Ultrazvočna liza za metodo western blot

• Western blot je analitski postopek za zaznavanje specifičnih beljakovin v vzorcu tkivnega homogenata ali celičnega ekstrakta.
• Za izvedbo metode western blot ali merjenje encimske aktivnosti številne analize zahtevajo dostop do snovi (npr. beljakovin, DNA, podceličnih fragmentov), ujetih v celici.
• Sonikacija je zanesljiva in preprosta metoda za nadzorovano razgradnjo in lizo celic.

Ultrazvočna razgradnja celic

Ekstrakcija beljakovin iz tkiv in gojenih celic je prvi korak pri številnih bioloških, biokemijskih in analitskih tehnikah (PAGE, metoda western blot, ELISA, masna spektrometrija itd.) ali pri čiščenju beljakovin. Za doseganje visokega izkoristka beljakovin je treba celični material in tkivo učinkovito razgraditi/lizirati. Ne glede na to, ali gre za rastlinsko celico ali živalsko tkivo, je sonikacija metoda za preprosto in hitro pripravo celičnega lizata.

Prednosti sonikacije

• hitra in učinkovita
• preprosta uporaba
• visok izkoristek beljakovin
• obnovljiva/ponovljiva
• natančno nadzorovana
• možnost povečanja obsega

Protokol imunoprecipitacije za imunski prenos western

A. Reagenti

Za pripravo raztopin uporabite prečiščeno vodo, kot je Milli-Q.

• 1X fiziološka raztopina s fosfatnim pufrom (PBS)
• 1X pufer za lizo celic: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natrijev pirofosfat, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptin
  Pomembno: neposredno pred uporabo dodajte 1 mM PMSF.
• 15 μl proteina A+15 μl proteina G zadostuje za IP, vendar je to lahko odvisno od vašega primarnega protitelesa in prostornine vzorca. Uporabite lahko tudi vnaprej pripravljeno mešanico agaroze s proteinoma A/G (npr. protein A za afinitetno obarjanje kunčjega IgG in protein G za afinitetno obarjanje mišjega IgG)
• 3X vzorčni pufer SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 pri 25°C), 6% w/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromfenol modro

B. Priprava celičnih lizatov

• Zberite celice. Za zbiranje celic v nedenaturirajočih pogojih odstranite gojišče in celice enkrat sperite z ledeno hladno raztopino PBS.
• Odstranite PBS, na vsako ploščo (10 cm) dodajte 0,5 ml ledeno hladnega 1X pufra za lizo celic in plošče inkubirajte na ledu 5 minut.
• Postrgajte celice s plošč in jih prenesite v mikrocentrifugirke. Hranite na ledu.
• Sonicirajte dvakrat po 10 sekund v ledeno hladnem imunoprecipitacijskem pufru (pufer IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 in mešanica zaviralcev proteaz). Za sonikacijo je najprimernejši VialTweeter ali ultrazvočni homogenizator s sondo, kot sta UP100H ali UP200Ht .
• Lizate centrifugirajte pri 15.000 g 10 minut pri 4°C.
• Supernatant prenesite v novo epruveto. (Po potrebi lahko lizat shranite pri –80°C.)
• Supernatantu dodajte primarno protitelo. Supernatant s primarnim protitelesom inkubirajte 1 h pri 4°C ob rahlem mešanju. Primarno protitelo se običajno doda v količini, ki zagotavlja 10x višjo koncentracijo kot pri metodi western blot. (Začnete lahko z 1μg na 100μL.)
• Supernatant nato inkubirajte še 1 h z mešanico enakih količin agaroze s proteinom A (Invitrogen) in agaroze s proteinom G.
• Agarozne usedline trikrat sperite s pufrom IP. Nato ekstrahirajte vezane beljakovine z nanašalnim pufrom za SDS-PAGE s segrevanjem pri 95°C 5 minut.

C. Imunoprecipitacija

• Vzemite 200 μl celičnega lizata in dodajte primarno protitelo. Inkubirajte čez noč pri 4°C ob nežnem zibanju.
• Dodajte agarozne kroglice s proteinom A ali G (20 μl 50% suspenzije kroglic). Inkubirajte ob nežnem zibanju 1–3 ure pri 4°C.
• Mikrocentrifugirajte 30 sekund pri 4°C. Usedlino petkrat sperite s 500 µl 1X pufra za lizo celic. Med spiranjem hranite na ledu.
• Usedlino resuspendirajte z 20 μl 3X vzorčnega pufra SDS. Premešajte na vrtinčnem mešalniku, nato mikrocentrifugirajte 30 sekund.
• Vzorec segrevajte na 95–100°C 2–5 minut in mikrocentrifugirajte 1 minuto pri 14.000 X g.
• Vzorec (15–30 μl) nanesite na gel SDS-PAGE (12–15%).
• Vzorec analizirajte z metodo western blot.

Analiza z metodo western blot s sonikatorjem UP50H

Naslednji protokol z uporabo sonikatorja s sondo UP50H je bil uporabljen v študiji Kriebisch et al. (2011):
Skupne beljakovine so izolirali iz celic MC3T3-E1, obdelanih z 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) ali vehiklom. Celice so lizirali s pufrom, ki je vseboval 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natrijevega dodecil sulfata (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) in 0,5% natrijevega deoksiholata (Merck). Celični lizat so sonicirali 2 × 10 s pri nastavitvi cikla 1 in amplitudi 80 z ultrazvočnim procesorjem UP50H (Hielscher, ultrazvočna tehnologija, Teltow, Nemčija). Nato so material centrifugirali 10 min pri 14.000 rpm in supernatant uporabili za metodo western blot. Petindvajset μg beljakovin so prekuhali v vzorčnem pufru in reducentu (Invitrogen), nato jih ločili s SDS-PAGE z uporabo 4–12% poliakrilamidnih gelov (Invitrogen) ter prenesli na nitrocelulozno membrano (GE health care). Membrano so blokirali 1 h z raztopino TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl), ki je vsebovala 1% kazeina (Sigma-Aldrich) in 1% Tris (1 M). Po blokiranju so membrano ob rahlem mešanju inkubirali čez noč pri 4°C s primarnim protitelesom (kunčje protitelo proti človeškemu CBS 1/500, razvito v laboratoriju prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, ZDA). Inkubacijo s sekundarnim protitelesom, konjugiranim s hrenovo peroksidazo (HPR) (Dako), so izvedli 1 h pri sobni temperaturi. Vse prenose so razvili z ojačano kemiluminiscenco (Perkin Elmer).
 

Kliknite tukaj za več informacij o najboljših praksah ultrazvočne lize celic in ekstrakcije, pripravi lizatov ter priporočilih za izboljšave procesov!
 
Spodnja tabela prikazuje približno zmogljivost obdelave naših laboratorijskih ultrazvočnih homogenizatorjev:

Literatura / Reference

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.