Protokol za inaktivacijo koronavirusa SARS-CoV-2 z ultrazvočnim razbijanjem

Hielscher VialTweeter je edinstvena ultrazvočna enota za pripravo več vzorcev, ki se uporablja za inaktivacijo koronavirusa SARS-COV-2. VialTweeter omogoča pripravo do 10 vial z vzorci hkrati in je zato idealna enota za obdelavo množičnih vzorcev.

Inaktivacija koronavirusa SARS-CoV-2 z VialTweeterjem

Po odstranitvi fiksativa so bili monosloji trikrat oprani s fosfatno pufrirano fiziološko raztopino (PBS), preden so celice strgali v 1mL MEM / 5% FBS in sonikirali (3 × 10 sekund vklopljeno, 10 sekund izklopljeno pri 100% moči in amplitudi) z uporabo Hielscher ultrazvočnega procesorja UP200St z VialTweeterjem priloga. Supernatanti so bili bistri s centrifugiranjem pri 3000 × g 10 minut. 

Celoten protokol za inaktivacijo koronavirusa SARS-CoV-2 preberite tukaj Welch et al. (2020) spodaj:

Celice in virus

Celice Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) so gojili v modificiranem Eagleovem minimalnem esencialnem gojišču (MEM), dopolnjenem z 10% (v / v) fetalnim telečjim serumom (FCS). Uporabljeni virus je bil sev SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, ki ga je PHE izoliral iz prvega grozda bolnikov v Združenem kraljestvu 29. 1. 2020. Ta virus je bil pridobljen na prehodu 1 in uporabljen za študije inaktivacije na prehodu 2 ali 3.
Za reagente in kemikalije, ki se uporabljajo za inaktivacijo SARS-CoV-2 in odstranitev citotoksičnosti reagenta, glejte znanstveno poročilo Welch et al. (2020).

Inaktivacija virusa z detergenti – Protokol za inaktivacijo koronavirusa SARS-CoV-2 Welch et al. 2020

Inaktivacija SARS-CoV-2

Za komercialne izdelke virusni pripravki (tekočina iz tkivne kulture, titri od 1 × 10⁶ do 1 × 10⁸ PFU/ml) so bili obdelani v treh izvodih z reagenti v koncentracijah in za kontaktne čase, priporočene v proizvajalčevih navodilih za uporabo, če so na voljo, ali za koncentracije in čase, ki jih posebej zahtevajo preskuševalni laboratoriji. Kadar je proizvajalec navedel razpon koncentracij, se je preskusilo najnižje razmerje med izdelkom in vzorcem (tj. najnižja priporočena koncentracija preskusnega izdelka). Reagenti za transportne epruvete za vzorce so bili testirani z uporabo razmerja med enim volumnom tekočine tkivne kulture in desetimi volumni reagenta, razen če je proizvajalec določil volumnsko razmerje med vzorčno tekočino in reagentom. Detergenti, fiksatorji in topila so bili testirani v navedenih koncentracijah za navedene čase. Vsi koraki inaktivacije so bili izvedeni pri sobni temperaturi okolja (18 – 25 °C). Za testiranje alternativnih vrst vzorcev je bil virus vstavljen v navedeno matrico vzorca v razmerju 1:9, nato pa obdelan s testnimi reagenti, kot je navedeno zgoraj. Vsi poskusi so vključevali trojne kontrolne vzorce, obdelane z enakovrednim volumnom PBS namesto testnega reagenta. Takoj po zahtevanem času stika je bil obdelan 1 ml obdelanega vzorca z ustrezno izbrano filtracijsko matrico. Odstranjevanje reagenta za testiranje inaktivacije je bilo izvedeno v večjem formatu vrtilne kolone z uporabo vrtilnih kolon za odstranjevanje detergenta Pierce 4mL (Thermo Fisher) ali s polnjenjem praznih centrifugalnih kolon s kapaciteto 10 ml (Thermo Fisher) s SM2 Bio-kroglicami, Sephacryl S-400HR ali Sephadex LH-20, da se dobijo 4 ml pakirane kroglice / smole. Za čiščenje z uporabo filtrov Amicon so 2 × 500 μl vzorcev očistili z dvema centrifugalnima filtroma po prej opisani metodi, nato pa združili. Za formaldehid in formaldehid z odstranitvijo glutaraldehida je bil uporabljen en filter z 1× 500μl volumna vzorca, ki je bil po predelavi v 500μl PBS resuspendiran in dodan 400ul MEM/5% FBS. Za inaktivacijo okuženih enoplasti, 12,5 cm² bučke celic Vero E6 (2,5 × 10⁶ celice / bučka v 2,5 ml MEM / 5% FBS) so bili okuženi pri MOI 0,001 in inkubirani pri 37 °C / 5% CO₂ 24 ur. Supernatant je bil odstranjen in celice fiksirane s 5 ml formaldehida ali formaldehida in glutaraldehida pri sobni temperaturi 15 ali 60 minut. Fiksativ je bil odstranjen in enoplastni trikrat oprani s PBS, preden so celice strgali v 1 ml MEM / 5% FBS in sonikirali (3 × 10 sekund vklopljeni, 10 sekund izklopljeni pri 100% moči in amplitudi) z uporabo UP200St s nastavkom VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatanti so bili bistri s centrifugiranjem pri 3000 × g 10 minut.

Podrobnosti o reagentu, ki se uporablja za inaktivacijo koronavirusa SARS-CoV-2 z ultrazvočnim VialTweeterjem v skladu s protokolom Welch et al. 2020

Celoten protokol, vključno z uporabo Hielscher VialTweeterja, najdete tukaj:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Sofisticirani ultrazvočni dismembratorji in celični motilci

Ultrazvočni zvočnik z več vzorci VialTweeter je le ena od mnogih ultrazvočnih rešitev za pripravo vzorcev v bioloških, biokemičnih in kliničnih laboratorijih. Hielscher Ultrasonics ponuja idealen ultrazvočni dismembrator za vašo aplikacijo, npr. Lizo celic, ekstrakcijo celic, homogenizacijo tkiva, raztapljanje lizata, raztapljanje, razplinjevanje vzorcev itd.
Sporočite nam, koliko vzorcev morate obdelati na uro in dan, če imate raje neposredno ali posredno ultrazvočno razbijanje in kakšen je cilj ultrazvočne obdelave vzorca. Priporočili vam bomo najprimernejšo ultrazvočno enoto za vašo vsakodnevno delovno rutino!
Digitalni ultrazvočni procesorji Hielscher Ultrasonics so opremljeni s pametno programsko opremo, samodejnim snemanjem podatkov, enostavnimi možnostmi prednastavitve za nadzor temperature, trajanjem ultrazvočne obdelave, ciklom / impulznim načinom ter osvetlitvijo vzorca in daljinskim upravljalnikom brskalnika. Prizadevamo si, da bi bile naše ultrazvočne naprave čim bolj pametne, tako da bodo vaše raziskave in delovna rutina čim bolj priročna in uspešna.
Kliknite tukaj, če želite najti več aplikacij, vključno s protokoli za pripravo ultrazvočnih vzorcev z VialTweeter!