Ekstrakcija beljakovin s pomočjo sonikacije za fosfoproteomiko

V sodobnih vedah o življenju se je fosfoproteomika uveljavila kot temeljna tehnologija za razvozlavanje celičnih signalnih poti in razumevanje mehanizmov bolezni na sistemski ravni. Ker fosforilacija uravnava ključne biološke funkcije – od encimske aktivnosti do interakcij med beljakovinami – je njeno natančno merjenje bistveno tako za temeljne raziskave kot za translacijsko medicino. Nedavni napredek v masni spektrometriji je omogočil identifikacijo več deset tisoč dogodkov fosforilacije v enem samem poskusu, kar poudarja potrebo po robustnih, skalabilnih in ponovljivih delovnih postopkih priprave vzorcev.
Med najvplivnejšimi novostmi na tem področju je uvedba ekstrakcije beljakovin s pomočjo sonikacije, ki znatno izboljšuje kakovost vzorcev, zmogljivost njihove obdelave in ponovljivost. Ultrazvočne tehnologije, kot sta VialTweeter in UIP400MTP, zdaj na novo opredeljujejo, kako laboratoriji obdelujejo velike skupine vzorcev, zlasti v fosfoproteomiki z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev.

Znanstveni pomen učinkovite priprave vzorcev v fosfoproteomiki

Fosforilacija beljakovin je zelo dinamična in reverzibilna posttranslacijska modifikacija, ki zadeva večino beljakovin v človeških celicah. Uravnava strukturo in lokalizacijo beljakovin ter njihove interakcijske mreže, motnje v njenem uravnavanju pa so povezane z boleznimi, kot sta rak in nevrodegeneracija.
Vendar fosfoproteomska analiza prinaša posebne tehnične izzive. Fosforilirani peptidi so pogosto prisotni v majhnih količinah ter zahtevajo skrbno obogatitev in zelo učinkovito pripravo vzorcev pred nadaljnjimi koraki. Vsaka neučinkovitost pri ekstrakciji ali razgradnji beljakovin lahko povzroči izgubo signala, slabo ponovljivost in nepopolno pokritost fosforilacijskih mest.
Tu postane sonikacija ključna.

Zakaj sonikacija spreminja ekstrakcijo beljakovin

Sonikacija uporablja ultrazvočne valove visoke intenzivnosti za mehansko razgradnjo celic in tkiv, kar omogoča učinkovito sproščanje beljakovin iz celic, tkiv, bioloških tekočin in zunajceličnih veziklov. V primerjavi z običajnimi tehnikami lize sonikacija ponuja več izrazitih prednosti:

• Prvič, zagotavlja hitro in enakomerno razgradnjo celic, kar je posebej pomembno za ohranjanje prehodnih stanj fosforilacije. V fosfoproteomiki lahko že majhne zamude ali nepopolna liza spremenijo signalne profile, zato je hitra in ponovljiva ekstrakcija bistvena.
• Drugič, sonikacija izboljšuje izkoristek in solubilizacijo beljakovin, zlasti pri vzorcih, ki jih je težko lizirati, kot so gosta tkiva ali celice z veliko membranami. To neposredno izboljša nadaljnjo razgradnjo beljakovin in izkoristek pridobivanja fosfopeptidov.
• Tretjič, ultrazvočna obdelava je po svoji naravi skalabilna. Naprave, kot je VialTweeter, omogočajo sočasno sonikacijo več zatesnjenih epruvet in zagotavljajo enake pogoje obdelave za vse vzorce. S tem odpravijo variabilnost, ki jo povzroča ročno ravnanje.
• Za zahteve po še višji zmogljivosti obdelave vzorcev UIP400MTP predstavlja velik tehnološki preskok. Omogoča neposredno sonikacijo celotnih mikroplošč ali stojal za epruvete, vključno z vialami za samodejni vzorčevalnik, zato je idealen za vzporedno obdelavo več sto vzorcev. Ta zmožnost je posebej dragocena v sistemski biologiji in kliničnih raziskavah, kjer so velike skupine vzorcev običajne.

Sonikacija z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev: v ospredju VialTweeter in UIP400MTP

Vključitev naprednih ultrazvočnih naprav v fosfoproteomske delovne postopke ni zgolj priročna – pomeni metodološko izboljšavo.
VialTweeter je zasnovan za sinhronizirano ultrazvočno obdelavo več zaprtih vial, pri čemer zmanjšuje navzkrižno kontaminacijo na najmanjšo možno mero in hkrati zagotavlja ponovljivost. Posebej je primeren za uporabo s srednjo zmogljivostjo obdelave vzorcev in za standardizirane delovne postopke.
 

UIP400MTP pa je optimiziran za okolja z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev in omogoča:

• Enakomerno sonikacijo po celotnih standardnih mikroploščah, npr. ploščah s 96 ali 384 vdolbinicami
• Neposredno obdelavo stojal za epruvete in vial za samodejni vzorčevalnik
• Znatno skrajšanje časa ročnega dela
• Izboljšano ponovljivost v velikih podatkovnih zbirkah

Ta skalabilnost se popolnoma ujema s sodobnimi fosfoproteomskimi pristopi, pri katerih delovni postopki rutinsko vzporedno obdelujejo od več deset do več sto vzorcev.

Splošni protokol priprave fosfoproteomskih vzorcev s pomočjo sonikacije

Robusten fosfoproteomski delovni postopek združuje učinkovito ekstrakcijo beljakovin, encimsko razgradnjo in obogatitev fosfopeptidov. Naslednji pregled odraža uveljavljene najboljše prakse, prilagojene pripravi s sonikacijo:

1. Hitra ustavitev reakcij v vzorcih in njihovo zbiranje
   Reakcije v celicah ali tkivih se hitro ustavijo – običajno s hipnim zamrzovanjem – da se ohranijo stanja fosforilacije. Ta korak je ključen zaradi prehodne narave dogodkov fosforilacije.
2. Ultrazvočna liza celic in ekstrakcija beljakovin
   Vzorce odtalimo in izpostavimo sonikaciji, običajno v kratkih ciklih. Ultrazvočna energija razgradi celične membrane in učinkovito sprosti beljakovine. V validiranih delovnih postopkih sonikacijo izvajamo v več ciklih, da zagotovimo popolno lizo.
   Primer: Po odtaljevanju vzorcev na ledu je bila liza celic dosežena s sonikacijo, npr. z napravo Vialtweeter v 2 ciklih, vsak cikel je trajal 1 min.
3. Bistrenje in kvantifikacija beljakovin
   Po lizi vzorce centrifugiramo, da odstranimo celične ostanke. Zberemo supernatant, ki vsebuje topne beljakovine, in v njem kvantificiramo beljakovine, da zagotovimo enako vhodno količino pri vseh vzorcih.
4. Redukcija in alkilacija
   Disulfidne vezi reduciramo (npr. z DTT) in alkiliramo (npr. z IAA), da stabiliziramo beljakovine in izboljšamo učinkovitost razgradnje.
5. Proteolitična razgradnja
   Beljakovine encimsko razgradimo, običajno s tripsinom, pri čemer nastanejo peptidi, primerni za analizo z masno spektrometrijo. Preberite več o ultrazvočno pospešeni razgradnji beljakovin!
6. Čiščenje peptidov in razsoljevanje
   Peptide očistimo z metodami na osnovi C18, da odstranimo nečistoče, ki bi lahko motile analizo LC-MS.
7. Obogatitev fosfopeptidov
   Zaradi majhnih količin fosforiliranih peptidov za selektivno izolacijo fosfopeptidov uporabimo tehnike obogatitve, kot so afinitetne metode s Fe-NTA ali TiO₂.
8. Analiza LC-MS/MS in obdelava podatkov
   Obogatene vzorce analiziramo z masno spektrometrijo visoke ločljivosti, pri čemer pogosto uporabljamo od podatkov neodvisno zajemanje (DIA) za izboljšano kvantifikacijo in ponovljivost.

Delovne postopke za obdelavo velikega števila vzorcev je mogoče prilagoditi formatom plošč s 96 vdolbinicami, kar omogoča vzporedno obdelavo do več sto vzorcev – ta pristop je popolnoma združljiv s sonikacijo z napravo UIP400MTP.
 

Optimiziran protokol za hitro ustavitev reakcij v fosfoproteomu, obogatitev fosfopeptidov in Phos-DIA-MS.
Protokol in slika: ©Die et al. 2023

Izboljšanje ponovljivosti in kakovosti podatkov s sonikacijo

Eden osrednjih izzivov v fosfoproteomiki je doseganje dosledne kvantifikacije v velikih podatkovnih zbirkah. Variabilnost, ki nastane med pripravo vzorcev, lahko zakrije biološko pomembne razlike.

Sonikacija to rešuje z zagotavljanjem:

1. Standardiziranega vnosa energije v vse vzorce
2. Zmanjšane variabilnosti zaradi ročnega dela
3. Izboljšane ponovljivosti ekstrakcije in razgradnje beljakovin

V kombinaciji s platformami z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev, kot je UIP400MTP, lahko laboratoriji dosežejo raven doslednosti, ki je bistvena za raziskave sistemske biologije in odkrivanje kliničnih biomarkerjev.

Prihodnost fosfoproteomike: avtomatizacija in skalabilnost

Ker se fosfoproteomika še naprej širi na uporabo v velikem obsegu in v kliničnem okolju, bo potreba po avtomatizaciji in zmogljivosti obdelave vzorcev samo še naraščala. Priprava vzorcev s sonikacijo, zlasti kadar je vključena v sisteme, združljive z mikroploščami, predstavlja ključno tehnologijo, ki omogoča ta razvoj.
Naprave, kot sta VialTweeter in UIP400MTP, s povezovanjem učinkovite ultrazvočne lize, vzporedne obdelave in združljivosti z avtomatiziranimi delovnimi postopki postavljajo nove standarde pri pripravi vzorcev za proteomiko.
Preberite več o vključitvi naprave UIP400MTP v avtomatizirane laboratorijske delovne postopke!

Izkoristite pripravo vzorcev s pomočjo sonikacije v fosfoproteomiki!

Ekstrakcija beljakovin s pomočjo sonikacije je postala ključna sestavina sodobne fosfoproteomike, saj ponuja neprekosljivo učinkovitost, skalabilnost in ponovljivost. Ob vse večji potrebi po analizi kompleksnih bioloških sistemov v velikih skupinah vzorcev ultrazvočne tehnologije niso zgolj koristne – so bistvene.
Rešitve, kot sta VialTweeter in UIP400MTP, z omogočanjem standardiziranih delovnih postopkov z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev pospešujejo odkritja na področjih celičnega signaliziranja, mehanizmov bolezni in precizne medicine.

Načrtovanje, proizvodnja in svetovanje – kakovost iz Nemčije

Ultrazvočne naprave Hielscher so znane po najvišjih standardih kakovosti in zasnove. Robustnost in preprosto upravljanje omogočata nemoteno vključitev naših ultrazvočnih naprav v industrijske obrate. Ultrazvočne naprave Hielscher zlahka obvladujejo težke razmere in zahtevna okolja.

Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in posebno pozornost namenja visokozmogljivim ultrazvočnim napravam z najsodobnejšo tehnologijo, ki so prijazne do uporabnika. Ultrazvočne naprave Hielscher so seveda skladne s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.

Modeli sonikatorjev Hielscher za več vzorcev UIP400MTP za mikroplošče, VialTweeter in CupHorn: hitra priprava vzorcev z visoko zmogljivostjo obdelave