Ultrazvočni Beljakovine Ekstrakcija iz tkiva in celičnih kultur
- ekstrakcija proteinov je bistvena priprava vzorcev korak proteomike.
- Proteini lahko ekstrahiramo iz rastlinskega in živalskega tkiva, kvasovke in mikroorganizmov.
- Ultrazvoka je zanesljiva, učinkovita metoda za ekstrakcijo proteinov daje visoke donose beljakovin v kratkem času ekstrakcije.
Ekstrakcija beljakovin iz tkiv in celic
Ekstrakcija beljakovin iz tkiv in kulturnih celic je bistven korak priprave vzorca, ki se izvaja v številnih biokemičnih in analitičnih tehnikah, kot so ELISA, PAGE, Zahodno napihnjenost, masna spektrometrija ali čiščenje beljakovin. Ultrazvočna motnja celic, liza in ekstrakcija je natančno kontrolirana, netermalna tehnika, ki zagotavlja visoke donose beljakovin.
Ekstrakcija beljakovin iz celic z ultrazvočna sonda UP200St
- hitro
- visoki donosi
- visoko učinkovite
- Natančen nadzor nad parametri
- ponovljive rezultate
- linearna razširljivost
Splošna navodila za ultrazvočno lizo in ekstrakcijo beljakovin
- Regulacija temperature: Da se zagotovi visok izkoristek beljakovin brez toplotne denaturacije, mora temperatura ekstrakcije je pod nadzorom. Hielscher je state-of-art ultrazvočni homogenizers – imenujemo tudi ultrazvočni deztegrator ali ultrasonifier – so natančno nadzorovati. Prihajajo s senzorjem plugable temperature. V možnosti nastavitev v ultrazvočno homogenizator, lahko najvišja temperatura nastavljena. Ko je dosežena ta temperatura max je ultrasonicator samodejno ustavi, dokler se vzorec ohladi.
- Medpomnilnik: Lastni izbor ustreznega pufra in desni volumnu pufra razlikuje od tkiva do tkiva in morajo biti pogruntal, ki jih testiranje poskusov in napak.
- Izolacijski / čistilni postopek: Protein lizate lahko vsebuje prebitek biomolekul, kot so DNA ali ogljikovih hidratov, ki jih lahko odstranimo z aktivnostjo protein obarjanja (deoksiholata-triklorocetna kislina) ali pufer izmenjavo.
Chittapalo in Noomhorm (2009) sta v svoji študiji poročala, da se je donos beljakovin povečal z uporabo sonikacije in da lahko ultrazvočni proces homogenizacije in lize tkiv znatno poveča obstoječe procese ekstrakcije – omogočajo nove poslovne priložnosti za ekstrakcijo.
Ultrazvočni cuphorn za sočasno, zelo učinkovito pripravo vzorca več vzorcev pod enakimi pogoji za izolacijo beljakovin in fragmentacijo DNA.
ekstrakcija proteinov iz živalskega tkiva
Za pripravo celotnega tkiva (npr. Ledvic, srca, pljuč, mišic itd.) Je treba tkivo razrezati na zelo majhne koščke s čistimi orodji, po možnosti na led in v najkrajšem možnem času, da preprečimo razgradnjo s proteazami (npr. liza pufer, kot je RIPA ali hipotonski lizinski pufer, ki vsebuje proteazo in koktail inhibitorja fosfataze). Po disekciji se vzorec potopi v tekoči dušik za zamrznitev. Vzorec se lahko shrani pri -80 ° C za poznejšo uporabo ali pa se zavije na ledu za takojšnjo homogenizacijo. Takoj pred ultrazvočno ekstrakcijo se v cev za vzorce hitro dodaja ledeno mrzlični pufer za lizo (z zaviralci proteaze DTT, leupeptin in aprotinin) (priporočamo približno 10 mg tkiva približno 600 μl puferja). Približno Priporočeno je 20-60 mg tkiva na cev vzorca.
Ultrazvočna homogenizacija, lyza in ekstrakcija se izvaja z ultrazvočnim homogenizerjem, kot je UP100H ali UP200Ht, opremljen z mikro-konico sonotrode. Sonication trajanje je 60-90 sek. na ultrazvočni cikel način 15 sek. sonication in 10 sek. počitek. Vzorec je treba ves čas hraniti v ledu.
Po ultrazvočni homogenizacijo / ekstrakcijo se lizat centrifugiramo pri 27,000g pribl. 20 min. Nato se supernatanta zberemo, tako da je mogoče koncentracijo proteina lahko določimo s testom proteina kot Pierce proteina analiznega BCA.
ekstrakcija proteinov iz krvnem serumu
Za homogeno mešanico seruma in fosfatnega pufra se vzorec najprej vrtinči pred ultrazvočno celično lizo. Za ultrazvočno lizo je vzorec sonikiran z ultrazvočnim laboratorijskim homogenizatorjem, kot je UP100H za 8 ciklov pri 20% amplitudi, za cikle vsakih 5 sekund in 15 sekund izklopa. Ekstrakcija beljakovin se izvede s sonikiranjem v ciklih (način pulziranja) in z dajanjem vzorca na led, tako da se preprečita pregrevanje in toplotna razgradnja vzorca. Ker serum vsebuje veliko količino beljakovin z visoko molekulsko maso (kot so albumin, α1-antitripsin, transferrin, haptoglobulin, imunoglobulin G in imunoglobulin A), ki vplivajo na ločevanje beljakovin z nizko molekulsko maso med IEF, je priporočljivo, da jih izčrpate iz seruma s pomočjo koleče za izčrpavanje.
ekstrakcija proteinov iz rastlinskega tkiva
Sveže, mehko rastlinsko tkivo, npr mahovi itd se lahko zlahka zmoti preprosto dajanje narezano vzorčnega materiala v liznega pufra za sonikacijo. Tough, ligenous rastlinskega tkiva, kot so semena, jelka igle itd, naj se zemlja suha. Nekateri trde, lesenih rastlinski materiali morajo biti zamrznjeni in zmleti v tekočem dušiku, preden ekstrahiramo s sonikacijo. Za suspenzij rastlinska celica kulture, ultrazvočno obdelavo med 30 in 150 sekund v pufru za lizo je večinoma zadošča. Doslednejše material, kot so bučna semena zahteva bolj intenzivno sonikacijo, kot je opisano spodaj.
Protokol za ultrazvočno ekstrakcijo albumina iz bučnih semen
Za ultrazvočno ekstrakcijo albumina iz fino zmletega bučnega seme v prahu se doda 10 g odmaščenega bučnega seja v prahu in 100 ml deionizirane vode kot vehikla v steklenem 250mL kozarcu. Ekstrakcija beljakovin sestoji v dveh korakih: Najprej se vzorec sonicije z ultrazvočnikator tipa sonde UP400St (400W, 24kHz), opremljen s sonotrodo S24d7. Steklena čaša se postavi v hladno vodno kopel med ultrazvočno homogenizacijo. Vtični temperaturni senzor in nastavitve nadzora temperature ultrasonicator UP400St zagotavljajo, da je temperatura vzorca vedno pod 30 ° C. Z natančnim nadzorom temperature med ultrazvočno razbijanjem se izognemo denaturaciji albumina. Drugič, ekstrakcija je bila izvedena z mešalnikom pri hitrosti 200 vrt / min in pri 30 ° C. Nato čašo prenesemo v termostatski stresalnik. Globulin odstranimo z dializo z destilirano vodo. Po odstranitvi globulina lahko beljakovinski ekstrakt vzorčimo za določitev profila albumina in ga nato prilagodimo na pI = 3,0 z uporabo 0,1 M HCl za koagulacijo albumina. Trdno fazo ločimo s centrifugiranjem pri 5000 g, 20 °C in ponovno raztopimo v deionizirani vodi. Koagulacijo albumina izvajamo dvakrat, da povečamo razmerje beljakovin v koncentratu albumina.
Ultrazvočni alkalna ekstrakcijska proteina za pripravo koncentrata proteina iz riževih otrobov kaže, da so ultrazvočni rezultati zdravljenja v visokem dobitku proteina v bistveno krajšem času ekstrakcije – v primerjavi z običajnimi metodami pridobivanja.
Priprava vzorcev protokol za funkcionalno iNOS encima
Za pridobitev popolnoma funkcionalnega iNOS encima (npr. za presejal drog) je priporočljiv naslednji protokol: Suspenzija celic je treba dajati na led in se sonicira z UP100H na 10μm amplitude v ciklovnem načinu 5 sek. sonication in 25 sec. počiva na ledu. Postopek je treba ponoviti približno 3-krat. Čas počitka med sonication cikli zmanjšuje dvig temperature in bo zato zmanjšal tveganje za denaturacijo.
Ultrazvočni Beljakovine topljenja
Ultrazvoka lahko pospešijo Solubilizacijski postopek protein, ki običajno zahteva nekaj ur. Da ne pregreje vzorca in preprečijo degradacijo proteinov ter spremembe v raztopinah, ki vsebujejo sečnino, so ultrazvočni razpoči naj ne trajajo dlje kot nekaj sekund.
Ultrasonicator UP200Ht z 2mm mikrotip S26d2 za sonication majhnih vzorcev.
Ultrasonic Oprema za Protein Extraction
Hielscher Ultrazvočna ponujajo široko paleto ultrazvočnih homogenizers za dezintegracijo celic, tkiv, bakterij, mikroorganizmov, kvasovk in spor.
Hielscher laboratorij ultrasonicators so močni in enostavni za uporabo. Zgrajeni za 24/7 delovanje, so zasnovani kot robustne in učinkovite laboratorijske in klopne naprave. Za vse naprave je mogoče natančno nadzorovati izhodno energijo in amplitudo. Širok nabor dodatne opreme odpira nadaljnje možnosti nastavitve. Digitalni ultrazvočniki, kot so VialTweeter, UP200Ht, UP200St in UP400St, imajo integriran nadzor temperature in vgrajeno SD kartico za samodejno snemanje podatkov.
Za posredno, navzkrižno kontaminacijo brez in hkratno sonication več vzorcev, vam ponujamo VialTweeter ali ultrazvočni CupHorn.
Spodnja tabela vam daje pregled nad našimi ultrasonicatorji za pripravo vzorca, motnje celic in ekstrakcijo. Kliknite na vrsto naprave, da bi dobili več informacij o vsakem ultrazvočnem homogenizerju. Naše dobro usposobljene in dolgotrajne izkušnje tehnično osebje vam bo z veseljem pomagalo pri izbiri najbolj primernega ultrasonicatorja za pripravo vzorca!
| serija Volume | Pretok | Priporočena naprave |
|---|---|---|
| do 10 vial ali cevi | ni podatkov | VialTweeter |
| multiwell / mikrotiter plošče | ni podatkov | UIP400MTP |
| več cevi / plovil | ni podatkov | Cuphorn |
| 1 do 500ml | 10 do 200 ml / min | UP100H |
| 10 do 1000mL | 20 do 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 do 2000 ml | 20 do 400ml / min | UP400St |
Glede na vašo prijavo, materiala in volumen vzorca, vam bomo priporočamo najprimernejše nastavitve za svoj vzorec prep. Pišite nam danes!
Kontaktiraj nas! / Vprašajte nas!
Hielscher digitalni ultrasonicatorji imajo daljinski upravljalnik brskalnika in samodejno protokoliranje podatkov na integrirani SD-kartici.
VialTweeter za posredno ultrazvočno razbijanje.
Dejstva je treba vedeti
proteomika
Proteomika je področje raziskav, ki raziskuje proteine in proteoma. Beljakovine fullfil široko paleto vitalnih funkcij v organizme. Proteoma je celoten sklop proteinov z genom, celice, tkiva ali organizma, izraženih v določenem času. Proteoma spreminja s časom in različne zahteve, ali poudarja, da je celica ali organizem podvržen. Natančneje, je množica izraženih proteinov v danem tipu celice ali organizma, v določenem času, v določenih pogojih. Izraz je mešanica beljakovin in genoma. Proteomika je študija proteoma.
Beljakovine
Beljakovine so se veliki biomolekul, tako imenovani makromolekule – ki so sestavljene iz ene ali več dolgih verig aminokislinskih ostankov. Beljakovine so prisotne v vseh organizmih rastlinskega in živalskega izvora in so bistvenega pomena za večino bioloških funkcij. Ker beljakovine vsebujejo veliko bioloških podatkov, jih izvlečemo za analitične namene, npr. Za proteomske raziskave. Najpomembnejša funkcija, ki jo izvajajo proteini, je kataliza metabolnih reakcij, replikacije DNA, odziv na dražljaje in transport molekul z ene lokacije na drugo. Proteini se med seboj razlikujejo predvsem v svoji sekvenci aminokislin, kar narekuje nukleotidna sekvenca njihovih genov in ki običajno povzroči, da se zlitje proteinov v specifično tridimenzionalno strukturo, ki določa njegovo delovanje. Beljakovine so – poleg peptidi – eden od ključnih sestavin hrane. Zato, proteomika je močno orodje v znanosti hrane za optimizacijo procesov, varnosti hrane in prehranske ocenjevanja.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction je pred analitični postopek za ločevanje in predhodno konetratsko analizo. V kombinaciji z ultrasonication, lahko ekstrakcijo oblaka točko se lahko intenzivneje proces učinkovitejši, hitrejši in okolju prijaznejši. Z ultrasonikacijo je ekstrakcija oblakov bistveno učinkovitejša metoda priprave analit. Preberite več o ultrazvočno podprti ekstrakciji točke oblaka!gel Electrophoresis
Gel elektroforeza je glavni Postopek za ločitev in analizo makromolekul kot so DNA, RNA in proteinov ter njihovih fragmentov, glede na njihovo velikost in naboja. Uporablja se v klinični kemiji za ločevanje proteinov pristojbine in / ali velikosti (IEF agaroze v bistvu velikost neodvisna) in biokemije, molekularne biologije in proteomika ločiti z mešano populacijo fragmentov DNA in RNA z dolžino, za oceno velikosti DNA in RNK fragmente ali za ločevanje proteinov s naboja.
celične kulture
Celične kulture je pod nadzorom narašča postopek, pri katerem se celice gojijo pod nadzorovanimi pogoji. Pogoji celičnih kultur razlikuje za vsak celični tip. Na splošno je okolje v celični kulturi sestavljajo primerno posodo (npr petrijevko) s substratom ali mediju, ki oskrbuje bistvenih hranil (aminokisline, ogljikovi hidrati, vitamini, minerali), rastni faktorji, hormoni, in plini (CO2, The2) In ureja fizikalno-kemijskega okolja v (pH pufer osmotski tlak, temperatura). Večina celic potrebujemo površino ali umetnega substrata, medtem ko se druge celične kulture lahko gojijo prosti zaplaval gojišča (suspenzijski kulturi, celične suspenzije).
Množične kulture linij živalskih celic se uporabljajo v industrijski proizvodnji virusnih cepiv in drugih biotehnološko pridobljenih proizvodov. človeških izvornih celic gojimo za povečanje števila celic in razlikovanje celic v različnih somatskih celičnih tipov zaradi presaditve.
Tkivo Vzorci
Izraz tkivo opisuje celično intermediat, kjer je celica gradivo na organizacijski ravni med celicami in popolno organa. V tkivu, podobne celice, iz istega izvora, ki skupaj opravljajo posebno funkcijo, so sestavljeni. Z funkcionalno združevanje različnih tkivih, se oblikujejo zapletene strukture organov.
Tkivo se vzorči za raziskave v biologiji, histologijo / histopatološki, parazitologije, biokemija, imunohistokemijo ter gojiti in ekstrakt DNA. To je mogoče razlikovati med živali (podpodročje: sesalec tkivo) in rastlinsko tkivo. Živalska tkiva so razvrščeni v štiri osnovne tipe vezivnega, mišice, živčni in epitelijskega tkiva. Rastlinsko tkivo je razdeljen na naslednjih treh sistemov tkiva: povrhnjice, v pritličju tkivo, in žilnega tkiva.
vzorce tkiva lahko pripravimo iz delov živali ali rastlin, npr kosti, mišice, listje, itd
telesnih tekočin
Kri, serum, plazma, likvor, slina in sinovialno tekočino so telesne tekočine, ki ponujajo velik vir diagnostično pomembnih informacij. Zato prefinjeno priprava vzorcev telesne tekočine za analizo je pomembno. Prva težava je povezana s širokim dinamičnim območju od komponent, prisotnih v telesnih tekočinah.
Določitev koncentracije proteina
Bradford preizkus, Lowry preizkus in bicinchoninic kisline (BCA) preizkus so pogosti testi za določanje koncentracije proteinov. Goveji serumski albumin (BSA) je eden od najbolj pogosto uporabljenega proteina standarda.
liza Buffer
Liznega pufra mora biti izbran v skladu s celični material ali tkiva (tkivne kulture, rastline, bakterije, glive, itd), in če so celice v strukturi in tip konstrukcije. Različni lizo pufri za ekstrakcijo proteinov, membran in organele formulirana z enim ali več detergentov. Detergent je ponavadi izbran preko testov poskusov in napak ali – če je na voljo – po obstoječem ekstrakcijo proteinov protokola. Detergent mora biti v skladu z virom tkiva in beljakovin. Na splošno je najbolj blago čistilo, ki deluje na določeni tkiva / protein, ki je izbran, da se ohrani maksimalno funkcionalnost ekstrakta. Nadalje, v primeru ekstrakcije membran in organelov, blagim detergentom ohranja membrana nedotaknjen. Pogosto uporabljeni detergenti v liza pufrov so večinoma neionski ali amfoterni, npr CHAPS, deoksiholat, Triton ™ X-100, NP40 in Tween 20.
Na primer, tkiva, kot so možgani, jetra, črevesja, ledvic, vranica itd mogoče enostavno zapufrano z RIPA – Vendar je treba vključiti inhibitorji proteaz in DTT (na primer za gelsko elektroforezo).
Liznega pufra za skeletno mišičnega tkiva (led mrzlo): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (m / v) glicerola, 1 mM EDTA , 1 mM ditiotreitola dopolnjenem z proteaze in inhibitorja fosfataza koktajl
Tabela skupnih pufrov in njihov pH območje. Na splošno se te pufri običajno uporabljajo v koncentracijah 20-50 mM.
| Medpomnilnik | območje pH |
|---|---|
| Citronska kislina – Naoh | 2,2 – 6,5 |
| natrijev citrat – Citronska kislina | 3,0 – 6,2 |
| natrijev acetat – ocetna kislina | 3,6 – 5,6 |
| Cacodylic kislina natrijeva sol – Hcl | 5,0 – 7,4 |
| MY – Naoh | 5,6 – 6,8 |
| Natrijev dihidrogen fosfat – dinatrijev hidrogen fosfat | 5,8 – 8,0 |
| imidazol – Hcl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – Koh | 6,6 – 7,8 |
| trietanolamin hidroklorida – Naoh | 6,8 – 8,8 |
| tris – Hcl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – Naoh | 7,2 – 8,2 |
| tricin – Naoh | 7,6 – 8,6 |
| natrijev tetraborat – Borova kislina | 7,6 – 9,2 |
| Bicin – Naoh | 7,7 – 8,9 |
| Glicin – Naoh | 8,6 – 10,6 |
Večina pufri prikaz pH odvisnost s temperaturo. To še posebej velja za Tris odbojnike. PKa spreminja od 8,06 pri 25 ° C do 8,85 pri 0 ° C.
(PH in pKa pufer: pH meri koncentracijo vodikovih ionov v vodni raztopini pKa (= kisline disociacijska konstanta) je povezano, vendar bolj specifičnih ukrep, s tem, da pomaga predvideti, kako bo molekula deluje na določeni. pH vrednost).
TRIzola
TRIzola je kemična raztopina se uporablja za pridobivanje RNA / DNA / proteina med ekstrakcijo gvanidin tiocianat-fenol-kloroform. Uporaba ultrazvočno pomoč TRIzola rezultatov ekstrakcijska v visoki DNA, RNA in proteinov donosov iz istega vzorca in se odlikuje s tem druge metode za ekstrakcijo.
Literatura / Reference
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.