Hielscher Ultrazvočna tehnologija

Ultrazvočni Beljakovine Ekstrakcija iz tkiva in celičnih kultur

  • ekstrakcija proteinov je bistvena priprava vzorcev korak proteomike.
  • Proteini lahko ekstrahiramo iz rastlinskega in živalskega tkiva, kvasovke in mikroorganizmov.
  • Ultrazvoka je zanesljiva, učinkovita metoda za ekstrakcijo proteinov daje visoke donose beljakovin v kratkem času ekstrakcije.

 

Ekstrakcija beljakovin iz tkiv in celic

ekstrakcija proteinov iz tkiv in kultiviranih celic je bistven vzorec pripravek korak, ki se izvede v številnih biokemičnih in analitičnimi tehnikami, kot ELISA, PAGE, Western blot, Masna spektrometrija, ali čiščenje proteina. Ultrazvočni motnje celic, liza in pridobivanje je natančno krmiliti tehnika za zagotavljanje visoke donose proteinov.

ekstrakcija proteinov iz živalskega tkiva

Za pripravo celotnega tkiva (npr. Ledvic, srca, pljuč, mišic itd.) Je treba tkivo razrezati na zelo majhne koščke s čistimi orodji, po možnosti na led in v najkrajšem možnem času, da preprečimo razgradnjo s proteazami (npr. liza pufer, kot je RIPA ali hipotonski lizinski pufer, ki vsebuje proteazo in koktail inhibitorja fosfataze). Po disekciji se vzorec potopi v tekoči dušik za zamrznitev. Vzorec se lahko shrani pri -80 ° C za poznejšo uporabo ali pa se zavije na ledu za takojšnjo homogenizacijo. Takoj pred ultrazvočno ekstrakcijo se v cev za vzorce hitro dodaja ledeno mrzlični pufer za lizo (z zaviralci proteaze DTT, leupeptin in aprotinin) (priporočamo približno 10 mg tkiva približno 600 μl puferja). Približno Priporočeno je 20-60 mg tkiva na cev vzorca.
Ultrazvočni homogenizacija, liza in ekstrakcijo izvedemo z ultrazvočno homogenizatorjem kot je UP200Ht ali UP200St, Opremljena z sonotrode za mikro konico. trajanje ultrazvočnega razbijanja je 60-90 sek. na način ultrazvočno ciklu 15 sek. ultrazvoka in 10 sek. počitek čas. Vzorec je treba hraniti na ledu ves čas.
Po ultrazvočni homogenizacijo / ekstrakcijo se lizat centrifugiramo pri 27,000g pribl. 20 min. Nato se supernatanta zberemo, tako da je mogoče koncentracijo proteina lahko določimo s testom proteina kot Pierce proteina analiznega BCA.

Protein ultrazvoka je pomembna metoda priprave vzorca

Ultrazvočni ekstrakcija beljakovin iz celic z UP200St

Prošnja za informacije




Upoštevajte naše Politika zasebnosti.


ekstrakcija proteinov iz krvnem serumu

Za homogeno mešanico seruma in fosfatnega pufra je vzorec vortex najprej pred ultrazvočno celično lizo. Za ultrazvočno lizo je vzorec sonicated z ultrazvočnim laboratorijskim homogenizatorjem, kot je UP100H 8 ciklusov pri 20% amplitude, za ciklih po 5 sekund na in 15 sekund off. Sonocation izvedemo z sonicationg v ciklih in z dajanjem vzorec na ledu, da se prepreči pregrevanje in termična razgradnja vzorca. Ker seruma vsebuje veliko količino visoko proteinov molekulsko maso (kot so albumin, a1-antitripsina, transferin, haptoglobulin, imunoglobulina G in imunoglobulina A), ki so v nasprotju z ločevanjem nizko proteinov molekulsko maso med IEF, je priporočljivo, da jih tanjšajo iz seruma ob uporabi kolone tanjšanja.

ekstrakcija proteinov iz rastlinskega tkiva

Sveže, mehko rastlinsko tkivo, npr mahovi itd se lahko zlahka zmoti preprosto dajanje narezano vzorčnega materiala v liznega pufra za sonikacijo. Tough, ligenous rastlinskega tkiva, kot so semena, jelka igle itd, naj se zemlja suha. Nekateri trde, lesenih rastlinski materiali morajo biti zamrznjeni in zmleti v tekočem dušiku, preden ekstrahiramo s sonikacijo. Za suspenzij rastlinska celica kulture, ultrazvočno obdelavo med 30 in 150 sekund v pufru za lizo je večinoma zadošča. Doslednejše material, kot so bučna semena zahteva bolj intenzivno sonikacijo, kot je opisano spodaj.

Protokol za ultrazvočno ekstrakcijo albumina iz bučnih semen

Ultrazvočni tkiva homogenizator UP400St z S24d40 - za ekstrakcijo proteinov iz rastlinskega in živalskega tkiva (Kliknite za povečavo!)Za ekstrakcijo ultrazvočni proteina albumina iz fino mlete bučnega v prahu, 10 g odmaščeno bučnega praška in 100 ml deionizirane vode kot topilo dodamo v 250mL stekleno čašo. Črpanje Protein je sestavljen v dveh korakih: najprej se vzorec sonicira s sondo tipa ultrasonicator a UP400St (400W, 24 kHz) z dvižno sonotrode S24d7. Steklo čašo damo v kopeli hladne vode med ultrazvočno homogenizaciji. The nastavitev ultrasonicator UP400St s senzorjem temperature priklopa je zagotovljeno, da se temperatura vzorca vedno ohranja pod 30 ° C. Z natančnim nadzorom temperature med soniciranjem se izognemo denaturaciji albuminov. Drugič, ekstrakcijo smo izvajali z mešalcem pri hitrosti 200 vrtljajev na minuto in pri 30 ° C. Nato se čaša prenese v termostatski stresalnik. Globulin odstranimo z dializo z destilirano vodo. Po odstranitvi globulina se lahko beljakovinski ekstrakt vzorči za določitev profila albumin in se nato prilagodi na pI = 3,0 z uporabo 0,1 M HCl za koagulacijo albuminov. Trdno fazo ločimo s centrifugiranjem pri 5000 g, 20 ° C in ponovno raztopimo v deionizirani vodi. Albuminov koagulacija se izvaja dvakrat, da poveča razmerje beljakovin v koncentratu albumin.

Ultrazvočni alkalna ekstrakcijska proteina za pripravo koncentrata proteina iz riževih otrobov kaže, da so ultrazvočni rezultati zdravljenja v visokem dobitku proteina v bistveno krajšem času ekstrakcije – v primerjavi z običajnimi metodami pridobivanja.

Ultrazvočna naprava VialTweeter za ekstrakcijo proteinov v vzorcih tkiva (Klikni za povečavo!)

VialTweeter za posredno ultrazvočno razbijanje.

prednosti

  • hitro
  • visoki donosi
  • visoko učinkovite
  • Natančen nadzor nad parametri
  • ponovljive rezultate
  • linearna razširljivost

Priprava vzorcev protokol za funkcionalno iNOS encima

Da bi dobili popolnoma funkcionalno iNOS encim (npr pri mamil), se priporoča naslednji protokol: Celično suspenzijo je treba dati na led in soniciraj z UP100H pri 10 um amplitudo na način cikla 5 sek. ultrazvoka in 25 sek. počiva na ledu. Postopek je treba ponoviti pribl. 3-krat. Čas počiva med ultrazvočno razbijanje ciklov zmanjšuje dvig temperature in bo zato zmanjša tveganje za denaturacijo.

Ultrazvočni Beljakovine topljenja

Ultrazvoka lahko pospešijo Solubilizacijski postopek protein, ki običajno zahteva nekaj ur. Da ne pregreje vzorca in preprečijo degradacijo proteinov ter spremembe v raztopinah, ki vsebujejo sečnino, so ultrazvočni razpoči naj ne trajajo dlje kot nekaj sekund.

Splošna navodila

Regulacija temperature: Da se zagotovi visok izkoristek beljakovin brez toplotne denaturacije, mora temperatura ekstrakcije je pod nadzorom. Hielscher je state-of-art ultrazvočni homogenizers – imenovan tudi ultrazvočni dezintegrator ali sonificator – so natančno nadzorovati. Prihajajo s senzorjem plugable temperature. V možnosti nastavitev v ultrazvočno homogenizator, lahko najvišja temperatura nastavljena. Ko je dosežena ta temperatura max je ultrasonicator samodejno ustavi, dokler se vzorec ohladi.
Medpomnilnik: Lastni izbor ustreznega pufra in desni volumnu pufra razlikuje od tkiva do tkiva in morajo biti pogruntal, ki jih testiranje poskusov in napak.
Izolacijski / čistilni postopek: Protein lizate lahko vsebuje prebitek biomolekul, kot so DNA ali ogljikovih hidratov, ki jih lahko odstranimo z aktivnostjo protein obarjanja (deoksiholata-triklorocetna kislina) ali pufer izmenjavo.

Chittapalo in Noomhorm (2009) je poročal, da je dobitek proteina povečano uporabo zvoka in da lahko ultrazvočno tkivo homogenizacija in liza Postopek znatno povečanje obstoječih postopkov pridobivanja – omogočajo nove poslovne priložnosti za ekstrakcijo.

Zvok zaščito z Hielscher zvočno zaprtega SPB-L in ultrazvočno napravo UP200St. (Kliknite za povečavo!)

Ultrazvočni tkiva homogenizator UP200St za učinkovito ekstrakcijo proteinov

Natančno krmiljenje ultrazvočni obdelavi (Kliknite za povečavo!)

Kontrola brskalnik za natančno delovanje in spremljanje procesa sonifikacijo

Ultrasonic Oprema za Protein Extraction

Hielscher Ultrazvočna ponujajo široko paleto ultrazvočnih homogenizers za dezintegracijo celic, tkiv, bakterij, mikroorganizmov, kvasovk in spor.
Hielscher lab ultrasonicators je zmogljiv in enostaven za uporabo. Zgrajen za 24/7 delovanje, so zasnovani kot zanesljive in učinkovite lab in klop-top naprav. Za vse naprave, se lahko proizvodnja energije in amplituda treba natančno nadzirati. Široka paleta Dodatna oprema odpira dodatne možnosti nastavitev. V digitalnih naprav, kot so VialTweeter, UP200Ht, UP200Stin UP400St ima vgrajen nadzor temperature in vgrajeno SD kartico za avtomatsko zapisovanje podatkov.
Za posredno, navzkrižno kontaminacijo-brezplačno in hkratno ultrazvočno razbijanje več vzorcev, nudimo VialTweeter ali Ultrazvočni cuphorn.
Glede na vašo prijavo, materiala in volumen vzorca, vam bomo priporočamo najprimernejše nastavitve za svoj vzorec prep. Pišite nam danes!

Kontaktiraj nas! / Vprašajte nas!

Prosimo, uporabite spodnji obrazec, če želite zahtevati dodatne informacije o ultrazvočni homogenizaciji. Z veseljem vam bomo ponudili ultrazvočni sistem, ki bo ustrezal vašim zahtevam.









Prosimo, upoštevajte naše Politika zasebnosti.


Literatura / Reference

  • Chittapalo T Noomhorm A (2009): Ultrazvočni pomaga alkalijske ekstrakciji beljakovin iz odmaščeno riževih otrobov in lastnosti proteinskih koncentratov. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simoes, André E.S:; Pereira Diane M. Amaral, Joan. Nunes, Ana M. Gomes, Sofija E. Roberts, Peter M. Glej, Adrian C. D'Hooge Rudi; Nakladalec, Clifford J. Thibodeau, Stephen C. Borralho, Peter M. Rodrigues, Cecilia M. P. (2013): učinkovito pridobivanje proteinov iz različnih vzorcev izvornih po TRIzola ali Trizol LS ekstrakcijo RNA in dolgotrajno skladiščenje. BMC Genomics, 2013, 14: 181.


Dejstva je treba vedeti

proteomika

Proteomika je področje raziskav, ki raziskuje proteine ​​in proteoma. Beljakovine fullfil široko paleto vitalnih funkcij v organizme. Proteoma je celoten sklop proteinov z genom, celice, tkiva ali organizma, izraženih v določenem času. Proteoma spreminja s časom in različne zahteve, ali poudarja, da je celica ali organizem podvržen. Natančneje, je množica izraženih proteinov v danem tipu celice ali organizma, v določenem času, v določenih pogojih. Izraz je mešanica beljakovin in genoma. Proteomika je študija proteoma.

Beljakovine

Beljakovine so se veliki biomolekul, tako imenovani makromolekule – ki so sestavljene iz ene ali več dolgih verig aminokislinskih ostankov. Beljakovine so prisotne v vseh organizmih rastlinskega in živalskega izvora in so bistvenega pomena za večino bioloških funkcij. Ker beljakovine vsebujejo veliko bioloških podatkov, jih izvlečemo za analitične namene, npr. Za proteomske raziskave. Najpomembnejša funkcija, ki jo izvajajo proteini, je kataliza metabolnih reakcij, replikacije DNA, odziv na dražljaje in transport molekul z ene lokacije na drugo. Proteini se med seboj razlikujejo predvsem v svoji sekvenci aminokislin, kar narekuje nukleotidna sekvenca njihovih genov in ki običajno povzroči, da se zlitje proteinov v specifično tridimenzionalno strukturo, ki določa njegovo delovanje. Beljakovine so – poleg peptidi – eden od ključnih sestavin hrane. Zato, proteomika je močno orodje v znanosti hrane za optimizacijo procesov, varnosti hrane in prehranske ocenjevanja.

gel Electrophoresis

Gel elektroforeza je glavni Postopek za ločitev in analizo makromolekul kot so DNA, RNA in proteinov ter njihovih fragmentov, glede na njihovo velikost in naboja. Uporablja se v klinični kemiji za ločevanje proteinov pristojbine in / ali velikosti (IEF agaroze v bistvu velikost neodvisna) in biokemije, molekularne biologije in proteomika ločiti z mešano populacijo fragmentov DNA in RNA z dolžino, za oceno velikosti DNA in RNK fragmente ali za ločevanje proteinov s naboja.

celične kulture

Celične kulture je pod nadzorom narašča postopek, pri katerem se celice gojijo pod nadzorovanimi pogoji. Pogoji celičnih kultur razlikuje za vsak celični tip. Na splošno je okolje v celični kulturi sestavljajo primerno posodo (npr petrijevko) s substratom ali mediju, ki oskrbuje bistvenih hranil (aminokisline, ogljikovi hidrati, vitamini, minerali), rastni faktorji, hormoni, in plini (CO2, The2) In ureja fizikalno-kemijskega okolja v (pH pufer osmotski tlak, temperatura). Večina celic potrebujemo površino ali umetnega substrata, medtem ko se druge celične kulture lahko gojijo prosti zaplaval gojišča (suspenzijski kulturi, celične suspenzije).
Množične kulture linij živalskih celic se uporabljajo v industrijski proizvodnji virusnih cepiv in drugih biotehnološko pridobljenih proizvodov. človeških izvornih celic gojimo za povečanje števila celic in razlikovanje celic v različnih somatskih celičnih tipov zaradi presaditve.

Tkivo Vzorci

Izraz tkivo opisuje celično intermediat, kjer je celica gradivo na organizacijski ravni med celicami in popolno organa. V tkivu, podobne celice, iz istega izvora, ki skupaj opravljajo posebno funkcijo, so sestavljeni. Z funkcionalno združevanje različnih tkivih, se oblikujejo zapletene strukture organov.
Tkivo se vzorči za raziskave v biologiji, histologijo / histopatološki, parazitologije, biokemija, imunohistokemijo ter gojiti in ekstrakt DNA. To je mogoče razlikovati med živali (podpodročje: sesalec tkivo) in rastlinsko tkivo. Živalska tkiva so razvrščeni v štiri osnovne tipe vezivnega, mišice, živčni in epitelijskega tkiva. Rastlinsko tkivo je razdeljen na naslednjih treh sistemov tkiva: povrhnjice, v pritličju tkivo, in žilnega tkiva.
vzorce tkiva lahko pripravimo iz delov živali ali rastlin, npr kosti, mišice, listje, itd

telesnih tekočin

Kri, serum, plazma, likvor, slina in sinovialno tekočino so telesne tekočine, ki ponujajo velik vir diagnostično pomembnih informacij. Zato prefinjeno priprava vzorcev telesne tekočine za analizo je pomembno. Prva težava je povezana s širokim dinamičnim območju od komponent, prisotnih v telesnih tekočinah.

Določitev koncentracije proteina

Bradford preizkus, Lowry preizkus in bicinchoninic kisline (BCA) preizkus so pogosti testi za določanje koncentracije proteinov. Goveji serumski albumin (BSA) je eden od najbolj pogosto uporabljenega proteina standarda.

liza Buffer

Liznega pufra mora biti izbran v skladu s celični material ali tkiva (tkivne kulture, rastline, bakterije, glive, itd), in če so celice v strukturi in tip konstrukcije. Različni lizo pufri za ekstrakcijo proteinov, membran in organele formulirana z enim ali več detergentov. Detergent je ponavadi izbran preko testov poskusov in napak ali – če je na voljo – po obstoječem ekstrakcijo proteinov protokola. Detergent mora biti v skladu z virom tkiva in beljakovin. Na splošno je najbolj blago čistilo, ki deluje na določeni tkiva / protein, ki je izbran, da se ohrani maksimalno funkcionalnost ekstrakta. Nadalje, v primeru ekstrakcije membran in organelov, blagim detergentom ohranja membrana nedotaknjen. Pogosto uporabljeni detergenti v liza pufrov so večinoma neionski ali amfoterni, npr CHAPS, deoksiholat, Triton ™ X-100, NP40 in Tween 20.
Na primer, tkiva, kot so možgani, jetra, črevesja, ledvic, vranica itd mogoče enostavno zapufrano z RIPA – Vendar je treba vključiti inhibitorji proteaz in DTT (na primer za gelsko elektroforezo).
Liznega pufra za skeletno mišičnega tkiva (led mrzlo): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (m / v) glicerola, 1 mM EDTA , 1 mM ditiotreitola dopolnjenem z proteaze in inhibitorja fosfataza koktajl
Tabela skupnih pufrov in njihov pH območje. Na splošno se te pufri običajno uporabljajo v koncentracijah 20-50 mM.

Medpomnilnik območje pH
Citronska kislina – Naoh 2,2 – 6,5
natrijev citrat – Citronska kislina 3,0 – 6,2
natrijev acetat – ocetna kislina 3,6 – 5,6
Cacodylic kislina natrijeva sol – Hcl 5,0 – 7,4
MY – Naoh 5,6 – 6,8
Natrijev dihidrogen fosfat – dinatrijev hidrogen fosfat 5,8 – 8,0
imidazol – Hcl 6,2 – 7,8
MOPS – Koh 6,6 – 7,8
trietanolamin hidroklorida – Naoh 6,8 – 8,8
tris – Hcl 7,0 – 9,0
HEPES – Naoh 7,2 – 8,2
tricin – Naoh 7,6 – 8,6
natrijev tetraborat – Borova kislina 7,6 – 9,2
Bicin – Naoh 7,7 – 8,9
Glicin – Naoh 8,6 – 10,6

Večina pufri prikaz pH odvisnost s temperaturo. To še posebej velja za Tris odbojnike. PKa spreminja od 8,06 pri 25 ° C do 8,85 pri 0 ° C.
(PH in pKa pufer: pH meri koncentracijo vodikovih ionov v vodni raztopini pKa (= kisline disociacijska konstanta) je povezano, vendar bolj specifičnih ukrep, s tem, da pomaga predvideti, kako bo molekula deluje na določeni. pH vrednost).

TRIzola

TRIzola je kemična raztopina se uporablja za pridobivanje RNA / DNA / proteina med ekstrakcijo gvanidin tiocianat-fenol-kloroform. Uporaba ultrazvočno pomoč TRIzola rezultatov ekstrakcijska v visoki DNA, RNA in proteinov donosov iz istega vzorca in se odlikuje s tem druge metode za ekstrakcijo.