Ekstrakcija proteinov s sonikacijo za fosfoproteomiko

Fosfoproteomika je v sodobnih znanostih o življenju postala temeljna tehnologija za dekodiranje celičnih signalnih poti in razumevanje mehanizmov bolezni na sistemski ravni. Ker fosforilacija uravnava ključne biološke funkcije – od encimske aktivnosti do interakcij med proteini in proteini – njegovo natančno merjenje je bistvenega pomena za temeljne raziskave in translacijsko medicino. Nedavni napredek na področju masne spektrometrije je omogočil identifikacijo več deset tisoč fosforilacijskih dogodkov v enem samem poskusu, kar poudarja potrebo po zanesljivih, razširljivih in ponovljivih delovnih postopkih priprave vzorcev.
Med najpomembnejšimi dosežki na tem področju je uvedba ekstrakcije proteinov s sonikacijo, ki bistveno izboljša kakovost, zmogljivost in ponovljivost vzorcev. Ultrazvočne tehnologije, kot sta VialTweeter in UIP400MTP, zdaj na novo določajo, kako laboratoriji obdelujejo velike skupine vzorcev, zlasti pri visoko zmogljivi fosfoproteomiki.

Znanstveni pomen učinkovite priprave vzorcev v fosfoproteomiki

Fosforilacija beljakovin je zelo dinamična in reverzibilna posttranslacijska modifikacija, ki vpliva na večino beljakovin v človeških celicah. Uravnava strukturo, lokalizacijo in interakcijska omrežja beljakovin, njena motena regulacija pa je povezana z boleznimi, kot sta rak in nevrodegeneracija.
Vendar pa fosfoproteomska analiza predstavlja edinstvene tehnične izzive. Fosforiliranih peptidov je pogosto malo, zato je potrebna skrbna obogatitev in zelo učinkovita predhodna priprava vzorcev. Vsaka neučinkovitost pri ekstrakciji ali razgradnji beljakovin lahko povzroči izgubo signala, slabo ponovljivost in nepopolno pokritost fosfozitov.
Pri tem je ključnega pomena sonifikacija.

Zakaj sonikacija spreminja ekstrakcijo beljakovin

Sonikacija uporablja ultrazvočne valove visoke intenzivnosti za mehansko razbijanje celic in tkiv, kar omogoča učinkovito sproščanje beljakovin iz celic, tkiv, bioloških tekočin in zunajceličnih veziklov. V primerjavi z običajnimi tehnikami lize ima sonikacija več izrazitih prednosti:

• Prvič, zagotavlja hitro in enakomerno prekinitev celic, kar je še posebej pomembno za ohranjanje prehodnih fosforilacijskih stanj. Pri fosfoproteomiki lahko že majhne zamude ali nepopolna liza spremenijo signalne profile, zato je hitra in ponovljiva ekstrakcija bistvenega pomena.
• Drugič, sonikacija izboljša izkoristek beljakovin in solubilizacijo, zlasti pri vzorcih, ki jih je težko razbliniti, kot so gosta tkiva ali z membranami bogate celice. To neposredno vpliva na boljšo prebavo in pridobivanje fosfopeptidov.
• Tretjič, ultrazvočna obdelava je po svoji naravi razširljiva. Naprave, kot je VialTweeter, omogočajo hkratno sonično obdelavo več zaprtih epruvet, kar zagotavlja enake pogoje obdelave vseh vzorcev. To odpravlja variabilnost, ki jo povzroča ročno rokovanje.
• Za še večje zahteve glede zmogljivosti predstavlja UIP400MTP velik tehnološki preskok. Omogoča neposredno sonikacijo celotnih mikroploščic ali stojal za epruvete, vključno s stekleničkami za samodejni vzorčevalnik, zato je idealen za vzporedno obdelavo več sto vzorcev. Ta zmogljivost je še posebej dragocena v sistemski biologiji in kliničnih raziskavah, kjer so standardom velike skupine vzorcev.

Visoko zmogljiva sonikacija: VialTweeter in UIP400MTP v ospredju

Vključevanje naprednih ultrazvočnih naprav v fosfoproteomske delovne postopke ni le priročno. – gre za metodološko izboljšavo.
VialTweeter je zasnovan za sinhronizirano ultrazvočno obdelavo več zaprtih stekleničk, kar zmanjšuje navzkrižno kontaminacijo in zagotavlja ponovljivost. Posebej primeren je za srednje zmogljive aplikacije in standardizirane delovne postopke.
 

Nasprotno pa je UIP400MTP optimiziran za visoko prepustna okolja, saj omogoča:

• Enakomerna sonikacija po celotnih standardnih mikroploščicah, npr. 96- ali 384-delnih ploščicah
• Neposredna obdelava stojal za epruvete in viale za avtosampler
• Bistveno skrajšanje časa, potrebnega za praktično delo
• Izboljšana ponovljivost v velikih naborih podatkov

Ta razširljivost se popolnoma ujema s sodobnimi pristopi fosfoproteomike, kjer delovni postopki rutinsko vzporedno obdelujejo na desetine do stotine vzorcev.

Splošni protokol za pripravo fosfoproteomskih vzorcev s sonikacijo

Zanesljiv fosfoproteomski delovni postopek združuje učinkovito ekstrakcijo beljakovin, encimsko prebavo in obogatitev s fosfopeptidi. Naslednji pregled odraža uveljavljene najboljše prakse, prilagojene pripravi na podlagi sonikacije:

1. Hitro ohlajanje in zbiranje vzorcev
   Celice ali tkiva hitro ugasnejo – običajno s hitrim zamrzovanjem – za ohranitev fosforilacijskih stanj. Ta korak je ključnega pomena zaradi prehodne narave fosforilacijskih dogodkov.
2. Ultrazvočna celična liza in ekstrakcija beljakovin
   Vzorce odtalimo in jih soniciramo, običajno v kratkih ciklih. Ultrazvočna energija razdrobi celične membrane in učinkovito sprosti beljakovine. V potrjenih delovnih postopkih se sonikacija izvaja v več ciklih, da se zagotovi popolna liza.
   Primer: Po odmrznitvi vzorcev na ledu je bila celična liza dosežena s sonikacijo, npr. z instrumentom Vialtweeter za 2 cikla, vsak cikel 1 min.
3. Razjasnitev in količinsko določanje beljakovin
   Po lizi vzorce centrifugiramo, da odstranimo ostanke. Supernatant, ki vsebuje topne beljakovine, se zbere in kvantificira, da se zagotovi dosleden vnos v vzorce.
4. Redukcija in alkiliranje
   Disulfidne vezi se reducirajo (npr. z DTT) in alkilirajo (npr. z IAA), da se stabilizirajo beljakovine in izboljša učinkovitost prebave.
5. proteolitična prebava
   Beljakovine se encimsko prebavijo, običajno s tripsinom, pri čemer nastanejo peptidi, primerni za analizo z masno spektrometrijo. Preberite več o ultrazvočno pospešeni prebavi beljakovin!
6. Čiščenje in razsoljevanje peptidov
   Peptide očistimo z uporabo metod na osnovi C18, da odstranimo kontaminante, ki bi lahko ovirali analizo LC-MS.
7. Obogatitev s fosfopeptidi
   Zaradi majhnega števila fosforiliranih peptidov se za selektivno izolacijo fosfopeptidov uporabljajo tehnike obogatitve, kot sta Fe-NTA ali TiO₂ afinitetni metodi.
8. Analiza LC-MS/MS in obdelava podatkov
   Obogateni vzorci se analizirajo z masno spektrometrijo visoke ločljivosti, pri čemer se pogosto uporablja od podatkov neodvisen zajem (DIA) za boljšo kvantifikacijo in ponovljivost.

Predvsem je mogoče obsežne delovne postopke prilagoditi formatu 96-delčnih plošč, kar omogoča vzporedno obdelavo do več sto vzorcev. – pristop, ki je popolnoma združljiv s sonikacijo na osnovi UIP400MTP.
 

Optimiziran protokol za hitro ugašanje fosfoproteoma, obogatitev s fosfopeptidi in Phos-DIA-MS.
Protokol in slika: ©Die et al. 2023

Izboljšanje ponovljivosti in kakovosti podatkov s sonikacijo

Eden od osrednjih izzivov fosfoproteomike je doseganje dosledne kvantifikacije v velikih naborih podatkov. Variabilnost, vnesena med pripravo vzorcev, lahko zakrije biološko pomembne razlike.

Sonikacija to rešuje z zagotavljanjem:

1. Standardiziran vnos energije pri vseh vzorcih
2. Zmanjšana variabilnost ročnega upravljanja
3. Izboljšana ponovljivost pri ekstrakciji in razgradnji beljakovin

V kombinaciji z visoko zmogljivimi platformami, kot je UIP400MTP, lahko laboratoriji dosežejo raven doslednosti, ki je bistvena za študije sistemske biologije in odkrivanje kliničnih biomarkerjev.

Prihodnost fosfoproteomike: Avtomatizacija in skalabilnost

Ker se fosfoproteomika še naprej širi na obsežne in klinične aplikacije, se bo povpraševanje po avtomatizaciji in prepustnosti le še povečevalo. Priprava vzorcev na podlagi sonikacije, zlasti če je integrirana s sistemi, združljivimi z mikroploščami, predstavlja ključno omogočitveno tehnologijo.
Naprave, kot sta VialTweeter in UIP400MTP, s kombinacijo učinkovite ultrazvočne lize, vzporedne obdelave in združljivosti z avtomatiziranimi delovnimi postopki postavljajo nove standarde pri pripravi proteomskih vzorcev.
Preberite več o integraciji UIP400MTP v avtomatizirane laboratorijske delovne postopke!

Izkoristite prednosti sonikacijske priprave vzorcev v fosfoproteomiki!

Ekstrakcija proteinov s sonikacijo je postala ključna sestavina sodobne fosfoproteomike, saj zagotavlja neprimerljivo učinkovitost, razširljivost in ponovljivost. Zaradi vse večje potrebe po analizi kompleksnih bioloških sistemov v velikih skupinah vzorcev ultrazvočne tehnologije niso le ugodne – so bistvenega pomena.
Rešitve, kot sta VialTweeter in UIP400MTP, z omogočanjem visoko zmogljivih in standardiziranih delovnih postopkov pospešujejo odkritja na področju celičnih signalov, mehanizmov bolezni in natančne medicine.

Projektiranje, izdelava in svetovanje – Kakovost izdelana v Nemčiji

Hielscher ultrazvočni aparati so znani po svojih najvišjih standardih kakovosti in oblikovanja. Robustnost in enostavno upravljanje omogočata nemoteno integracijo naših ultrazvočnih aparatov v industrijske objekte. Težke pogoje in zahtevna okolja zlahka obvladajo Hielscher ultrasonicatorji.

Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visoko zmogljivim ultrazvočnim aparatom z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Seveda so Hielscher ultrazvočni aparati skladni s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.

Hielscher Multi-Sample Sonicator modeli UIP400MTP za mikroplošče, VialTweeter in CupHorn: hitra in zmogljiva priprava vzorcev