Ultrazvočna ekstrakcija beljakovin iz tkivnih in celičnih kultur
- Ekstrakcija beljakovin je bistveni korak priprave vzorca v proteomiki.
- Beljakovine se lahko ekstrahirajo iz rastlinskega in živalskega tkiva, kvasovk in mikroorganizmov.
- Sonication je zanesljiva in učinkovita metoda ekstrakcije beljakovin, ki zagotavlja visoke donose beljakovin v kratkem času ekstrakcije.
Ekstrakcija beljakovin iz tkiv in celic
Ekstrakcija beljakovin iz tkiv in gojenih celic je bistven korak priprave vzorca, ki se izvaja med številnimi biokemičnimi in analitskimi tehnikami, kot so ELISA, PAGE, Western blotting, masna spektrometrija ali čiščenje beljakovin. Ultrazvočna motnja celic, liza in ekstrakcija je natančno nadzorovana, netoplotna tehnika, ki zagotavlja visoke donose beljakovin.
Ekstrakcija beljakovin iz celic z ultrazvočna sonda UP200St
- Hiter
- Visoki donosi
- Visoko učinkovit
- Natančen nadzor nad parametri
- ponovljivi rezultati
- linearna razširljivost
Splošna navodila za ultrazvočno lizo in ekstrakcijo beljakovin
- Nadzor temperature: Da bi zagotovili visok donos beljakovin brez toplotne denaturacije, je treba temperaturo med ekstrakcijo nadzorovati. Hielscherjevi najsodobnejši ultrazvočni homogenizatorji – imenovan tudi ultrazvočni dezintegrator ali ultrazvočnik – so natančno nadzorovani. Na voljo so s temperaturnim senzorjem, ki ga je mogoče priključiti. V možnostih nastavitve ultrazvočnega homogenizatorja lahko nastavite najvišjo temperaturo. Ko je dosežena ta najvišja temperatura, se ultrazvočni aparat samodejno ustavi, dokler se vzorec ne ohladi.
- Medpomnilnik: Izbira ustreznega pufra in pravi volumen pufra se razlikujeta od tkiva do tkiva in ju je treba ugotoviti s testiranjem poskusov in napak.
- Izolacija / čiščenje: Proteinski lizati lahko vsebujejo presežek biomolekul, kot so DNA ali ogljikovi hidrati, ki jih je mogoče odstraniti z obarjanjem beljakovin (deoksiholat-trikloroocetna kislina) ali izmenjavo pufra.
Chittapalo in Noomhorm (2009) sta v svoji študiji poročala, da se je donos beljakovin povečal z uporabo ultrazvočne razbijanje in da lahko postopek ultrazvočne homogenizacije in lize tkiva znatno izboljša obstoječe procese ekstrakcije – omogočanje novih komercialnih priložnosti za pridobivanje.
Ultrazvočni CupHorn za sočasno, zelo učinkovito pripravo vzorcev več vzorcev pod enakimi pogoji za izolacijo beljakovin in fragmentacijo DNK.
Ekstrakcija beljakovin iz živalskega tkiva
Za pripravo celotnega tkiva (npr. ledvic, srca, pljuč, mišic itd.) je treba tkivo razrezati na zelo majhne koščke s čistim orodjem, po možnosti na ledu, in to čim hitreje, da se prepreči razgradnja s proteazami (npr. pufr za lizo, kot je RIPA, ali hipotonični pufr za lizo, ki vsebuje koktajl zaviralcev proteaze in fosfataze). Po seciranju se vzorec potopi v tekoči dušik za hitro zamrzovanje. Vzorec lahko shranite pri -80 °C za kasnejšo uporabo ali pa ga hranite na ledu za takojšnjo homogenizacijo. Tik pred ultrazvočno ekstrakcijo se v epruveto za vzorec hitro doda pufer za ledeno hladno lizo (z zaviralci proteaze DTT, leupeptin in aprotinin) (na ~ 10 mg tkiva približno ~ 600 μL pufra). Priporočeno je približno 20-60 mg tkiva na vzorčno epruveto.
Ultrazvočna homogenizacija, liza in ekstrakcija se izvaja z ultrazvočnim homogenizatorjem, kot je UP100H ali UP200Ht, opremljen s sonotrodom z mikro konico. Trajanje ultrazvočnega razbijanja je 60-90 sekund v načinu ultrazvočnega cikla 15 sekund ultrazvočnega razbijanja in 10 sekund časa počitka. Vzorec je treba ves čas hraniti v ledu.
Po ultrazvočni homogenizaciji / ekstrakciji se lizat centrifugira pri 27.000 g približno 20 min. Nato se zbere supernatent, tako da se koncentracija beljakovin lahko določi z beljakovinskim testom, kot je Pierceov proteinski test BCA.
Ekstrakcija beljakovin iz krvnega seruma
Za homogeno mešanico seruma in fosfatnega pufra se vzorec najprej vrtinči pred ultrazvočno lizo celic. Za ultrazvočno lizo se vzorec ultrazvočno uniči z ultrazvočnim laboratorijskim homogenizatorjem, kot je UP100H za 8 ciklov pri 20% amplitudi, za cikle vsakih 5 sekund vklopa in 15 sekund izklopa. Ekstrakcija beljakovin se izvede z ultrazvočnim razbijanjem v ciklih (pulzacijskim načinom) in z dajanjem vzorca na led, tako da se prepreči pregrevanje in toplotna razgradnja vzorca. Ker serum vsebuje veliko količino beljakovin z visoko molekulsko maso (kot so albumin, α1-antitripsin, transferin, haptoglobulin, imunoglobulin G in imunoglobulin A), ki vplivajo na ločevanje beljakovin z nizko molekulsko maso med IEF, je priporočljivo, da jih izčrpate iz seruma z uporabo kolone za izčrpanje.
Ekstrakcija beljakovin iz rastlinskega tkiva
Sveže, mehko rastlinsko tkivo, npr. mah itd., je mogoče zlahka prekiniti tako, da sesekljan vzorčni material preprosto položite v pufer za lizo za ultrazvočno razbijanje Težka, ligenozna rastlinska tkiva, kot so semena, jelke itd., Je treba suho zmleti. Nekatere trde, lesne rastlinske materiale je treba zamrzniti in zmleti v tekočem dušiku, preden jih ekstrahiramo z ultrazvočnim razbijanjem. Za suspenzije rastlinskih celičnih kultur večinoma zadostuje ultrazvočna obdelava med 30 in 150 sekundami v pufru za lizo. Močnejši material, kot so bučna semena, zahtevajo intenzivnejšo ultrazvočno razbijanje, kot je opisano spodaj.
Protokol za ultrazvočno ekstrakcijo albumina iz bučnih semen
Za ultrazvočno ekstrakcijo beljakovin albumina iz fino mletega bučnega semena v prahu se v 250 ml stekleni čaši doda 10 g razmaščenega prahu bučnih semen in 100 ml deionizirane vode kot topila. Ekstrakcija beljakovin je sestavljena iz dveh korakov: Prvič, vzorec se ultrazvočno ultrazvočni zvočnik tipa sonde UP400St (400W, 24kHz), opremljen s sonotrodo S24d7. Steklena čaša se med ultrazvočno homogenizacijo postavi v hladno vodno kopel. Vtični temperaturni senzor in nastavitve nadzora temperature ultrazvočnega UP400St zagotavljajo, da je temperatura vzorca vedno pod 30 °C. Z natančnim nadzorom temperature med ultrazvočnim razbijanjem se izognemo denaturaciji albumina. Drugič, ekstrakcija je bila izvedena z mešalnikom pri hitrosti 200 vrt / min in pri 30 °C. Nato se čaša prenese v termostatski stresalnik. Globulin odstranimo z dializo z destilirano vodo. Po odstranitvi globulina se lahko beljakovinski ekstrakt vzorči za določitev albuminskega profila in se nato prilagodi na pI=3,0 z uporabo 0,1 M HCl za koagulacijo albumina. Trdno fazo ločimo s centrifugiranjem pri 5000 g, 20 °C in ponovno raztopimo v deionizirani vodi. Koagulacija albumina se izvede dvakrat, da se poveča razmerje beljakovin v koncentratu albumina.
Ultrazvočna ekstrakcija alkalnih beljakovin za pripravo beljakovinskega koncentrata iz riževih otrobov kaže, da ultrazvočna obdelava povzroči večji donos beljakovin v bistveno krajšem času ekstrakcije – v primerjavi s konvencionalnimi metodami ekstrakcije.
Protokol priprave vzorca za funkcionalni encem iNOS
Za pridobitev popolnoma funkcionalnega encima iNOS (npr. za presejanje zdravil) je priporočljiv naslednji protokol: Celično suspenzijo je treba položiti na led in sonikirati z UP100H pri amplitudi 10 μm v cikličnem načinu 5 sekund ultrazvočne razbijanja in 25 sekund počiva na ledu. Postopek je treba ponoviti približno 3-krat. Čas počitka med cikli ultrazvočnega razbijanja zmanjša dvig temperature in tako zmanjša tveganje za denaturacijo.
ultrazvočna raztapljanje beljakovin
Sonication lahko pospeši proces raztapljanja beljakovin, ki običajno zahteva več ur. Da ne bi pregreli vzorca in preprečili razgradnjo beljakovin in spremembe v raztopinah, ki vsebujejo sečnino, ultrazvočni izbruhi ne smejo trajati dlje kot nekaj sekund.
Ultrazvočni aparat UP200Ht z 2 mm mikrokonico S26d2 za ultrazvočno razbijanje majhnih vzorcev.
Ultrazvočna oprema za ekstrakcijo beljakovin
Hielscher Ultrasonics ponuja široko paleto ultrazvočnih homogenizatorjev za razgradnjo celic, tkiv, bakterij, mikroorganizmov, kvasovk in spor.
Hielscher laboratorijski ultrazvočni aparati so zmogljivi in enostavni za uporabo. Zgrajene so za delovanje 24 ur na dan, 7 dni v tednu, zasnovane pa so kot robustne in učinkovite laboratorijske in namizne naprave. Za vse naprave je mogoče natančno nadzorovati izhodno energijo in amplitudo. Široka paleta dodatne opreme odpira dodatne možnosti nastavitve. Digitalni ultrazvočni aparati, kot so VialTweeter, UP200Ht, UP200St in UP400St, imajo vgrajen nadzor temperature in vgrajeno kartico SD za samodejno snemanje podatkov.
Za posredno ultrazvočno razbijanje več vzorcev brez navzkrižne kontaminacije ponujamo VialTweeter ali ultrazvočni CupHorn.
Spodnja tabela vam daje pregled naših ultrazvočnih aparatov za pripravo vzorcev, motnje celic in ekstrakcijo. Kliknite na vrsto naprave, če želite dobiti več informacij o vsakem ultrazvočnem homogenizatorju. Naše dobro usposobljeno in dolgoletno tehnično osebje vam bo z veseljem pomagalo pri izbiri najprimernejšega ultrazvočnega aparata za pripravo vzorca!
| Obseg serije | Pretok | Priporočene naprave |
|---|---|---|
| do 10 vial ali epruvet | n.a. | VialTweeter |
| Plošče z več jamicami / mikrotitri | n.a. | UIP400MTP |
| več cevi / posod | n.a. | Cuphorn |
| 1 do 500 ml | 10 do 200 ml / min | UP100H |
| 10 do 1000 ml | 20 do 200 ml / min | UP200Ht, UP200St |
| 10 do 2000 ml | 20 do 400 ml / min | UP400St |
Glede na vašo aplikacijo, material in količino vzorca vam bomo priporočili najprimernejšo nastavitev za pripravo vzorca. Kontaktirajte nas še danes!
Kontaktirajte nas! / Vprašajte nas!
Hielscher digitalni ultrazvočni aparati imajo daljinski upravljalnik brskalnika in samodejno protokoliranje podatkov na integrirani kartici SD.
VialTweeter za posredno ultrazvočno razbijanje.
Dejstva, ki jih je vredno vedeti
proteomika
Proteomika je raziskovalno področje, ki raziskuje beljakovine in proteom. Beljakovine izpolnjujejo široko paleto vitalnih funkcij v organizmih. Proteom je celoten niz beljakovin, ki jih v določenem času izraža genom, celica, tkivo ali organizem. Proteom se spreminja s časom in različnimi zahtevami ali stresi, ki jih doživlja celica ali organizem. Natančneje, to je niz izraženih beljakovin v določeni vrsti celice ali organizma v določenem času, pod določenimi pogoji. Izraz je mešanica beljakovin in genoma. Proteomika je študija proteoma.
beljakovina
Beljakovine so velike biomolekule, tako imenovane makromolekule – ki so sestavljene iz ene ali več dolgih verig aminokislinskih ostankov. Beljakovine so prisotne v vseh organizmih rastlinskega in živalskega izvora in so ključne za večino bioloških funkcij. Ker beljakovine vsebujejo veliko bioloških informacij, se ekstrahirajo za analitične namene, npr. za proteomske raziskave. Najpomembnejša funkcija, ki jo opravljajo beljakovine, vključuje katalizo presnovnih reakcij, replikacijo DNA, odziv na dražljaje in transport molekul z ene lokacije na drugo. Beljakovine se med seboj razlikujejo predvsem po zaporedju aminokislin, ki ga narekuje nukleotidno zaporedje njihovih genov in kar običajno povzroči zlaganje beljakovin v specifično tridimenzionalno strukturo, ki določa njegovo aktivnost. Beljakovine so – poleg peptidov – Ena ključnih sestavin hrane. Zato je proteomika močno orodje v znanosti o hrani za optimizacijo procesov, varnosti hrane in ocenjevanja prehrane.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction je predanalitski postopek za ločevanje in predhodno koncentriranje analitov. V kombinaciji z ultrasonication se lahko ekstrakcija točke oblaka okrepi, zaradi česar je postopek učinkovitejši, hitrejši in okolju prijaznejši. Z ultrasonication je ekstrakcija točke oblačnosti bistveno učinkovitejša metoda priprave analita. Preberite več o ultrazvočno podprtem pridobivanju točk oblakov!Gel elektroforeza
Gel elektroforeza je glavna metoda za ločevanje in analizo makromolekul, kot so DNA, RNA in beljakovine, kot tudi njihovih fragmentov, glede na njihovo velikost in naboj. Uporablja se v klinični kemiji za ločevanje beljakovin po naboju in / ali velikosti (IEF agaroza, v bistvu neodvisna od velikosti) in v biokemiji, molekularni biologiji in proteomiki za ločevanje mešane populacije fragmentov DNA in RNA po dolžini, za oceno velikosti fragmentov DNA in RNA ali za ločevanje beljakovin po naboju.
celične kulture
Celična kultura je nadzorovan proces gojenja, s katerim se celice gojijo v nadzorovanih pogojih. Pogoji celične kulture se razlikujejo za vsak tip celice. Na splošno je okolje celične kulture sestavljeno iz primerne posode (npr. Petrijeve vemke) s substratom ali gojiščem, ki zagotavlja esencialna hranila (aminokisline, ogljikove hidrate, vitamine, minerale), rastne faktorje, hormone in pline (CO2, O2) in uravnava fizikalno-kemijsko okolje (pH pufer, osmotski tlak, temperatura). Večina celic potrebuje površinski ali umetni substrat, medtem ko se druge celične kulture lahko gojijo prosto plavajoče v gojišču (suspenzijska kultura, celična suspenzija).
Množične kulture živalskih celičnih linij se uporabljajo v industrijski proizvodnji virusnih cepiv in drugih biotehnološko pridobljenih izdelkov. Človeške matične celice se gojijo, da se razširi število celic in celice diferencirajo v različne vrste somatskih celic za namene presaditve.
Vzorci tkiv
Izraz tkivo opisuje celični vmesni produkt, kjer je celični material na organizacijski ravni med celicami in celotnim organom. V tkivu so sestavljene podobne celice istega izvora, ki skupaj opravljajo določeno funkcijo. S funkcionalnim združevanjem več tkiv se oblikujejo kompleksne strukture organov.
Tkivo se vzorči za raziskave v biologiji, histologiji/histopatologiji, parazitologiji, biokemiji, imunohistokemiji ter za gojenje in ekstrakcijo DNK. Razlikujemo ga lahko med živalskim (pododdelkom: tkivo sesalcev) in rastlinskim tkivom. Živalska tkiva so razvrščena v štiri osnovne vrste vezivnega, mišičnega, živčnega in epitelijskega tkiva. Rastlinsko tkivo je razdeljeno na naslednje tri tkivne sisteme: povrhnjico, talno tkivo in žilno tkivo.
Vzorci tkiva se lahko pripravijo iz živalskih ali rastlinskih delov, npr. kosti, mišice, listi itd.
Telesne tekočine
Kri, serum, plazma, cerebrospinalna tekočina, slina in sinovialna tekočina so telesne tekočine, ki so odličen vir diagnostično pomembnih informacij. Zato je pomembna prefinjena priprava vzorcev telesnih tekočin za analizo. Prva težava je povezana s širokim dinamičnim razponom sestavin, ki so prisotne v telesnih tekočinah.
Določanje koncentracije beljakovin
Bradfordov test, Lowryjev test in test bicynhoninske kisline (BCA) so pogosti testi za določanje koncentracije beljakovin. Goveji serumski albumin (BSA) je eden najpogosteje uporabljenih beljakovinskih standardov.
Pufer za lizo
Pufer za lizo je treba izbrati v skladu s celičnim materialom ali tkivom (tkivna kultura, rastlina, bakterije, glive itd.) ter glede na to, ali so celice v strukturi in vrsti strukture. Široka paleta liznih pufrov za ekstrakcijo beljakovin, membran in organel je formulirana z enim ali več detergenti. Detergent se običajno izbere s testi poskusov in napak ali – če je na voljo – v skladu z obstoječim protokolom ekstrakcije beljakovin. Detergent mora biti združljiv z virom tkiva in beljakovinami. Na splošno je najblažji detergent, ki deluje za določeno tkivo / beljakovino, izbran zato, da se ohrani maksimalna funkcionalnost ekstrakta. Poleg tega v primeru ekstrakcije membran in organel blag detergent ohranja membrano nedotaknjeno. Pogosto uporabljeni detergenti v pufrih za lizo so večinoma neionski ali zwitterionski, npr. CHAPS, deoksiholat, Triton™ X-100, NP40 in Tween 20.
Na primer, tkiva, kot so možgani, jetra, črevesje, ledvice, vranica itd., Se lahko preprosto popustijo z RIPA – vendar pa je treba vključiti zaviralce proteaze in DTT (npr. za gel elektroforezo).
Pufer za lizo skeletnega mišičnega tkiva (ledeno hladen): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (m/v) glicerol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol dopolnjen s koktajlom zaviralcev proteaze in fosfataze
Tabela skupnih pufrov in njihov pH razpon. Na splošno se ti pufri običajno uporabljajo v koncentracijah 20-50 mM.
| Medpomnilnik | Območje pH |
|---|---|
| Citronska kislina – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Natrijev citrat – Citronska kislina | 3.0 – 6.2 |
| Natrijev acetat – ocetna kislina | 3.6 – 5.6 |
| Natrijeva sol kakodilne kisline – Hcl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Natrijev dihidrogenfosfat – dinatrijev hidrogenfosfat | 5.8 – 8.0 |
| Imidazol – Hcl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Trietanolamin hidroklorid – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – Hcl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Natrijev tetraborat – borova kislina | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| Glicin – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Večina pufrov kaže odvisnost od pH temperature. To še posebej velja za blažilnike Tris. pKa se spremeni z 8,06 pri 25 °C na 8,85 pri 0 °C.
(pH in pKa pufra: pH meri koncentracijo vodikovih ionov v vodni raztopini. pKa (= konstanta disociacije kisline) je povezana, vendar bolj specifična merila, saj pomaga napovedati, kako bo molekula delovala pri določeni vrednosti pH.)
TRIzol
TRIzol je kemična raztopina, ki se uporablja za ekstrakcijo RNA/DNA/beljakovin med ekstrakcijo gvanidinijev tiocianat-fenol-kloroform. Uporaba ultrazvočno podprte ekstrakcije TRIzola ima za posledico visoke donose DNA, RNA in beljakovin iz istega vzorca in s tem izstopa z drugimi metodami ekstrakcije.
Literatura/Reference
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.