แต่ปริมาณเพปไทด์ที่ได้และคุณภาพยังคงสอดคล้องกับวิธีดั้งเดิมที่ใช้เวลาข้ามคืน

ประสิทธิภาพของการย่อยโปรตีนด้วยอัลตราซาวนด์

ในการศึกษาเปรียบเทียบโดยใช้โปรตีโอมของ E. coli:

• การระบุชนิดโปรตีน: ตัวอย่างที่ย่อยด้วยอัลตราซาวนด์สามารถระบุโปรตีนได้ 777 ชนิดในเวลา 5 นาที เทียบกับ 817 ชนิดในเวลา 12 ชั่วโมง โปรตีนที่ระบุได้ตรงกันระหว่างทั้งสองวิธีมีมากกว่า 70%
• ความสามารถในการให้ผลซ้ำ: การวิเคราะห์ซ้ำแสดงค่าสหสัมพันธ์สูงกว่า 98% ภายในแต่ละวิธี ซึ่งแสดงถึงความน่าเชื่อถือ
• ความเลือกจำเพาะ: แต่ละวิธีย่อยโปรตีนบางชนิดได้ดีกว่าชนิดอื่น โดยการย่อยด้วยอัลตราซาวนด์เอื้อต่อโปรตีน 65 ชนิด และการย่อยข้ามคืนเอื้อต่อโปรตีน 54 ชนิด ความแตกต่างในรายละเอียดเหล่านี้เน้นย้ำถึงศักยภาพเฉพาะตัวของการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์สำหรับการประยุกต์ใช้เฉพาะด้าน

ผลการหาปริมาณโปรตีนโดยไม่ใช้สารติดฉลากสำหรับโปรตีนเจ็ดชนิดที่เติมลงในตัวอย่าง E. coli
โดยเติมโปรตีนต่อไปนี้ที่สองระดับแตกต่างกันตามที่ระบุในคอลัมน์
ชื่อ “Theo Ratio” โดย Theo Ratio คืออัตราส่วนทางทฤษฎีระหว่างสองระดับที่ใช้ใน
การทดลองนี้ ได้แก่ Bovine serum albumin (ALBU), β-lactoglobulin (LACB), α-S1 casein (CASA1),
α-S2 casein (CASA2), cytochrome c (CYC), ovalbumin (OVAL) และ carbonic anhydrase 2
(CAH2) คำนวณอัตราส่วนโดยใช้ค่าความเข้มของโปรตีนจาก LFQ ที่ได้จากการวิเคราะห์ด้วย MaxQuant
ใช้การทดสอบทีของสติวเดนต์เพื่อเปรียบเทียบค่าที่ได้จากแต่ละวิธี (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6)
การศึกษาและภาพกราฟิก: © Martins et al., 2019)

ทริปซินที่ตรึงบนอนุภาคนาโน

การผสานอนุภาคนาโนที่ตรึงทริปซินไว้ (เช่น T-FMNPs) กับการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพกระบวนการทำงานด้านโปรตีโอมิกส์ยิ่งขึ้น อนุภาคนาโนเหล่านี้มีพื้นที่ผิวสูงสำหรับปฏิสัมพันธ์ระหว่างเอนไซม์กับสารตั้งต้น จึงเพิ่มประสิทธิภาพ เมื่อนำไปใช้กับโปรตีโอมที่ซับซ้อน เช่น โปรตีโอมของ E. coli วิธีผสมผสานนี้ให้ผลดังนี้:

• ความเร็ว: ย่อยได้อย่างสมบูรณ์ภายใน 5 นาที
• ความถูกต้อง: การหาปริมาณโปรตีนเทียบเคียงได้กับวิธีดั้งเดิม (p > 0.01, n=3)
• ความสามารถในการขยายขนาด: การปรับใช้กับแพลตฟอร์มเพลตหลายหลุม เช่น UIP400MTP ช่วยให้ประมวลผลตัวอย่างจำนวนมากได้

คลิกที่นี่เพื่อดูโพรโทคอลโดยละเอียดพร้อมคำแนะนำทีละขั้นตอน!
(ดูเปรียบเทียบ Martins et al., 2019)

การย่อยโปรตีนด้วยความเร็วสูงและรองรับตัวอย่างจำนวนมากด้วยเครื่องอัลตราโซนิก Hielscher

เครื่องอัลตราโซนิกรุ่นที่ดีที่สุดสำหรับโปรตีโอมิกส์

Hielscher Ultrasonics มีเครื่องอัลตราโซนิกหลากหลายรุ่นสำหรับการเตรียมหลายตัวอย่างพร้อมกัน ช่วยให้กระบวนการทำงานรองรับตัวอย่างจำนวนมากได้ ไม่ว่าคุณจะใช้ขวดตัวอย่าง หลอดทดลอง เพลตหลายหลุม (เช่น เพลต 6, 24, 96 หลุม) หรือจานเพาะเชื้อ – เรามีเครื่องอัลตราโซนิกที่เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการทดลองของคุณ

เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP

เพื่อให้รองรับตัวอย่างได้ในปริมาณสูงสุด UIP400MTP สามารถประมวลผลเพลต 96 หลุมด้วยคลื่นอัลตราซาวนด์ได้ UIP400MTP ใช้งานร่วมกับไมโครเพลตมาตรฐานใดก็ได้ โดยไม่ต้องใช้วัสดุสิ้นเปลืองเฉพาะของผู้ผลิตที่มีราคาแพง และให้อิสระแก่คุณในการเลือกเพลตหลายหลุมที่ดีที่สุดสำหรับงานวิจัย ด้วยการส่งพลังงานอย่างสม่ำเสมอทั่วทั้งเพลต เครื่องนี้จึงช่วยให้ดำเนินการรีดักชัน แอลคิเลชัน และย่อยโปรตีโอมที่ซับซ้อนได้สูงสุด 200 ชุดอย่างรวดเร็วภายในเวลาเพียง 1 ชั่วโมง ระบบอัตโนมัติและประสิทธิภาพในระดับนี้มีความสำคัญอย่างยิ่งต่องานโปรตีโอมิกส์ที่รองรับตัวอย่างจำนวนมากและการประยุกต์ใช้ทางคลินิก เรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับเครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลตหลายหลุม!

VialTweeter

VialTweeter ออกแบบมาให้เหมาะกับห้องปฏิบัติการที่ต้องการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์กับขวดตัวอย่างหรือหลอดทดลองสูงสุด 10 หลอดพร้อมกัน วิธีการที่ไม่รุกล้ำตัวอย่างนี้ขจัดความเสี่ยงต่อการปนเปื้อนข้าม พร้อมรับประกันการย่อยโปรตีนที่ให้ผลซ้ำได้ อุปกรณ์นี้เหมาะอย่างยิ่งสำหรับนักวิจัยที่ทำงานกับตัวอย่างปริมาตรจำกัดหรือตัวอย่างหลากหลายประเภท
เรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับเครื่องอัลตราโซนิกสำหรับหลายหลอด VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

เครื่องอัลตราโซนิก CupHorn เป็นอุปกรณ์ทรงพลังที่ออกแบบมาเพื่อประมวลผลหลายตัวอย่างในภาชนะปิดสนิทพร้อมกัน เครื่องนี้รับประกันการกระจายพลังงานอัลตราซาวนด์อย่างสม่ำเสมอและการควบคุมอุณหภูมิอย่างแม่นยำ ความสามารถในการประมวลผลตัวอย่างสูงสุดห้าตัวอย่างพร้อมกัน ประกอบกับความเข้ากันได้กับกระบวนการทำงานที่ประกอบด้วยการรีดักชัน แอลคิเลชัน และการย่อย ทำให้ CupHorn เป็นเครื่องมือที่เชื่อถือได้สำหรับโปรตีโอมิกส์ที่ใช้ MS
เรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับ CupHorn SonoReactor!

โพรโทคอลทีละขั้นตอนสำหรับการย่อยโปรตีนโดยใช้อัลตราซาวนด์ช่วยร่วมกับทริปซินที่ตรึงบนอนุภาคนาโน

โพรโทคอลนี้ของ Martins et al. (2019) ได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับการย่อยโปรตีนอย่างรวดเร็วด้วยพลังงานอัลตราซาวนด์และทริปซินที่ตรึงบนอนุภาคนาโน (T-FMNPs) ขั้นตอนที่ระบุช่วยให้การรีดักชัน แอลคิเลชัน และการสลายโปรตีนมีประสิทธิภาพ เหมาะสำหรับการประยุกต์ใช้แมสสเปกโทรเมทรี (MS)
ขั้นตอนของโพรโทคอล

1. การรีดักชันพันธะไดซัลไฟด์
   • เติมสารละลาย DTT (110 mM) ปริมาตร 2 µL ลงในตัวอย่างโปรตีนปริมาตร 20 µL (0.5 mg/mL) ในบัฟเฟอร์ AmBic
   • วางหลอดตัวอย่างในเครื่องปฏิกรณ์อัลตราซาวนด์ UP200St-CupHorn
   • ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์กับตัวอย่างเป็นเวลา 2.5 นาทีที่แอมพลิจูด 50% (200 W, 26 kHz)
   • หยุดพักช่วงสั้น ๆ เพื่อให้เย็นลง จากนั้นใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ต่ออีก 2.5 นาทีภายใต้สภาวะเดียวกัน
2. การแอลคิเลชันหมู่ cysteine ที่ผ่านการรีดักชัน
   • เติมสารละลาย IAA (400 mM) ปริมาตร 2 µL ลงในตัวอย่างโปรตีนที่ผ่านการรีดักชัน
   • ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์เป็นเวลา 2.5 นาทีที่แอมพลิจูด 50% เพื่อช่วยให้เกิดแอลคิเลชัน
   • หยุดพักเพื่อให้เย็นลง จากนั้นใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ต่ออีก 2.5 นาที

   หมายเหตุ: ลดการสัมผัสแสงของตัวอย่างที่ผ่านแอลคิเลชันให้เหลือน้อยที่สุดเพื่อป้องกันการสลายตัวของ IAA

3. การเจือจางตัวอย่าง
   • เจือจางตัวอย่างโปรตีนที่ผ่านแอลคิเลชันให้มีปริมาตรสุดท้าย 100 µL โดยใช้บัฟเฟอร์ AmBic ความเข้มข้น 25 mM ที่มี acetonitrile 4% (v/v)
   • ผสมให้ทั่วโดยใช้ปิเปตดูดและจ่ายอย่างนุ่มนวล
4. การย่อยโปรตีนด้วยทริปซินที่ตรึงบนอนุภาคนาโน
   • เติมสารละลาย T-FMNP (3 mg/mL) ปริมาตร 20 µL ลงในตัวอย่างโปรตีนที่เจือจางแล้ว
   • ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์กับส่วนผสมในเครื่องปฏิกรณ์อัลตราซาวนด์เป็นเวลา 2.5 นาทีที่แอมพลิจูด 50%
   • หยุดพักเพื่อให้เย็นลง จากนั้นใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ต่ออีก 2.5 นาทีภายใต้สภาวะเดียวกัน
5. การแยกอนุภาคนาโนที่ตรึงทริปซินไว้
   • ใช้แม่เหล็กแยก T-FMNPs ออกจากของเหลวส่วนใสที่มีเพปไทด์จากการย่อย
   • ย้ายของเหลวส่วนใสไปยังหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ใหม่
6. การเตรียมเพปไทด์สำหรับการวิเคราะห์ด้วย MS
   • ทำให้ของเหลวส่วนใสที่มีเพปไทด์แห้งในเครื่องปั่นเหวี่ยงสุญญากาศ
   • เก็บเพปไทด์ที่แห้งแล้วที่ -20°C จนกว่าจะนำไปวิเคราะห์เพิ่มเติมด้วยแมสสเปกโทรเมทรี