Ultrazvočna priprava vzorcev za teste ELISA

Testi, kot je ELISA, se pogosto uporabljajo za diagnostiko in vitro, odkrivanje beljakovin, povezanih z boleznimi, in nadzor kakovosti (npr. spremljanje alergenov v živilih). Ultrazvočna priprava vzorcev je hitra, zanesljiva in ponovljiva tehnika za lizo celic ter izolacijo znotrajceličnih beljakovin, DNA, RNA in organelov. Hielscher Ultrasonics ponuja različne ultrazvočne rešitve za priročno pripravo posameznih vzorcev, več vial ter vzorcev v mikrotitrskih ploščah in ploščah s 96 vdolbinicami.

ELISA – encimsko vezani imunosorbentni test

ELISA pomeni encimsko vezani imunosorbentni test in je široko uporabljana tehnika biokemijske analize iz skupine testov vezave ligandov. Pri testu ELISA se tekoči vzorec nanese na stacionarno trdno fazo s posebnimi vezavnimi lastnostmi. Stacionarna trdna faza se običajno nanese kot prevleka na ploščo z vdolbinicami ali ploščo ELISA. Nato se zaporedoma dodajajo različni tekoči reagenti, inkubirajo in izpirajo, tako da na koncu v tekočini v vdolbinici nastane optična sprememba (npr. razvoj barve zaradi produkta encimske reakcije). Optična sprememba omogoča merjenje količine analita s tako imenovanim kvantitativnim »odčitavanjem«. Za kvantitativno odčitavanje se uporablja spektrofotometer, fluorometer ali luminometer, ki zazna in izmeri intenziteto prepuščene svetlobe. Na občutljivost zaznavanja vpliva ojačitev signala med analitičnimi reakcijami. Ker so encimske reakcije dobro raziskani in zanesljivi procesi ojačitve, se za ustvarjanje signala uporabljajo encimi. Encimi so vezani na reagente za zaznavanje v stalnih razmerjih, kar omogoča natančno kvantifikacijo in pojasnjuje tudi poimenovanje »encimsko vezani« imunosorbentni test.
Ker se testi ELISA izvajajo v mikrotitrskih ploščah / ploščah s 96 vdolbinicami, je ELISA znana kot tehnika testiranja na ploščah in se uporablja npr. v klinični diagnostiki in vitro, raziskavah, razvoju zdravil itd. za zaznavanje in kvantifikacijo protiteles, peptidov, beljakovin in hormonov.
Tehnika ELISA se pogosto uporablja kot diagnostično orodje v medicini, biotehnologiji in rastlinski patologiji ter je tudi pomembna merilna metoda za nadzor kakovosti v številnih panogah.

Ultrazvočna priprava vzorcev pred testom ELISA

Pred izvedbo testa ELISA je treba vzorce pripraviti s postopki, kot sta liza celic in ekstrakcija znotrajceličnih beljakovin, DNA, RNA itd. Prednosti ultrazvočne lize celic in izolacije beljakovin so visoka učinkovitost, zanesljivost in ponovljivost. Vsi ti dejavniki so pomembni za kakovostno diagnostiko in kakovostne rezultate raziskav

Protokol za ultrazvočno lizo celic pred testom ELISA

• Za celične kulture: Pred ultrazvočno lizo celic centrifugirajte celice 5 minut pri 270 x g v mikrocentrifugi. Z aspiracijo odstranite supernatant in celice resuspendirajte v 30 – 100 μL pufra RIPA. Nato celično usedlino inkubirajte na ledu 30 min.
• Celični vzorec je zdaj pripravljen za ultrazvočno lizo:
  Uporabite ultrazvočno napravo s sondo (npr. UP200Ht s sondo S26d2) ali ultrazvočno napravo za več vzorcev (npr. VialTweeter za sočasno sonikacijo do 10 vial ali UIP400MPT za mikrotitrske plošče / plošče s 96 vdolbinicami), odvisno od števila vzorcev, ki jih morate pripraviti.
  Za sonikacijo posameznega vzorca s sondo dajte celice v 1.5 mL mikrocentrifugirke.
• V digitalnem meniju ultrazvočne naprave vnaprej nastavite trajanje ultrazvočne obdelave, skupni vnos energije, način cikličnega delovanja in/ali temperaturne omejitve. To zagotavlja zelo zanesljivo sonikacijo in ponovljivost.
• Vstavite sonotrodo in vklopite ultrazvočno napravo. Mikrokonico ultrazvočne sonde nežno premikajte skozi vzorec, da ga enakomerno sonicirate.
  Pri večini celic bo ultrazvočna liza zaključena po 2 –4 ciklih sonikacije po 10 sekund.
• Po sonikaciji odstranite sonotrodo iz vzorca. Vzorce je treba inkubirati na ledu 5 min. Nato centrifugirajte pri 10.000 x g 20 min, da se ostanki usedejo. Supernatante prenesite v novo mikrocentrifugirko. Označite analite in jih shranite pri -20°C.
• Ultrazvočno sonotrodo lahko očistite tako, da jo temeljito obrišete z alkoholom ali jo sonicirate v čaši, napolnjeni z alkoholom, npr. 70% etanolom. Vse ultrazvočne sonde iz titana je mogoče avtoklavirati.

• Tkivo sperite z ledeno hladnim PBS (0,01M, pH=7,4), da temeljito odstranite odvečno hemolizirano kri.
• Stehtajte tkivo (ledvice, srce, pljuča, vranica itd.) in ga z maceracijo razdelite na majhne koščke, ki jih homogenizirate v PBS. Potrebna prostornina PBS je odvisna od mase tkiva. Praviloma je za 1g tkiva potrebnih približno 9mL PBS. Priporočljivo je, da PBS dodate nekaj zaviralca proteaz. (Namesto tega lahko uporabite RIPA ali hipotonični pufer za lizo, ki vsebuje mešanico zaviralcev proteaz in fosfataz.)
• Glede na velikost tkiva je lahko za njegovo predhodno obdelavo koristna kratka obdelava z vrtinčnim mešalnikom (približno 1–2 min. v 15-sekundnih pulzih).
• Na ultrazvočno napravo namestite mikrokonico, npr. S26d2. Epruveto z vzorcem tkiva postavite v ledeno kopel.
• Vzorec sonicirajte z ultrazvočno napravo, npr. UP200St (80% amplituda), 1 min. v pulznem načinu (15 sekund delovanja, 15 sekund premora). Vzorec naj ostane v ledeni kopeli.
• Homogenati se nato centrifugirajo, da se pridobijo specifične frakcije (citosolna, jedrna, mitohondrijska ali lizosomska) za obogatitev beljakovine za analizo. S centrifugiranjem vzorca 5 minut pri 5000×g se pridobi supernatant.

Zanesljiv nadzor temperature med sonikacijo

Temperatura je ključni dejavnik, ki vpliva na proces, in je še posebej pomembna pri obdelavi bioloških vzorcev, npr. za preprečevanje toplotne razgradnje beljakovin. Tako kot vse mehanske tehnike priprave vzorcev tudi sonikacija ustvarja toploto. Vendar je mogoče temperaturo vzorcev pri uporabi naprav Hielscher Ultrasonics dobro nadzorovati. Predstavljamo vam različne možnosti za spremljanje in nadzor temperature vzorcev med njihovo predanalitično pripravo z ultrazvočno napravo s sondo ali napravo VialTweeter.

1. Spremljanje temperature vzorca: Vsi digitalni ultrazvočni procesorji Hielscher so opremljeni z inteligentno programsko opremo in priključljivim temperaturnim tipalom. Temperaturno tipalo priključite na ultrazvočno napravo (npr. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP) in konico temperaturnega tipala vstavite v eno od epruvet z vzorci. Prek digitalnega barvnega zaslona na dotik lahko v meniju ultrazvočnega procesorja nastavite določeno temperaturno območje za sonikacijo vzorcev. Ultrazvočna naprava se samodejno ustavi, ko je dosežena najvišja temperatura, in začasno prekine delovanje, dokler temperatura vzorca ne pade na spodnjo vrednost nastavljene temperature ∆. Nato se sonikacija samodejno znova začne. Ta pametna funkcija preprečuje razgradnjo zaradi toplote.
2. Pri ultrazvočni enoti za več vzorcev VialTweeter je mogoče titanov blok, ki drži epruvete z vzorci, predhodno ohladiti. Blok VialTweeter (samo sonotrodo brez pretvornika!) postavite v hladilnik ali zamrzovalnik, da titanov blok predhodno ohladite in tako upočasnite dvig temperature v vzorcu. Če je mogoče, lahko predhodno ohladite tudi sam vzorec.
3. Za hlajenje med sonikacijo uporabite ledeno kopel ali suhi led. Epruveto oziroma epruvete z vzorci med sonikacijo postavite v ledeno kopel. Za VialTweeter uporabite plitev pladenj, napolnjen s suhim ledom, in VialTweeter postavite na suhi led, da se toplota lahko hitro odvaja.

Stranke po vsem svetu uporabljajo ultrazvočne naprave Hielscher s sondo ter enoti za sonikacijo več vzorcev VialTweeter in UIP400MTP pri vsakodnevni pripravi vzorcev v bioloških, biokemijskih, medicinskih in kliničnih laboratorijih. Inteligentna programska oprema in nadzor temperature procesorjev Hielscher zagotavljata zanesljiv nadzor temperature in preprečujeta razgradnjo vzorcev zaradi toplote. Ultrazvočna priprava vzorcev z ultrazvočnimi rešitvami Hielscher zagotavlja zelo zanesljive in ponovljive rezultate!
Preberite več o sonikaciji z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev z uporabo sonikatorja za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP za teste!