Ultrazvočne lize za Western blot

  • Western blot je analitska postopek za odkrivanje specifičnih proteinov v vzorcu homogenata tkiva ali celičnega ekstrakta.
  • Za zagon Western blot ali za merjenje encimske aktivnosti, mnogi poskusi zahteva dostop do materialov (npr proteinov, DNA, subceličnih fragmente) ujetega v celici.
  • Ultrazvoka je zanesljiva in enostavna za rokovanje Postopek za motnje nadzorovano celic in lizi.

Ultrazvočnega celičnega motnje

ekstrakcija proteinov iz tkiv in kultiviranih celic je prvi korak za številne biološke, biokemijske in analitičnimi tehnikami (PAGE, Western blot, ELISA, masna spektrometrija, itd) ali čiščenje proteinov. Da bi dobili visok izkoristek beljakovin, mora celica materiala in tkivo učinkovito moten / lizirali. Ali rastlinske celice ali živalskega tkiva, ultrazvoka je metoda za pripravo vaš mobilni lizat enostavno in hitro.

Prednosti ultrazvočno razbijanje

  • hitro & učinkovite
  • enostavno delovanje
  • visok dobitek proteina
  • ponovljivo / ponovljivo
  • natančno nadzoruje
  • prilagodljiva

Prošnja za informacije




Upoštevajte naše Politika zasebnosti.


Hielscher's VialTweeter is ideal for the lysis of multiple samples

VialTweeter sonikator for ultrasonic sample prep such as cell disruption and protein isolation

Imuno protokol za Zahodni imuno

A. Reagenti

Za pripravo raztopin, uporabljajo prečiščene vode kot Milli-Q.

  • 1X fosfatni pufer s soljo (PBS)
  • 1X celično lizo pufer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natrijev pirofosfat, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 ug / ml leupeptina
    Pomembno: Dodajte 1 mM PMSF tik pred uporabo.
  • 15 ul Protein A + 15 ul Protein G zadostuje za OP, vendar je lahko odvisna od vašega primarnega protitelesa in vzorca prostornine. Lahko uporabite tudi dvofazni protein A / G Agarozo (npr Protein A za rabbit IgG podirajo in Protein G za miške IgG podreti)
  • 3X SDS vzorčnega pufra: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 pri 25 ° C), 6% m / v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% m / v bromofenola modro

B. Priprava celičnih lizatov

  • Letino celice. Za žetev celic pod nondenaturing pogoji odstranimo medije in enkrat izpiranje celic z ledeno mrzlo PBS.
  • Odstrani PBS in dodamo 0,5 ml ledeno mrzle 1X celica liznega pufra za vsako ploščo (10 cm) in inkubiramo plošč na ledu za 5 minut.
  • Strganje celice off plošč in prenesti na mikrocentrifugirkah. Naj na ledu.
  • Sonicate dvakrat 10 sekund v ledeno mrzlo imunoprecipitacije pufra (IP pufer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 in inhibitor zmes proteaze). Za ultrazvočno razbijanje je VialTweeter ali sonda ultrasonicator kot je UP100H ali UP200Ht so najbolj primerni.
  • Centrifugira lizate pri 15.000 g 10 minut pri 4 ° C.
  • Prenos supernatant na novo cev. (Če je potrebno, lahko lizat se shranimo pri -80 ° C.)
  • Dodajanje primarnega protitelesa v supernatantu. Supernatant s primarnim protitelesom inkubiramo 1 uro pri 4 ° C pod svetlobnim stresanjem. Primarno protitelo značilno dodamo v količini 10x bolj koncentrirane kot se uporablja za Western blotting-om. (Lahko začnete z 1 pg na 100 nI.)
  • Supernatant se nato nadalje inkubiramo z mešanico enakih količin protein-agaroze (Invitrogen) in beljakovine g agaroze za nadaljnjo 1 h.
  • Operite Agarozo peleti trikrat z IP buffer. Nato ekstrakt vezanih proteinov s SDS-PAGE pufra s segrevanjem pri 95 ° C 5 minut.

C. imunoprecipitacije

  • Vzemite 200 ul celični lizat in dodajte primarno protitelo. Inkubiramo z nežno zibanje preko noči pri 4 ° C.
  • Dodamo bodisi protein A ali G agarozo kroglice (20 p.L 50% kroglic brozge). Inkubiramo z nežno zibanje 1-3 ure pri 4 ° C.
  • Mikrocentrifugi 30 sekund pri 4 ° C. Pralni pellet petkrat s 500 ul 1x celica liznega pufra. Naj na ledu med opere.
  • Suspenzijo peleta z 20 ul 3X SDS vzorca pufrom. Vortex, nato mikrocentrifugirkah za 30 sekund.
  • Segrejemo vzorec na 95-100 ° C 2-5 minut in mikrocentrifugi 1 minuto pri 14000 x g.
  • Nalaganje vzorca (15-30 ul) na SDS-PAGE gelu (12-15%).
  • Analizirali vzorec z metodo Western blot.

Western Blot analiza s Sonicator UP50H

Following protocol using the probe-type sonicator UP50H was used in study of Kriebisch et al. (2011):
Ultrasonic probe-type homogenizer UP50H is commonly used for cell disruption and protein isolation as sample preparation step before Western BlottingCelotni protein smo izolirali iz MC3T3-E1 celicah, obdelanih z 1,25 (OH)2D3 (10-8 M) ali vehikel. Celice smo lizirali s pufrom, ki vsebuje 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCI (Fisher Scientific); 0,1% natrijevega dodecil sulfata (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) in 0,5% natrijev deoksiholat (Merck). Celični lizat smo podvrgli sonikaciji tekom 2 x 10 sekund na ciklu 1 in amplitudo 80 s UP50H Ultrazvočni procesor (Hielscher, Ultrazvučna tehnologija, Teltow, Nemčija). Nato smo material centrifugirali 10 minut pri 14.000 obratih na minuto in supernatant smo uporabili za Western blotiranje. Petindvajset μg proteina smo kuhali v puferu za vzorčenje in reducirajočem sredstvu (Invitrogen) in nato ločili s SDS-PAGE z uporabo 4-12% poliakrilamidnih gelov (Invitrogen) in prenesli v nitrocelulozno membrano (GE zdravstvena oskrba). Membrano smo blokirali 1 uro s TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl), ki vsebuje 1% kazeina (Sigma-Aldrich) in 1% Tris (1 M). Po blokiranju je bila membrana inkubirana z rahlim mešanjem preko noči pri 4 ° C s primarnim protitelesom (kuncasti anti-človeški CBS 1/500, razvit v laboratoriju prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, ZDA). Inkubacijo s hrenovo peroksidazo (HPR)-konjugirano sekundarno protitelo (Dako) smo izvajali 1 uro pri sobni temperaturi. Vse blotnice so razvili z izboljšano kemiluminiscenco (Perkin Elmer).
 

Ta vadnica pojasnjuje, katera vrsta sonikatorja je najboljša za vaše naloge priprave vzorcev, kot so liza, motnje celic, izolacija beljakovin, fragmentacija DNK in RNA v laboratorijih, analize in raziskave. Izberite idealno vrsto sonikatorja za vašo aplikacijo, volumen vzorca, številko vzorca in prepustnost. Hielscher Ultrasonics ima idealen ultrazvočni homogenizator za vas!

Kako najti popoln Sonicator za motnje celic in ekstrakcijo beljakovin v znanosti in analizi

Video sličica

 
Spodnja tabela vam prikazuje približno zmogljivost obdelave naših laboratorijskih ultrazvočnikov:

Priporočena naprave serija Volume Pretok
UIP400MTP 96-kanalni ploščni sonikator multi-well / mikrotiter plošče ni podatkov
Ultrazvočni cuphorn CupHorn za viale ali čašo ni podatkov
GDmini2 ultrazvočni reaktor z mikro pretokom ni podatkov
VialTweeter 00,5 do 1,5 ml ni podatkov
UP100H 1 do 500ml 10 do 200 ml / min
UP200Ht, UP200St 10 do 1000mL 20 do 200mL/min
UP400St 10 do 2000 ml 20 do 400ml / min
ultrazvočni sito tresel ni podatkov ni podatkov

Kontaktiraj nas! / Vprašajte nas!

Vprašajte za več informacij

Prosimo, uporabite spodnji obrazec, da zahtevate dodatne informacije o naših zvočnih napravah za pripravo vzorcev pred Western Blots, podrobne protokole uporabe in ceno. Z veseljem se bomo z vami pogovorili o vašem postopku priprave vzorca in vam ponudili ultrazvočni sistem, ki izpolnjuje vaše zahteve!









Prosimo, upoštevajte naše Politika zasebnosti.


Mikroplošče, plošče z več vrtinami, plošče PCR in 96-kanalne plošče lahko udobno in enakomerno sonizirate z uporabo UIP400MTP plošče sonikator

UIP400MTP plošča Sonicator za visoko zmogljivo ultrazvočno razbijanje 96-kanalnih plošč



O Western blot

Odtise so analizni postopki, kjer so DNA, RNA in proteinov prenese na nosilec, tako da lahko ločimo.
Southern blot uporabimo za detekcijo DNA, Northern blot za RNA in Western blot za beljakovine.
Western blot se imenuje tudi beljakovine imunoblot ker se protitelo uporablja za specifično odkrivanje svoj antigen. Zahodni Blotting je eden od najpomembnejših analitskih metod za odkrivanje specifičnih beljakovin v vzorcu. V Western blot, so proteini imobiliziramo na membrani jih zaznajo z uporabo poliklonskih protiteles.
S SDS-poliakrilamidnim gelnim elektroforezo (SDS-PAGE) so naravne proteine ​​ločene s 3-D strukturo ali denaturiranimi proteini glede na dolžino polipeptida. Proteine ​​nato prenesemo na membrano (ponavadi nitrocelulozo ali PVDF), kjer so obarvana s protitelesi, specifičnimi za ciljni protein. Korak gelske elektroforeze je vključen v analizo zahodnega blata, da bi rešili vprašanje navzkrižne reaktivnosti protiteles.
Nato se ločene beljakovine blatirajo na matriko (večinoma na nitrocelulozno ali PVDF membrano), kjer so obarvana s protitelesi. Protitelesa delujejo kot sonda in so izbrana posebej za ciljni protein. Analiza lokacije in intenzitete specifične reakcije razkrivata podrobnosti o ekspresiji ciljnih proteinov v danem vzorcu. Western blotenje lahko zazna ciljne beljakovine, ki so tako visoke kot 1g zaradi visoke ločljivosti gelske elektroforeze in močne specifičnosti ter visoke občutljivosti imunskega testa. Metoda Western blot se uporablja v molekularni biologiji, biokemiji, imunogenetiki in drugih molekularnih raziskovalnih področjih.
Druge sorodne tehnike vključujejo dot blot analizo, imunohistokemično in imunocitokemija, kjer so protitelesa, ki se uporablja za zaznavanje proteinov v tkiva in celice z imunskim barvanjem in encimskoimunske testom (ELISA).


Literatura/reference

Popolno namestitev VialTweeter: VialTweeter votlina na ultrazvočno procesor UP200St

VialTweeter sonikator Za sočasno pripravo vzorca več vial

Kontaktiraj nas! / Vprašajte nas!





Prosimo, upoštevajte naše Politika zasebnosti.


Ultrazvoka je pomemben korak med pripravo vzorca

UP200St z mikro konico za vzorec sonikacijo

Z veseljem bomo razpravljali o vašem procesu.

Pojdiva v stik.