Ultrazvočna liza vzorcev Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster se v laboratorijih pogosto uporablja kot modelni organizem. Zato je treba pogosto izvajati predanalitske korake priprave vzorcev Drosophila melanogaster, kot so liza, razgradnja celic, ekstrakcija beljakovin in striženje DNA. Ultrazvočni dezintegratorji so zanesljivi in učinkoviti ter omogočajo preprosto izvajanje različnih nalog, kot so liza, ekstrakcija beljakovin ali fragmentacija DNA, zgolj s prilagajanjem parametrov ultrazvočnega procesa. Ultrazvočni homogenizatorji so zato prilagodljiva orodja s širokim področjem uporabe.

Ultrazvočna liza in ekstrakcija beljakovin

Liza, solubilizacija celic, homogenizacija tkiv in ekstrakcija beljakovin so običajne naloge ultrazvočnih dezintegratorjev v bioloških laboratorijih. Ultrazvočni dezintegratorji in naprave za razgradnjo celic so zelo primerni za homogenizacijo živalskih tkiv, žuželk (npr. Drosophila melanogaster, C. elegans) ali rastlinskih vzorcev. Nadaljnje uporabe ultrazvočne obdelave vključujejo lizo celičnih suspenzij in peletov ter ekstrakcijo znotrajceličnih beljakovin.
Ultrazvočna liza in ekstrakcija beljakovin sta zelo zanesljiva in ponovljiva procesa, ki ju je mogoče izvajati na podlagi uveljavljenih protokolov. Ker je mogoče intenzivnost ultrazvočnega procesa natančno prilagoditi s parametri sonikacije, kot so amplituda, ciklični / pulzni način, temperatura in prostornina vzorca, je mogoče preverjene protokole vedno znova ponavljati z enakim rezultatom.

Ultrazvočna fragmentacija DNA in RNA

Po lizi celic in ekstrakciji beljakovin je pogost nujni korak pri pripravi vzorcev striženje in fragmentacija DNA, RNA ter kromatina, npr. pred imunoprecipitacijo kromatina (ChIP). Fragmentacijo DNA in RNA je mogoče zanesljivo doseči s pretrganjem kovalentnih vezi, ki držijo DNA skupaj, s fizikalnimi silami. Pri fizikalnem striženju, kot je sonikacija, se najprej pretrgajo verige DNA, nato pa se DNA fragmentira na manjše dele.
Ultrazvočna fragmentacija DNA je zanesljiva in učinkovita pri striženju DNA na ciljno dolžino, npr. 500bp (baznih parov). Glavne prednosti ultrazvočne fragmentacije DNA vključujejo natančen nadzor parametrov in intenzivnosti ultrazvočnega procesa. Parametre ultrazvočnega procesa je mogoče prilagoditi z natančnim nastavljanjem intenzivnosti, ciklov in časa sonikacije. Tako je mogoče ustvariti želene velikosti DNA ter zanesljivo doseči in ponovno doseči ciljno dolžino DNA. Ultrazvočno striženje DNA je idealno tudi za ustvarjanje fragmentov DNA z visoko molekulsko maso.

Protokoli za ultrazvočno lizo Drosophila melanogaster

Spodaj so predstavljeni različni protokoli za ultrazvočno podprto lizo, ekstrakcijo beljakovin ter fragmentacijo DNA ali kromatina v vzorcih Drosophila.

Ultrazvočna liza za test imunoprecipitacije z navzkrižnim povezovanjem (CLIP)

Test CLIP je bil izveden, kot je bilo že opisano, z nekaterimi spremembami. Približno 20 mg jajčnikov samic divjega tipa, starih od 0 do 1 dneva, je bilo navzkrižno povezanih z UV-svetlobo (3 × 2000 μJ/cm2), homogeniziranih na ledu v 1 mL pufra RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saharoze, 1 mM DTT, 1× Complete Protease Inhibitors brez EDTA, 1 mM PMSF) z dodatkom 300 U RNAseOUT in postavljenih na led za 30 min. Homogenat je bil na ledu sonikiran pri 80% moči petkrat v 20 s pulzih s 60 s premorom med njimi z ultrazvočnim procesorjem Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) in centrifugiran (16.000 × g za 5 min pri 4°C). Topni ekstrakt je bil predhodno očiščen z 20 μl Protein-G dynabeads za 20 min pri 4°C. Po odvzemu vzorcev za imunoblot in kvantifikacijo vhodne RNA (1%) je bil HP1 imunoprecipitiran s protitelesom anti-HP1 9A9 iz 450 μl predhodno očiščenega ekstrakta z inkubacijo 4 h s 50 μl Protein-G dynabeads. Imunoprecipitati so bili 4-krat sprani z RCB. Za elucijo imunoprecipitiranih RNA so bile peletirane kroglice 5 min kuhane v 100 μL vode UltraPure DEPC-treated Water. Supernatantu, pridobljenemu za pripravo RNA, je bilo dodanih 900 μL reagenta Qiazol Reagent. Prečiščena RNA je bila uporabljena kot matrica za sintezo cDNA z oligo dT, naključnimi heksameri in reverzno transkriptazo SuperScript III po protokolu proizvajalca.
(Cassale et al. 2019)

Ultrazvočna liza za test imunoprecipitacije kromatina

Imunoprecipitacija kromatina je bila izvedena po metodi, ki jo je opisal Menet, z manjšimi spremembami. Približno 20 mg jajčnikov samic divjega tipa, starih od 0 do 1 dneva, je bilo homogeniziranih v 1 mL pufra NEB (10 mM HEPES-Na pri pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pri pH 8, 0,5 mM EDTA-Na pri pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidina, 0,15 mM spermina, 1× Complete Protease Inhibitors brez EDTA) s homogenizatorjem / potopnim dispergatorjem 1 min (pri 3000 rpm). Homogenat je bil prenesen v predhodno ohlajen stekleni homogenizator Dounce, nato pa je bilo izvedenih 15 polnih hodov s tesno prilegajočim se batom. Prosta jedra so bila nato centrifugirana pri 6000xg za 10 min pri 4°C. Peleti, ki so vsebovali jedra, so bili resuspendirani v 1 mL NEB in centrifugirani pri 20.000 × g za 20 min na saharoznem gradientu (0,65 mL 1,6 M saharoze v NEB, 0,35 mL 0,8 M saharoze v NEB). Pelet je bil resuspendiran v 1 mL NEB in formaldehidu do končne koncentracije 1%. Jedra so bila navzkrižno povezana 10 min pri sobni temperaturi, reakcija pa je bila ustavljena z dodatkom 1/10 vol 1,375 M glicina. Jedra so bila zbrana s centrifugiranjem pri 6000 × g za 5 min. Jedra so bila dvakrat sprana v 1 mL NEB in resuspendirana v 1 mL liznega pufra (15 mM HEPES-Na pri pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pri pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% natrijevega deoksiholata, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarkozina in 1× Complete Protease Inhibitors brez EDTA). Jedra so bila sonikirana z ultrazvočnim procesorjem Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) šestkrat po 20 s sonikacije in 1 min na ledu. Sonikirana jedra so bila centrifugirana pri 13.000 × g za 4 min pri 4°C. Večina sonikiranega kromatina je bila dolga od 500 do 1000 baznih parov (bp). Za vsako imunoprecipitacijo je bilo 15 μg kromatina inkubiranih v prisotnosti 10 μg monoklonskega protitelesa HP1 9A9 (3 h pri 4°C na vrtljivem kolesu). Nato je bilo dodanih 50 μl dynabeads protein G in inkubacija se je nadaljevala čez noč pri 4°C. Supernatanti so bili zavrženi, vzorci pa dvakrat sprani v liznem pufru (vsako spiranje 15 min pri 4 °C) in dvakrat v pufru TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pri pH 8). Kromatin je bil eluiran s kroglic v dveh korakih; najprej v 100 μl elucijskega pufra 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pri pH 8) pri 65°C za 15 min, čemur sta sledila centrifugiranje in zbiranje supernatanta. Material kroglic je bil ponovno ekstrahiran v 100 μl TE + 0,67% SDS. Združeni eluat (200 μl) je bil inkubiran čez noč pri 65°C za razveljavitev navzkrižnih povezav ter obdelan s 50 μg/ml RNaseA za 15 min pri 65°C in s 500 μg/ml proteinaze K za 3 h pri 65°C. Vzorci so bili ekstrahirani s fenolom–kloroformom in oborjeni z etanolom. DNA je bila resuspendirana v 25 μl vode. Za čim večji obseg molekularnih analiz z imunoprecipitirano DNA so bili kandidatni geni pomnoženi v parih z optimiziranim protokolom dupleksne PCR z uporabo dveh različnih kompletov začetnih oligonukleotidov s podobnimi temperaturami taljenja v eni reakciji.
(Casale et al. 2019)
 

Visokozmogljive ultrazvočne naprave za razgradnjo celic v bioloških vzorcih

Hielscher Ultrasonics je vaš partner z dolgoletnimi izkušnjami na področju visokozmogljivih ultrazvočnih sonikatorjev za razgradnjo celic, lizo, ekstrakcijo beljakovin, fragmentacijo DNA, RNA in kromatina ter druge predanalitske korake priprave vzorcev. S celovito ponudbo ultrazvočnih laboratorijskih homogenizatorjev in enot za pripravo vzorcev ima Hielscher idealno ultrazvočno napravo za vašo biološko uporabo in zahteve.
Klasični ultrazvočni sonikator s sondo z mikrokonico, kot je UP200St (200W; glejte sliko levo), ali ena od ultrazvočnih enot za pripravo vzorcev VialTweeter ali UP200ST_TD_CupHorn z VialHolder sodi med priljubljene modele v raziskovalnih in analitskih laboratorijih. Klasična ultrazvočna sonda je idealna, kadar je treba lizirati, ekstrahirati ali fragmentirati manjše število vzorcev. Enoti za pripravo vzorcev VialTweeter in UP200St_TD_CupHorn omogočata sočasno sonikacijo do 10 oziroma 5 vial.
Če je treba obdelati veliko število vzorcev (npr. plošče s 96 vdolbinicami, mikrotitrske plošče itd.), je UIP400MTP idealna postavitev za sonikacijo. UIP400MTP deluje kot večji cuphorn, napolnjen z vodo, ki ima dovolj prostora za plošče z mikrovdolbinicami. UIP400MTP poganja ultrazvočni procesor z močjo 400 vatov in zagotavlja zelo enakomerno ter intenzivno sonikacijo plošč z več vdolbinicami za razgradnjo celic, lizo vzorcev, solubilizacijo peletov, ekstrakcijo beljakovin ali striženje DNA.

Natančen nadzor s pametno programsko opremo

Vse rešitve za sonikacijo podjetja Hielscher z močjo od 200 vatov navzgor so opremljene z digitalnim barvnim zaslonom na dotik in inteligentno programsko opremo. S pametnim beleženjem podatkov se vsi parametri ultrazvočnega procesa samodejno shranijo kot datoteka CSV na vgrajeno kartico SD takoj ob zagonu ultrazvočnega sonikatorja. Tako sta raziskovanje in beleženje podatkov veliko priročnejša. Po poskusih sonikacije ali pripravi vzorcev lahko preprosto pregledate parametre vsake izvedbe sonikacije in jih primerjate.
V intuitivnem meniju je mogoče pred sonikacijo vnaprej nastaviti številne parametre: za nadzor temperature vzorca in preprečevanje njegove toplotne razgradnje je na primer mogoče nastaviti zgornjo mejno temperaturo vzorca. Priključljivi temperaturni senzor, ki je priložen ultrazvočni enoti, ultrazvočnemu procesorju posreduje povratne informacije o dejanski temperaturi sonikacije. Ko je dosežena zgornja mejna temperatura, ultrazvočna naprava začasno prekine delovanje, dokler ni dosežena spodnja meja nastavljene ∆T, nato pa samodejno ponovno začne sonikacijo.
Če je potrebna sonikacija z določenim vnosom energije, lahko vnaprej nastavite končno ultrazvočno energijo posamezne izvedbe sonikacije. Seveda je mogoče ločeno nastaviti tudi ultrazvočno pulziranje in ciklični način.
Za ponovno uporabo najuspešnejših parametrov sonikacije lahko različne načine sonikacije (npr. čas sonikacije, intenzivnost, ciklični način itd.) shranite kot prednastavljene načine, ki jih lahko preprosto in hitro ponovno zaženete.
Za priročnejše upravljanje je mogoče vse digitalne ultrazvočne enote upravljati na daljavo prek katerega koli običajnega brskalnika (npr. InternetExplorer, Safari, Chrome itd.). Povezava LAN omogoča preprosto priključitev in uporabo ter ne zahteva namestitve dodatne programske opreme.
V podjetju Hielscher vemo, da uspešna sonikacija bioloških vzorcev zahteva natančnost in ponovljivost. Zato smo naše ultrazvočne sonikatorje zasnovali kot pametne naprave z vsemi funkcijami, ki omogočajo učinkovito, zanesljivo, ponovljivo in priročno pripravo vzorcev.

Spodnja preglednica prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih sistemov, od ultrazvočnih mikrokonic in klasičnih ultrazvočnih homogenizatorjev do sonikatorjev MultiSample za priročno in zanesljivo pripravo številnih vzorcev: