เวิร์กโฟลว์โปรตีโอมิกส์พร้อมการย่อยโปรตีนปริมาณงานสูง

โปรตีโอมิกส์เป็นสาขาสําคัญสําหรับการทําความเข้าใจกระบวนการและระบบทางชีวภาพ โดยการย่อยโปรตีนเป็นขั้นตอนสําคัญในเวิร์กโฟลว์ ตามเนื้อผ้า การย่อยโปรตีนจะดําเนินการในสารละลายโดยใช้เอนไซม์โปรตีโอไลติก เช่น ทริปซิน ซึ่งจะไฮโดรไลซ์พันธะเปปไทด์ที่ไลซีนและอาร์จินีนตกค้างโดยเฉพาะ กระบวนการนี้สร้างเปปไทด์ที่เหมาะอย่างยิ่งสําหรับการแตกตัวเป็นไอออนและการกระจายตัวในการใช้งานแมสสเปกโตรเมตรี (MS) อย่างไรก็ตาม วิธีการย่อยอาหารแบบเดิมต้องใช้เวลา 12-24 ชั่วโมงจึงจะเสร็จสมบูรณ์ ซึ่งสร้างปัญหาคอขวดที่สําคัญในเวิร์กโฟลว์โปรตีโอมิกส์
อัลตราโซนิกเป็นทางเลือกที่มีประสิทธิภาพช่วยลดเวลาในการย่อยอาหารลงอย่างมากจากชั่วโมงเหลือเพียงไม่กี่นาที เมื่อรวมกับเครื่องโซนิกหลายตัวอย่างขั้นสูงเช่น Hielscher CupHorn, VialTweeter และ 96 หลุม sonicator UIP400MTP อัลตราโซนิกช่วยให้สามารถเร่งโปรตีโอมิกส์ที่มีปริมาณงานสูง เทคโนโลยีเหล่านี้ช่วยเพิ่มความคล่องตัวให้กับเวิร์กโฟลว์ ลดเวลาในการเตรียมตัวอย่าง และเพิ่มประสิทธิภาพโดยไม่ลดทอนความสามารถในการทําซ้ําหรือคุณภาพของข้อมูล

บทบาทของพลังงานอัลตราโซนิกในการย่อยโปรตีน

อัลตราซาวนด์ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ที่โฟกัสเพื่อสร้างโพรงอากาศ - ไมโครบับเบิ้ลเฉพาะที่ซึ่งยุบตัวเพื่อสร้างแรงเฉือนที่รุนแรง ปรากฏการณ์นี้ช่วยเพิ่มการถ่ายโอนมวลส่งเสริมการผสมของเอนไซม์กับสารตั้งต้นและแฉโครงสร้างโปรตีนทําให้ตําแหน่งการแตกแยกสัมผัสกับเอนไซม์โปรตีโอไลติกเช่นทริปซิน
ผลลัพธ์? ลดเวลาในการย่อยได้อย่างมีนัยสําคัญโดยไม่ลดทอนประสิทธิภาพหรือความสามารถในการทําซ้ํา

การย่อยโปรตีนที่เพิ่มด้วยอัลตราโซนิก: วิธีการและผลลัพธ์

โปรโตคอลการย่อยแบบเร่ง

การย่อยอาหารด้วยอัลตราโซนิกช่วยผสมผสานเอนไซม์โปรตีโอไลติกและพลังงานอัลตราโซนิกเพื่อเร่งเวิร์กโฟลว์ ตัวอย่างเช่น การใช้ Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) เวิร์กโฟลว์การย่อยอาหารจะดําเนินการดังนี้:

1. การลด: ตัวอย่างโปรตีน (0.5 มก./มล., 20 ไมโครลิตร) ได้รับการบําบัดด้วย DTT (2 ไมโครลิตร, 110 มิลลิเมตร) ในบัฟเฟอร์แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต (12.5 มิลลิเมตร) Sonication ถูกนําไปใช้ที่แอมพลิจูด 50% เป็นเวลา 5 นาที
2. Alkylation: หลังจากเพิ่ม IAA (2 μL, 400 mM) การ sonication จะทําซ้ําภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน
3. การย่อยอาหาร: ตัวอย่างถูกเจือจางและบ่มด้วยอนุภาคนาโนทริปซินที่ตรึงไว้ การ sonication รอบสุดท้าย (5 นาที) เสร็จสิ้นการย่อยอาหาร เปปไทด์จะถูกแยก ทําให้แห้ง และเก็บไว้เพื่อการวิเคราะห์ MS

วิธีการอัลตราโซนิกนี้ช่วยลดเวลาในการเตรียมการทั้งหมดจาก 12 ชั่วโมงเหลือน้อยกว่า 30 นาที แม้จะมีกระบวนการเร่งขึ้น แต่ผลผลิตและคุณภาพของเปปไทด์ยังคงสอดคล้องกับวิธีการข้ามคืนแบบดั้งเดิม

ประสิทธิภาพของการย่อยโปรตีนอัลตราโซนิก

ในการศึกษาเปรียบเทียบโดยใช้โปรตีโอมของ. coli:

• การระบุโปรตีน: ตัวอย่างที่ย่อยด้วยอัลตราโซนิกระบุโปรตีน 777 ชนิดใน 5 นาที เทียบกับ 817 ใน 12 ชั่วโมง การระบุโปรตีนที่ใช้ร่วมกันเกิน 70%
• ความสามารถในการทําซ้ํา: การวิเคราะห์ซ้ําแสดงค่าสหสัมพันธ์ที่สูงกว่า 98% ในแต่ละวิธี ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความน่าเชื่อถือ
• การเลือก: โปรตีนบางชนิดถูกย่อยโดยแต่ละวิธีโดยเฉพาะ โดยการย่อยอัลตราโซนิกที่ชอบโปรตีน 65 ชนิดและการย่อยโปรตีน 54 โปรตีนในชั่วข้ามคืน ความแตกต่างที่ละเอียดอ่อนดังกล่าวเน้นย้ําถึงศักยภาพเฉพาะของอัลตราโซนิกสําหรับการใช้งานเฉพาะ

ผลการหาปริมาณโปรตีนที่ไม่มีฉลากของโปรตีนที่มีหนามเจ็ดชนิดลงใน. coli
ตัวอย่าง โปรตีนต่อไปนี้ถูกเพิ่มในสองระดับที่แตกต่างกันตามที่ระบุไว้ในคอลัมน์
ตั้งชื่อว่า "Theo Ratio" Theo Ratio คืออัตราส่วนทางทฤษฎีระหว่างสองระดับที่ใช้ในสิ่งนี้
ทดลอง อัลบูมินซีรัมวัว (ALBU), β-แลคโตโกลบูลิน (LACB), α-S1 casein (CASA1),
α-S2 casein (CASA2), cytochrome c (CYC), ovalbumin (OVAL) และ carbonic anhydrase 2
(CAH2) อัตราส่วนคํานวณโดยใช้ความเข้มของโปรตีน LFQ ที่ได้จาก MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
การศึกษาและกราฟิก: © Martins et al., 2019)

ทริปซินที่ตรึงด้วยอนุภาคนาโน

การรวมอนุภาคนาโนทริปซินแบบตรึง (เช่น T-FMNPs) กับอัลตราโซนิกช่วยเพิ่มเวิร์กโฟลว์โปรตีโอมิกส์ให้ดียิ่งขึ้น อนุภาคนาโนเหล่านี้ให้พื้นที่ผิวสูงสําหรับปฏิสัมพันธ์ระหว่างเอนไซม์กับสารตั้งต้น ซึ่งช่วยเพิ่มประสิทธิภาพ เมื่อนําไปใช้กับโปรตีโอมที่ซับซ้อน เช่น. coli วิธีการรวมกันจะบรรลุ:

• ความเร็ว: ย่อยอาหารให้เสร็จภายใน 5 นาที
• ความถูกต้อง: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• ความสามารถในการปรับขนาด: การปรับให้เข้ากับแพลตฟอร์มหลายหลุม เช่น UIP400MTP ช่วยให้สามารถประมวลผลที่มีปริมาณงานสูง

คลิกที่นี่เพื่อดูโปรโตคอลโดยละเอียดพร้อมคําแนะนําทีละขั้นตอน!
(อ้างอิง Martins et al., 2019)

การย่อยโปรตีนด้วยความเร็วสูงและปริมาณงานสูงด้วยเครื่องโซนิคเตอร์ Hielscher

โมเดล Sonicator ที่ดีที่สุดสําหรับโปรตีโอมิกส์

Hielscher Ultrasonics นําเสนอเครื่องโซนิกรุ่นต่างๆสําหรับการเตรียมหลายตัวอย่างพร้อมกันซึ่งอํานวยความสะดวกในเวิร์กโฟลว์ที่มีปริมาณงานสูง ไม่ว่าคุณจะทํางานกับขวด หลอดทดลอง แผ่นหลายหลุม (เช่น จาน 6, 24, 96 หลุม) หรือจานเพาะเชื้อ – เราขอเสนอเครื่องสะท้อนเสียงในอุดมคติสําหรับการทดลองของคุณ

UIP400MTP เครื่องสะท้อนเสียงแบบแผ่นหลายหลุม

สําหรับปริมาณงานสูงสุด UIP400MTP ให้ความสามารถในการประมวลผลเพลต 96 หลุมด้วยอัลตราโซนิก เข้ากันได้กับไมโครเพลทมาตรฐาน UIP400MTP ไม่จําเป็นต้องใช้วัสดุใช้แล้วทิ้งที่เป็นกรรมสิทธิ์ราคาแพง และให้อิสระในการเลือกเพลทแบบมัลติเวลที่ดีที่สุดสําหรับการวิจัยของคุณ ด้วยการส่งพลังงานที่สม่ําเสมอทั่วทั้งเพลต ทําให้สามารถลด อัลคิลเลชัน และการย่อยโปรตีโอมที่ซับซ้อนได้ถึง 200 ตัวได้อย่างรวดเร็วในเวลาเพียง 1 ชั่วโมง ระบบอัตโนมัติและประสิทธิภาพในระดับนี้มีความสําคัญอย่างยิ่งสําหรับโปรตีโอมิกส์ที่มีปริมาณงานสูงและการใช้งานทางคลินิก เรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับเครื่องโซนิคเตอร์แบบหลายหลุม!

ไวอัลทวีตเตอร์

VialTweeter ได้รับการปรับแต่งสําหรับห้องปฏิบัติการที่ต้องการการ sonication พร้อมกันได้ถึง 10 ขวดหรือหลอดทดลอง วิธีการแบบไม่รุกรานช่วยขจัดความเสี่ยงจากการปนเปื้อนข้ามในขณะที่รับประกันการย่อยโปรตีนที่ทําซ้ําได้ อุปกรณ์นี้เหมาะสําหรับนักวิจัยที่ทํางานด้วยปริมาณตัวอย่างที่จํากัดหรือประเภทตัวอย่างที่หลากหลาย
เรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับเครื่องโซนิคเตอร์หลายหลอด VialTweeter!

Hielscher UP200St-Cup ฮอร์น

เครื่องสะท้อนเสียง CupHorn เป็นอุปกรณ์ที่ทรงพลังที่ออกแบบมาสําหรับการประมวลผลตัวอย่างหลายตัวอย่างพร้อมกันในภาชนะที่ปิดสนิท ช่วยให้มั่นใจได้ถึงการกระจายพลังงานอัลตราโซนิกที่สม่ําเสมอและการควบคุมอุณหภูมิที่แม่นยํา ความสามารถในการประมวลผลตัวอย่างได้ถึงห้าตัวอย่างพร้อมกัน ควบคู่ไปกับความเข้ากันได้กับเวิร์กโฟลว์ที่ลดลง อัลคิลเลต และย่อย ทําให้ CupHorn เป็นเครื่องมือที่เชื่อถือได้สําหรับโปรตีโอมิกส์ที่ใช้ MS
เรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับ CupHorn SonoReactor!

โปรโตคอลทีละขั้นตอนสําหรับการย่อยโปรตีนช่วยอัลตราโซนิกโดยใช้ทริปซินที่ตรึงด้วยอนุภาคนาโน

โปรโตคอลนี้โดย Martins et al. (2019) ได้รับการปรับให้เหมาะสมสําหรับการย่อยโปรตีนอย่างรวดเร็วโดยใช้พลังงานอัลตราโซนิกและทริปซินที่ตรึงอนุภาคนาโน (T-FMNPs) ขั้นตอนที่ระบุไว้ช่วยให้มั่นใจได้ถึงการลด อัลคิลเลชัน และโปรตีโอไลซิสที่มีประสิทธิภาพ ซึ่งเหมาะสําหรับการใช้งานแมสสเปกโตรเมตรี (MS)
ขั้นตอนโปรโตคอล

1. การลดพันธะไดซัลไฟด์
   • เติมสารละลาย DTT 2 μL (110 mM) ลงในตัวอย่างโปรตีน 20 μL (0.5 mg/mL) ในบัฟเฟอร์ AmBic
   • วางหลอดตัวอย่างในเครื่องปฏิกรณ์โซโนเสาร์ UP200St-CupHorn
   • โซนิคชั่นตัวอย่างเป็นเวลา 2.5 นาทีที่ 50% amplitude (200 W, 26 kHz)
   • หยุดชั่วคราวในช่วงเวลาสั้น ๆ เพื่อให้เย็นลง จากนั้น sonicate อีก 2.5 นาทีภายใต้สภาวะเดียวกัน
2. อัลคิลเลชันของสารตกค้างซิสเทอีนที่ลดลง
   • เติมสารละลาย IAA 2 μL (400 mM) ลงในตัวอย่างโปรตีนที่ลดลง
   • โซนิคเป็นเวลา 2.5 นาทีที่แอมพลิจูด 50% เพื่ออํานวยความสะดวกในอัลคิลเลชัน
   • หยุดชั่วคราวเพื่อทําความเย็น จากนั้น sonicate อีก 2.5 นาที

   หมายเหตุ ลดการสัมผัสอัลคิลเลตให้น้อยที่สุด amp ต่อแสงเพื่อป้องกันการเสื่อมสภาพของ IAA

3. การเจือจางตัวอย่าง
   • เจือจางตัวอย่างโปรตีนอัลคิลเลตให้ได้ปริมาตรสุดท้าย 100 μL โดยใช้บัฟเฟอร์ AmBic 25 mM ที่มีอะซิโตไนไตรล์ 4% (v/v)
   • ผสมให้เข้ากันโดยการปิเปตอย่างอ่อนโยน
4. การย่อยโปรตีนด้วยทริปซินแบบตรึงด้วยอนุภาคนาโน
   • เติมสารละลาย T-FMNP 20 μL (3 มก./มล.) ลงในตัวอย่างโปรตีนเจือจาง
   • โซนิคส่วนผสมในเครื่องปฏิกรณ์โซโนนิคเป็นเวลา 2.5 นาทีที่แอมพลิจูด 50%
   • หยุดชั่วคราวเพื่อทําความเย็นจากนั้น sonicate อีก 2.5 นาทีภายใต้สภาวะเดียวกัน
5. การแยกอนุภาคนาโนทริปซิน
   • ใช้แม่เหล็กเพื่อแยก T-FMNP ออกจากส่วนเหนือน้ําที่มีเปปไทด์ที่ย่อยแล้ว
   • ถ่ายโอนส่วนเหนือน้ําไปยังหลอด microcentrifuge ใหม่
6. การเตรียมเปปไทด์สําหรับการวิเคราะห์ MS
   • เช็ด supernatant ที่มีเปปไทด์ให้แห้งในเครื่องหมุนเหวี่ยงสุญญากาศ
   • เก็บเปปไทด์แห้งไว้ที่อุณหภูมิ -20°C จนกว่าจะมีการวิเคราะห์เพิ่มเติมโดยแมสสเปกโตรเมตรี