Ultrazvočni vzorec priprava za ELISA assays

Elisa – Encimsko povezana imunosorbent assay

ELISA je encimsko povezana imunosorbent analiza in je široko uporabljena biokemična analiza kategorije ligand-vezavnih analiz. V ELISA se tekoči vzorec doda v stacionarno trdno fazo s posebnimi vezavnim lastnostmi. Običajno se stacionarna trdna faza nanese kot premaz na ploščo z dobro ali ELISA ploščo. Nato se različni tekoči reagenti zaporedno dodajajo, inkubirajo in izpirajo, tako da končno pride do optične spremembe (npr. razvoja barv po produktu encimske reakcije) v končni tekočini v dobro. Optična sprememba omogoča merjenje količine analita s tako imenovanim kvantitativnim “branju". Za količinsko branje se za odkrivanje in merjenje intenzivnosti oddane svetlobe uporablja spektrofotometrij, fluorometer ali luminometer. Na občutljivost zaznavanja vpliva ojačevanje signala med analitsko reakcijo. Ker so encimske reakcije dobro raziskane in zanesljivi procesi ojačevanja, se za ustvarjanje signala uporabljajo encimi. Encimi so povezani z detekcijo reagentov v fiksnih razmerjih, da se omogoči točna kvantifikacija, ki pojasnjuje tudi ime "encimom povezan" imunosorbent assay.
Kot ELISA preskusi se izvajajo v mikrotiter plošče / 96-dobro plošče, je znano kot plate-based assay tehniko in se uporablja npr. v klinični in-vitro diagnostiki, raziskave, razvoj drog itd za odkrivanje in količinsko ugotavljanje protiteles, peptidov, beljakovin, in hormonov.
Tehnika ELISA se pogosto uporablja kot diagnostično orodje v medicini, biotehniki, rastlinski patologiji in je tudi pomembno merjenje kontrole kakovosti v več panogah.

Ultrazvočni vzorec prep pred ELISA

Pred izvedbo testa ELISA vzorci zahtevajo korake priprave, kot so celična liza in ekstrakcija znotrajceličnih beljakovin, DNK, RNK itd. Prednost ultrazvočne celice in izoliranje beljakovin je njegova visoka učinkovitost, zanesljivost in razmnoževanje. Vsi ti dejavniki so pomembni za pridobitev visokokakovostne diagnostike in rezultatov raziskav

Protokol za ultrazvočno celično lizo pred ELISA

• Za celične kulture: Pred ultrazvočno celico, centrifuge celice za 5 min pri 270 x g v mikrocentrifuga. Odstranite supernatant s tesnjenje in ponovno pospeševanje celic v 30 – 100 μL RIPA pufer. Nato inkubator celice pelete na ledu za 30 min.
• Vzorec celice je pripravljen za ultrazvočno lyzo:
  Uporabite ultrasonikator tipa sonde (npr. UP200Ht s sondo S26d2) ali ultrazvočno multi-vzorčno napravo (npr. VialTweeter za hkratno sonikacijo do 10 vial ali UIP400MPT za mikrotiterske plošče / 96-dobro ploščo), odvisno od količine vzorcev, ki jih morate pripraviti.
  Za sondo tipa sondirajte en vzorec, postavite celice v 1,5 ml mikrocentrifugnih cevi.
• Predhodno nastavite ultrazvočno trajanje, skupni vnos energije, način cikla in/ali omejitve temperature v digitalnem meniju ultrazvočnega. To zagotavlja zelo zanesljivo sonication in ponočljivost.
• Vklopite sonotrodo in vklopite ultrazvočno napravo. Nežno premaknite mikro-konico ultrazvočne sonde skozi vzorec, da se vzorec enotno sonicira.
  Za večino celic bo ultrazvočna liza končana po 2 -4 ciklih 10 sek sonication.
• Po sonikacijo odstranite sonotrodo iz vzorca. Vzorce je treba inkubovati na ledu 5 min. Nato centrifug na 10.000 x g za 20 min, da pelete razbitine. Prenesite supernatante v novo mikrocentrifugno cev. Označite analite in shranjujte pri -20 °C.
• Ultrazvočno sonotrodo lahko očistimo tako, da jo pravilno obrišimo z alkoholom ali soniciramo v kešu, napolnjenem z alkoholom, npr. 70% etanola. Vse ultrazvočne sonde, narejene iz titana, so samodejne.

Za tkivne homogenate:

• Tkivo sperite z ledeno hladnim PBS (0,01M, pH=7,4), da temeljito odstranite odvečno hemolizo.
• Tehtajte tkivo (ledvice, srce, pljuča, vranico itd.) in ga macerizirajte na majhne koščke, ki so homogenizirani v PBS. Zahtevani volumen PBS je povezan s težo tkiv. Praviloma palec, 1g tkivo zahteva približno 9mL PBS. V PBS je priporočljivo dodati nekaj zaviralca proteaze. (RIPA ali hipotonični odbojnik, ki vsebuje proteazo in inhibitor fosfatazo, se lahko uporabljata alternativno.)
• Odvisno od velikosti tkiv, lahko kratek tretma vrtinca (približno 1-2 min. v 15 sek. impulzov) pomaga pred zdravljenjem tkivo.
• Namestite mikro-konico, na primer S26d2, na ultrazvočnitor. Vzorčno cev z tkivom postavite v ledeno kopel.
• Vzorec sonicirajte z ultrazvočnim, npr. UP200St (80% amplitude) 1 min. v pulznem načinu (15sec on, 15sec pavza). Vzorec hranite v ledeni kopeli.
• Homogenati se nato centrifugirajo, da se pridobijo specifični bazeni (citosolni, jedrski, mitohondrialni ali lysosomalni), da se obogati beljakovina za analizo. S centrifugom vzorca za 5 minut pri 5000×g se supernatant pridobi.

Zanesljiv nadzor temperature med sonication

Temperatura je ključni dejavnik, ki vpliva na proces, ki je še posebej pomemben za obdelavo bioloških vzorcev, npr. Kot vse mehanske tehnike priprave vzorcev, sonication ustvarja toploto. Vendar pa je temperatura vzorcev lahko dobro nadzorovana pri uporabi Hielscher Ultrasonics naprav. Predstavljamo vam različne možnosti za spremljanje in nadzor temperature vaših vzorcev, medtem ko jih pripravljate z ultrazvočnim ali VialTweeter predhodno analitično.

1. Spremljanje temperature vzorca: Vsi Hielscher digitalni ultrazvočni procesorji so opremljeni z inteligentno programsko opremo in vtičnim senzorjem temperature. Senzor temperature priključite v ultrazvočno napravo (npr. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) in vstavite konico senzorja temperature v eno od vzorčnih cevi. Preko digitalnega barvnega zaslona na dotik lahko v meniju ultrazvočnega procesorja nastavite določen temperaturni razpon za vašo ultrazvočno ultrazvočno ultrazvočno sekacijo. Ultrasonicator se samodejno ustavi, ko doseže največjo temperaturo in ustavi, dokler temperatura vzorca ne pade na nižjo vrednost nastavljene temperature ∆. Nato se sonication začne samodejno znova. Ta pametna funkcija preprečuje degradacijo, ki jo povzroči toplota.
2. V zvezi z ultrazvočno multi-vzorec enoto VialTweeter, titanov blok, ki imajo vzorčne cevi, se lahko predhodno ohladi. Blok VialTweeter (samo sonotrode brez pretvornika!) dajte v hladilnik ali zamrzovalnik, da se blok titana pred hlajenjem preloži pri preložitvi dviga temperature v vzorcu. Če je mogoče, se lahko tudi sam vzorec predhodno ohladi.
3. Med sonikacijo uporabite ledeno kopel ali suhi led. Med sonikacijo v ledeno kopel namestite vzorčne cevi. Za VialTweeter uporabite plitvi pladenj, napolnjen s suhim ledom, in postavite VialTweeter na suhi led, da se lahko toplota hitro raztaplja.

Stranke po vsem svetu uporabljajo Hielscher probe-ultrasonicators, kot tudi multi-vzorec sonication enote VialTweeter in UIP400MTP za svoje vsakodnevno pripravo vzorca dela v bioloških, biokemičnih, medicinskih in kliničnih laboratorijih. Inteligentna programska oprema in nadzor temperature hielscher procesorjev, temperatura je zanesljivo nadzorovana in toplotno povzročeni razgradnja vzorca izogiba. Ultrazvočna priprava vzorca z Ultrazvočnimi rešitvami Hielscher prinaša zelo zanesljive in ponovljive rezultate!