การเฉือนโครมาตินด้วยคลื่นอัลตราโซนิก

การเฉือนโครมาตินเป็นขั้นตอนสำคัญในกระบวนการทำงานด้านอีพิเจเนติกส์และชีววิทยาระดับโมเลกุลหลายประเภท โดยเฉพาะการตกตะกอนโครมาตินด้วยภูมิคุ้มกัน (ChIP), ChIP-seq และการทดสอบที่เกี่ยวข้อง เป้าหมายคือการทำให้โครมาตินแตกเป็นชิ้นส่วนสารเชิงซ้อน DNA–โปรตีนที่ให้ผลทำซ้ำได้ พร้อมรักษาความสมบูรณ์ของเอพิโทปและลดการสูญเสียตัวอย่างให้น้อยที่สุด ในบรรดาวิธีที่มีอยู่ การทำให้โครมาตินแตกเป็นชิ้นส่วนด้วยคลื่นอัลตราโซนิกได้กลายเป็นแนวทางที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย เนื่องจากทำให้เกิดการแตกเป็นชิ้นส่วนที่เชื่อถือได้โดยไม่ใช้สารรีเอเจนต์ และให้ผลทำซ้ำได้อย่างดีเยี่ยม

ควรพิจารณาอะไรบ้างเมื่อเฉือนโครมาติน?

การเฉือนโครมาตินอย่างมีประสิทธิภาพต้องอาศัยการควบคุมพารามิเตอร์การทดลองอย่างรอบคอบ การทำให้แตกเป็นชิ้นส่วนที่ไม่เหมาะสมอาจส่งผลเสียต่อการทดลอง ChIP ในขั้นตอนถัดไป โดยทำให้เกิดชิ้นส่วนที่มีขนาดใหญ่เกินไป เสื่อมสลายมากเกินไป หรือไม่สม่ำเสมอระหว่างตัวอย่าง
ปัจจัยที่สำคัญที่สุดประการหนึ่งคือการกระจายขนาดชิ้นส่วนที่ต้องการ สำหรับการใช้งาน ChIP และ ChIP-seq ส่วนใหญ่ ชิ้นส่วนโครมาตินที่มีขนาดระหว่าง 100 ถึง 600 คู่เบสเหมาะสมที่สุด ช่วงขนาดนี้ช่วยให้การตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันมีประสิทธิภาพ พร้อมให้ความละเอียดเพียงพอสำหรับการทำแผนที่จีโนม

ปัจจัยสำคัญอีกประการหนึ่งคือประสิทธิภาพการเชื่อมขวางก่อนใช้คลื่นอัลตราโซนิก กระบวนการทำงาน ChIP ส่วนใหญ่ใช้การตรึงด้วยฟอร์มาลดีไฮด์เพื่อทำให้ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับ DNA มีความเสถียร อย่างไรก็ตาม การเชื่อมขวางมากเกินไปอาจทำให้โครมาตินทนต่อการแตกเป็นชิ้นส่วนมากขึ้น จึงต้องใช้คลื่นอัลตราโซนิกนานขึ้น และอาจเพิ่มการสัมผัสความร้อน
การควบคุมอุณหภูมิก็มีความสำคัญอย่างยิ่งเช่นกัน การใช้คลื่นอัลตราโซนิกก่อให้เกิดพลังงานเฉพาะบริเวณที่อาจทำให้อุณหภูมิตัวอย่างสูงขึ้น อุณหภูมิที่สูงขึ้นอาจทำให้ DNA เสียหายหรือทำให้โปรตีนเสียสภาพ ซึ่งส่งผลต่อการจดจำเป้าหมายของแอนติบอดีระหว่าง ChIP นักวิจัยจำนวนมากจึงใช้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นรอบแบบพัลส์ร่วมกับช่วงพักเพื่อระบายความร้อน เพื่อรักษาความเสถียรของตัวอย่าง
ความเข้มข้นและปริมาตรของตัวอย่างยังมีผลต่อประสิทธิภาพการแตกเป็นชิ้นส่วน สารแขวนลอยโครมาตินที่มีความเข้มข้นสูงอาจต้องใช้คลื่นอัลตราโซนิกนานขึ้น ขณะที่ตัวอย่างปริมาตรน้อยต้องได้รับพลังงานอย่างแม่นยำเพื่อป้องกันการประมวลผลมากเกินไป
ท้ายที่สุด การเลือกอุปกรณ์ให้คลื่นอัลตราโซนิกมีผลอย่างมากต่อความสามารถในการทำซ้ำผลการทดลอง อุปกรณ์ที่ออกแบบสำหรับการเฉือนโครมาตินโดยทั่วไปให้พลังงานอัลตราโซนิกที่ควบคุมได้และมีการจัดการตัวอย่างตามมาตรฐาน ช่วยให้การแตกเป็นชิ้นส่วนมีความสม่ำเสมอในตัวอย่างหลายตัวอย่าง

ควรเลือกเครื่องให้คลื่นอัลตราโซนิกชนิดใดสำหรับการเฉือนโครมาติน?

กระบวนการทำงานในห้องปฏิบัติการที่แตกต่างกันต้องใช้รูปแบบการให้คลื่นอัลตราโซนิกที่แตกต่างกัน ระบบที่เหมาะสมที่สุดขึ้นอยู่กับจำนวนตัวอย่างที่ประมวลผลได้ต่อหน่วยเวลา ปริมาตร และรูปแบบการทดลองเป็นหลัก

เครื่องให้คลื่นอัลตราโซนิกแบบโพรบ

เครื่องให้คลื่นอัลตราโซนิกแบบโพรบส่งพลังงานอัลตราโซนิกเข้าสู่ตัวอย่างโดยตรงผ่านโพรบไทเทเนียม รูปแบบนี้ให้ความหนาแน่นของพลังงานสูงมาก จึงเหมาะสำหรับการสลายโครมาตินอย่างมีประสิทธิภาพในตัวอย่างแต่ละตัวอย่าง

เครื่องให้คลื่นอัลตราโซนิกแบบโพรบมีประโยชน์เป็นพิเศษสำหรับ:

• จำนวนตัวอย่างน้อยถึงปานกลาง
• โครมาตินที่ทำให้แตกเป็นชิ้นส่วนได้ยาก
• ระเบียบวิธีการทดลองที่ยืดหยุ่น

เครื่องให้คลื่นอัลตราโซนิกสำหรับหลายหลอด – VialTweeter

สำหรับห้องปฏิบัติการที่ประมวลผลตัวอย่างหลายตัวอย่างพร้อมกัน เครื่องให้คลื่นอัลตราโซนิกสำหรับหลายหลอด VialTweeter เป็นโซลูชันที่ให้ผลทำซ้ำได้ในระดับสูง ระบบส่งพลังงานอัลตราโซนิกทางอ้อมผ่านตัวยึดขวดตัวอย่าง ทำให้สามารถทำให้ตัวอย่างภายในหลอดที่ปิดสนิทหลายหลอดแตกเป็นชิ้นส่วนภายใต้สภาวะเดียวกัน

รูปแบบนี้มีข้อดีสำคัญดังต่อไปนี้:

• การเฉือนโครมาตินในตัวอย่างหลายตัวอย่างแบบขนาน
• การขจัดการปนเปื้อนจากโพรบ
• ความสามารถในการทำซ้ำผลระหว่างหลอดในระดับสูง
• กระบวนการทำงานที่ง่ายขึ้นสำหรับการเตรียมตัวอย่าง ChIP

ระบบสำหรับหลายหลอดดังกล่าวเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการทดลอง ChIP เป็นประจำและการศึกษาที่มีจำนวนตัวอย่างที่ประมวลผลได้ต่อหน่วยเวลาในระดับปานกลาง
 

เครื่องให้คลื่นอัลตราโซนิกสำหรับไมโครเพลต – UIP400MTP

การศึกษาด้านอีพิเจเนติกส์ที่มีจำนวนตัวอย่างที่ประมวลผลได้ต่อหน่วยเวลาสูงพึ่งพาการประมวลผลตัวอย่างในไมโครเพลตมากขึ้นเรื่อย ๆ เครื่องให้คลื่นอัลตราโซนิกสำหรับไมโครเพลต UIP400MTP ออกแบบมาเพื่อทำให้โครมาตินแตกเป็นชิ้นส่วนโดยตรงในไมโครเพลตมาตรฐานโดยไม่ต้องย้ายตัวอย่าง

แนวทางนี้ช่วยให้สามารถ:

• ประมวลผลตัวอย่างหลายสิบหรือหลายร้อยตัวอย่างพร้อมกัน
• ใช้กระบวนการทำงานที่รองรับระบบอัตโนมัติ
• กระจายพลังงานอัลตราโซนิกอย่างสม่ำเสมอทั่วทุกหลุม
• ลดขั้นตอนการจัดการตัวอย่างได้อย่างมาก

สำหรับโครงการคัดกรอง ChIP-seq ขนาดใหญ่หรือการศึกษาด้านอีพิเจเนติกส์ที่มีจำนวนตัวอย่างที่ประมวลผลได้ต่อหน่วยเวลาสูง การใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับไมโครเพลตให้ความสามารถในการขยายขนาดและประสิทธิภาพที่โดดเด่น เครื่องให้คลื่นอัลตราโซนิกสำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP เหมาะอย่างยิ่งสำหรับ การผสานเข้ากับระบบจัดการของเหลวและกระบวนการทำงานในห้องปฏิบัติการแบบอัตโนมัติ
 

เหตุใดจึงเลือกการใช้คลื่นอัลตราโซนิกแทนเทคนิคการเฉือนโครมาตินอื่น ๆ?

เมื่อเทียบกับแนวทางที่ใช้เอนไซม์ การใช้คลื่นอัลตราโซนิกสำหรับ ChIP ทำให้เกิดการแตกเป็นชิ้นส่วนโดยไม่มีอคติ เนื่องจากกระบวนการนี้ไม่ได้ขึ้นอยู่กับการทำงานของเอนไซม์ที่จำเพาะต่อลำดับเบส ประเด็นนี้มีความสำคัญเป็นพิเศษสำหรับการศึกษาด้านอีพิเจเนติกส์ทั่วทั้งจีโนม ซึ่งจำเป็นต้องมีความครอบคลุมอย่างสม่ำเสมอ
ข้อดีสำคัญอีกประการหนึ่งคือความสามารถในการขยายขนาด ระบบอัลตราโซนิกสามารถรองรับตัวอย่างเดี่ยว หลายหลอด หรือไมโครเพลตทั้งแผ่น ทำให้ห้องปฏิบัติการเลือกรูปแบบที่เหมาะสมที่สุดกับจำนวนตัวอย่างที่ต้องประมวลผลต่อหน่วยเวลาในการทดลองได้
ท้ายที่สุด การใช้คลื่นอัลตราโซนิกช่วยให้ควบคุมพารามิเตอร์การแตกเป็นชิ้นส่วนได้อย่างดีเยี่ยม นักวิจัยสามารถปรับรอบพัลส์ ระยะเวลา และระดับกำลัง เพื่อให้ได้การกระจายขนาดชิ้นส่วนที่ต้องการอย่างเชื่อถือได้

จะวัดปริมาณและประเมินคุณภาพของผลผลิตโครมาตินหลังการทำให้แตกเป็นชิ้นส่วนด้วยคลื่นอัลตราโซนิกได้อย่างไร?

หลังใช้คลื่นอัลตราโซนิกสำหรับ ChIP นักวิจัยต้องประเมินทั้งปริมาณและคุณภาพของโครมาตินที่แตกเป็นชิ้นส่วน ขั้นตอนการตรวจสอบนี้ช่วยให้มั่นใจว่าการทำให้โครมาตินแตกเป็นชิ้นส่วนเป็นไปตามข้อกำหนดของการใช้งานในขั้นตอนถัดไป เช่น ChIP-qPCR หรือ ChIP-seq
การวัดปริมาณโดยทั่วไปเริ่มจากการวัดความเข้มข้นของ DNA วิธีสเปกโทรโฟโตเมตรี เช่น การวิเคราะห์ด้วย Nanodrop หรือการทดสอบด้วยฟลูออโรเมตรี เช่น การวัดปริมาณ DNA ด้วย Qubit ให้ค่าประมาณที่เชื่อถือได้ของผลผลิตโครมาตินหลังการสลายพันธะเชื่อมขวางและการทำให้บริสุทธิ์
อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นของ DNA เพียงอย่างเดียวไม่ได้บอกว่าการทำให้แตกเป็นชิ้นส่วนสำเร็จหรือไม่ นักวิจัยจึงประเมินการกระจายขนาดชิ้นส่วนโดยใช้เทคนิคอิเล็กโทรโฟรีซิส อิเล็กโทรโฟรีซิสบนเจลอะกาโรสยังคงเป็นแนวทางที่ใช้กันทั่วไปในการแสดงภาพชิ้นส่วน DNA และตรวจสอบว่าชิ้นส่วนส่วนใหญ่อยู่ในช่วงขนาดเป้าหมาย
ห้องปฏิบัติการที่มีเทคโนโลยีขั้นสูงกว่ามักใช้ระบบอิเล็กโทรโฟรีซิสแบบแคปิลลารี เช่น Agilent Bioanalyzer หรือ TapeStation แพลตฟอร์มเหล่านี้ให้รูปแบบการกระจายขนาดที่แม่นยำ และช่วยให้นักวิจัยตรวจพบการแตกเป็นชิ้นส่วนมากเกินไปหรือการเฉือนที่ไม่สมบูรณ์

เมื่อประเมินคุณภาพโครมาตินหลังการทำให้แตกเป็นชิ้นส่วนด้วยคลื่นอัลตราโซนิก นักวิจัยมักตรวจยืนยันว่า:

• ชิ้นส่วน DNA ส่วนใหญ่อยู่ในช่วง 100–600 bp
• การกระจายของชิ้นส่วนมีความสม่ำเสมอในตัวอย่างที่ทำซ้ำ
• การเสื่อมสลายของ DNA มีน้อยที่สุด
• ผลผลิตโครมาตินทั้งหมดเพียงพอสำหรับการทดสอบ ChIP ที่วางแผนไว้

การควบคุมคุณภาพอย่างเหมาะสมช่วยให้มั่นใจว่าขั้นตอนการเฉือนโครมาตินด้วยคลื่นอัลตราโซนิกให้ผลที่ทำซ้ำได้และมีความหมายทางชีววิทยา

บทสรุป: การเฉือนโครมาตินด้วยคลื่นอัลตราโซนิกเพื่องานวิจัยที่เชื่อถือได้

การเฉือนโครมาตินที่เชื่อถือได้เป็นพื้นฐานสำคัญของความสำเร็จในการวิจัย ChIP และอีพิเจเนติกส์ การทำให้แตกเป็นชิ้นส่วนด้วยคลื่นอัลตราโซนิกเป็นโซลูชันที่มีประสิทธิภาพสูง เพราะช่วยให้สลายโครมาตินได้อย่างแม่นยำ ให้ผลทำซ้ำได้ และไม่ใช้สารรีเอเจนต์ ในรูปแบบการทดลองที่หลากหลาย
ด้วยการปรับพารามิเตอร์การใช้คลื่นอัลตราโซนิกให้เหมาะสมอย่างรอบคอบ ตรวจสอบการกระจายขนาดชิ้นส่วน และเลือกระบบให้คลื่นอัลตราโซนิกที่เหมาะสม – ไม่ว่าจะเป็นเครื่องแบบโพรบ เครื่องสำหรับหลายหลอด VialTweeter หรือเครื่องสำหรับไมโครเพลต UIP400MTP ที่มีจำนวนตัวอย่างที่ประมวลผลได้ต่อหน่วยเวลาสูง – นักวิจัยสามารถทำให้โครมาตินแตกเป็นชิ้นส่วนอย่างสม่ำเสมอ ซึ่งสนับสนุนผล ChIP และ ChIP-seq ที่มีคุณภาพสูง
ขณะที่การวิจัยด้านอีพิเจเนติกส์ขยายตัวอย่างต่อเนื่องไปสู่จำนวนตัวอย่างที่ประมวลผลได้ต่อหน่วยเวลาที่สูงขึ้นและความสามารถในการทำซ้ำผลการทดลองที่มากขึ้น การเฉือนโครมาตินด้วยคลื่นอัลตราโซนิกยังคงเป็นหนึ่งในวิธีที่ใช้งานได้หลากหลายและเชื่อถือได้มากที่สุดสำหรับห้องปฏิบัติการชีววิทยาระดับโมเลกุลสมัยใหม่

การออกแบบ การผลิต และการให้คำปรึกษา – คุณภาพที่ผลิตในเยอรมนี

เครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher เป็นที่รู้จักกันดีในด้านมาตรฐานคุณภาพและการออกแบบที่สูงที่สุด ความทนทานและการใช้งานที่ง่ายช่วยให้ผสานเครื่องอัลตราโซนิกของเราเข้ากับโรงงานอุตสาหกรรมได้อย่างราบรื่น เครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher รับมือกับสภาวะที่สมบุกสมบันและสภาพแวดล้อมที่มีข้อเรียกร้องสูงได้อย่างง่ายดาย

Hielscher Ultrasonics เป็นบริษัทที่ได้รับการรับรอง ISO และให้ความสำคัญเป็นพิเศษกับเครื่องอัลตราโซนิกสมรรถนะสูงที่ใช้เทคโนโลยีล้ำสมัยและใช้งานง่าย แน่นอนว่าเครื่องอัลตราโซนิกของ Hielscher เป็นไปตามข้อกำหนด CE และตรงตามข้อกำหนดของ UL, CSA และ RoHs

วรรณกรรม / เอกสารอ้างอิง

• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
• Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
• José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
• Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)