Ultrazvočna solubilizacija proteinskih peletov
V proteomiki priprava vzorcev nikoli ni nepomembna podrobnost. Je temelj, na katerem gradijo natančnost identifikacije, zanesljivost kvantifikacije in ponovljivost. Eden najtrdovratnejših izzivov pri pripravi proteinskih vzorcev je učinkovito ponovno raztapljanje proteinskih peletov po obarjanju ali koncentriranju. Prav tu postaja ultrazvočna solubilizacija proteinskih peletov vse pomembnejša. Z nadzorovano sonikacijo lahko laboratoriji izboljšajo izkoristek pridobivanja proteinov, pospešijo raztapljanje peletov in učinkoviteje pripravijo vzorce za nadaljnjo masno spektrometrijo in biokemijsko analizo.
Solubilizacija proteinov: zakaj je sonikacija pomembna v sodobni proteomiki
Proteinski peleti pogosto nastanejo pri obarjanju z acetonom, etanolom, metanolom in kloroformom, amonijevim sulfatom ali TCA. Ti postopki se pogosto uporabljajo za odstranjevanje onesnaževal, koncentriranje proteinov in čiščenje ekstraktov pred analizo. Vendar je po končanem obarjanju nastali pelet lahko težko ponovno solubilizirati. Gosti agregati, hidrofobne domene, proteini, povezani z membranami, in proteinski kompleksi z močnimi medsebojnimi interakcijami se pogosto upirajo običajnemu mešanju ali vrtinčenju. Nepopolna solubilizacija lahko zato povzroči izgubo vzorca, pristransko zastopanost proteinov in slabo ponovljivost med poskusi.
Sonikacija odpravlja prav to ozko grlo. Z ustvarjanjem mehanske energije v tekočem mediju razbije kompaktne strukture peletov, spodbuja prodiranje pufra in razprši agregirani material v raztopino. Rezultat je hitrejša in pogosto popolnejša rekonstitucija proteinov, kar je še posebej dragoceno pri delu z omejenimi količinami vzorcev, kompleksnimi lizati ali zahtevnimi proteomskimi tarčami.
Sonikator za mikrotitrske plošče UIP400MTP za ekstrakcijo proteinov in solubilizacijo peletov
Zakaj je proteinske pelete težko solubilizirati
Obarjanje proteinov je učinkovito, ker izloči proteine iz raztopine. Vendar isti proces, zaradi katerega je obarjanje uporabno, povzroča tudi težavo pri ponovnem pridobivanju proteinov iz peleta. Ko so proteini v peletu, se lahko tesno zložijo in delno denaturirajo. Hidrofobne interakcije se lahko okrepijo, medmolekulsko vezanje se lahko poveča, nekateri proteini pa lahko ujamejo soli, lipide, nukleinske kisline ali druge sestavine matriksa. Tudi ob uporabi močnega solubilizacijskega pufra je pasivna resuspenzija pogosto počasna in nepopolna.
V proteomiki je to pomembno, ker nepopolno raztapljanje peletov ne zmanjša le skupnega izkoristka. Selektivno lahko izključi določene razrede proteinov, zlasti membranske proteine, strukturne proteine ali vrste, nagnjene k agregaciji. To pomeni, da končni analizni rezultat morda ne odraža več dejanske sestave izvirnega vzorca. V proteomiki z visoko ločljivostjo, kjer so lahko majhne razlike v količini ali posttranslacijskih modifikacijah biološko odločilne, je takšna pristranskost pri pripravi resna omejitev.
Kako sonikacija izboljša solubilizacijo proteinskih peletov
Ultrazvočna obdelava izboljša solubilizacijo z vnosom visokofrekvenčne mehanske energije v vzorec. Ta energija pomaga razbiti kompaktni material peleta in poveča stik med solubilizacijskim pufrom in proteini, ujetimi v njem. Namesto da bi se postopek zanašal le na difuzijo in ročno mešanje, aktivno razprši pelet na manjše frakcije, ki jih je lažje raztopiti.
Praktični učinek je znaten. Sonikacija lahko:
- pospeši raztapljanje gostih ali težko raztopljivih proteinskih peletov
- izboljša izkoristek pridobivanja slabo topnih in agregiranih proteinov
- skrajša čas priprave v proteomskih delovnih postopkih
- pripomore k bolj homogenim vzorcem za razgradnjo in analizo
Ta izboljšana disperzija je še posebej uporabna pri resuspendiranju peletov v pufrih, ki vsebujejo sečnino, tiosečnino, detergente, kaotrope ali druge reagente, ki se pogosto uporabljajo v proteomiki. Sonikacija pomaga tem sestavinam učinkoviteje doseči in solubilizirati pelet, kar omogoča bolj enakomerno raztopino vzorca.
Prednosti ultrazvočne solubilizacije v proteomiki
Ključna prednost ultrazvočne solubilizacije je, da pogosto podcenjen korak priprave spremeni v nadzorljiv in učinkovit proces. V proteomiki ima to neposredne posledice za analizo.
- Prvič, izboljšana solubilizacija poveča verjetnost, da je vzorec, ki vstopi v encimsko razgradnjo, reprezentativen za celotno populacijo proteinov. Razgradnja s tripsinom je na primer odvisna od tega, ali so proteini ustrezno razviti in dostopni v raztopini. Če deli peleta ostanejo neraztopljeni, so ti proteini dejansko izključeni iz nastajanja peptidov in s tem iz zaznavanja.
- Drugič, sonikacija lahko izboljša ponovljivost. Ročna resuspenzija peletov je že po naravi spremenljiva, zlasti kadar sodelujejo različni izvajalci ali se razlikujejo velikosti peletov oziroma matriksi vzorcev. Nadzorovana ultrazvočna obdelava standardizira mehansko energijo, dovedeno vzorcu, kar lahko zmanjša variabilnost med pripravami in izboljša doslednost nadaljnjih postopkov LC-MS ali postopkov na osnovi gelov.
- Tretjič, ultrazvočna obdelava je zelo dragocena za vzorce z majhno količino vhodnega materiala in dragocene vzorce. Klinična proteomika, odkrivanje bioloških označevalcev, poskusi s celičnimi kulturami in raziskave tkiv pogosto temeljijo na omejeni količini materiala. Vsaka izguba proteinov med solubilizacijo zmanjša informacijsko vrednost vzorca. Učinkovito ultrazvočno ponovno raztapljanje pomaga ohraniti čim več analita.
- Nazadnje sonikacija pripomore k hitrosti delovnih postopkov. Proteomski laboratoriji, ki obdelujejo več vzorcev, potrebujejo robustne in časovno učinkovite metode priprave. Pelet, ki se hitro in popolnoma raztopi, ni le priročen; zmanjša zamude, zniža tveganje napak pri rokovanju in izboljša zmogljivost obdelave vzorcev.
Sonikacija v primerjavi z običajnimi metodami resuspenzije
Tradicionalne metode resuspenzije peletov običajno vključujejo pipetiranje, mešanje, vrtinčenje, dolgotrajno inkubacijo ali ponavljajoče se korake segrevanja. Čeprav so te tehnike lahko učinkovite pri rahlo zgoščenih peletih, so pogosto manj uspešne pri zelo kompaktnem ali hidrofobnem proteinskem materialu. Samo mehansko mešanje morda ne razgradi v celoti strukture peleta, zato ostanejo vidni delci ali nevidne netopne frakcije.
Sonikacija omogoča aktivnejši in bolj ciljno usmerjen pristop. Namesto da bi bila odvisna od počasne difuzije pufra, fizično razbije pelet in spodbuja hitro homogenizacijo. To ne odpravi potrebe po ustreznem pufru za resuspenzijo, vendar bistveno izboljša njegovo učinkovitost.
V primerjavi s povsem ročnimi metodami ultrazvočna solubilizacija pogosto omogoča boljši nadzor procesa, večjo učinkovitost in boljšo primernost za zahtevne proteomske aplikacije. Za laboratorije, ki si prizadevajo tako za kakovost analize kot za zanesljivost delovanja, je zato sonikacija prepričljiva izbira.
Najprimernejše uporabe ultrazvočne solubilizacije proteinskih peletov
Ultrazvočna solubilizacija je še posebej koristna v delovnih postopkih, ki vključujejo:
- obarjanje proteinov pred masno spektrometrijo,
- rekonstitucijo peletov iz celičnih lizatov ali tkivnih ekstraktov,
- pridobivanje proteinov, bogatih z membranami ali nagnjenih k agregaciji,
- in pripravo vzorcev za kvantitativno proteomiko, kjer je ponovljivost bistvena.
Zelo pomembna je tudi, kadar so bili peleti shranjeni, preveč posušeni ali pridobljeni iz kompleksnih bioloških matriksov. V takih primerih lahko pasivna resuspenzija postane še posebej neučinkovita, medtem ko sonikacija pomaga ponovno vzpostaviti uporabnost vzorca z manj ročnega poseganja.
Sonikator VialTweeter za sočasno sonikacijo 10 vzorcev, npr. za ekstrakcijo in solubilizacijo proteinov
Poiščite najboljši sonikator za svoj delovni postopek solubilizacije proteinov!
Za laboratorije, ki delajo z dragocenimi vzorci, majhnimi količinami vhodnega materiala ali proteomiko z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev, ponudba Hielscher vključuje več oblik sonikacije, ki jih je mogoče natančno prilagoditi delovnemu postopku.
Ne glede na to, ali izberete sonikator Hielscher s sondo, sonikator za več epruvet VialTweeter ali sonikator za mikrotitrske plošče UIP400MTP – vsak model ultrazvočnega sonikatorja je namenjen drugačnemu načinu priprave vzorcev, pri čemer imajo vsi enako temeljno prednost: ponovljivo ultrazvočno energijo za učinkovito in nadzorovano obdelavo vzorcev.
Sonikatorji s sondo
Ultrazvočne sonde, kot je UP200Ht, so še posebej primerne za neposredno sonikacijo posameznih vzorcev. Za proteomske laboratorije je UP200Ht odlična izbira, kadar proteinski peleti potrebujejo intenzivno resuspenzijo v majhnih do srednjih volumnih, zlasti kadar sta pomembna nadzor metode in ponovljivost. Neposredna sonikacija s sondo lahko hitro razbije kompaktni material peleta in pomaga solubilizacijskim pufrom doseči proteine, ki bi sicer ostali delno neraztopljeni.
Pregled vseh sonikatorjev s sondo!
Sonikator za več epruvet VialTweeter
Kadar je treba več zaprtih vial obdelati pod enakimi pogoji, ima sonikator za več epruvet VialTweeter izrazito prednost. VialTweeter omogoča intenzivno sonikacijo majhnih volumnov s sonikacijo več zaprtih vial v sterilnih pogojih. Zaradi sočasne priprave vzorcev v več epruvetah pod enakimi pogoji ter zmanjšanega tveganja navzkrižne kontaminacije, izgube vzorcev in nastajanja aerosolov med obdelavo zaprtih vial je VialTweeter zanesljivo orodje za pripravo vzorcev. V proteomiki je to zelo pomembno pri delu z dragocenimi peleti iz več ponovitev ali kliničnih vzorcev, kjer je doslednost med epruvetami ključnega pomena.
Izvedite več o napravi VialTweeter!
Sonikator za mikrotitrske plošče UIP400MTP
Za laboratorije z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev sonikator za mikrotitrske plošče UIP400MTP razširja prednosti sonikacije na delovne postopke s ploščami. UIP400MTP je predstavljen kot sonikator za mikrotitrske plošče in plošče z več vdolbinicami za enakomerno ultrazvočno obdelavo standardnih plošč, vključno s formati s 96 vdolbinicami, pri čemer je poudarjena njegova primernost za avtomatizirano pripravo vzorcev na področjih, kot so proteomika, diagnostika in odkrivanje zdravil. Platforma je zasnovana za sočasno obdelavo številnih vzorcev in ima prednosti, kot so zmanjšano tveganje navzkrižne kontaminacije, manjša potreba po delu, izboljšan izkoristek pridobivanja vzorcev in vključevanje v avtomatizirane delovne postopke.
V praktični proteomiki to pomeni, da je mogoče solubilizacijo peletov, lizo celic, ekstrakcijo in povezane korake priprave veliko učinkoviteje prenesti na večji obseg. Namesto obdelave vzorcev enega za drugim lahko laboratoriji sonikirajo celotne plošče z doslednim vnosom energije. To je dragoceno vedno, kadar morajo delovni postopki združevati zmogljivost obdelave vzorcev z analizno natančnostjo, na primer pri presejalnih raziskavah, kvantitativni proteomiki ali standardiziranih zaporedjih postopkov priprave vzorcev. UIP400MTP zato ni le priročno orodje; je platforma, ki podpira širši trend avtomatizacije, ponovljivosti in robustne proteomike z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev.
Izvedite več o sonikatorju za mikrotitrske plošče UIP400MTP!
VialTweeter v hladilni komori – nadzorovani procesni parametri med sonikacijo.
Ekstrakcija in solubilizacija proteinov z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev s sonikatorjem za mikrotitrske plošče UIP400MTP
Načrtovanje, proizvodnja in svetovanje – kakovost iz Nemčije
Ultrazvočne naprave Hielscher so znane po najvišjih standardih kakovosti in zasnove. Robustnost in preprosto upravljanje omogočata nemoteno vključevanje naših ultrazvočnih naprav v industrijske obrate. Ultrazvočne naprave Hielscher zlahka obvladujejo težke pogoje in zahtevna okolja.
Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO, ki posebno pozornost namenja visoko zmogljivim ultrazvočnim napravam z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Seveda so ultrazvočne naprave Hielscher skladne s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.
Literatura / reference
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Susana Jorge, Kevin Pereira, Hugo López-Fernández, William LaFramboise, Rajiv Dhir, Javier Fernández-Lodeiro, Carlos Lodeiro, Hugo M. Santos, Jose L. Capelo-Martínez (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, Volume 206, 2020.
- Lindemann C, Lupilova N, Müller A, Warscheid B, Meyer HE, Kuhlmann K, Eisenacher M, Leichert LI. (2013): Redox proteomics uncovers peroxynitrite-sensitive proteins that help Escherichia coli to overcome nitrosative stress. Journal of Biological Chemistry 288(27); 2013. 19698-714.
- Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.
Pogosta vprašanja
Zakaj ultrazvočne kopeli niso primerne za solubilizacijo proteinov?
V ultrazvočnih kopelih kavitacija, ki je načelo delovanja sonikacije, poteka zelo neenakomerno, zato so vzorci izpostavljeni različnim sonikacijskim obdelavam. Glede na položaj epruvet z vzorci v ultrazvočni kopeli na posamezen vzorec delujejo različne intenzitete. Proteomika je odvisna od primerljivosti. Če je en pelet nepopolno raztopljen, drugi pa popolnoma resuspendiran, lahko dobljeni podatki odražajo pristranskost pri pripravi namesto dejanskega biološkega stanja. V nasprotju z ultrazvočnimi kopelmi brezkontaktni sonikatorji, kot sta VialTweeter ali sonikator za mikrotitrske plošče UIP400MTP, omogočajo bolj standardizirano ravnanje, saj je mogoče več vzorcev obdelovati vzporedno pod enakimi ultrazvočnimi pogoji, kar lahko pomaga izboljšati ponovljivost med poskusi. To je še posebej uporabno v raziskavah bioloških označevalcev, primerjalni proteomiki in delovnih postopkih z več biološkimi ali tehničnimi ponovitvami.
Katere so najpogostejše preiskave v proteomiki?
Najpogostejše preiskave v proteomiki so preiskave za kvantifikacijo proteinov in metode za karakterizacijo proteinov, ki se uporabljajo med pripravo in analizo vzorcev. Pogosto uporabljene preiskave vključujejo Bradfordovo metodo, metodo BCA, Lowryjevo metodo in merjenje UV-absorbance pri 280 nm za določanje koncentracije proteinov. V širših proteomskih delovnih postopkih se za ocenjevanje količine, čistosti, molekulske mase in identitete proteinov pogosto uporabljajo tudi SDS-PAGE, prenos western, ELISA, razgradnja v gelu in analize na osnovi masne spektrometrije.
Kaj je briljantno modrilo Coomassie?
Briljantno modrilo Coomassie je trifenilmetansko barvilo, ki se pogosto uporablja pri raziskovanju proteinov za barvanje proteinov v gelih in kolorimetrično kvantifikacijo proteinov. Veže se predvsem na bazične in aromatske aminokislinske ostanke, zlasti na arginin, ob vezavi na proteine pa pride do spektralnega premika. Zaradi te lastnosti je uporabno tako za vizualizacijo proteinov po elektroforezi kot za Bradfordovo metodo določanja proteinov.
Kako deluje Bradfordova metoda?
Bradfordova metoda temelji na mešanju proteinskega vzorca z barvilom briljantno modrilo Coomassie v kislih pogojih. Ko se barvilo veže na proteine, se njegov absorpcijski maksimum premakne s približno 465 nm na 595 nm, kar povzroči merljivo spremembo barve iz rdečkasto rjave v modro. Povečanje absorbance pri 595 nm je v določenem območju sorazmerno s koncentracijo proteinov, kar omogoča kvantifikacijo s primerjavo z umeritveno krivuljo, običajno pripravljeno z govejim serumskim albuminom.
Usmerjena sonikacija vzorcev v ploščah z več vdolbinicami
Hielscher Ultrasonics izdeluje visoko zmogljive ultrazvočne homogenizatorje od laboratorijskih do industrijskih velikosti.