Liza celic BL21 z ultrazvokom

Celice BL21 so sev E. coli, ki se zaradi svoje sposobnosti zelo učinkovitega izražanja beljakovin pogosto uporablja v raziskovalnih laboratorijih, biotehnologiji in industrijski proizvodnji. Ultrazvočna razgradnja celic, liza in ekstrakcija beljakovin so običajna metoda za izolacijo in pridobivanje ciljnih beljakovin iz notranjosti celic BL21. Ultrazvočna obdelava celico popolnoma razgradi in sprosti vse v njej ujete beljakovine, s čimer postane na voljo 100% beljakovin.

Celice BL21 za izražanje beljakovin

Celice BL21 so kemično kompetenten bakterijski sev E. coli, primeren za transformacijo in visoko raven izražanja beljakovin z uporabo indukcijskega sistema T7 RNA-polimeraza–IPTG. Celice BL21 omogočajo zelo učinkovito izražanje beljakovin iz katerega koli gena, ki je pod nadzorom promotorja T7. Sev E. coli BL21(DE3) je sev za proizvodnjo beljakovin na osnovi RNA-polimeraze T7, ki se uporablja v kombinaciji z ekspresijskimi vektorji na osnovi promotorja T7 in se pogosto uporablja v laboratorijih in industriji za proizvodnjo rekombinantnih beljakovin. Pri BL21(DE3) izražanje gena, ki kodira rekombinantno beljakovino, prepisuje kromosomsko kodirana RNA-polimeraza T7 (T7 RNAP), ki prepisuje osemkrat hitreje kot običajna RNAP E. coli. Zaradi tega je sev BL21(DE3) zelo učinkovit in sodi med najbolj priljubljene celične sisteme za izražanje beljakovin.

Protokol za ultrazvočno lizo in ekstrakcijo beljakovin iz celic BL21

Liza celic BL21 se večinoma izvaja z ultrazvočno obdelavo v kombinaciji z natrijevim lavroil sarkozinatom (znanim tudi kot sarkozil) kot pufrom za lizo. Prednosti ultrazvočne razgradnje celic in ekstrakcije beljakovin so zanesljivost, ponovljivost ter preprosto, varno in hitro upravljanje ultrazvočnih naprav. Spodnji protokol podaja navodila po korakih za ultrazvočno lizo celic BL21:

• Za odstranitev šaperonskih beljakovin so bili bakterijski peleti BL21 resuspendirani v 50 ml ledeno hladnega pufra natrijev Tris-EDTA (STE) (ki vsebuje 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl z dodatkom 100 mM PMSF).
• Nato se doda 500 ul lizocima (10 mg/ ml), celice pa se inkubirajo na ledu 15 min.
• Zatem se doda 500 ul DTT in 7 ml sarkozila (10% (w/v), pripravljenega v pufru STE).
• Bistveno je, da so vsi pufri za čiščenje ledeno hladni in da vzorci ves čas ostanejo na ledu. Vse korake čiščenja je treba po možnosti izvesti v hladni sobi.



• Za ultrazvočno lizo in ekstrakcijo beljakovin se vzorci sonicirajo v napravi VialTweeter MultiSample Ultrasonicator 4 x 30 sec pri 100% amplitudi z 2 min presledkom med posameznimi sonikacijami. Kot alternativa se lahko uporabi ultrazvočni homogenizator s sondo z mikrokonico, npr. UP200Ht s S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. premora med ultrazvočnimi cikli, 80% amplituda).
• Za nadaljnje korake čiščenja morajo vzorci ostati na ledu ali pa se do nadaljnje obdelave shranijo pri -80°C.

Ultrazvočna liza ob natančnem nadzoru temperature

Natančen in zanesljiv nadzor temperature je ključen pri ravnanju z biološkimi vzorci. Visoke temperature sprožijo toplotno povzročeno razgradnjo beljakovin v vzorcih.
Tako kot vse mehanske tehnike priprave vzorcev tudi sonikacija ustvarja toploto. Vendar je mogoče pri uporabi naprave VialTweeter temperaturo vzorcev dobro nadzorovati. Predstavljamo vam različne možnosti spremljanja in nadzora temperature vaših vzorcev med pripravo za analizo z napravama VialTweeter in VialPress.

1. Spremljanje temperature vzorca: Ultrazvočni procesor UP200St, ki poganja VialTweeter, je opremljen z inteligentno programsko opremo in priklopljivim temperaturnim senzorjem. Temperaturni senzor priključite na UP200St in njegovo konico vstavite v eno od epruvet z vzorci. Prek digitalnega barvnega zaslona na dotik lahko v meniju UP200St nastavite določeno temperaturno območje za sonikacijo vzorca. Ultrazvočna naprava se samodejno ustavi, ko je dosežena najvišja temperatura, in počaka, dokler temperatura vzorca ne pade na spodnjo vrednost nastavljene temperature ∆. Nato se sonikacija samodejno znova začne. Ta pametna funkcija preprečuje toplotno povzročeno razgradnjo.
2. Blok VialTweeter je mogoče predhodno ohladiti. Blok VialTweeter (samo sonotrodo brez pretvornika!) postavite v hladilnik ali zamrzovalnik, da predhodno ohladite titanov blok in s tem odložite dvig temperature v vzorcu. Če je mogoče, lahko predhodno ohladite tudi sam vzorec.
3. Za hlajenje med sonikacijo uporabite suhi led. Plitev pladenj napolnite s suhim ledom in nanj postavite VialTweeter, da se lahko toplota hitro odvaja.

Stranke po vsem svetu uporabljajo VialTweeter in VialPress za vsakodnevno pripravo vzorcev v bioloških, biokemičnih, medicinskih in kliničnih laboratorijih. Inteligentna programska oprema in nadzor temperature procesorja UP200St zagotavljata zanesljiv nadzor temperature in preprečujeta toplotno povzročeno razgradnjo vzorcev. Ultrazvočna priprava vzorcev z napravama VialTweeter in VialPress zagotavlja zelo zanesljive in ponovljive rezultate!
 

Poiščite optimalni ultrazvočni razgrajevalnik za svojo uporabo pri lizi

Hielscher Ultrasonics je proizvajalec z dolgoletnimi izkušnjami na področju visokozmogljivih ultrazvočnih razgrajevalnikov celic in homogenizatorjev za laboratorije, namizne sisteme in sisteme v industrijskem merilu. Velikost vaše bakterijske celične kulture, vaš raziskovalni ali proizvodni cilj ter prostornina celic, ki jih je treba obdelati na uro ali dan, so bistveni dejavniki pri izbiri ustreznega ultrazvočnega razgrajevalnika celic za vašo uporabo.
Hielscher Ultrasonics ponuja različne rešitve za hkratno sonikacijo več vzorcev (do 10 vial z napravo VialTweeter) in velikega števila vzorcev (tj. mikrotitrskih plošč / plošč ELISA z napravo UIP400MTP), pa tudi klasične laboratorijske ultrazvočne naprave s sondo z različnimi močmi od 50 do 400 vatov ter povsem industrijske ultrazvočne procesorje z močjo do 16.000 vatov na enoto za komercialno razgradnjo celic in ekstrakcijo beljakovin v obsežni proizvodnji. Vse ultrazvočne naprave Hielscher so zasnovane za delovanje 24/7/365 pri polni obremenitvi. Robustnost in zanesljivost sta ključni lastnosti naših ultrazvočnih naprav.
Vsi digitalni ultrazvočni homogenizatorji so opremljeni s pametno programsko opremo, barvnim zaslonom na dotik in samodejnim beleženjem podatkov, zaradi česar je ultrazvočna naprava priročno delovno orodje v laboratorijih in proizvodnih obratih.
Sporočite nam, katere vrste celic, kakšno prostornino, kako pogosto in s kakšnim ciljem morate obdelovati svoje biološke vzorce. Priporočili vam bomo najprimernejši ultrazvočni razgrajevalnik celic za zahteve vašega procesa.

Spodnja tabela prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih sistemov, od kompaktnih ročnih homogenizatorjev in ultrazvočnih naprav za več vzorcev do industrijskih ultrazvočnih procesorjev za komercialno uporabo:

Literatura / Reference

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.