Ekstrakcija beljakovin iz tumorskega tkiva s pomočjo sonikacije – protokol

Ta protokol opisuje metodo ekstrakcije beljakovin iz tumorskega tkiva s pomočjo sonikacije, ki nadgrajuje standardni postopek lize s sečnino CPTAC z dodajanjem nadzorovanega koraka sonikacije s sondo med razgradnjo tkiva. Ta prilagoditev temelji na uveljavljeni strategiji CPTAC za pripravo proteoma in fosfoproteoma za poglobljeno analizo ter izboljšuje razgradnjo celic in podceličnih struktur, zmanjšuje viskoznost vzorca in izboljšuje sproščanje beljakovin, ki jih je običajno težje pridobiti zgolj z lizo s sečnino, zlasti beljakovin, vezanih na membrane, in beljakovin, ki vežejo DNA ali so povezane z jedrom. V študiji, na kateri temelji protokol, je postopek s pomočjo sonikacije povečal zaznavanje tako beljakovin kot fosfopeptidov, hkrati pa ohranil združljivost z nadaljnjim postopkom razgradnje po pristopu CPTAC, označevanja s TMT, frakcioniranja, obogatitve fosfopeptidov in analize LC-MS/MS.

Ekstrakcija beljakovin iz tumorskega tkiva s pomočjo sonikacije za poglobljeno proteomsko in fosfoproteomsko analizo

Naslednji protokol je optimiziran za ekstrakcijo beljakovin iz kriogeno uprašenega tumorskega tkiva v liznem pufru z 8 M sečnino: dodani korak sonikacije s sondo izboljšuje izkoristek ekstrakcije težje dostopnih razredov beljakovin, zlasti beljakovin, povezanih z membranami in DNA oziroma jedrom, pred razgradnjo in nadaljnjo analizo LC-MS/MS. V študiji Li et al. (2025), na kateri temelji protokol, je dodajanje sonikacije povečalo zaznavanje beljakovin, povezanih z membranami in jedrom, ter v okviru njihovega postopka omogočilo poglobljeno pokritost z >12.000 beljakovinami in >25.000 fosfopeptidi.

Področje uporabe protokola

Ta postopek uporabite za:

• sveže zamrznjeno, kriogeno uprašeno tumorsko tkivo
• celične usedline ali druge biološke vzorce, pri katerih je ekstrakcija s sečnino že uveljavljena
• postopke globalne proteomike in fosfoproteomike s tripsinsko razgradnjo in izbirnim označevanjem s TMT

Študija Li et al. (2025) navaja, da je postopek uporaben tudi za druge vrste vzorcev, kot so celične linije, kri in urin, vendar je glede na vrsto vzorca lahko potrebna optimizacija.

Optimiziran postopek priprave vzorcev z vključenim korakom sonikacije. Optimizirani postopek in zasnova poskusa temeljita na protokolu CPTAC za pripravo vzorcev za globalno proteomsko in fosfoproteomsko analizo.
Študija in shema: ©Li et al., 2025

Načelo delovanja

V izvirni študiji so standardnemu postopku lize s sečnino CPTAC dodali sonikacijo in ugotovili izboljšano zaznavanje beljakovin, povezanih z membranami in jedri. Avtorji navajajo, da je treba parametre sonikacije natančno prilagoditi velikosti oziroma koncentraciji vzorca – z izbiro velikosti sonotrode, vnosa energije in časovnih nastavitev impulzov.

Na primer, za Hielscher UP200Ht in UP200St to pomeni:

• kot glavni krmilni spremenljivki uporabite amplitudo in impulzni način
• vzorce ves čas ohranjajte hladne (tj. na ledu)
• začnite s previdno izbranimi nastavitvami
• optimizirajte glede na bistrost vzorca, temperaturo, izkoristek beljakovin in kakovost peptidov za nadaljnje korake

 
Oba modela sonikatorjev Hielscher z močjo 200 vatov, UP200Ht in UP200St, sta zasnovana za majhne in srednje prostornine vzorcev ter imata nastavljivo amplitudo in impulzne nastavitve; oba ultrazvočna homogenizatorja omogočata digitalno upravljanje prek zaslona na dotik za natančno prilagajanje parametrov, samodejno beleženje podatkov, priključljiv temperaturni senzor, daljinsko upravljanje in osvetlitev vzorca.
 

Reagenti za ekstrakcijo beljakovin s pomočjo sonikacije

Lizni pufer s sečnino

Svežega pripravite neposredno pred uporabo:

• 8 M sečnina
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinin
• 10 µg/mL levpeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Sečnina mora biti pred dodajanjem dodatkov popolnoma raztopljena; inhibitorje je treba dodati neposredno pred uporabo; pufer je treba hraniti na ledu; po dodajanju dodatkov pa je priporočljivo mešanje s krožnimi gibi namesto intenzivnega mešanja na vrtinčnem mešalniku.
 

Dodatni reagenti:

• Reagenti za določanje beljakovin z metodo BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodoacetamid
• LysC
• Tripsin
• Mravljinčna kislina
• Reagenti TMT, če uporabljate multipleksno kvantitativno proteomiko
• Reagenti IMAC, če izvajate obogatitev fosfopeptidov

Oprema za ekstrakcijo beljakovin s pomočjo sonikacije

Potrebna oprema

Priporočena izbira sonde

Za vzorce s prostornino približno 200–1000 µL uporabite sonotrodo z majhnim premerom, primerno za neposredno obdelavo majhnih prostornin z visoko intenzivnostjo. Hielscher ponuja sonotrode različnih premerov, manjši premeri konic pa zagotavljajo večjo intenzivnost na konici.

Praktična opomba: uporabite najmanjšo sondo, ki zagotavlja učinkovito mešanje brez pretiranega penjenja ali stika s steno posode.

Če hkrati obdelujete več vzorcev, lahko razmislite o sonikatorju za več epruvet VialTweeter ali sonikatorju za mikrotitrske plošče UIP400MTP!

Navodila po korakih: postopek ekstrakcije beljakovin s pomočjo sonikacije

A. Predhodno hlajenje in priprava

1. Centrifugo ohladite na 4°C.
2. Pripravite svež lizni pufer s sečnino in ga hranite na ledu.
3. UP200Ht ali UP200St namestite na stojalo v zvočnozaščitnem ohišju.
4. Pripravite dovolj veliko ledeno kopel, da bodo epruvete z vzorci v njej stale pokončno in stabilno.

Priprava svežega pufra in delo pri nizki temperaturi sta ključnega pomena.

B. Začetna ekstrakcija s sečnino

1. Kriogeno uprašeno tkivo hranite na ledu.
2. Dodajte 200 µL ohlajenega liznega pufra s sečnino na 50 mg mokrega tkiva.
3. Mešajte na vrtinčnem mešalniku 5–10 s pri visoki hitrosti.
4. Inkubirajte 15 min pri 4°C.
5. Korak mešanja na vrtinčnem mešalniku in inkubacije ponovite še enkrat.
6. Centrifugirajte pri 20.000g 10 min pri 4°C.
7. Lizat/supernatant prenesite v čisto epruveto z majhno vezavo beljakovin.

C. Sonikacija z uporabo UP200Ht ali UP200St

Začetni pogoji sonikacije

• Amplituda: začnite pri 20–30%
• Trajanje impulza: 5 s VKLOP
• Hlajenje: 2 min na ledu med impulzi
• Število ciklov: 4 cikli
• Skupni čas aktivne sonikacije: 20 s
• Skupni čas postopka, vključno s hlajenjem: približno 8–10 min

Koraki sonikacije

1. Lizat prenesite v epruveto, primerno za sonikacijo. Uporabite ozko epruveto s tankimi stenami, ki omogoča dobro izmenjavo toplote in varno potopitev sonde.
2. Epruveto postavite v ledeno kopel. Članek poudarja, da je hlajenje med sonikacijo ključnega pomena za preprečevanje toplotnih poškodb.
3. Konico sonde potopite v vzorec. Konica naj bo dovolj globoko potopljena za stabilno kavitacijo, vendar se ne sme dotikati stene ali dna epruvete.
4. Izvedite en 5 s impulz pri začetni amplitudi.
5. Vzorec takoj v celoti vrnite na led za 2 min.
6. Ponavljajte, dokler ne zaključite 4 ciklov.
7. Po ciklu preglejte lizat.
8. Nadaljujte samo po potrebi, vsakič z enim dodatnim 5 s impulzom, ki mu mora vedno slediti popolno ohlajanje.
9. Prenehajte, ko lizat postane bolj enakomeren in manj nitast/viskozen.
   Končna točka je bolj prosojen lizat, ki tvori kapljice namesto neprekinjenega viskoznega toka.
10. Centrifugirajte pri približno 16.000g 15 min pri 4°C.
11. Zbistreni supernatant prenesite v novo epruveto in izmerite koncentracijo beljakovin.

Primerjava globalne proteomike in fosfoproteomike med sonikiranimi in nesonikiranimi vzorci.
a. Število identificiranih beljakovin (globalna proteomika) v vseh tumorskih tkivih PDX s sonikacijo ali brez nje. b. Število identificiranih fosfopeptidov (obogatitev IMAC) v vseh tumorskih tkivih PDX s sonikacijo ali brez nje. Šteli so samo beljakovine in fosfopeptide z razmerjem zastopanosti, večjim ali enakim 25. percentilu. Razmerje zastopanosti je bilo izračunano med istimi vrstami vzorcev.
Študija in grafi: ©Li et al., 2025

Nadaljnja razgradnja in analiza

Po sonikaciji in bistrenju nadaljujte, kot je opisano v izvirnem postopku po pristopu CPTAC:

1. Lizat razredčite v razmerju 1:3 (v/v) s 50 mM Tris-HCl pri pH 8,0, da zmanjšate koncentracijo sečnine na <2 M.
2. Dodajte LysC v količini 1 mAU na 50 µg beljakovin in inkubirajte 2 h pri 25°C.
3. Dodajte tripsin v razmerju encim:substrat 1:49 (w/w) in razgrajujte čez noč pri 25°C.
4. Reakcijo ustavite z dodatkom mravljinčne kisline do končne koncentracije 1%.
5. Po potrebi nadaljujte z razsoljevanjem, označevanjem s TMT, frakcioniranjem, obogatitvijo fosfopeptidov in LC-MS/MS.

Diferencialno izražanje fosfopeptidov, ugotovljeno z MS z označevanjem s TMT.
a. Bazalni podtip s poudarkom na nekaterih človeških fosfopeptidih (začetek in konec protein-sequence) s povečanim izražanjem v sonikiranih vzorcih v primerjavi z nesonikiranimi vzorci. b. Luminalni podtip s poudarkom na nekaterih človeških fosfopeptidih (začetek in konec protein_sequence) s povečanim izražanjem v sonikiranih vzorcih v primerjavi z nesonikiranimi vzorci. c. Obogatene poti KEGG na podlagi beljakovin fosfopeptidov s povečanim izražanjem pri sonikiranem bazalnem podtipu tumorjev. d. Obogatene poti KEGG na podlagi beljakovin fosfopeptidov s povečanim izražanjem pri sonikiranem luminalnem podtipu tumorjev.
Študija in grafi: ©Li et al., 2025

Načrtovanje, proizvodnja in svetovanje – kakovost iz Nemčije

Sonikatorji Hielscher so znani po najvišjih standardih kakovosti in zasnove. Robustnost in preprosto upravljanje omogočata nemoteno vključevanje naših sonikatorjev v industrijske obrate. Sonikatorji Hielscher zlahka obvladujejo težke razmere in zahtevna okolja.

Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visoko zmogljivim sonikatorjem z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Seveda so sonikatorji Hielscher skladni z zahtevami CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.

Literatura / reference

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.