Ultrazvočna liza za zahodno blotting

• Western blot je analitični postopek za odkrivanje specifičnih beljakovin v vzorcu tkivnega homogenata ali celičnega ekstrakta.
• Za izvedbo zahodne madeže ali za merjenje aktivnosti encimov mnogi testi zahtevajo dostop do materialov (npr. beljakovin, DNK, subceličnih fragmentov), ujetih v celici.
• Sonication je zanesljiva in enostavna metoda za nadzorovane motnje in lizo celic.

Ultrazvočna motnja celic

Ekstrakcija beljakovin iz tkiv in gojenih celic je prvi korak za številne biološke, biokemične in analitične tehnike (PAGE, Western blotting, ELISA, masna spektrometrija itd.) ali čiščenje beljakovin. Da bi dosegli visok donos beljakovin, je treba celični material in tkivo učinkovito motiti / lizirati. Ne glede na to, ali so rastlinske celice ali živalsko tkivo, je ultrazvočno razbijanje metoda za enostavno in hitro pripravo lizata celic.

Prednosti ultrazvočnega razbijanja

• Hitro & Učinkovito
• Enostavno upravljanje
• visok donos beljakovin
• ponovljivo/ponovljivo
• natančno nadzorovano
• Razširljive

Protokol imunoprecipitacije za zahodno imunoblotiranje

A. Reagenti

Za pripravo raztopin uporabite prečiščeno vodo, kot je Milli-Q.

• 1X fosfatna puferirana fiziološka raztopina (PBS)
• 1X pufer za lizo celic: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natrijev pirofosfat, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
  Pomembno: Dodajte 1 mM PMSF tik pred uporabo.
• 15 μl beljakovin A + 15 μl beljakovin G zadostuje za IP, vendar je lahko odvisno od vašega primarnega protitelesa in volumna vzorca. Uporabite lahko tudi predhodno zmešano beljakovino A/G agarozo (npr. Protein A za zajec IgG in Protein G za miši IgG povleci navzdol)
• 3X pufer za vzorec SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 pri 25 °C), 6% m/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% m/v bromofenol modro

B. Priprava celičnih lizatov

• Poberite celice. Za žetev celic v nedenaturacijskih pogojih odstranite medij in celice enkrat sperite z ledeno hladnim PBS.
• Odstranite PBS in dodajte 0,5 ml ledeno hladnega pufra za lizo celic 1X na vsako ploščo (10 cm) in plošče inkubirajte na ledu 5 minut.
• Celice strgajte s plošč in jih prenesite v epruvete za mikrocentrifuge. Ostanite na ledu.
• Sonikirajte dvakrat 10 sekund v ledeno hladnem imunoprecipitacijskem pufru (IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 in mešanica zaviralcev proteaze). Za ultrazvočno razbijanje VialTweeter ali ultrazvočni sonda, kot je UP100H ali UP200Ht so najprimernejši.
• Lizate centrifugiramo pri 15.000 g 10 minut pri 4 °C.
• Prenesite supernatant v novo cevko. (Po potrebi lahko lizat shranjujete pri –80 °C.)
• Supernatantu dodajte primarno protitelo. Supernatant s primarnim protitelesom se inkubira 1 uro pri 4 °C pod rahlim vznemirjenjem. Primarna protitelesa se običajno dodajo v količini, ki je 10-krat bolj koncentrirana, kot se uporablja za zahodno blotting. (Lahko začnete z 1 μg na 100 μL.)
• Supernatant se nato nadalje inkubira z mešanico enakih količin proteina A-agaroze (Invitrogen) in proteina G agaroze še 1 uro.
• Agarozne pelete trikrat speremo z IP puferom. Nato vezane beljakovine ekstrahiramo s polnilnim pufrom SDS-PAGE tako, da 5 minut segrevamo pri 95 °C.

C. Imunoprecipitacija

• Vzemite 200 μl celičnega lizata in dodajte primarno protitelo. Inkubiramo z nežnim zibanjem čez noč pri 4 °C.
• Dodamo beljakovine A ali G agarozne kroglice (20 μl 50 % kaše). Inkubiramo z rahlim zibanjem 1–3 ure pri 4 °C.
• Mikrocentrifugiramo 30 sekund pri 4 °C. Pelet petkrat speremo s 500 μl pufra za lizo celic 1X. Med pranjem hranite na ledu.
• Pelet resuspendiramo z 20 μl pufra za vzorec 3X SDS. Vortex, nato mikrocentrifugirajte 30 sekund.
• Vzorec segrevamo na 95–100 °C 2–5 minut in mikrocentrifugiramo 1 minuto pri 14.000 X g.
• Vzorec (15–30 μl) naložite na SDS-PAGE gel (12–15%).
• Analizirajte vzorec z zahodnim blottingom.

Analiza Western Blot s Sonicatorjem UP50H

V študiji Kriebisch et al. (2011) je bil uporabljen naslednji protokol z uporabo sondnega sonikatorja UP50H:
Skupni protein je bil izoliran iz celic MC3T3-E1, obdelanih z 1,25 (OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) ali vozilo. Celice so bile lizirane z pufrom, ki vsebuje 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natrijev dodecil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) in 0,5% natrijev deoksiholat (Merck). Celični lizat je bil sonikiran 2 × 10 s v ciklu 1 in amplitudo 80 z UP50H ultrazvočni procesor (Hielscher, ultrazvočna tehnologija, Teltow, Nemčija). Nato je bil material centrifugiran 10 minut pri 14.000 vrtljajih na minuto, supernatant pa je bil uporabljen za Western blotting. Petindvajset μg beljakovin smo kuhali v pufru vzorca in redukcijskem sredstvu (Invitrogen) in nato ločili s SDS-PAGE s 4–12% poliakrilamidnimi geli (Invitrogen) in prenesli v nitrocelulozno membrano (GE zdravstvena oskrba). Membrana je bila blokirana za 1 uro s TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl), ki je vseboval 1% kazeina (Sigma-Aldrich) in 1% Tris (1 M). Po blokiranju so membrano inkubirali z rahlim vznemirjanjem čez noč pri 4 °C s primarnim protitelesom (kunčji protičloveški CBS 1/500, razvit v laboratoriju prof. R. Banerjeeja, Ann Arbor, MI, ZDA). Inkubacija s konjugiranim sekundarnim protitelesom (Dako) s hrenovo peroksidazo (HPR) je trajala 1 uro pri sobni temperaturi. Vse madeže so bile razvite z izboljšano kemiluminiscenco (Perkin Elmer).
 

Kliknite tukaj, če želite prebrati več o najboljših praksah za ultrazvočno lizo in ekstrakcijo celic, pripravo lizata in priporočila za izboljšanje procesov!
 
Spodnja tabela vam prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih aparatov v laboratoriju:

Literatura / Reference