• Western blot je analitska postopek za odkrivanje specifičnih proteinov v vzorcu homogenata tkiva ali celičnega ekstrakta.
• Za zagon Western blot ali za merjenje encimske aktivnosti, mnogi poskusi zahteva dostop do materialov (npr proteinov, DNA, subceličnih fragmente) ujetega v celici.
• Ultrazvoka je zanesljiva in enostavna za rokovanje Postopek za motnje nadzorovano celic in lizi.

Ultrazvočnega celičnega motnje

ekstrakcija proteinov iz tkiv in kultiviranih celic je prvi korak za številne biološke, biokemijske in analitičnimi tehnikami (PAGE, Western blot, ELISA, masna spektrometrija, itd) ali čiščenje proteinov. Da bi dobili visok izkoristek beljakovin, mora celica materiala in tkivo učinkovito moten / lizirali. Ali rastlinske celice ali živalskega tkiva, ultrazvoka je metoda za pripravo vaš mobilni lizat enostavno in hitro.

Prednosti ultrazvočno razbijanje

• hitro & učinkovite
• enostavno delovanje
• visok dobitek proteina
• ponovljivo / ponovljivo
• natančno nadzoruje
• prilagodljiva

Imuno protokol za Zahodni imuno

A. Reagenti

Za pripravo raztopin, uporabljajo prečiščene vode kot Milli-Q.

• 1X fosfatni pufer s soljo (PBS)
• 1X celično lizo pufer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natrijev pirofosfat, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 ug / ml leupeptina
  Pomembno: Dodajte 1 mM PMSF tik pred uporabo.
• 15 ul Protein A + 15 ul Protein G zadostuje za OP, vendar je lahko odvisna od vašega primarnega protitelesa in vzorca prostornine. Lahko uporabite tudi dvofazni protein A / G Agarozo (npr Protein A za rabbit IgG podirajo in Protein G za miške IgG podreti)
• 3X SDS vzorčnega pufra: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 pri 25 ° C), 6% m / v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% m / v bromofenola modro

B. Priprava celičnih lizatov

• Letino celice. Za žetev celic pod nondenaturing pogoji odstranimo medije in enkrat izpiranje celic z ledeno mrzlo PBS.
• Odstrani PBS in dodamo 0,5 ml ledeno mrzle 1X celica liznega pufra za vsako ploščo (10 cm) in inkubiramo plošč na ledu za 5 minut.
• Strganje celice off plošč in prenesti na mikrocentrifugirkah. Naj na ledu.
• Sonicate dvakrat 10 sekund v ledeno mrzlo imunoprecipitacije pufra (IP pufer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 in inhibitor zmes proteaze). Za ultrazvočno razbijanje je VialTweeter ali sonda ultrasonicator kot je UP100H ali UP200Ht so najbolj primerni.
• Centrifugira lizate pri 15.000 g 10 minut pri 4 ° C.
• Prenos supernatant na novo cev. (Če je potrebno, lahko lizat se shranimo pri -80 ° C.)
• Dodajanje primarnega protitelesa v supernatantu. Supernatant s primarnim protitelesom inkubiramo 1 uro pri 4 ° C pod svetlobnim stresanjem. Primarno protitelo značilno dodamo v količini 10x bolj koncentrirane kot se uporablja za Western blotting-om. (Lahko začnete z 1 pg na 100 nI.)
• Supernatant se nato nadalje inkubiramo z mešanico enakih količin protein-agaroze (Invitrogen) in beljakovine g agaroze za nadaljnjo 1 h.
• Operite Agarozo peleti trikrat z IP buffer. Nato ekstrakt vezanih proteinov s SDS-PAGE pufra s segrevanjem pri 95 ° C 5 minut.

C. imunoprecipitacije

• Vzemite 200 ul celični lizat in dodajte primarno protitelo. Inkubiramo z nežno zibanje preko noči pri 4 ° C.
• Dodamo bodisi protein A ali G agarozo kroglice (20 p.L 50% kroglic brozge). Inkubiramo z nežno zibanje 1-3 ure pri 4 ° C.
• Mikrocentrifugi 30 sekund pri 4 ° C. Pralni pellet petkrat s 500 ul 1x celica liznega pufra. Naj na ledu med opere.
• Suspenzijo peleta z 20 ul 3X SDS vzorca pufrom. Vortex, nato mikrocentrifugirkah za 30 sekund.
• Segrejemo vzorec na 95-100 ° C 2-5 minut in mikrocentrifugi 1 minuto pri 14000 x g.
• Nalaganje vzorca (15-30 ul) na SDS-PAGE gelu (12-15%).
• Analizirali vzorec z metodo Western blot.

Western Blot analiza s Sonicator UP50H

Following protocol using the probe-type sonicator UP50H was used in study of Kriebisch et al. (2011):
Celotni protein smo izolirali iz MC3T3-E1 celicah, obdelanih z 1,25 (OH)₂D₃ (10^-8 M) ali vehikel. Celice smo lizirali s pufrom, ki vsebuje 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCI (Fisher Scientific); 0,1% natrijevega dodecil sulfata (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) in 0,5% natrijev deoksiholat (Merck). Celični lizat smo podvrgli sonikaciji tekom 2 x 10 sekund na ciklu 1 in amplitudo 80 s UP50H Ultrazvočni procesor (Hielscher, Ultrazvučna tehnologija, Teltow, Nemčija). Nato smo material centrifugirali 10 minut pri 14.000 obratih na minuto in supernatant smo uporabili za Western blotiranje. Petindvajset μg proteina smo kuhali v puferu za vzorčenje in reducirajočem sredstvu (Invitrogen) in nato ločili s SDS-PAGE z uporabo 4-12% poliakrilamidnih gelov (Invitrogen) in prenesli v nitrocelulozno membrano (GE zdravstvena oskrba). Membrano smo blokirali 1 uro s TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl), ki vsebuje 1% kazeina (Sigma-Aldrich) in 1% Tris (1 M). Po blokiranju je bila membrana inkubirana z rahlim mešanjem preko noči pri 4 ° C s primarnim protitelesom (kuncasti anti-človeški CBS 1/500, razvit v laboratoriju prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, ZDA). Inkubacijo s hrenovo peroksidazo (HPR)-konjugirano sekundarno protitelo (Dako) smo izvajali 1 uro pri sobni temperaturi. Vse blotnice so razvili z izboljšano kemiluminiscenco (Perkin Elmer).
 

 
Spodnja tabela vam prikazuje približno zmogljivost obdelave naših laboratorijskih ultrazvočnikov:

Literatura/reference