Ultrazvočna fragmentacija DNA za sekvenciranje naslednje generacije

Sekvenciranje naslednje generacije (NGS) zahteva zanesljivo striženje in fragmentacijo genomske DNA za sekvenciranje verig genomske DNA in pripravo genomskih knjižnic. Nadzorovana fragmentacija DNA v fragmente DNA je bistven korak priprave vzorcev, ki je potreben pred sekvenciranjem DNA. Sonikacija je dokazano učinkovita in zanesljiva tehnika za fragmentacijo DNA na določeno dolžino. Protokoli ultrazvočne fragmentacije DNA zagotavljajo ponovljive rezultate fragmentacije. Ultrazvočne naprave Hielscher omogočajo doseganje širokega razpona porazdelitev velikosti fragmentov genomske DNA, ki jih je mogoče natančno nadzorovati z obratovalnimi parametri. Ker so sistemi Hielscher za ultrazvočno striženje DNA na voljo za posamezne in več vial ter za mikroplošče, postane priprava vzorcev zelo učinkovita.

Sekvenciranje naslednje generacije: ultrazvočna fragmentacija DNA za pripravo knjižnic

Za izvedbo sekvenciranja naslednje generacije je treba opraviti tri osnovne korake: (1) pripravo knjižnice, (2) sekvenciranje in (3) analizo podatkov. Med pripravo knjižnice se DNA fragmentira, nato se konci fragmentov popravijo (zgladijo) z dodatkom ene adeninske baze, ciljni fragmenti pa se pretvorijo v dvoverižno DNA. Nazadnje se z ligacijo, PCR ali tagmentacijo pritrdijo tako imenovani adapterji, da je mogoče končni produkt DNA knjižnice količinsko ovrednotiti za sekvenciranje.
Fragmentacija DNA s sonikacijo: Zlasti pri uporabi tehnologij sekvenciranja s kratkimi odčitki, kot je Illumina, ki ne morejo zlahka odčitati daljših fragmentov DNA, je treba verige DNA fragmentirati na določeno velikost, kar je mogoče zanesljivo doseči s sonikacijo.
Sonikacijo je mogoče zanesljivo uporabljati za fragmentacijo DNA, RNA in kromatina.

Sekvenciranje naslednje generacije – priprava knjižnic

Ultrazvočna fragmentacija DNA se pogosto uporablja pri pripravi knjižnic za sekvenciranje DNA na platformah za sekvenciranje naslednje generacije (NGS). Ta tehnika se uporablja za razbijanje molekul DNA na manjše fragmente v želenem velikostnem razponu, kar olajša nadaljnje korake pri pripravi knjižnic. Ultrazvočna fragmentacija DNA je običajno potrebna med korakom priprave knjižnice v delovnih postopkih NGS, da se genomska DNA fragmentira na manjše dele, primerne za nadaljnjo obdelavo in sekvenciranje. Ima ključno vlogo pri zagotavljanju uspeha poskusa sekvenciranja, saj ustvarja fragmente DNA v velikostnem razponu, ustreznem za uporabljeno platformo za sekvenciranje.

Sekvenciranje naslednje generacije – koraki postopka:

• Ultrazvočna fragmentacija DNA: Pred pripravo knjižnice se genomska DNA fragmentira na manjše dele, s katerimi je lažje ravnati. Ultrazvočna fragmentacija vključuje uporabo visokofrekvenčnih zvočnih valov za striženje molekul DNA v fragmente želenega velikostnega razpona. Ta korak je ključen, saj pomaga zagotoviti, da bodo pozneje ustvarjeni odčitki sekvenciranja ustrezne dolžine za uporabljeno platformo za sekvenciranje. Velikostni razpon fragmentov je mogoče prilagoditi posebnim zahtevam poskusa sekvenciranja.
• Klonalno pomnoževanje s PCR: Po ultrazvočni fragmentaciji se na fragmentih DNA izvedejo popravilo koncev, ligacija adapterjev in pomnoževanje s PCR, da se pripravijo končne knjižnice za sekvenciranje DNA. Ti koraki pripravijo fragmentirane molekule DNA za postopek sekvenciranja z dodajanjem adapterskih zaporedij, potrebnih za vezavo na platformo za sekvenciranje, in zagotavljanjem mest za vezavo začetnih oligonukleotidov za pomnoževanje s PCR.
• Sekvenciranje DNA s sintezo: Ko so knjižnice za sekvenciranje pripravljene, se začne postopek sekvenciranja DNA s sintezo (SBS). Med SBS se zaporedje DNA določi z zaporednim dodajanjem nukleotidov komplementarni verigi. Ta korak vključuje ciklične reakcije vgrajevanja nukleotidov, zajemanja slik in cepitve, kar omogoča določanje zaporedja DNA na podlagi fluorescenčnih signalov, ki jih oddajajo vgrajeni nukleotidi.
• Masovno vzporedno sekvenciranje: V zadnjem koraku se prostorsko ločene, pomnožene matrice DNA sekvencirajo sočasno na masovno vzporeden način. Ta pristop sekvenciranja z visoko zmogljivostjo omogoča ustvarjanje od milijonov do milijard odčitkov sekvenciranja v eni izvedbi sekvenciranja ter s tem učinkovito in hitro določanje zaporedij DNA.

Kako deluje ultrazvočna fragmentacija DNA?

Sonikacija, znana tudi kot akustična obdelava vzorcev, je široko uporabljena metoda za fragmentacijo DNA. Pri ultrazvočnem striženju DNA so vzorci izpostavljeni ultrazvočnim valovom v nadzorovanih pogojih. Načelo delovanja ultrazvočne fragmentacije DNA temelji na vibracijah in kavitaciji, ki jih ustvarjajo ultrazvočni valovi. Strižne sile, ki nastanejo zaradi ultrazvočne (akustične) kavitacije, razbijajo molekule DNA z visoko molekulsko maso. Nastavitve sonikacije, kot so intenzivnost (amplituda, trajanje), pulzni način in temperatura, omogočajo natančno fragmentacijo DNA na določeno želeno dolžino fragmentov DNA. Medtem ko se DNA s sonikacijo pogosto skrajša na 100 do 600 bp, je pri blažjih ultrazvočnih pogojih mogoče pridobiti daljše fragmente DNA, dolge do 1300 bp.

Nadzor temperature za preprečevanje razgradnje DNA

Dvoverižna molekulska struktura DNA je zelo občutljiva na povišane temperature, zato je natančen nadzor temperature med koraki priprave vzorcev ključen dejavnik za zanesljive rezultate analiz.
Ne glede na to, ali uporabljate ultrazvočne naprave Hielscher s sondo, VialTweeter ali UIP400MTP – stalno spremljanje in nadzor temperature zagotavljata priključljiv temperaturni senzor in pametna programska oprema naprave. Za ohranjanje temperature v določenem razponu lahko nastavite zgornjo in spodnjo temperaturno mejo. Ultrazvočna naprava zato prekine delovanje takoj, ko je ta temperaturna meja presežena, in samodejno nadaljuje sonikacijo, ko se temperatura zniža za nastavljeni ∆T.
Napredna programska oprema ultrazvočnih naprav Hielscher zagotavlja zanesljivo ohranjanje idealnih pogojev obdelave vzorcev.

Fragmentacija DNA v velikem številu vzorcev z ultrazvočno napravo UIP400MTP za plošče z več vdolbinicami

Število vzorcev v vedah o življenju se je v zadnjem desetletju znatno povečalo. To pomeni, da je treba med pripravo vzorcev in analizo obdelati zelo veliko število vzorcev (npr. 384, 1536 ali 3456 vdolbinic na mikroploščo) v dosledno enakih pogojih, da bi pridobili primerljive in veljavne rezultate. Z napravo UIP400MTP Hielscher Ultrasonics sledi trendu obdelave velikega števila vzorcev. UIP400MTP je ultrazvočna naprava za pripravo vzorcev z uporabo mikroplošč. UIP400MTP lahko obdeluje plošče s 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 ali 3456 vdolbinicami. Glede na vrsto mikroplošče lahko posamezna vdolbinica običajno vsebuje vzorce s prostornino od več deset nanolitrov do več mililitrov. UIP400MTP, ki se široko uporablja pri raziskavah v vedah o življenju, se zelo pogosto uporablja za pripravo vzorcev pred testi, kot sta ELISA (encimsko vezani imunosorbentni test) ali PCR, pred analizami beljakovin ter za pripravo kromatina pred CHiP in CHiP-seq, identifikacijo modifikacij histonov in drugimi analitskimi obdelavami (npr. gelsko elektroforezo, masno spektrometrijo).
Preberite več o obdelavi plošč PCR z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev!

VialTweeter za pripravo vzorcev v do 10 vialah

VialTweeter je široko uporabljena laboratorijska ultrazvočna naprava VialTweeter, ki omogoča učinkovito in priročno sonikacijo do 10 vial sočasno. Ker se viale in epruvete (npr. viale Eppendorf, krioviale, centrifugirne epruvete) sonificirajo posredno, se prepreči vsakršna navzkrižna kontaminacija. Ker se vsakemu vzorcu dovaja enaka ultrazvočna intenzivnost, so vsi rezultati sonikacije homogeni in ponovljivi. VialTweeter ponuja vse pametne funkcije kot naše druge digitalne naprave (npr. pametni meni, programirljive nastavitve, nadzor temperature, daljinsko upravljanje itd.), kar zagotavlja največje udobje za uporabnika.

Večprstne sonde za plošče z mikrovdolbinicami

Večprstne sonde s 4 ali 8 prsti, ki so na voljo za ultrazvočna homogenizatorja s sondo UP200Ht in UP200St, so priročna možnost za sočasno sonikacijo več vzorcev v enakih pogojih. Sonotroda MTP-24-8-96 je na primer osemprstna sonda, ki je idealna za vključitev v avtomatizirane sisteme ali učinkovito ročno pripravo vzorcev v vdolbinicah plošč z več vdolbinicami. Večprstna sonotroda je idealna za avtomatizacijo v laboratorijih, kjer se večinoma obdelujejo vzorci v čašah in epruvetah s standardno ultrazvočno sonotrodo. Večprstne in standardne sonde je mogoče hitro zamenjati v nekaj minutah ter tako ultrazvočno napravo z eno sondo pretvoriti v ultrazvočno napravo za razgradnjo z več sondami.

Ultrazvočne naprave Hielscher za fragmentacijo DNA

Hielscher Ultrasonics ponuja različne platforme na osnovi ultrazvoka za fragmentacijo DNA, RNA in kromatina. Te različne platforme vključujejo ultrazvočne sonde (sonotrode), rešitve za posredno sonikacijo za sočasno pripravo vzorcev v več epruvetah ali ploščah z več vdolbinicami (npr. ploščah s 96 vdolbinicami, mikrotitrskih ploščah), sonoreaktorje in ultrazvočne naprave CupHorn. Vse platforme za striženje DNA poganjajo frekvenčno uglašeni visokozmogljivi ultrazvočni procesorji, ki jih je mogoče natančno nadzorovati in zagotavljajo ponovljive rezultate.

Ultrazvočni procesorji za poljubno število in velikost vzorcev

Z ultrazvočnima napravama Hielscher za več vzorcev VialTweeter (za do 10 epruvet) in UIP400MTP (za mikroplošče / plošče z več vdolbinicami) je zaradi intenzivne in natančno nadzorovane sonikacije preprosto mogoče skrajšati čas obdelave vzorcev ter hkrati doseči želeno porazdelitev velikosti fragmentov DNA in izkoristek. Ultrazvočna fragmentacija DNA omogoča učinkovito in zanesljivo pripravo vzorcev, katere obseg je mogoče prilagajati. Protokole je mogoče linearno prilagajati od enega do številnih vzorcev z uporabo stalno nadzorovanega ultrazvoka.
Ultrazvočne naprave s sondami z enim do petimi prsti so idealne za pripravo manjšega števila vzorcev. Laboratorijske ultrazvočne naprave Hielscher so na voljo v različnih velikostih, zato vam lahko priporočimo idealno napravo za vašo uporabo in zahteve.

Natančen nadzor procesa

Natančno nadzorovane nastavitve sonikacije so ključne, saj lahko pretirana sonikacija uniči DNA, RNA in kromatin, nezadostno ultrazvočno striženje pa povzroči predolge fragmente DNA in kromatina. Digitalne ultrazvočne naprave Hielscher je mogoče preprosto nastaviti na natančne parametre sonikacije. Določene nastavitve sonikacije je mogoče shraniti tudi kot programirane nastavitve za hitro ponovitev istega postopka.
Vse sonikacije se samodejno beležijo in shranjujejo kot datoteke CSV na vgrajeno kartico SD. To omogoča natančno dokumentiranje izvedenih poskusov in preprost pregled izvedb sonikacije.
Z daljinskim upravljanjem prek brskalnika je mogoče vse digitalne ultrazvočne naprave upravljati in spremljati prek katerega koli standardnega brskalnika. Namestitev dodatne programske opreme ni potrebna, saj povezava LAN omogoča zelo preprosto nastavitev po načelu priključi in uporabljaj.


Največja prijaznost do uporabnika pri ultrazvočni pripravi vzorcev

Vse ultrazvočne naprave Hielscher so zasnovane tako, da zagotavljajo visokozmogljiv ultrazvok, hkrati pa so vedno zelo prijazne do uporabnika in preproste za upravljanje. Vse nastavitve so dobro strukturirane v preglednem meniju, do katerega je mogoče preprosto dostopati prek barvnega zaslona na dotik ali daljinskega upravljanja prek brskalnika. Pametna programska oprema s programirljivimi nastavitvami in samodejnim beleženjem podatkov zagotavlja optimalne nastavitve sonikacije za zanesljive in ponovljive rezultate. Pregleden menijski vmesnik, ki je preprost za uporabo, naredi ultrazvočne naprave Hielscher uporabniku prijazne in učinkovite.
Spodnja tabela prikazuje približno zmogljivost obdelave naših laboratorijskih ultrazvočnih naprav, ki so idealne za pripravo vzorcev, kot so fragmentacija DNA in RNA, liza celic ter ekstrakcija beljakovin: