Ekstrakcija beljakovin iz tumorskega tkiva s sonikacijo – protokol

V tem protokolu je opisana metoda ekstrakcije proteinov iz tumorskega tkiva s pomočjo sonikacije, ki nadgrajuje standardni delovni postopek lize s sečnino CPTAC z dodajanjem nadzorovane sonikacije sonde med razdruževanjem tkiva. Ta sprememba, ki temelji na uveljavljeni strategiji priprave proteomov in fosfoproteomov CPTAC v velikem obsegu, izboljša prekinitev celične in subcelične strukture, zmanjša viskoznost vzorca in poveča sproščanje proteinov, ki jih je običajno težje obnoviti samo z lizo s sečnino, zlasti proteinov, vezanih na membrane in DNA ali povezanih z jedrom. V osnovni študiji je delovni postopek s sonikacijo povečal zaznavanje proteinov in fosfopeptidov, hkrati pa je ohranil združljivost z nadaljnjo razgradnjo v slogu CPTAC, označevanjem TMT, frakcioniranjem, obogatitvijo s fosfopeptidi in analizo LC-MS/MS.

Ekstrakcija proteinov iz tumorskega tkiva s sonikacijo za globinsko proteomsko in fosfoproteomsko analizo

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Območje uporabe protokola

Ta postopek uporabite za:

• sveže zamrznjeno, kriopulverizirano tumorsko tkivo
• celični peleti ali drugi biološki vzorci, pri katerih je ekstrakcija na osnovi sečnine že uveljavljena
• globalna proteomika in fosfoproteomika z uporabo triptične digestije in opcijskega označevanja TMT

V študiji Li et al. (2025) je navedeno, da je delovni postopek uporaben tudi za druge vrste vzorcev, kot so celične linije, kri in urin, vendar bo morda potrebna optimizacija glede na vrsto vzorca.

Optimiziran delovni postopek priprave vzorca z uvedenim korakom sonifikacije. Optimiziran potek dela in eksperimentalna zasnova temeljita na protokolu CPTAC za pripravo vzorcev za globalno proteomsko in fosfoproteomsko analizo.
Študija in shema: ©Li et al., 2025

Načelo delovanja

V prvotni študiji je bilo standardnemu postopku lize s sečnino CPTAC dodano sonificiranje in ugotovljeno boljše zaznavanje beljakovin, povezanih z membranami in jedri. Avtorji navajajo, da je treba parametre sonikacije natančno prilagoditi glede na velikost/koncentracijo vzorca – z izbiro velikosti sonotrode, vnosa energije in časa impulza.

Za Hielscher UP200Ht in UP200St to na primer pomeni:

• amplituda in način impulza sta glavni kontrolni spremenljivki.
• vzorce ves čas hranite na hladnem (npr. na ledu).
• začnite s konzervativnimi nastavitvami.
• optimizacija glede na čistost vzorca, temperaturo, izkoristek beljakovin in kakovost peptidov v nadaljnjem proizvodnem procesu

 
Oba Hielscher 200 W sonikator modeli UP200Ht in UP200St so namenjeni za majhne in srednje količine vzorcev, z nastavljivo amplitudo in nastavitve pulzov; oba ultrazvočni homogenizatorji zagotavljajo digitalni nadzor na dotik za natančno nastavitev parametrov, avtomatsko snemanje podatkov, priključljivo temperaturno tipalo, daljinski upravljalnik, vzorec osvetlitev.
 

Reagenti za ekstrakcijo proteinov s sonikacijo

Raztopina za lizo s sečnino

Pripravite sveže neposredno pred uporabo:

• 8 M sečnine
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/ml aprotinina
• 10 µg/ml leupeptina
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Koktajl inhibitorjev fosfataz 2, 1:100 (v/v)
• Koktajl fosfataznega inhibitorja 3, 1:100 (v/v)

Pred dodajanjem dodatkov je treba sečnino popolnoma raztopiti, inhibitorje je treba dodati neposredno pred uporabo, pufer je treba hraniti na ledu, po dodajanju dodatkov pa je priporočljivo vrtenje namesto močnega vrtinčenja.
 

Dodatni reagenti:

• Reagenti za testiranje beljakovin BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodoacetamid
• LysC
• Tripsina
• Mravljinčna kislina
• reagenti TMT, če uporabljate multipleksirano kvantitativno proteomiko
• reagenti IMAC, če izvajate obogatitev s fosfopeptidi

Oprema za ekstrakcijo proteinov s sonikacijo

Zahtevano

Priporočena izbira sonde

Za vzorce s prostornino od 200 do 1000 µl uporabite sonotrodo z majhnim premerom, ki je primerna za neposredno obdelavo majhnih količin z visoko intenzivnostjo. Hielscher ponuja več premerov sonotrod, manjši premeri konic pa zagotavljajo večjo intenzivnost na konici.

Praktična opomba: Uporabite najmanjšo sondo, ki omogoča učinkovito mešanje brez pretiranega penjenja ali stika s stenami posode.

Če delate z več vzorci hkrati, lahko razmislite o večcevni sonikator VialTweeter ali sonikator za mikroplošče UIP400MTP!

Navodila po korakih: Postopek ekstrakcije proteinov s sonikacijo

A. Predhodno hlajenje in priprava

1. Centrifugirko ohladite na 4 °C.
2. Pripravite svež sečninski pufer za lizo in ga hranite na ledu.
3. Postavite napravo UP200Ht ali UP200St na stojalo v zvočno ohišje.
4. Pripravite dovolj veliko ledeno kopel, da bodo epruvete z vzorci v pokončnem položaju in stabilne.

Priprava svežega pufra in ravnanje na hladnem sta ključnega pomena.

B. Začetna ekstrakcija sečnine

1. Kriopulverizirano tkivo hranite na ledu.
2. Na 50 mg mokrega tkiva dodajte 200 µl ohlajenega sečninskega pufra za lizo.
3. Vrtinec 5-10 s pri visoki hitrosti.
4. Inkubirajte 15 minut pri 4 °C.
5. Korak z vrtinčenjem in inkubacijo ponovite še enkrat.
6. Centrifugirajte pri 20.000 g 10 minut pri 4 °C.
7. Lizat/supernatant prenesite v čisto epruveto z nizko vezavo.

C. Sonikacija z uporabo UP200Ht ali UP200St

Začetni pogoji za sonikacijo

• Amplituda: začetek pri 20-30 %
• Dolžina impulza: 5 s ON
• Hlajenje: 2 min na ledu med impulzi
• Število ciklov: 4 cikli
• Skupni čas aktivne sonikacije: 20 s
• Skupni čas postopka, vključno s hlajenjem: približno 8-10 min

Koraki sonikacije

1. Lizat prenesite v epruveto, primerno za sonifikacijo. Uporabite ozko, tankostensko epruveto, ki omogoča dobro izmenjavo toplote in varno potopitev sonde.
2. Epruveto postavite v ledeno kopel. V članku je navedeno, da je hlajenje med sonikacijo ključnega pomena za preprečevanje toplotnih poškodb.
3. Konico sonde potopite v vzorec. Konica naj bo potopljena dovolj, da bo kavitacija stabilna, vendar naj se ne dotika stene ali dna epruvete.
4. Izvedite en 5-sekundni impulz z začetno amplitudo.
5. Vzorec takoj za 2 min v celoti postavite na led.
6. Ponavljajte, dokler ne zaključite 4 ciklov.
7. Po ciklu preglejte lizat.
8. Nadaljujte le po potrebi z enim dodatnim 5-s pulzom, ki mu vedno sledi popolno ohlajanje.
9. Prenehajte, ko lizat postane bolj enakomeren in manj žilav/viskozen.
   Končna točka je bolj prosojen lizat, ki tvori kapljice in ne neprekinjenega viskoznega toka.
10. Centrifugirajte pri približno 16.000 g 15 minut pri 4 °C.
11. Prečiščeni supernatant prenesite v novo epruveto in izmerite koncentracijo beljakovin.

Primerjava globalne proteomike in fosfoproteomike med soniciranimi in nesoniciranimi vzorci.
a. Število identificiranih proteinov (globalna proteomika) v vseh tumorskih tkivih PDX s sonikacijo ali brez nje. b. Število identificiranih fosfopeptidov (obogatitev IMAC) v vseh tumorskih tkivih PDX s sonikacijo ali brez nje. Upoštevani so bili samo proteini in fosfopeptidi z razmerjem obilja, ki je bilo večje ali enako 25. percentilu. Razmerje abundance je bilo izračunano med istimi vrstami vzorcev.
Študija in grafi: ©Li et al., 2025

Razgradnja in analiza na nižjih stopnjah proizvodne verige

Po sonikaciji in bistrenju nadaljujte, kot je opisano v prvotnem delovnem postopku v slogu CPTAC:

1. Lizat razredčite v razmerju 1:3 (v/v) s 50 mM Tris-HCl pH 8,0, da se sečnina zmanjša na <2 M.
2. Dodajte LysC v količini 1 mAU na 50 µg proteina in inkubirajte 2 uri pri 25 °C.
3. Dodajte tripsin v razmerju 1:49 encim:substrat (m/m) in ga razgradite čez noč pri 25 °C.
4. Gasite z mravljinčno kislino do končnega 1 %.
5. Po potrebi nadaljujte z razsoljevanjem, označevanjem TMT, frakcioniranjem, obogatitvijo s fosfopeptidi in LC-MS/MS.

Diferencialno izražanje fosfopeptidov iz MS, označenih s TMT.
a. Bazalni podtip, ki poudarja nekatere človeške fosfopeptide (začetek in konec proteinskega zaporedja), ki so v soniciranih vzorcih regulirani v primerjavi z nesoniciranimi vzorci. b. Luminalni podtip, ki poudarja nekatere človeške fosfopeptide (začetek in konec proteinskega zaporedja), ki so v soniciranih vzorcih regulirani v primerjavi z nesoniciranimi vzorci. c. Obogatene poti KEGG na podlagi proteinov z reguliranimi fosfopeptidi v soniciranih tumorjih bazalnega podtipa. d. Obogatene poti KEGG na podlagi proteinov z reguliranimi fosfopeptidi v soniciranih tumorjih luminalnega podtipa.
Študija in grafi: ©Li et al., 2025

Projektiranje, izdelava in svetovanje – Kakovost izdelana v Nemčiji

Hielscher ultrazvočni aparati so znani po svojih najvišjih standardih kakovosti in oblikovanja. Robustnost in enostavno upravljanje omogočata nemoteno integracijo naših ultrazvočnih aparatov v industrijske objekte. Težke pogoje in zahtevna okolja zlahka obvladajo Hielscher ultrasonicatorji.

Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visoko zmogljivim ultrazvočnim aparatom z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Seveda so Hielscher ultrazvočni aparati skladni s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.

Literatura / Reference