Ultrazvočna priprava vzorca za teste ELISA

Testi, kot je ELISA, se pogosto uporabljajo za in vitro diagnostiko, odkrivanje beljakovin, povezanih z boleznijo, in nadzor kakovosti (npr. spremljanje alergenov na živila). Ultrazvočna priprava vzorca je hitra, zanesljiva in ponovljiva tehnika za lizo celic in izolacijo znotrajceličnih beljakovin, DNK, RNA in organelov. Hielscher Ultrasonics ponuja različne ultrazvočne rešitve za priročno pripravo posameznih vzorcev, več vial, kot tudi za mikrotitrijske plošče in 96-jamične plošče.

ELISA – Encimski imunosorbentni test

ELISA je kratica za encimski imunosorbentni test in je široko uporabljena tehnika biokemične analize v kategoriji testov, ki vežejo ligand. V ELISA se tekoči vzorec doda na stacionarno trdno fazo s posebnimi vezavnimi lastnostmi. Običajno se stacionarna trdna faza nanese kot premaz na ploščo vdolbinice ali ploščo ELISA. Nato se različni tekoči reagenti zaporedno dodajajo, inkubirajo in operejo, tako da se končno v končni tekočini v vdolbini pojavi optična sprememba (npr. Razvoj barve z produktom encimske reakcije). Optična sprememba omogoča merjenje količine analita s tako imenovanim kvantitativnim “branje". Za kvantitativno odčitavanje se uporablja spektrofotometer, fluorometer ali luminometer za zaznavanje in merjenje intenzivnosti prehodne svetlobe. Na občutljivost zaznavanja vpliva ojačitev signala med analitičnimi reakcijami. Ker so encimske reakcije dobro raziskane in zanesljive procese amplifikacije, se encimi uporabljajo za ustvarjanje signala. Encimi so povezani z reagenti za odkrivanje v fiksnih razmerjih, da se omogoči natančna kvantifikacija, kar pojasnjuje tudi ime "encimsko vezan" imunosorbentni test.
Ker se testi ELISA izvajajo na mikrotitro ploščah / 96-jamičnih ploščah, je znana kot tehnika testiranja na ploščah in se uporablja npr. v klinični in vitro diagnostiki, raziskavah, razvoju zdravil itd. za odkrivanje in kvantifikacijo protiteles, peptidov, beljakovin in hormonov.
Tehnika ELISA se pogosto uporablja kot diagnostično orodje v medicini, biotehnologiji, rastlinski patologiji in je tudi pomembna meritev nadzora kakovosti v več industrijah.

Ultrazvočna priprava vzorca pred ELISA

Preden se lahko izvede test ELISA, vzorci zahtevajo korake priprave, kot so liza celic in ekstrakcija znotrajceličnih proteinov, DNA, RNA itd. Prednost ultrazvočne lize celic in izolacije beljakovin je visoka učinkovitost, zanesljivost in ponovljivost. Vsi ti dejavniki so pomembni za pridobitev kakovostnih rezultatov diagnostike in raziskav

Protokol za ultrazvočno lizo celic pred ELISA

• Za celične kulture: Pred ultrazvočno lizo celic centrifugirajte celice 5 minut pri 270 x g v mikrocentrifugi. Supernatant odstranite z aspiracijo in resuspendirajte celice v 30 – 100 μl pufra RIPA. Nato inkubirajte celično peto na ledu 30 minut.
• Zdaj je vzorec celice pripravljen za ultrazvočno lizo:
  Uporabite ultrazvočni aparat tipa sonde (npr. UP200Ht s sondo S26d2) ali ultrazvočno napravo za več vzorcev (npr. VialTweeter za hkratno ultrazvočno razbijanje do 10 vial ali UIP400MPT za mikrotitrijske plošče / 96-jamične plošče), odvisno od količine vzorcev, ki jih morate pripraviti.
  Za sondno ultrazvočno razbijanje posameznega vzorca postavite celice v 1,5 ml epruvete z mikrocentrifugo.
• Vnaprej nastavite ultrazvočno trajanje, skupni vnos energije, način cikla in / ali temperaturne omejitve v digitalnem meniju ultrazvočnega zvočnika. To zagotavlja visoko zanesljivo ultrazvočno razbijanje in ponovljivost.
• Vstavite sonotrodo in vklopite ultrazvočno napravo. Nežno premaknite mikro konico ultrazvočne sonde skozi vzorec, da se vzorec enakomerno sonikira.
  Za večino celic bo ultrazvočna liza končana po 2-4 ciklih 10 sekund ultrazvočne obdelave.
• Po ultrazvočnem razbijanju odstranite sonotrode iz vzorca. Vzorce je treba inkubirati na ledu 5 minut. Nato centrifugiramo pri 10.000 x g 20 minut, da se ostanki peletirajo. Supernatante prenesemo v novo epruveto za mikrocentrifugo. Označite analite in shranite pri -20 °C.
• Ultrazvočno sonotrodo lahko očistimo tako, da jo pravilno obrišete z alkoholom ali sonikatom v čaši, napolnjeni z alkoholom, npr. 70% etanola. Vse ultrazvočne sonde iz titana so avtoklavne.

• Tkivo sperite z ledeno hladnim PBS (0,01 M, pH = 7,4), da temeljito odstranite odvečno kri za hemolizo.
• Stehtajte tkivo (ledvice, srce, pljuča, vranico itd.) in ga macerirajte na majhne koščke, ki so homogenizirani v PBS. Potreben volumen PBS je povezan s težo tkiva. Praviloma 1 g tkiva zahteva približno 9 ml PBS. Priporočljivo je, da PBS dodate nekaj zaviralcev proteaze. (Alternativno se lahko uporablja RIPA ali hipotonični pufer za lizo, ki vsebuje koktajl zaviralcev proteaze in fosfataze.)
• Odvisno od velikosti tkiva je lahko kratko vrtinčno zdravljenje (približno 1-2 minuti v 15 sekundah) koristno za predhodno obdelavo tkiva.
• Namestite mikro konico, npr. S26d2, na ultrazvočni aparat. Epruveto za vzorčenje s tkivom postavimo v ledeno kopel.
• Sonikirajte vzorec z ultrazvočnim aparatom, npr. UP200St (80% amplituda) za 1 minuto v impulznem načinu (15 sekund vklopljeno, 15 sekund premor). Vzorec hranite v ledeni kopeli.
• Homogenati se nato centrifugirajo, da se dobijo specifični bazeni (citosolni, jedrski, mitohondrijski ali lizosomski), da se beljakovina obogati za analizo. S centrifugiranjem vzorca 5 minut pri 5000×g se pridobi supernatant.

Zanesljiv nadzor temperature med ultrazvočnim razbijanjem

Temperatura je ključni dejavnik, ki vpliva na proces, ki je še posebej pomemben za obdelavo bioloških vzorcev, npr. za preprečevanje toplotne razgradnje beljakovin. Kot vse mehanske tehnike priprave vzorcev, ultrazvočna obdelava ustvarja toploto. Vendar pa je temperaturo vzorcev mogoče dobro nadzorovati pri uporabi naprav Hielscher Ultrasonics. Predstavljamo vam različne možnosti za spremljanje in nadzor temperature vaših vzorcev, medtem ko jih pripravljate z ultrazvočnim aparatom tipa sonde ali predanalitičnim VialTweeterjem.

1. Spremljanje temperature vzorca: Vsi Hielscher digitalni ultrazvočni procesorji so opremljeni z inteligentno programsko opremo in priključnim temperaturnim senzorjem. Priključite temperaturni senzor v ultrazvočno napravo (npr. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) in vstavite konico temperaturnega senzorja v eno od epruvet za vzorce. Z digitalnim barvnim zaslonom na dotik lahko v meniju ultrazvočnega procesorja nastavite določeno temperaturno območje za ultrazvočno razbijanje vzorca. Ultrazvočni aparat se bo samodejno ustavil, ko bo dosežena najvišja temperatura, in se ustavil, dokler se temperatura vzorca ne zniža na nižjo vrednost nastavljene temperature ∆. Nato se ultrazvočno razbijanje spet začne samodejno. Ta pametna funkcija preprečuje degradacijo, ki jo povzroča toplota.
2. Kar zadeva ultrazvočno enoto z več vzorci VialTweeter, se lahko titanov blok, ki drži cevi za vzorce, predhodno ohladi. Postavite blok VialTweeter (samo sonotrode brez pretvornika!) v hladilnik ali zamrzovalnik, da se titanov blok predhodno ohladi, pomaga odložiti dvig temperature v vzorcu. Če je mogoče, se lahko tudi sam vzorec predhodno ohladi.
3. Uporabite ledeno kopel ali suh led, da se ohladite med ultrazvočnim razbijanjem. Med ultrazvočnim razbijanjem postavite epruvete z vzorci v ledeno kopel. Za VialTweeter uporabite plitki pladenj, napolnjen s suhim ledom, in postavite VialTweeter na suh led, da se lahko toplota hitro razprši.

Kupci po vsem svetu uporabljajo ultrazvočne sonde Hielscher, kot tudi enoto za ultrazvočno razbijanje z več vzorci VialTweeter in UIP400MTP za vsakodnevno pripravo vzorcev v bioloških, biokemičnih, medicinskih in kliničnih laboratorijih. Inteligentna programska oprema in nadzor temperature Hielscherjevih procesorjev, temperatura je zanesljivo nadzorovana in prepreči toplotno povzročena degradacija vzorca. Ultrazvočna priprava vzorcev s Hielscher ultrazvočnimi raztopinami zagotavlja zelo zanesljive in ponovljive rezultate!