Ultrazvočna fragmentacija DNK za sekvenciranje naslednje generacije

Sekvenciranje naslednje generacije (NGS) zahteva zanesljivo striženje in fragmentacijo genomske DNK, da bi zaporedili verige genomske DNK in ustvarili genomske knjižnice. Nadzorovana fragmentacija DNK v fragmente DNK je bistven korak priprave vzorca, ki je potreben pred zaporedjem DNK. Ultrasonication je dokazano učinkovita in zanesljiva tehnika za fragmentacijo DNK določene dolžine. Ultrazvočni protokoli fragmentacije DNK dosegajo ponovljive rezultate fragmentacije. Hielscherjevi ultrazvočni aparati so sposobni proizvajati širok spekter porazdelitev velikosti genomskih fragmentov DNA, ki jih je mogoče natančno nadzorovati z delovnimi parametri. Ker so Hielscher ultrazvočni sistemi za striženje DNK na voljo za enojne in večkratne viale ter za mikroplošče, postane priprava vzorca zelo učinkovita.

Zaporedje naslednje generacije: ultrazvočna fragmentacija DNK za pripravo knjižnice

Za izvedbo zaporedja naslednje generacije je treba izvesti tri osnovne korake: (1) pripravo knjižnice, (2) zaporedje in (3) analizo podatkov. Med pripravo knjižnice se DNK fragmentira, nato se konci fragmentov popravijo (polirajo) z dodajanjem ene adeninske baze in ciljni fragmenti se pretvorijo v dvoverižno DNK. Končno so tako imenovani adapterji pritrjeni z ligacijo, PCR ali označevanjem, tako da se lahko končni produkt DNK v knjižnici kvantificira za sekvenciranje.
Fragmentacija DNK z uporabo ultrazvočne obdelave: Še posebej, če tehnologije sekvenciranja kratkega branja, kot je Illumina, ki ne morejo zlahka brati daljših fragmentov DNK, morajo biti stojala DNK razdrobljena do določene velikosti, ki jo je mogoče zanesljivo doseči z ultrazvokom.
Ultrasonication se lahko zanesljivo uporablja za fragmentacijo DNA, RNA in kromatina.

Zaporedje naslednje generacije – Priprava knjižnice

Ultrazvočna fragmentacija DNK se običajno uporablja pri pripravi knjižnic za sekvenciranje DNK za platforme za sekvenciranje naslednje generacije (NGS). Ta tehnika se uporablja za razbijanje molekul DNK na manjše fragmente želenega razpona velikosti, kar olajša nadaljnje korake pri pripravi knjižnice. Ultrazvočna fragmentacija DNK je običajno potrebna med korakom priprave knjižnice NGS delovnih tokov, da se genomska DNK razdeli na manjše kose, primerne za nadaljnjo obdelavo in zaporedje. Igra ključno vlogo pri zagotavljanju uspeha poskusa sekvenciranja z ustvarjanjem fragmentov DNK ustreznega razpona velikosti za določeno uporabljeno platformo za sekvenciranje.

Zaporedje naslednje generacije – Koraki postopka:

• Ultrazvočna fragmentacija DNK: Pred izgradnjo knjižnice je genomska DNK razdrobljena na manjše, bolj obvladljive dele. Ultrazvočna fragmentacija vključuje uporabo visokofrekvenčnih zvočnih valov za striženje molekul DNA v fragmente želenega razpona velikosti. Ta korak je ključnega pomena, ker pomaga zagotoviti, da bodo pozneje ustvarjeni odčitki zaporedja primerne dolžine za uporabljeno platformo za zaporedje. Razpon velikosti fragmentov se lahko prilagodi glede na posebne zahteve poskusa zaporedja.
• Klonska amplifikacija s PCR: Po ultrazvočni fragmentaciji so fragmenti DNK podvrženi končnemu popravilu, adapterski ligaciji in PCR amplifikaciji, da se ustvarijo končne knjižnice za sekvenciranje DNK. Ti koraki pripravijo fragmentirane molekule DNA za postopek zaporedja z dodajanjem adapterskih zaporedij, potrebnih za vezavo na platformo za sekvenciranje, in zagotavljanjem mest za povečanje PCR.
• Zaporedje DNK s sintezo: Ko so knjižnice za sekvenciranje pripravljene, se začne postopek sekvenciranja DNK s sintezo (SBS). Med SBS se zaporedje DNK določi z zaporednim dodajanjem nukleotidov v komplementarno verigo. Ta korak vključuje ciklične reakcije vgradnje nukleotidov, slikanja in cepitve, kar omogoča določanje zaporedja DNK na podlagi fluorescentnih signalov, ki jih oddajajo vključeni nukleotidi.
• Množično vzporedno zaporedje: V zadnjem koraku se prostorsko ločene, ojačene predloge DNK sekvencirajo istočasno na zelo vzporeden način. Ta visoko zmogljiv pristop zaporedja omogoča ustvarjanje milijonov do milijard branih zaporedij v enem zaporedju, kar omogoča učinkovito in hitro določanje zaporedij DNK.

Kako deluje ultrazvočna fragmentacija DNK?

Ultrazvočna obdelava, znana tudi kot akustična obdelava vzorcev, je široko uporabljena metoda za fragmentacijo DNK. Za ultrazvočno striženje DNK so vzorci izpostavljeni ultrazvočnim valovom v nadzorovanih pogojih. Načelo delovanja ultrazvočne fragmentacije DNA temelji na vibracijah in kavitaciji, ki jih ustvarjajo ultrazvočni valovi. Strižne sile, ki so posledica ultrazvočne (akustične) kavitacije, razbijejo molekule DNK z visoko molekulsko maso. Nastavitev ultrazvočne obdelave, kot so intenzivnost (amplituda, trajanje), način pulziranja in temperatura, omogočajo natančno fragmentacijo DNK na določeno želeno dolžino fragmentov DNA. Medtem ko se DNK pogosto zmanjša na 100 do 600 bp z uporabo ultrazvoka, lahko dobimo daljše fragmente DNK do 1300 bp, ko se uporabijo blažji ultrazvočni pogoji.

Nadzor temperature za preprečevanje razgradnje DNK

Dvoverižna molekularna oblika DNK je zelo občutljiva na povišane temperature, tako da je natančen nadzor nad temperaturo med koraki priprave vzorca ključni dejavnik za zanesljive rezultate analize.
Ne glede na to, ali uporabljate Hielscherjeve ultrazvočne sonde, VialTweeter ali UIP400MTP – Neprekinjeno spremljanje in nadzor temperature je zagotovljen s priključnim temperaturnim senzorjem in programsko opremo pametne naprave. Da bi ohranili temperaturo v določenem območju, lahko nastavite zgornjo in spodnjo temperaturno mejo. Posledično se bo ultrazvočni aparat ustavil takoj, ko bo ta temperaturna meja presežena, in bo samodejno nadaljeval s sonikiranjem, ko se temperatura zniža za nastavljeno ∆T.
Prefinjena programska oprema Hielscher ultrasonicators zagotavlja zanesljivo vzdrževanje idealnih pogojev obdelave vzorcev.

Fragmentacija DNK množičnega vzorca z ultrazvočnim aparatom z več vdolbicami UIP400MTP

Število vzorcev v znanosti o življenju se je v zadnjem desetletju znatno povečalo. To pomeni, da je treba med pripravo in analizo vzorcev obdelati zelo veliko število vzorcev (npr. 384, 1536 ali 3456 jamic na mikroploščo) pod dosledno enakimi pogoji, da se dobijo primerljivi in veljavni rezultati. S UIP400MTP Hielscher Ultrasonics sledi trendu množične obdelave vzorcev. UIP400MTP je ultrazvočni aparat za pripravo vzorcev z uporabo mikroplošč. UIP400MTP lahko obdeluje plošče s 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 ali 3456 vdolbinicami. Odvisno od vrste mikroplošče lahko vsaka jaminica običajno vsebuje prostornino vzorca med več deset nanolitri in nekaj mililitri. Pogosto se uporablja v raziskavah znanosti o življenju, UIP400MTP se zelo pogosto uporablja za pripravo vzorcev pred testi, kot so ELISA (encimski imunosorbentni test) ali PCR, pred analitiko beljakovin, kot tudi za pripravo kromatina pred CHiP in CHiP-seq, identifikacijo modifikacije histona in drugimi analitičnimi obdelavami (npr. Gel elektroforeza, masna spektrometrija).
Preberite več o visokozmogljivi obdelavi PCR plošč!

VialTweeter za pripravo vzorcev do 10 vial

VialTweeter je široko uporabljen laboratorijski ultrazvočni zvočnik VialTweeter, ki omogoča učinkovito in udobno ultrazvočno razbijanje do 10 vial hkrati. Ker so viale in epruvete (npr. Eppendorfove viale, krio viale, centrifugalne epruvete) posredno ultrazvočno obdelane, se izognemo navzkrižni kontaminaciji. Ker je vsakemu vzorcu dostavljena enaka intenzivnost ultrazvoka, so vsi rezultati ultrazvočnega razbijanja homogeni in ponovljivi. VialTweeter ponuja vse pametne funkcije, kot so naše druge digitalne naprave (npr. pametni meni, programabilne nastavitve, nadzor temperature, daljinski upravljalnik itd.), tako da je zagotovljeno najvišje udobje uporabnika.

Sonde z več prsti za plošče z mikrovdolbicami

Na voljo za homogenizatorje ultrazvočnih sond UP200Ht in UP200St, sonde z več prsti s 4 ali 8 prsti so udobna možnost za sonikiranje več vzorcev hkrati pod enakimi pogoji. Na primer, sonotroda MTP-24-8-96 je sonda z osmimi prsti, ki je idealna za integracijo v avtomatizirane sisteme ali učinkovito ročno pripravo vzorcev jamic plošč z več vdolbicami. Sonotroda z več prsti je idealna za avtomatizirane laboratorije, kjer se večinoma obdelujejo čaše in epruvete s standardno ultrazvočno sonotrodo. Sonde z več prsti in standardne sonde se lahko hitro zamenjajo v nekaj minutah, tako da ultrazvočni zvočnik z eno sondo spremenijo v ultrazvočni motilec z več sondami.

Hielscher ultrazvočni aparati za fragmentacijo DNK

Hielscher Ultrasonics ponuja različne ultrazvočne platforme za fragmentacijo DNA, RNA in kromatina. Te različne platforme vključujejo ultrazvočne sonde (sonotrode), posredne ultrazvočne raztopine za hkratno pripravo vzorcev več cevi ali plošč z več vdolbicami (npr. 96-vdolbine plošče, mikrotitrijske plošče), sonoreaktorje in ultrazvočne cuphorns. Vse platforme za striženje DNK poganjajo frekvenčno uglašeni, visoko zmogljivi ultrazvočni procesorji, ki jih je mogoče natančno nadzorovati in dajejo ponovljive rezultate.

Ultrazvočni procesorji za vsako število in velikost vzorca

S Hielscherjevimi ultrazvočnimi aparati z več vzorci VialTweeter (za do 10 epruvet) in UIP400MTP (za mikroplošče / plošče z več jamicami) je enostavno mogoče skrajšati čas obdelave vzorca zaradi intenzivne in natančno nadzorovane ultrazvočne obdelave, hkrati pa doseči želeno porazdelitev velikosti fragmentov DNK in donos. Ultrazvočna fragmentacija DNK omogoča učinkovito pripravo vzorcev, zanesljivo in prilagodljivo. Protokoli se lahko linearno razširijo od enega do številnih vzorcev z uporabo stalno nadzorovanega ultrazvoka.
Ultrazvočni sondatorji z enim do petimi prsti so idealni za pripravo manjših vzorcev. Hielscherjevi laboratorijski ultrazvočni aparati so na voljo v različnih velikostih, tako da vam lahko priporočimo idealno napravo za vašo aplikacijo in zahteve.

natančen nadzor procesa

Natančno nadzorovane nastavitve ultrazvočne razbijanja so ključnega pomena, saj lahko izčrpna sonifikacija uniči DNK, RNA in kromatin, vendar neustrezno ultrazvočno striženje povzroči predolge fragmente DNK in kromatina. Hielscherjeve digitalne ultrazvočne aparate je mogoče enostavno nastaviti na natančen parameter ultrazvočnega razbijanja. Posebne nastavitve ultrazvočnega razbijanja lahko shranite tudi kot programirano nastavitev za hitro ponavljanje istega postopka.
Vsa ultrazvočna obdelava se samodejno protokolira in shrani kot datoteka CSV na vgrajeni kartici SD. To omogoča natančno dokumentacijo opravljenih poskusov in omogoča enostavno revizijo ultrazvočnih tekov.
Z daljinskim upravljalnikom brskalnika lahko vse digitalne ultrazvočne naprave upravljate in spremljate prek katerega koli standardnega brskalnika. Namestitev dodatne programske opreme ni potrebna, saj povezava LAN omogoča zelo preprosto nastavitev plug-n-play.

Najvišja prijaznost do uporabnika pri pripravi ultrazvočnih vzorcev

Vsi Hielscher ultrazvočni aparati so zasnovani tako, da zagotavljajo visoko zmogljiv ultrazvok, hkrati pa so vedno zelo uporabniku prijazni in enostavni za uporabo. Vse nastavitve so dobro strukturirane v jasnem meniju, do katerega lahko enostavno dostopate prek barvnega zaslona na dotik ali daljinskega upravljalnika brskalnika. Pametna programska oprema s programabilnimi nastavitvami in samodejnim beleženjem podatkov zagotavlja optimalne nastavitve ultrazvočne obdelave za zanesljive in ponovljive rezultate. Čist in enostaven za uporabo vmesnik menija spremeni Hielscher ultrazvočne naprave v uporabniku prijazne in učinkovite naprave.
Spodnja tabela vam prikazuje približno zmogljivost obdelave naših laboratorijskih ultrazvočnih aparatov, ki so idealni za naloge priprave vzorcev, kot so fragmentacija DNA in RNA, liza celic in ekstrakcija beljakovin: