Hielscher Ultrazvočna tehnologija

Ultrazvočni vzorec priprava za ELISA assays

Presodi, kot je ELISA, se pogosto uporabljajo za in-vitro diagnostiko, odkrivanje beljakovin, povezanih z boleznimi, in nadzor kakovosti (npr. spremljanje alergenov na hrano). Ultrazvočni vzorec priprava je hitra, zanesljiva in pomnoževalna tehnika za lyse celice in izolacijo znotrajceličnih beljakovin, DNK, RNK in organele. Hielscher Ultrasonics ponuja različne ultrazvočne rešitve za priročno pripravo posameznih vzorcev, več vial, kot tudi za mikrotiter plošče in 96-dobro plošče.

Elisa – Encimsko povezana imunosorbent assay

ELISA je encimsko povezana imunosorbent analiza in je široko uporabljena biokemična analiza kategorije ligand-vezavnih analiz. V ELISA se tekoči vzorec doda v stacionarno trdno fazo s posebnimi vezavnim lastnostmi. Običajno se stacionarna trdna faza nanese kot premaz na ploščo z dobro ali ELISA ploščo. Nato se različni tekoči reagenti zaporedno dodajajo, inkubirajo in izpirajo, tako da končno pride do optične spremembe (npr. razvoja barv po produktu encimske reakcije) v končni tekočini v dobro. Optična sprememba omogoča merjenje količine analita s tako imenovanim kvantitativnim “branju". Za količinsko branje se za odkrivanje in merjenje intenzivnosti oddane svetlobe uporablja spektrofotometrij, fluorometer ali luminometer. Na občutljivost zaznavanja vpliva ojačevanje signala med analitsko reakcijo. Ker so encimske reakcije dobro raziskane in zanesljivi procesi ojačevanja, se za ustvarjanje signala uporabljajo encimi. Encimi so povezani z detekcijo reagentov v fiksnih razmerjih, da se omogoči točna kvantifikacija, ki pojasnjuje tudi ime "encimom povezan" imunosorbent assay.
Kot ELISA preskusi se izvajajo v mikrotiter plošče / 96-dobro plošče, je znano kot plate-based assay tehniko in se uporablja npr. v klinični in-vitro diagnostiki, raziskave, razvoj drog itd za odkrivanje in količinsko ugotavljanje protiteles, peptidov, beljakovin, in hormonov.
Tehnika ELISA se pogosto uporablja kot diagnostično orodje v medicini, biotehniki, rastlinski patologiji in je tudi pomembno merjenje kontrole kakovosti v več panogah.

Popolno namestitev VialTweeter: VialTweeter votlina na ultrazvočno procesor UP200St

Ultrazvočna enota za pripravo vzorca VialTweeter se uporablja za celično lizo in ekstrakcijo beljakovin, preden ELISA

Prošnja za informacije




Upoštevajte naše Politika zasebnosti.


Ultrazvočni vzorec prep pred ELISA

Pred izvedbo testa ELISA vzorci zahtevajo korake priprave, kot so celična liza in ekstrakcija znotrajceličnih beljakovin, DNK, RNK itd. Prednost ultrazvočne celice in izoliranje beljakovin je njegova visoka učinkovitost, zanesljivost in razmnoževanje. Vsi ti dejavniki so pomembni za pridobitev visokokakovostne diagnostike in rezultatov raziskav

Prednosti ultrazvočne lize pred ELISA

  • Homogena obdelava vzorcev
  • Popolna lyza
  • Popolna ekstrakcija beljakovin (npr. protitelesa, DNK)
  • Optimalna prilagoditev vrsti celice
  • Za vsako velikost vzorca
  • ponovljivo
  • Nadzorovano s temperaturo
  • Samodejno protokoliranje podatkov na kartici SD

Protokol za ultrazvočno celično lizo pred ELISA

Sonda tipa insonifier UP200St za lizo

  • Za celične kulture: Pred ultrazvočno celico, centrifuge celice za 5 min pri 270 x g v mikrocentrifuga. Odstranite supernatant s tesnjenje in ponovno pospeševanje celic v 30 – 100 μL RIPA pufer. Nato inkubator celice pelete na ledu za 30 min.
  • Vzorec celice je pripravljen za ultrazvočno lyzo:
    Uporabite ultrasonikator tipa sonde (npr. UP200Ht s sondo S26d2) ali ultrazvočno multi-vzorčno napravo (npr. VialTweeter za hkratno sonikacijo do 10 vial ali UIP400MPT za mikrotiterske plošče / 96-dobro ploščo), odvisno od količine vzorcev, ki jih morate pripraviti.
    Za sondo tipa sondirajte en vzorec, postavite celice v 1,5 ml mikrocentrifugnih cevi.
  • Predhodno nastavite ultrazvočno trajanje, skupni vnos energije, način cikla in/ali omejitve temperature v digitalnem meniju ultrazvočnega. To zagotavlja zelo zanesljivo sonication in ponočljivost.
  • Vklopite sonotrodo in vklopite ultrazvočno napravo. Nežno premaknite mikro-konico ultrazvočne sonde skozi vzorec, da se vzorec enotno sonicira.
    Za večino celic bo ultrazvočna liza končana po 2 -4 ciklih 10 sek sonication.
  • Po sonikacijo odstranite sonotrodo iz vzorca. Vzorce je treba inkubovati na ledu 5 min. Nato centrifug na 10.000 x g za 20 min, da pelete razbitine. Prenesite supernatante v novo mikrocentrifugno cev. Označite analite in shranjujte pri -20 °C.
  • Ultrazvočno sonotrodo lahko očistimo tako, da jo pravilno obrišimo z alkoholom ali soniciramo v kešu, napolnjenem z alkoholom, npr. 70% etanola. Vse ultrazvočne sonde, narejene iz titana, so samodejne.

Za tkivne homogenate:

  • Tkivo sperite z ledeno hladnim PBS (0,01M, pH=7,4), da temeljito odstranite odvečno hemolizo.
  • Tehtajte tkivo (ledvice, srce, pljuča, vranico itd.) in ga macerizirajte na majhne koščke, ki so homogenizirani v PBS. Zahtevani volumen PBS je povezan s težo tkiv. Praviloma palec, 1g tkivo zahteva približno 9mL PBS. V PBS je priporočljivo dodati nekaj zaviralca proteaze. (RIPA ali hipotonični odbojnik, ki vsebuje proteazo in inhibitor fosfatazo, se lahko uporabljata alternativno.)
  • Odvisno od velikosti tkiv, lahko kratek tretma vrtinca (približno 1-2 min. v 15 sek. impulzov) pomaga pred zdravljenjem tkivo.
  • Namestite mikro-konico, na primer S26d2, na ultrazvočnitor. Vzorčno cev z tkivom postavite v ledeno kopel.
  • Vzorec sonicirajte z ultrazvočnim, npr. UP200St (80% amplitude) 1 min. v pulznem načinu (15sec on, 15sec pavza). Vzorec hranite v ledeni kopeli.
  • Homogenati se nato centrifugirajo, da se pridobijo specifični bazeni (citosolni, jedrski, mitohondrialni ali lysosomalni), da se obogati beljakovina za analizo. S centrifugom vzorca za 5 minut pri 5000×g se supernatant pridobi.
Sonotroda MTP-24-8-96 ima osem ultrazvočnih sond za sonikacijo vohunov mikrotiterskih plošč.

Sonotroda MTP-24-8-96 ima osem ultrazvočnih sond za sonikacijo vohunov mikrotiterskih plošč.

Zanesljiv nadzor temperature med sonication

Temperatura je ključni dejavnik, ki vpliva na proces, ki je še posebej pomemben za obdelavo bioloških vzorcev, npr. Kot vse mehanske tehnike priprave vzorcev, sonication ustvarja toploto. Vendar pa je temperatura vzorcev lahko dobro nadzorovana pri uporabi Hielscher Ultrasonics naprav. Predstavljamo vam različne možnosti za spremljanje in nadzor temperature vaših vzorcev, medtem ko jih pripravljate z ultrazvočnim ali VialTweeter predhodno analitično.

  1. Spremljanje temperature vzorca: Vsi Hielscher digitalni ultrazvočni procesorji so opremljeni z inteligentno programsko opremo in vtičnim senzorjem temperature. Senzor temperature priključite v ultrazvočno napravo (npr. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) in vstavite konico senzorja temperature v eno od vzorčnih cevi. Preko digitalnega barvnega zaslona na dotik lahko v meniju ultrazvočnega procesorja nastavite določen temperaturni razpon za vašo ultrazvočno ultrazvočno ultrazvočno sekacijo. Ultrasonicator se samodejno ustavi, ko doseže največjo temperaturo in ustavi, dokler temperatura vzorca ne pade na nižjo vrednost nastavljene temperature ∆. Nato se sonication začne samodejno znova. Ta pametna funkcija preprečuje degradacijo, ki jo povzroči toplota.
  2. V zvezi z ultrazvočno multi-vzorec enoto VialTweeter, titanov blok, ki imajo vzorčne cevi, se lahko predhodno ohladi. Blok VialTweeter (samo sonotrode brez pretvornika!) dajte v hladilnik ali zamrzovalnik, da se blok titana pred hlajenjem preloži pri preložitvi dviga temperature v vzorcu. Če je mogoče, se lahko tudi sam vzorec predhodno ohladi.
  3. Med sonikacijo uporabite ledeno kopel ali suhi led. Med sonikacijo v ledeno kopel namestite vzorčne cevi. Za VialTweeter uporabite plitvi pladenj, napolnjen s suhim ledom, in postavite VialTweeter na suhi led, da se lahko toplota hitro raztaplja.

Stranke po vsem svetu uporabljajo Hielscher probe-ultrasonicators, kot tudi multi-vzorec sonication enote VialTweeter in UIP400MTP za svoje vsakodnevno pripravo vzorca dela v bioloških, biokemičnih, medicinskih in kliničnih laboratorijih. Inteligentna programska oprema in nadzor temperature hielscher procesorjev, temperatura je zanesljivo nadzorovana in toplotno povzročeni razgradnja vzorca izogiba. Ultrazvočna priprava vzorca z Ultrazvočnimi rešitvami Hielscher prinaša zelo zanesljive in ponovljive rezultate!

Kontaktiraj nas! / Vprašajte nas!

Vprašajte za več informacij

Prosimo, uporabite spodnji obrazec, da zahteva dodatne informacije o ultrazvočni procesorji, aplikacije in ceno. Mi bo z veseljem razpravljali vaš proces z vami in vam ponudimo ultrazvočni sistem, ki izpolnjuje vaše zahteve!









Prosimo, upoštevajte naše Politika zasebnosti.


Ultrasonic high-shear homogenizers are used in lab, bench-top, pilot and industrial processing.

Hielscher Ultrasonics proizvaja visoko zmogljivost ultrazvočnih homogenizatorjev za mešanje aplikacij, disperzijo, emulgiranje in ekstrakcijo na lab, pilot in industrijske lestvice.

Literatura/reference



Dejstva je treba vedeti

Vrste ELISA

Obstaja več vrst ELISA, ki se razločejo po svojem načelu delovanja. Znani so kot neposredna ELISA, posredna ELISA, sendvič ELISA, konkurenčna ELISA in obratna ELISA. Spodaj vam predstavljamo pregled nad različnimi vrstami ELISA in njihovimi glavnimi značilnostmi in razlikami.
ELISA se lahko izvaja v kvalitativnem ali kvantitativnem formatu. Kakovostni rezultati zagotavljajo preprost pozitiven ali negativen rezultat, medtem ko se v kvantitativni ELISA optični gostoti (OD) vzorca primerja s standardno krivuljo, ki je običajno serijsko redčenje znane koncentracijske raztopine ciljne molekule.

Neposredna ELISA

Neposredna ELISA je najbolj preprosta oblika Elisa, kjer se uporablja samo encimsko označeno primarno protitelo in sekundarna protitelesa niso potrebna. Primarna protitelesa z oznako encima se prilegajo neposredno na cilj, to je antigen. Raztopina z odbojnim antigenom se doda vsakemu dobro mikrotiterskemu krožniku (običajno 96-dobro plošče, ELISA-plošče), kjer se drži plastične površine s pomočjo nabojnih interakcij. Ko encim, povezan s primarnim protitelesom, reagira s svojo substrat, proizvaja vidni signal, ki se lahko meri prek spektrohotometra, fluorometra ali luminometra.

Posredna ELISA

Za posredni test ELISA je potrebno primarno protitelo in sekundarno protitelo. Vendar v nasprotju z neposredno ELISA ne primarno protitelo, ampak sekundarno protitelo je označeno z encimom. Antigen je imobiliziran na ploščo dobro in vezan s primarnim protitelesom. Nato se sekundarno protitelo z encimom pritrjuje na primarno protitelo. Nazadnje, encim, povezan s sekundarnim protitelesom, reagira s svojo substrato, da proizvaja vidni signal, ki ga je mogoče odkriti.

Sendvič ELISA

Medtem ko je pri neposrednih in posrednih preskusih ELISA antigen imobiliziran in premazan na površino plošče z dobro, v sendviču ELISA je protitelo imobilizirano na plastično površino ELISA-plošče. Imobilizirana protitelesa v sendviču ELISA so znana kot zajem protiteles. Poleg tega, da zajema protitelesa, v sendviču ELISA tudi tako imenovana detekcijo protitelesa so potrebni. Med protitelesa za odkrivanje so neosvabeno protitelo za primarno odkrivanje in encimom označeno sekundarno detekcijo protitelesa.
V koraku, antigen interesa se veže za zajem protitelesa, imobilizirana na ploščo. Nato se primarno detekcijo protitelo veže za antigen. Po tem se sekundarno detekcijo protitelesa vežejo za primarno detekcijo protitelo. V končnem reakcijski korak, encim reagira s svojo substrat proizvajajo vidni signal, ki ga je mogoče zaznati optično.

Konkurenčna ELISA

Konkurenčna ELISA, znana tudi kot inhibicija ELISA, je najkomplekšnejši tip ELISA, ker vključuje uporabo inhibitornega antigena. Vsak od treh formatov, neposredni, posredni in sendvič ELISA, se lahko prilagodi konkurenčnemu formatu ELISA. V konkurenčni ELISA, zaviralec antigen in antigen interesov tekmujejo za vezavo na primarno protitelo.
Za konkurenčno zdravilo ELISA se neobla čeno protitelo inkubatorje v prisotnosti njegovega antigena, to je vzorca. Ti vezani kompleksi protiteles/antigenov se nato dodajo v antigensko obloženo dobro.
Plošča se umi, tako da se odstranijo nevezana protitelesa. Konkurenčna ELISA ima svoje ime zaradi dejstva, da več antigena je v vzorcu, več antigen protiteles kompleksi so oblikovani. To pomeni, da so manj nevezana protitelesa, ki se lahko vežejo na antigen v dobro in antigeni morajo konkurirati za razpoložljivo protitelo. Doda se sekundarno protitelo, ki ustreza primarnim protitelesom. To drugo protitelo je povezano z encimom. Ko je substrat dodan, preostali encimi proizvajajo kromogen ali fluorescentni signal.
V tem trenutku se reakcija ustavi, da se izognemo zasičenosti signala.
Nekateri konkurenčni ELISA kompleti vključujejo encimsko povezan antigen namesto encimsko povezanega protitelesa. Označeni antigen je za primarna mesta, ki zavezujoča protitelesa tekmujejo z vzorcem antigena (neobla čeno). Manj antigena v vzorcu, bolj označen antigen se obdrži v dobro in močnejši signal.

Obratna ELISA

Obratna ELISA ne uporablja dobro plošč, ampak pušča antigene suspendiran v preskusni tekočini. Povratni preskus ELISA meri količino vezanih protiteles preko antigena. Razvit je bil posebej za odkrivanje in preiskavo beljakovin virusa Zahodnega Nila in kako je sposoben najti protitelesa specifična za virus.

Encimski marker, ki se uporablja za ELISA

Na spodnjem seznamu so navedeni najpogostejši encimski označevalci, uporabljeni v testih ELISA, ki omogočajo merjenje rezultatov testa po zaključku.

  • OPD (o-fenilenediamin dihidroklorid) obrne jantar za odkrivanje HRP (Hren peroksidaze), ki se pogosto uporablja kot konjugovan protein.
  • TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin) pri odkrivanju HRP postane moder, po dodatku žveplove ali fosforne kisline pa rumeno.
  • ABTS (2,2′-Azinobis [3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina]-diamonijev sol) postane zelena pri odkrivanju HRP.
  • PNPP (p-Nitrofenil fosfat, dinatrijeva sol) postane rumena pri odkrivanju alkalne fosfataze.