Ultrazvočna lysis drosophila melanogaster vzorci

Drosophila melanogaster se pogosto uporablja v laboratorijih kot model organizma. Zato je treba pogosto izvajati pred analitične korake priprave, kot so lyza, motnje v celicah, ekstrakcija beljakovin in striž dnk vzorcev drozofilnega melanogastra. Ultrazvočni dismembratorji so zanesljivi in učinkoviti in se lahko uporabljajo za opravljanje različnih nalog, kot so lysis, ekstrakcija beljakovin ali DNA fragmentacija na lahek način samo prilagajanje ultrazvočnih procesnih parametrov. Ultrazvočni homogenizatorji so s tem prilagodljiva orodja s široko paleto aplikacij.

Ultrazvočna lysis in ekstrakcija beljakovin

Lysis, topitev celic, homogenizacija tkiv in pridobivanje beljakovin so tipične naloge za ultrazvočne dismembratorje v bioloških laboratorijih. Ultrazvočni disembratorji in celični motilci so primerni za homogenizacijo živalskih tkiv, žuželk (npr. Drosophila melanogaster, C. elegans) ali rastlinskih osebkov. Naslednje uporabe ultrasonication so lysis celic suspenzije in peleti, kot tudi ekstrakcija znotrajceličnih beljakovin.
Ultrazvočna lysis in ekstrakcija beljakovin so zelo zanesljivi in pomnoževalni procesi, ki se lahko izvajajo na podlagi uveljavljenih protokolov. Ker ultrazvočno intenzivnost procesa je mogoče natančno prilagoditi preko sonication parametrov, kot so amplitude, cikel / impulzni način, temperatura in volumen vzorca, enkrat dokazano protokoli se lahko ponovi z enakim izidom znova in znova.

Ultrazvočna DNA in RNA fragmentacija

Po celični lizi in ekstrakciji beljakovin je pogost potreben korak pri pripravi vzorca omejevanje in fragmentacija DNK, RNK in kromatina, npr. Razdrobljenost DNK in RNK je mogoče zanesljivo doseči z zlomom kovalentnih vezi, ki držijo DNK skupaj s fizičnimi silami. Z uporabo fizičnega omejevanje, kot so sonication, sprva DNA sklopi so zlomljeni, nato je DNK razdrobljena na manjše kose.
Ultrazvočna razdrobljenost DNK je zanesljiva in učinkovita pri hlajenju DNK na ciljno dolžino, npr. 500bp (osnovni pari). Glavne prednosti ultrazvočne razdrobljenosti DNK vključujejo natančna kontrola ultrazvočnih procesnih parametrov in intenzivnosti. Ultrazvočne proces parametre lahko prilagodite z ugasnjenjem sonication intenzivnost, ciklov in časa natančno. To omogoča ustvarjanje želenih velikosti DNK in ciljno dolžino DNK je mogoče zanesljivo proizvajati, kot tudi razmnoževanje. Ultrazvočno omejevanje DNK je idealno tudi za ustvarjanje fragmentov DNK visoke molekulske mase.

Protokoli za ultrazvočno lyzo drosophila melanogaster

Spodaj najdete različne protokole za ultrazvočno podprto lysis, ekstrakcijo beljakovin, in DNA ali kromatin fragmentacijo Drosophila vzorcev.

Ultrazvočna lysis za navzkrižno povezovanje imunoprecipitacije (CLIP) Assay

Pregled CLIP je bil opravljen, kot je bilo predhodno sporočene z nekaj spremembami. Približno 20 mg jajčnikov od 0 do 1-dnevnih samic divjega tipa so bile UV navzkrižno povezane (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizirane na ledu v 1 ml RCB puferja (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saharoze, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) dopolnjene sa 300 U RNAseOUT i 30 min ložene na led. Homogenat je bil sonicated na ledu, pri 80% moči, petkrat v 20 s poči z 60 s počitka vmes z uporabo Hielscher Ultrasonic Procesor UP100H (100 W, 30 kHz) centrifugirana (16000 × g 5 min pri 4 °C). Topni izvleček je bil predhodno razčlenjen z 20 μl Protein-G dinabead za 20 min pri 4 °C. Po odstranitvi vzorcev za imunoblotiranje in kvantitacijo vnosa RNK (1 %), je bil HP1 imunoprecipitiran z anti-HP1 9A9 protitelesom iz 450 μl vnaprej pripravljenega ekstrakta z inkubacijo za 4 h s 50 μl Protein-G dinabeadi. Imunoprecipitate so s RCB 4-krat umili. Za izvleček imunoprecipitiranih RNA so peletirane kroglice v 100 μL vode, obdelane z UltraPure DEPC, 5 min. 900 μL Qiazol Reagentu dodali v nadnatant, ki je bil okreval za pripravo RNK. RNK prečiščena je bila uporabljena kot predloga za sintezo cDNA z uporabo Oligo dT, naključnih heksamerjev in SuperScript povratne prepisa III v skladu s protokolom proizvajalca.
(Cassale et al. 2019)

Ultrazvočna lysis za kromatin Imunoprecipitation Assay

Imunoprecipitacija kromatina je bila izvedena po metodi, ki jo je opisal Menet z manjšimi spremembami. Približno 20 mg jajčnikov od 0 do 1-dnevnih samic divjega tipa so homogenizirali v 1 ml NEB puferja (10 mM HEPES-Na pri pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pri pH 8, 0,5 mM EDTA-Na na pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidin, 0,15 mM Spermin, 1× EDTA- free Complete Protease Inhibitors) s homogenizerom / disperzerom potopa 1 min (na 3000 vrt/min). Homogenat je bil prenesen na predhladeno stekleno dounce, 15 polnih udarcev pa so nanesli s tesnim tulčkom. Prosta jeder so nato centrifugirana pri 6000xg 10 min pri 4 °C. Kroglice, ki vsebujejo jed, so bile ponovno posodobljene v 1 ml NEB in centrifugljene 20000 × g 20 min na gradientuharoze (0,65 ml 1,6 Mharoze v NEB, 0,35 ml 0,8 Mharoze v NEB). Pelet je bil ponovno posodobljen v 1 ml NEB in formaldehid do končne koncentracije 1 %. Jedra so bila navzkrižno povezana 10 min pri sobni temperaturi in ugasnjena z dodajanjem 1/10 vol 1,375 M glicina. Jedrji so bili zbrani s centrifugacijo pri 6000 × g 5 min. Zdravilo Nuclei so dvakrat umili v 1 ml NEB in se ponovno napojili v 1 ml lysis bufferja (15 mM HEPES-Na pri pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA na pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine i 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors). Nuclei so bili sonicated z uporabo Hielscher ultrazvočni procesor UP100H (100 W, 30 kHz) šestkrat za 20 s na in 1 min na ledu. Sonicana jed so centrifugirana pri 13000 × g 4 min pri 4 °C. Večina soniciranega kromatina je bila v dolžini od 500 do 1000 osnovnih parov (bp). Za vsako imunoprecipitacijo je bilo inkubiranih 15 μg kromatina v prisotnosti 10 μg monoklonalnega protitelesa HP1 9A9 (3 h pri 4 °C v vrtečem kolesu). Nato je bilo dodanih 50 μl dinabead proteina G, inkubacijo pa so nadaljevali čez noč pri 4 °C. Supernatanti so bili zavrženi in vzorci so bili dvakrat napihnjeni v Lysis Bufferju (vsak pomiva 15 min pri 4 °C) in dvakrat v TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pri pH 8). Kromatin je bil izvlečen iz beads v dveh korakih; prvi v 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pri pH 8) pri 65 °C za 15 min, sledi centrifugacija in okrevanje supernatanta. V 100 μl TE + 0,67% SDS je bil ponovno izvleček materiala iz posode. Kombinirani eluat (200 μl) je bil inkubirana čez noč pri 65 °C za vzvratne navzkrižne povezave in zdravljen s 50 μg/ml RNaseA 15 min pri 65 °C in za 500 μg/ml Proteinase K pri 3 h pri 65 °C. Vzorci so bili ekstrahirani fenol-kloroform in etanol obujani. DNK so ponovno našli v 25 μl vode. Za maksimizacijo molekularnih analiz z imunoprecipitiranim DNK so se geni kandidatk v parih povečali z optimiziranim protokolom dupleks-PCR z uporabo dveh različnih nastavitev primerkov s podobnimi temperaturami taljenja v eni reakciji.
(Casale et al. 2019)

Visokozmoglivni ultrazvočni celični disruptorji za biološke vzorce

Hielscher Ultrasonics je vaš dolgo izkušen partner, ko gre za visoko zmogljivost ultrasonicators za motnje celic, lysis, pridobivanje beljakovin, DNA, RNK, in kromatin fragmentacijo, kot tudi druge korake pred analitično pripravo vzorca. Hielscher ponuja celovit portfelj ultrazvočnih laboratorijskih homogenizatorjev in enot za pripravo vzorcev, Hielscher ima idealno ultrazvočno napravo za vašo biološko aplikacijo in zahteve.
Klasična sonda tipa ultrasonicator z mikro-konico, kot je UP200St (200W; glej sliko levo) ali eno od ultrazvočnih enot za pripravo vzorca VialTweeter ali UP200St_TD_CupHorn z VialHolder so najljubši modeli v raziskovalnih in analitičnih laboratorijih. Klasična ultrazvočna sonda je idealna, ko pripravite manj vzorcev je treba lysed, izvleči ali fragmenti. Enote za pripravo vzorca VialTweeter in UP200St_TD_CupHorn omogočajo sočasno sonikacijo do 10 ali 5 vial.
Če je treba obdelati visoka števila vzorcev (npr. plošče z 96 dobro, mikrotiterske plošče itd.), UIP400MTP je idealna nastavitev sonication. UIP400MTP deluje kot večji cuphorn, ki je napolnjen z vodo in ima dovolj prostora za držo plošč mikro vodnjakov. UIP400MTP, ki ga napaja 400 vatov močan ultrazvočni procesor, zagotavlja zelo enotno in intenzivno sonikacijo večplastnih plošč, da bi zmotil celice, vzorce lize, topilne pelete, ekstrahiral beljakovine ali omejevalni DNK.

Natancen nadzor prek pametne programske opreme

Vse Hielscher sonication rešitve od 200 vatov navzgor so opremljene z digitalnim barvnim zaslonom na dotik in inteligentno programsko opremo. Prek pametnega protokoliranja podatkov se vsi ultrazvočni procesni parametri samodejno shranijo kot CSV datoteka na vgrajeni SD-kartici takoj, ko se ultrazvočnikator zažene. Zato je raziskovanje in protokoliranje veliko bolj priročno. Po poskusih sonikacije ali pripravi vzorca lahko preprosto pregledate parametre sonication vsakega sonication teči in jih primerjati.
Preko intuitivnega menija je mogoče pred sonikacijo prednastaviti številne parametre: Na primer, za nadzor temperature v vzorcu in za preprečevanje njegove toplotne degradacije je mogoče določiti zgornjo mejo temperature vzorca. Vtični senzor temperature, ki prihaja z ultrazvočno enoto, daje ultrazvočni procesor povratne informacije o dejanski temperaturi sonication. Ko dosežete zgornjo mejo temperature, ultrazvočna naprava zastaja, dokler ni dosežena spodnja meja nastavljenega ∆T in se začne samodejno ponovno sonicira.
Če je potrebna sonication s specifičnim vnosom energije, lahko prednastavite končno ultrazvočno energijo sonication teka. Seveda je lahko tudi ultrazvočno utripanje in način cikla individualno nastavljen.
Če želite znova uporabiti svoje najuspešnejše parametre sonication, lahko shranite različne načine sonication (npr. čas sonikacije, intenzivnost, način cikla itd.) kot vnaprej nastavljene načine, tako da so lahko enostavni in hitro začeti znova.
Za večjo operativno udobje lahko vse digitalne ultrazvočne enote upravljate prek daljinskega upravljalnika brskalnika v vsakem skupnem brskalniku (npr. InternetExplorer, Safari, Chrome itd.). LAN povezava je preprosta nastavitev plug-n-play in ne zahteva dodatne namestitve programske opreme.
V Hielscherju vemo, da uspešno sonication bioloških vzorcev zahteva natančnost in ponovljivost. Zato smo naše ultrazvočne naprave oblikovali kot pametne naprave z vsemi funkcijami, ki omogočajo učinkovito, zanesljivo, pomnoževalno in priročno pripravo vzorca.

Spodnja tabela vam prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih sistemov od ultrazvočnih mikro-nasvetov in klasičnih ultrazvočnih homogenizatorjev do MultiSample ultrasonicatorjev za priročno, zanesljivo pripravo številnih vzorcev: