Ultrazvočna liza vzorcev Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster se pogosto uporablja v laboratorijih kot modelni organizem. Zato je treba pogosto izvajati predanalitične korake priprave, kot so liza, motnje celic, ekstrakcija beljakovin in striženje DNK vzorcev Drosophila melanogaster. Ultrazvočni dismembatorji so zanesljivi in učinkoviti in se lahko uporabljajo za opravljanje različnih nalog, kot so liza, ekstrakcija beljakovin ali fragmentacija DNK, z lahkoto prilagajanjem ultrazvočnih procesnih parametrov. Ultrazvočni homogenizatorji so tako prilagodljiva orodja s širokim spektrom uporabe.

Ultrazvočna liza in ekstrakcija beljakovin

Liza, raztapljanje celic, homogenizacija tkiva in ekstrakcija beljakovin so tipične naloge za ultrazvočne disembatorje v bioloških laboratorijih. Ultrazvočni dismembratorji in celični motilci so primerni za homogenizacijo živalskih tkiv, žuželk (npr. Drosophila melanogaster, C. elegans) ali rastlinskih vzorcev. Nadaljnje aplikacije ultrazvočne obdelave so liza celičnih suspenzij in peletov ter ekstrakcija znotrajceličnih beljakovin.
Ultrazvočna liza in ekstrakcija beljakovin sta zelo zanesljiva in ponovljiva procesa, ki se lahko izvajata na podlagi uveljavljenih protokolov. Ker je intenzivnost ultrazvočnega procesa mogoče natančno prilagoditi s parametri ultrazvočnega razbijanja, kot so amplituda, cikel / impulzni način, temperatura in prostornina vzorca, se lahko po dokazanih protokolih ponavljajo z istim rezultatom znova in znova.

Ultrazvočna fragmentacija DNA in RNA

Po lizi celic in ekstrakciji beljakovin je pogost potreben korak pri pripravi vzorca striženje in fragmentacija DNA, RNA in kromatina, npr. pred kromatinsko imunoprecipitacijo (ChIP). Fragmentacijo DNK in RNA je mogoče zanesljivo doseči z razbijanjem kovalentnih vezi, ki držijo DNK skupaj s fizičnimi silami. Z uporabo fizičnega striženja, kot je ultrazvočno razbijanje, se najprej razbijejo verige DNK, nato pa se DNK razpade na manjše koščke.
Ultrazvočna fragmentacija DNA je zanesljiva in učinkovita pri striženju DNK do ciljne dolžine, npr. 500 bp (bazni pari). Glavne prednosti ultrazvočne fragmentacije DNA vključujejo natančen nadzor parametrov in intenzivnosti ultrazvočnega procesa. Ultrazvočne procesne parametre je mogoče prilagoditi z natančno nastavitvijo intenzivnosti ultrazvočne obdelave, ciklov in časa. To omogoča ustvarjanje želenih velikosti DNK, ciljno dolžino DNK pa je mogoče zanesljivo izdelati in reproducirati. Ultrazvočno striženje DNK je idealno tudi za ustvarjanje fragmentov DNK z visoko molekulsko maso.

Protokoli za ultrazvočno lizo Drosophila melanogaster

Spodaj lahko najdete različne protokole za ultrazvočno podprto lizo, ekstrakcijo beljakovin in fragmentacijo DNK ali kromatina vzorcev Drosophila.

Ultrazvočna liza za test navzkrižnega povezovanja imunoprecipitacije (CLIP)

Test CLIP je bil izveden, kot je bilo prej poročano, z nekaterimi spremembami. Približno 20 mg jajčnikov od 0- do 1 dan starih samic divjega tipa je bilo UV premreženih (3 × 2000 μJ/cm2), homogeniziranih na ledu v 1 ml pufra RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saharoza, 1 mM DTT, 1× zaviralci popolne proteaze brez EDTA, 1 mM PMSF), dopolnjeni s 300 U RNAseOUT in postavljeni na led za 30 minut. Homogenat je bil sonikiran na ledu, pri 80% moči, petkrat v 20 s izbruhih s 60 s počitkom vmes z uporabo Hielscherjevega ultrazvočnega procesorja UP100H (100 W, 30 kHz) in centrifugirano (16000 × g 5 minut pri 4 °C). Topni ekstrakt je bil predhodno očiščen z 20 μl Protein-G dynabeads za 20 minut pri 4 °C. Po odstranitvi vzorcev za imunoblotacijo in kvantifikaciji vnosa RNA (1%) je bil HP1 imunoprecipitiran s protitelesom anti-HP1 9A9 iz 450 μl predhodno očiščenega ekstrakta z inkubacijo 4 ure s 50 μl Protein-G dynabeads. Imunoprecipitati so bili 4-krat oprani z RCB. Da bi izlugli imunoprecipitirane RNA, so peletirane kroglice kuhali v 100 μl vode, obdelane z UltraPure DEPC, 5 minut. 900 μL Qiazol Reagent je bil dodan supernatantu, pridobljenemu za pripravo RNA. Prečiščena RNA je bila uporabljena kot predloga za sintezo cDNA z uporabo oligo dT, naključnih heksamerjev in reverzne transkriptaze SuperScript III v skladu s protokolom proizvajalca.
(Cassale et al. 2019)

Ultrazvočna liza za test kromatinske imunoprecipitacije

Kromatinsko imunoprecipitacijo smo izvedli po metodi, ki jo je opisal Menet, z manjšimi spremembami. Približno 20 mg jajčnikov od 0- do 1 dan starih samic divjega tipa je bilo homogeniziranih v 1 ml pufra NEB (10 mM HEPES-Na pri pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pri pH 8, 0,5 mM EDTA-Na pri pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidina, 0,15 mM spermina, 1× zaviralcev popolne proteaze brez EDTA) s homogenizatorjem / potopnim dispergatorjem 1 min (pri 3000 vrtljajih na minuto). Homogenat je bil prenesen v predhodno ohlajeno steklo in s tesnim pestilom je bilo nanesenih 15 polnih udarcev. Prosta jedra so nato centrifugirali pri 6000xg 10 minut pri 4 °C. Peleti, ki vsebujejo jedra, so bili resuspendirani v 1 ml NEB in centrifugirani pri 20000 × g 20 minut na gradientu saharoze (0,65 ml 1,6 M saharoze v NEB, 0,35 ml 0,8 M saharoze v NEB). Pelet je bil resuspendiran v 1 ml NEB in formaldehida do končne koncentracije 1%. Jedra so bila premrežena 10 minut pri sobni temperaturi in ugasnjena z dodajanjem 1/10 vol 1,375 M glicina. Jedra so bila zbrana s centrifugiranjem pri 6000 × g 5 minut. Jedra so bila dvakrat oprana v 1 ml NEB in resuspendirana v 1 ml pufra za lizo (15 mM HEPES-Na pri pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pri pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na deoksiholat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarkozin in 1× zaviralci popolne proteaze brez EDTA). Jedra so bila sonikirana z uporabo Hielscherjevega ultrazvočnega procesorja UP100H (100 W, 30 kHz) šestkrat za 20 s na ledu in 1 min na ledu. Sonikirana jedra so centrifugirali pri 13000 × g 4 minute pri 4 °C. Večina ultrazvočnega kromatina je bila dolga od 500 do 1000 baznih parov (bp). Za vsako imunoprecipitacijo smo inkubirali 15 μg kromatina v prisotnosti 10 μg monoklonskega protitelesa HP1 9A9 (3 ure pri 4 °C v vrtečem se kolesu). Nato je bilo dodanih 50 μl dynabeads proteina G in inkubacija se je nadaljevala čez noč pri 4 °C. Supernatanti so bili zavrženi in vzorci so bili dvakrat oprani v pufru za lizo (vsako pranje 15 minut pri 4 °C) in dvakrat v pufru TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pri pH 8). Kromatin je bil eluiran iz kroglic v dveh korakih; najprej v 100 μl eluitijskega pufra 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pri pH 8) pri 65 °C za 15 minut, čemur sledi centrifugiranje in pridobivanje supernatanta. Material kroglic je bil ponovno ekstrahiran v 100 μl TE + 0,67% SDS. Kombinirani eluat (200 μl) so čez noč inkubirali pri 65 °C, da bi obrnili navzkrižne povezave, in obdelali s 50 μg/ml RNaze A 15 minut pri 65 °C in s 500 μg/ml proteinaze K 3 ure pri 65 °C. Vzorci so bili ekstrahirani fenol-kloroform in oborjeni etanol. DNK je bila resuspendirana v 25 μl vode. Za maksimiranje molekularnih analiz z imunoprecipitirano DNK so bili geni kandidati pomnoženi v parih z optimiziranim dupleks-PCR protokolom z uporabo dveh različnih sklopov začetnih premazov s podobnimi temperaturami taljenja v eni sami reakciji.
(Casale et al. 2019)
 

Visoko zmogljivi ultrazvočni motilci celic za biološke vzorce

Hielscher Ultrasonics je vaš dolgoletni izkušen partner, ko gre za visoko zmogljive ultrazvočne naprave za celične motnje, lizo, ekstrakcijo beljakovin, fragmentacijo DNA, RNA in kromatina ter druge korake priprave vzorcev pred analitiko. Ponuja obsežen portfelj ultrazvočnih laboratorijskih homogenizatorjev in enot za pripravo vzorcev, Hielscher ima idealno ultrazvočno napravo za vašo biološko uporabo in zahteve.
Klasični ultrazvočni aparat s sondo z mikro konico, kot je UP200St (200W; glej sliko levo) ali eno od ultrazvočnih enot za pripravo vzorcev VialTweeter ali UP200St_TD_CupHorn z VialHolder so priljubljeni modeli v raziskovalnih in analitičnih laboratorijih. Klasična ultrazvočna sonda je idealna, ko je treba pripraviti manj vzorcev, ki jih je treba lizirati, ekstrahirati ali razdrobiti. Enote za pripravo vzorcev VialTweeter in UP200St_TD_CupHorn omogočajo sočasno ultrazvočno razbijanje do 10 oziroma 5 vial.
Če je treba obdelati veliko število vzorcev (npr. plošče s 96 jamicami, mikrotitrijske plošče itd.), UIP400MTP je idealna nastavitev ultrazvočnega razbijanja. UIP400MTP deluje kot večja skodelica, ki je napolnjena z vodo in ima dovolj prostora za shranjevanje mikro plošč. Poganja ga 400-vatni zmogljiv ultrazvočni procesor, UIP400MTP zagotavlja zelo enakomerno in intenzivno ultrazvočno razbijanje plošč z več vdolbinicami, da bi motil celice, liziral vzorce, raztapljal pelete, ekstrahiral beljakovine ali strižno DNK.

Natančen nadzor s pametno programsko opremo

Vse Hielscher ultrazvočne rešitve od 200 W navzgor so opremljene z digitalnim barvnim zaslonom na dotik in inteligentno programsko opremo. Prek pametnega protokoliranja podatkov se vsi ultrazvočni procesni parametri samodejno shranijo kot CSV datoteko na vgrajeno SD kartico takoj, ko se ultrazvočni aparat zažene. Zaradi tega je raziskovanje in protokoliranje veliko bolj priročno. Po poskusih ultrazvočnega razbijanja ali pripravi vzorca lahko preprosto pregledate parametre ultrazvočnega razbijanja vsake ultrazvočne vožnje in jih primerjate.
Prek intuitivnega menija lahko pred ultrazvočno obdelavo vnaprej nastavite številne parametre: Na primer, za nadzor temperature v vzorcu in preprečevanje njegove toplotne degradacije lahko nastavite zgornjo mejo temperature vzorca. Vtični temperaturni senzor, ki je priložen ultrazvočni enoti, daje ultrazvočnemu procesorju povratne informacije o dejanski temperaturi ultrazvočne obdelave. Ko je dosežena zgornja temperaturna meja, se ultrazvočna naprava ustavi, dokler ne doseže spodnje meje nastavljene ∆T, in se nato samodejno spet začne sonicing.
Če je potrebna ultrazvočna vonj z določenim vnosom energije, lahko prednastavite končno ultrazvočno energijo ultrazvočne vožnje. Seveda lahko individualno nastavite tudi ultrazvočno pulziranje in način cikla.
Če želite ponovno uporabiti svoje najuspešnejše parametre ultrazvočnega razbijanja, lahko shranite različne načine ultrazvočnega razbijanja (npr. Čas ultrazvočnega razbijanja, intenzivnost, način cikla itd.) kot vnaprej nastavljene načine, tako da jih je mogoče enostavno in hitro znova zagnati.
Za večje udobje delovanja lahko vse digitalne ultrazvočne enote upravljate prek daljinskega upravljalnika brskalnika v katerem koli običajnem brskalniku (npr. InternetExplorer, Safari, Chrome itd.). Povezava LAN je preprosta nastavitev plug-n-play in ne zahteva dodatne namestitve programske opreme.
Pri Hielscherju vemo, da je za uspešno ultrazvočno razbijanje bioloških vzorcev potrebna natančnost in ponovljivost. Zato smo naše ultrazvočne aparate zasnovali kot pametne naprave z vsemi funkcijami, ki omogočajo učinkovito, zanesljivo, ponovljivo in priročno pripravo vzorcev.

Spodnja tabela vam prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih sistemov od ultrazvočnih mikro-konic in klasičnih ultrazvočnih homogenizatorjev do ultrazvočnih multiSample za priročno in zanesljivo pripravo številnih vzorcev: