Ultrazvočna ekstrakcija beljakovin iz tkiv in celičnih kultur
- Ekstrakcija beljakovin je bistven korak priprave vzorcev v proteomiki.
- Beljakovine je mogoče ekstrahirati iz rastlinskih in živalskih tkiv, kvasovk in mikroorganizmov.
- Sonikacija je zanesljiva in učinkovita metoda ekstrakcije beljakovin, ki zagotavlja visoke izkoristke beljakovin v kratkem času ekstrakcije.
Ekstrakcija beljakovin iz tkiv in celic
Ekstrakcija beljakovin iz tkiv in gojenih celic je bistven korak priprave vzorcev, ki se izvaja pri številnih biokemijskih in analiznih tehnikah, kot so ELISA, PAGE, prenos western, masna spektrometrija ali čiščenje beljakovin. Ultrazvočna razgradnja celic, liza in ekstrakcija so natančno obvladljiva, netermična tehnika za zagotavljanje visokih izkoristkov beljakovin.
Ekstrakcija beljakovin iz celic z ultrazvočno sondo UP200St
- Hitrost
- Visoki izkoristki
- Visoka učinkovitost
- Natančen nadzor parametrov
- Ponovljivi rezultati
- Linearno povečevanje obsega
Splošna navodila za ultrazvočno lizo in ekstrakcijo beljakovin
- Nadzor temperature: Za zagotavljanje visokega izkoristka beljakovin brez toplotne denaturacije je treba med ekstrakcijo nadzorovati temperaturo. Najsodobnejši ultrazvočni homogenizatorji Hielscher – imenovani tudi ultrazvočni dezintegratorji ali sonikatorji – omogočajo natančen nadzor. Opremljeni so s priključljivim temperaturnim tipalom. V nastavitvah ultrazvočnega homogenizatorja je mogoče določiti najvišjo temperaturo. Ko je ta najvišja temperatura dosežena, se ultrazvočna naprava samodejno ustavi, dokler se vzorec ne ohladi.
- Pufer: Izbira ustreznega pufra in njegove ustrezne prostornine se razlikuje glede na tkivo ter jo je treba določiti s preizkušanjem po metodi poskusov in napak.
- Izolacija / čiščenje: Beljakovinski lizati lahko vsebujejo presežek biomolekul, kot so DNA ali ogljikovi hidrati, ki jih je mogoče odstraniti z obarjanjem beljakovin (deoksiholat–trikloroocetna kislina) ali zamenjavo pufra.
Chittapalo in Noomhorm (2009) sta v svoji raziskavi poročala, da se je izkoristek beljakovin z uporabo sonikacije povečal in da lahko postopek ultrazvočne homogenizacije in lize tkiv znatno izboljša obstoječe postopke ekstrakcije – s tem pa omogoči nove možnosti komercialne ekstrakcije.
Ultrazvočni CupHorn za sočasno, zelo učinkovito pripravo več vzorcev pod enakimi pogoji za izolacijo beljakovin in fragmentacijo DNA.
Ekstrakcija beljakovin iz živalskih tkiv
Za pripravo tkiva v celoti (npr. ledvice, srca, pljuč, mišice itd.) je treba tkivo s čistimi pripomočki razrezati na zelo majhne koščke, po možnosti na ledu in čim hitreje, da se prepreči razgradnja s proteazami (npr. lizni pufer, kot je RIPA, ali hipotonični lizni pufer, ki vsebuje mešanico inhibitorjev proteaz in fosfataz). Po razrezu se vzorec potopi v tekoči dušik za hitro zamrzovanje. Vzorec je mogoče shraniti pri -80°C za poznejšo uporabo ali ga hraniti na ledu za takojšnjo homogenizacijo. Neposredno pred ultrazvočno ekstrakcijo se v epruveto z vzorcem hitro doda ledeno hladen lizni pufer (z inhibitorji proteaz DTT, levpeptinom in aprotininom) (na ~10 mg tkiva se priporoča približno ~600 μL pufra). Na epruveto z vzorcem se priporoča približno 20–60mg tkiva.
Ultrazvočna homogenizacija, liza in ekstrakcija se izvajajo z ultrazvočnim homogenizatorjem, kot je UP100H ali UP200Ht, opremljenim s sonotrodo z mikrokonico. Sonikacija traja 60–90 s v ultrazvočnem cikličnem načinu s 15 s sonikacije in 10 s premora. Vzorec je treba ves čas hraniti v ledu.
Po ultrazvočni homogenizaciji / ekstrakciji se lizat centrifugira pri 27.000g približno 20 min. Nato se zbere supernatant, da se lahko koncentracija beljakovin določi z metodo za določanje beljakovin, kot je metoda Pierce BCA.
Ekstrakcija beljakovin iz krvnega seruma
Za homogeno zmes seruma in fosfatnega pufra se vzorec pred ultrazvočno lizo celic najprej premeša na vrtinčnem mešalniku. Za ultrazvočno lizo se vzorec sonificira z ultrazvočnim laboratorijskim homogenizatorjem, kot je UP100H, v 8 ciklih pri 20% amplitudi, pri čemer vsak cikel obsega 5 sekund delovanja in 15 sekund premora. Ekstrakcija beljakovin se izvaja s sonikacijo v ciklih (pulzni način) in s postavitvijo vzorca na led, da se preprečita pregrevanje in toplotna razgradnja vzorca. Ker serum vsebuje veliko beljakovin z visoko molekulsko maso (kot so albumin, α1-antitripsin, transferin, haptoglobulin, imunoglobulin G in imunoglobulin A), ki med IEF motijo ločevanje beljakovin z nizko molekulsko maso, jih je priporočljivo odstraniti iz seruma z uporabo kolone za odstranjevanje teh beljakovin.
Ekstrakcija beljakovin iz rastlinskih tkiv
Sveže, mehko rastlinsko tkivo, npr. mah itd., je mogoče preprosto razgraditi tako, da se sesekljani vzorčni material za sonikacijo vstavi v lizni pufer. Trdo, olesenelo rastlinsko tkivo, kot so semena, jelove iglice itd., je treba zmleti na suho. Nekatere trde, olesenele rastlinske materiale je treba pred ekstrakcijo s sonikacijo zamrzniti in zmleti v tekočem dušiku. Za suspenzije rastlinskih celičnih kultur večinoma zadostuje ultrazvočna obdelava v liznem pufru, ki traja od 30 do 150 sekund. Trši material, kot so bučna semena, zahteva intenzivnejšo sonikacijo, kot je opisano spodaj.
Protokol za ultrazvočno ekstrakcijo albumina iz bučnih semen
Za ultrazvočno ekstrakcijo beljakovine albumina iz fino zmletega prahu bučnih semen se v 250mL stekleno čašo doda 10 g razmaščenega prahu bučnih semen in 100 mL deionizirane vode kot topila. Ekstrakcija beljakovin obsega dva koraka: najprej se vzorec sonificira z ultrazvočno napravo s sondo UP400St (400W, 24kHz), opremljeno s sonotrodo S24d7. Med ultrazvočno homogenizacijo je steklena čaša postavljena v hladno vodno kopel. Priključljivo temperaturno tipalo in nastavitve nadzora temperature ultrazvočne naprave UP400St zagotavljajo, da temperatura vzorca vedno ostane pod 30°C. Natančen nadzor temperature med sonikacijo preprečuje denaturacijo albumina. V drugem koraku je bila ekstrakcija izvedena z mešalnikom pri hitrosti 200 rpm in pri 30°C. Nato se čaša prenese v termostatski stresalnik. Globulin se odstrani z dializo z destilirano vodo. Po odstranitvi globulina je mogoče odvzeti vzorec beljakovinskega ekstrakta za določitev profila albumina, nato pa se ekstrakt z uporabo 0,1 M HCl prilagodi na pI=3,0 za koagulacijo albumina. Trdna faza se loči s centrifugiranjem pri 5000g in 20°C ter ponovno raztopi v deionizirani vodi. Koagulacija albumina se izvede dvakrat, da se poveča delež beljakovin v albuminskem koncentratu.
Ultrazvočna alkalna ekstrakcija beljakovin za pripravo beljakovinskega koncentrata iz riževih otrobov kaže, da ultrazvočna obdelava zagotavlja višji izkoristek beljakovin v znatno krajšem času ekstrakcije – v primerjavi s konvencionalnimi metodami ekstrakcije.
Protokol priprave vzorcev za funkcionalni encim iNOS
Za pridobitev popolnoma funkcionalnega encima iNOS (npr. za presejanje zdravil) se priporoča naslednji protokol: celično suspenzijo je treba postaviti na led in jo sonificirati z UP100H pri amplitudi 10µm v cikličnem načinu s 5 s sonikacije in 25 s premora na ledu. Postopek je treba ponoviti približno 3-krat. Premor med cikli sonikacije zmanjša dvig temperature in s tem tudi tveganje denaturacije.
Ultrazvočna solubilizacija beljakovin
Sonikacija lahko pospeši postopek solubilizacije beljakovin, ki običajno traja več ur. Da se vzorec ne pregreje ter da se preprečijo razgradnja in spremembe beljakovin v raztopinah, ki vsebujejo sečnino, ultrazvočni impulzi ne smejo trajati dlje kot nekaj sekund.
Ultrazvočna naprava UP200Ht z 2mm mikrokonico S26d2 za sonikacijo majhnih vzorcev.
Ultrazvočna oprema za ekstrakcijo beljakovin
Hielscher Ultrasonics ponuja širok nabor ultrazvočnih homogenizatorjev za razgradnjo celic, tkiv, bakterij, mikroorganizmov, kvasovk in spor.
Laboratorijske ultrazvočne naprave Hielscher so zmogljive in preproste za uporabo. Izdelane so za delovanje 24/7 in zasnovane kot robustne ter učinkovite laboratorijske in namizne naprave. Pri vseh napravah je mogoče natančno nadzorovati oddano energijo in amplitudo. Širok nabor dodatne opreme omogoča nadaljnje možnosti konfiguracije. Digitalne ultrazvočne naprave, kot so VialTweeter, UP200Ht, UP200St in UP400St, imajo vgrajen nadzor temperature in vgrajeno kartico SD za samodejno beleženje podatkov.
Za posredno in sočasno sonikacijo več vzorcev brez navzkrižne kontaminacije ponujamo VialTweeter ali ultrazvočni CupHorn.
Spodnja tabela prikazuje pregled naših ultrazvočnih naprav za pripravo vzorcev, razgradnjo celic in ekstrakcijo. Kliknite vrsto naprave za več informacij o posameznem ultrazvočnem homogenizatorju. Naše dobro usposobljeno tehnično osebje z dolgoletnimi izkušnjami vam bo z veseljem pomagalo izbrati najprimernejšo ultrazvočno napravo za pripravo vaših vzorcev!
| Prostornina šarže | Pretok | Priporočene naprave |
|---|---|---|
| do 10 vial ali epruvet | n.a. | VialTweeter |
| plošče z več vdolbinicami / mikrotitrske plošče | n.a. | UIP400MTP |
| več epruvet / posod | n.a. | CupHorn |
| od 1 do 500mL | od 10 do 200mL/min | UP100H |
| od 10 do 1000mL | od 20 do 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| od 10 do 2000mL | od 20 do 400mL/min | UP400St |
Glede na vašo uporabo, material in prostornino vzorca vam bomo priporočili najprimernejšo konfiguracijo za pripravo vaših vzorcev. Stopite v stik z nami še danes!
Stopite v stik z nami! / Vprašajte nas!
Digitalne ultrazvočne naprave Hielscher omogočajo daljinsko upravljanje prek brskalnika in samodejno beleženje podatkov na vgrajeno kartico SD.
VialTweeter za posredno sonikacijo.
Koristna dejstva
Proteomika
Proteomika je raziskovalno področje, ki preučuje beljakovine in proteom. Beljakovine v organizmih opravljajo številne življenjsko pomembne funkcije. Proteom je celoten nabor beljakovin, ki jih genom, celica, tkivo ali organizem izraža v določenem trenutku. Proteom se spreminja s časom in glede na različne zahteve ali stresne razmere, ki jim je izpostavljena celica ali organizem. Natančneje, je nabor izraženih beljakovin v določeni vrsti celice ali organizma v določenem trenutku in pod opredeljenimi pogoji. Izraz je sestavljen iz besed protein in genom. Proteomika je preučevanje proteoma.
Beljakovina
Beljakovine so velike biomolekule, tako imenovane makromolekule – sestavljene iz ene ali več dolgih verig aminokislinskih ostankov. Beljakovine so prisotne v vseh organizmih rastlinskega in živalskega izvora ter so ključne za večino bioloških funkcij. Ker beljakovine vsebujejo veliko bioloških informacij, jih ekstrahiramo za analizne namene, npr. za proteomske raziskave. Najpomembnejše funkcije beljakovin vključujejo katalizo presnovnih reakcij, podvojevanje DNA, odzivanje na dražljaje in prenos molekul z enega mesta na drugo. Beljakovine se med seboj razlikujejo predvsem po zaporedju aminokislin, ki ga določa nukleotidno zaporedje njihovih genov in ki običajno vodi do zvijanja beljakovine v specifično tridimenzionalno strukturo, ki določa njeno aktivnost. Beljakovine so – poleg peptidov – ena ključnih sestavin hrane. Zato je proteomika zmogljivo orodje v živilski znanosti za optimizacijo procesov, varnosti živil in prehranskega vrednotenja.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction je predanalizni postopek za ločevanje in predkoncentriranje analitov. V kombinaciji z ultrazvočno obdelavo je mogoče ekstrakcijo pri točki motnosti intenzivirati, s čimer postane postopek učinkovitejši, hitrejši in okolju prijaznejši. Z ultrazvočno obdelavo je ekstrakcija pri točki motnosti znatno učinkovitejša metoda priprave analitov. Preberite več o ultrazvočno podprti ekstrakciji pri točki motnosti!
Gelska elektroforeza
Gelska elektroforeza je glavna metoda za ločevanje in analizo makromolekul, kot so DNA, RNA in beljakovine, ter njihovih fragmentov na podlagi njihove velikosti in naboja. V klinični kemiji se uporablja za ločevanje beljakovin glede na naboj in/ali velikost (IEF v agarozi, v osnovi neodvisno od velikosti), v biokemiji, molekularni biologiji in proteomiki pa za ločevanje mešane populacije fragmentov DNA in RNA glede na dolžino, za oceno velikosti fragmentov DNA in RNA ali za ločevanje beljakovin glede na naboj.
Celične kulture
Gojenje celičnih kultur je nadzorovan proces rasti, pri katerem se celice gojijo pod nadzorovanimi pogoji. Pogoji gojenja celičnih kultur se razlikujejo glede na vrsto celic. Na splošno okolje celične kulture sestavlja ustrezna posoda (npr. petrijevka) s substratom ali gojiščem, ki zagotavlja bistvena hranila (aminokisline, ogljikove hidrate, vitamine, minerale), rastne dejavnike, hormone in pline (CO2, O2) ter uravnava fizikalno-kemijsko okolje (pufer za pH, osmotski tlak, temperaturo). Večina celic potrebuje površino ali umetni substrat, druge celične kulture pa je mogoče gojiti tako, da prosto plavajo v gojišču (suspenzijska kultura, celična suspenzija).
Obsežne kulture živalskih celičnih linij se uporabljajo pri industrijski proizvodnji virusnih cepiv in drugih biotehnološko pridobljenih izdelkov. Človeške matične celice se gojijo za povečanje števila celic in njihovo diferenciacijo v različne vrste somatskih celic za presaditev.
Vzorci tkiv
Izraz tkivo opisuje vmesno celično organizacijsko raven, na kateri je celični material med posameznimi celicami in celotnim organom. V tkivu so združene podobne celice istega izvora, ki skupaj opravljajo določeno funkcijo. S funkcionalnim združevanjem več tkiv nastanejo kompleksne strukture organov.
Vzorci tkiv se odvzemajo za raziskave v biologiji, histologiji/histopatologiji, parazitologiji, biokemiji in imunohistokemiji ter za gojenje tkiv in ekstrakcijo DNA. Razlikujemo med živalskim tkivom (podskupina: tkivo sesalcev) in rastlinskim tkivom. Živalska tkiva so razvrščena v štiri osnovne vrste: vezivno, mišično, živčno in epitelijsko tkivo. Rastlinsko tkivo se deli na naslednje tri tkivne sisteme: povrhnjico, osnovno tkivo in prevodno tkivo.
Vzorce tkiv je mogoče pripraviti iz živalskih ali rastlinskih delov, npr. kosti, mišic, listov itd.
Telesne tekočine
Kri, serum, plazma, cerebrospinalna tekočina, slina in sinovijska tekočina so telesne tekočine, ki so odličen vir diagnostično pomembnih informacij. Zato je pomembna skrbno zasnovana priprava vzorcev telesnih tekočin za analizo. Prva težava je povezana s širokim dinamičnim razponom sestavin, prisotnih v telesnih tekočinah.
Določanje koncentracije beljakovin
Bradfordova metoda, Lowryjeva metoda in metoda z bicinhoninsko kislino (BCA) so običajne metode za določanje koncentracije beljakovin. Goveji serumski albumin (BSA) je eden najpogosteje uporabljenih beljakovinskih standardov.
Lizni pufer
Lizni pufer je treba izbrati glede na celični material ali tkivo (tkivna kultura, rastlina, bakterije, glive itd.) ter glede na to, ali so celice v strukturi in za kakšno strukturo gre. Številni lizni pufri za ekstrakcijo beljakovin, membran in organelov so pripravljeni z enim ali več detergenti. Detergent se običajno izbere s preizkušanjem po metodi poskusov in napak ali – če je na voljo – v skladu z obstoječim protokolom ekstrakcije beljakovin. Detergent mora biti združljiv z izvornim tkivom in beljakovinami. Na splošno se izbere najblažji detergent, ki deluje pri določenem tkivu / beljakovini, da se ohrani največja možna funkcionalnost ekstrakta. Poleg tega blag detergent pri ekstrakciji membran in organelov ohrani membrano nepoškodovano. Pogosto uporabljeni detergenti v liznih pufrih so večinoma neionski ali zwitterionski, npr. CHAPS, deoksiholat, Triton™ X-100, NP40 in Tween 20.
Tkiva, kot so možgani, jetra, črevesje, ledvice, vranica itd., je na primer mogoče preprosto pufrirati z RIPA – vendar je treba vključiti inhibitorje proteaz in DTT (npr. za gelsko elektroforezo).
Lizni pufer za tkivo skeletnih mišic (ledeno hladen): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glicerola, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitola z dodatkom mešanice inhibitorjev proteaz in fosfataz
Tabela običajnih pufrov in njihovega območja pH. Na splošno se ti pufri običajno uporabljajo v koncentracijah 20–50 mM.
| Pufer | Območje pH |
|---|---|
| Citronska kislina – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Natrijev citrat – citronska kislina | 3,0 – 6,2 |
| Natrijev acetat – ocetna kislina | 3,6 – 5,6 |
| Natrijeva sol kakodilne kisline – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Natrijev dihidrogenfosfat – dinatrijev hidrogenfosfat | 5,8 – 8,0 |
| Imidazol – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Trietanolamin hidroklorid – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricin – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Natrijev tetraborat – borova kislina | 7,6 – 9,2 |
| Bicin – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glicin – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Pri večini pufrov je pH odvisen od temperature. To še posebej velja za pufre Tris. pKa se spremeni z 8,06 pri 25°C na 8,85 pri 0°C.
(pH in pKa pufra: pH meri koncentracijo vodikovih ionov v vodni raztopini. pKa (= konstanta disociacije kisline) je povezana, vendar bolj specifična mera, saj pomaga napovedati, kako se bo molekula obnašala pri določeni vrednosti pH.)
TRIzol
TRIzol je kemična raztopina, ki se uporablja za ekstrakcijo RNA/DNA/beljakovin med ekstrakcijo z gvanidinijevim tiocianatom, fenolom in kloroformom. Uporaba ultrazvočno podprte ekstrakcije s TRIzol zagotavlja visoke izkoristke DNA, RNA in beljakovin iz istega vzorca ter s tem prekaša druge metode ekstrakcije.
Literatura/Reference
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.