Liza celic celic BL21 z ultrazvokom
Celice BL21 so sev E. coli, ki se pogosto uporablja v raziskovalnih laboratorijih, biotehnologiji in industrijski proizvodnji zaradi svoje sposobnosti izražanja beljakovin zelo učinkovito. Ultrazvočna motnja celic, liza in ekstrakcija beljakovin je običajna metoda za izolacijo in zbiranje ciljnih beljakovin iz celične notranjosti celic BL21. Ultrasonication popolnoma moti celico in sprosti vse ujete beljakovine, zaradi česar je na voljo 100% beljakovin.
Celice BL21 za izražanje beljakovin
Celica BL21 je kemično kompetenten bakterijski sev E. coli, primeren za transformacijo in izražanje beljakovin na visoki ravni z uporabo indukcijskega sistema T7 RNA polimeraze-IPTG. Celice BL21 omogočajo visoko učinkovito ekspresijo beljakovin katerega koli gena, ki je pod nadzorom promotorja T7. Sev E. coli BL21 (DE3) je sev za proizvodnjo beljakovin na osnovi T7 RNA polimeraze v kombinaciji z ekspresijskimi vektorji na osnovi promotorja T7 in se pogosto uporablja v laboratorijih in industriji za proizvodnjo rekombinantnih beljakovin. V BL21 (DE3) se izražanje gena, ki kodira rekombinantni protein, transkribira s kromosomsko kodirano T7 RNA polimerazo (T7 RNAP), ki transkribira osemkrat hitreje kot običajna E. coli RNAP. Zaradi tega je sev BL21 (DE3) zelo učinkovit in ga spremeni v enega najbolj priljubljenih celičnih sistemov za ekspresijo beljakovin.
Protokol za ultrazvočno lizo in ekstrakcijo beljakovin iz celic BL21
Liza celic BL21 se večinoma izvaja z ultrazvočno razglasitvijo v kombinaciji z natrijevim lauroil sarkozinatom (znanim tudi kot sarkosyl) kot pufr za lizo. Prednosti ultrazvočnih motenj celic in ekstrakcije beljakovin so v zanesljivosti, ponovljivosti ter enostavnem, varnem in hitrem delovanju ultrazvočnih aparatov. Spodnji protokol daje navodila po korakih za ultrazvočno lizo celic BL21:
- Da bi odstranili beljakovine spremljevalca, so bakterijske pelete BL21 resuspendirali v 50 ml ledeno hladnega natrijevega pufra Tris-EDTA (STE) (sestavljenega iz 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, dopolnjenega s 100 mM PMSF).
- Doda se 500 ul lizocima (10 mg / ml) in celice se inkubirajo na ledu 15 minut.
- Nato dodamo 500 ul DTT in 7 ml sarkozila (10 % (m/v) v pufru STE).
- Bistveno je, da so vsi čistilni blažilniki ledeno hladni in da so vzorci ves čas na ledu. Če je mogoče, je treba vse korake čiščenja izvesti v hladnem prostoru.
- Za ultrazvočno lizo in ekstrakcijo beljakovin se vzorci sonicirajo v VialTweeter MultiSample ultrazvočni aparat 4 x 30 sekund pri 100% amplitudi z 2-minutnim intervalom med vsako ultrazvočno razbijanjem. Druga možnost je, ultrazvočni homogenizator tipa sonde z mikro konico, npr. UP200Ht s S26d2 (3 x 30 sekund, 2 min. premor med ultrazvočnimi cikli, 80% amplituda).
- Za nadaljnje postopke čiščenja je treba vzorce hraniti na ledu ali pa jih do nadaljnje predelave hraniti pri -80 °C.
Ultrazvočni motilec celic UP200St z mikro konico S26d2 za lizo in ekstrakcijo beljakovin
Ultrazvočna liza pod natančnim nadzorom temperature
Natančen in zanesljiv nadzor temperature je ključnega pomena pri ravnanju z biološkimi vzorci. Visoke temperature sprožijo toplotno povzročeno razgradnjo beljakovin v vzorcih.
Kot vse mehanske tehnike priprave vzorcev, ultrazvočna obdelava ustvarja toploto. Vendar pa je temperaturo vzorcev mogoče dobro nadzorovati pri uporabi VialTweeterja. Predstavljamo vam različne možnosti za spremljanje in nadzor temperature vaših vzorcev, medtem ko jih pripravljate z VialTweeter in VialPress za analizo.
- Spremljanje temperature vzorca: Ultrazvočni procesor UP200St, ki poganja VialTweeter, je opremljen z inteligentno programsko opremo in vtičnim temperaturnim senzorjem. Priključite temperaturni senzor v UP200St in vstavite konico temperaturnega senzorja v eno od epruvet za vzorce. Prek digitalnega barvnega zaslona na dotik lahko v meniju UP200St nastavite določeno temperaturno območje za ultrazvočno razbijanje vzorca. Ultrazvočni aparat se bo samodejno ustavil, ko bo dosežena najvišja temperatura, in se ustavil, dokler se temperatura vzorca ne zniža na nižjo vrednost nastavljene temperature ∆. Nato se ultrazvočno razbijanje spet začne samodejno. Ta pametna funkcija preprečuje degradacijo, ki jo povzroča toplota.
- Blok VialTweeter je mogoče predhodno ohladiti. Postavite blok VialTweeter (samo sonotrode brez pretvornika!) v hladilnik ali zamrzovalnik, da se titanov blok predhodno ohladi, pomaga odložiti dvig temperature v vzorcu. Če je mogoče, se lahko tudi sam vzorec predhodno ohladi.
- Uporabite suhi led za hlajenje med ultrazvočnim razbijanjem. Uporabite plitki pladenj, napolnjen s suhim ledom, in postavite VialTweeter na led, da se toplota lahko hitro razprši.
Kupci po vsem svetu uporabljajo VialTweeter in VialPress za vsakodnevno pripravo vzorcev v bioloških, biokemičnih, medicinskih in kliničnih laboratorijih. Inteligentna programska oprema in nadzor temperature procesorja UP200St omogoča zanesljivo nadzor temperature in preprečitev toplotne razgradnje vzorca. Ultrazvočna priprava vzorcev z VialTweeter in VialPress zagotavlja zelo zanesljive in ponovljive rezultate!
Poiščite optimalni ultrazvočni motilec za vašo aplikacijo Lysis
Hielscher Ultrasonics je dolgoletni izkušen proizvajalec visoko zmogljivih ultrazvočnih motilcev celic in homogenizatorjev za laboratorije, namizne in industrijske sisteme. Velikost vaše bakterijske celične kulture, vaš raziskovalni ali proizvodni cilj in obseg celice za obdelavo na uro ali dan so bistveni dejavniki za iskanje pravega ultrazvočnega motilca celic za vašo uporabo.
Hielscher Ultrasonics ponuja različne rešitve za hkratno ultrazvočno razbijanje več vzorcev (do 10 vial z VialTweeterjem) in masnih vzorcev (tj. Mikrotitrijske plošče / ELISA plošče z UIP400MTP), kot tudi klasični laboratorijski ultrazvočni ultrazvočni aparat s sondami z različnimi stopnjami moči od 50 do 400 vatov do popolnoma industrijskih ultrazvočnih procesorjev z do 16.000 vatov na enoto za komercialne motnje celic in ekstrakcijo beljakovin v veliki proizvodnji. Vsi Hielscher ultrazvočni aparati so izdelani za delovanje 24/7/365 pod polno obremenitvijo. Robustnost in zanesljivost sta temeljni lastnosti naših ultrazvočnih naprav.
Vsi digitalni ultrazvočni homogenizatorji so opremljeni s pametno programsko opremo, barvnim zaslonom na dotik in samodejnim protokoliranjem podatkov, zaradi česar je ultrazvočna naprava priročno delovno orodje v laboratoriju in proizvodnih obratih.
Sporočite nam, kakšne celice, kakšen volumen, s kakšno frekvenco in s kakšnim ciljem morate obdelati svoje biološke vzorce. Priporočili vam bomo najprimernejši ultrazvočni motilec celic za vaše procesne zahteve.
Spodnja tabela vam prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih sistemov od kompaktnih ročnih homogenizatorjev in MultiSample ultrasonicatorjev do industrijskih ultrazvočnih procesorjev za komercialne aplikacije:
| Obseg serije | Pretok | Priporočene naprave |
|---|---|---|
| 96-jamične / mikrotitrijske plošče | n.a. | UIP400MTP |
| 10 vial po 0,5 do 1,5 ml | n.a. | VialTweeter na UP200St |
| 001 do 250 ml | 5 do 100 ml / min | UP50H |
| 0.01 do 500 ml | 10 do 200 ml / min | UP100H |
| 10 do 2000 ml | 20 do 400 ml / min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 do 20L | 00,2 do 4 l/min | UIP2000hdT |
| 10 do 100L | 2 do 10 l/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 do 100 l/min | UIP16000 |
| n.a. | Večji | Grozd UIP16000 |
Kontaktirajte nas! / Vprašajte nas!
UIP400MTP plošča sonikator za visoko zmogljive motnje celic na ploščah z 96 vdolbinicami
ultrazvočni aparat UP200Ht z 2 mm mikrokonico S26d2 za ultrazvočno razbijanje majhnih vzorcev
Preberite več o tem, kako lahko uporabite svoj ultrazvočni homogenizator tkiva za učinkovito in zanesljivo pripravo puferskih raztopin!
Dejstva, ki jih je vredno vedeti
Bakterije Escherichia Coli
Escherichia coli je vrsta bakterije, ki ne tvori spore, gram-negativna in je značilna oblika ravne palice. Bakterije E. coli so prisotne v okolju, hrani in črevesju ljudi in živali. E. coli je običajno gibljiva z uporabo peritrihičnih flagel, vendar obstajajo tudi negibljivi tipi. E. coli so tako imenovani fakultativno anaerobni kemoorganotrofni organizmi, kar pomeni, da so sposobni tako dihalne kot fermentativne presnove. Večina vrst E. coli je benignih in opravlja koristne funkcije v telesu, npr. zavira rast škodljivih bakterijskih vrst, sintetizira vitamine itd.
Celice bakterij Escherichia coli tako imenovanega tipa B so posebna kategorija sevov E. coli, ki se pogosto uporabljajo v raziskavah za raziskovanje mehanizmov, kot so občutljivost bakteriofagov ali sistemi omejevanja in modifikacije. Poleg tega so bakterije E. coli cenjene kot zanesljiv delovni konj za izražanje beljakovin v biotehnoloških laboratorijih in laboratorijih za znanost o življenju. Na primer, E. coli se uporablja za sintezo spojin, kot so beljakovine in oligosaharidi v industrijskem obsegu. Zaradi specifičnih lastnosti, kot so pomanjkanje proteaze, nizka proizvodnja acetata pri visoki ravni glukoze in povečana prepustnost, so celice B E. coli najpogosteje uporabljene gostiteljske celice za proizvodnjo gensko spremenjenih beljakovin.
Rekombinantne beljakovine
Rekombinantni proteini (rProt) postajajo vse pomembnejši v različnih panogah, vključno s kemično proizvodnjo, farmacevtsko, kozmetično, humano in živalsko medicino, kmetijstvom, hrano in industrijo obdelave odpadkov.
Proizvodnja rekombinantnih beljakovin zahteva uporabo izražalnega sistema. Kot izražanje celičnih sistemov za proizvodnjo rekombinantne DNK se lahko uporabijo tako prokariontske kot evkariontske celice. Medtem ko se bakterijske celice najpogosteje uporabljajo za izražanje beljakovin zaradi dejavnikov, kot so nizki stroški, enostavna razširljivost in preprosti medijski pogoji, so sesalci, kvasovke, alge, žuželke in sistemi brez celic uveljavljene alternative. Vrsta beljakovin, funkcionalna aktivnost in zahtevani donos izraženih beljakovin vplivajo na izbiro celičnega sistema, ki se uporablja za izražanje beljakovin.
Za ekspresijo rekombinantnega proteina je treba določeno celico transfekirati z vektorjem DNK, ki vsebuje predlogo rekombinantne DNK. Celice, transfekirane s predlogo, se nato kultivirajo. Kot posledica celičnega mehanizma celice prepišejo in prevedejo želeno beljakovino, s čimer proizvedejo ciljno beljakovino.
Ker so izražene beljakovine ujete v celični matriks, je treba celico lizirati (prekiniti in zlomiti), da se beljakovine sprostijo. V naslednjem koraku čiščenja se beljakovina loči in očisti.
Prvi rekombinantni protein, uporabljen pri zdravljenju, je bil rekombinantni humani insulin leta 1982. Danes se po vsem svetu proizvaja več kot 170 vrst rekombinantnih beljakovin za zdravljenje. Pogosto uporabljeni rekombinantni proteini, ki se uporabljajo v medicini, so na primer rekombinantni hormoni, interferoni, interlevkini, rastni faktorji, faktorji tumorske nekroze, faktorji strjevanja krvi, trombolitična zdravila in encimi za zdravljenje hudih bolezni, kot so sladkorna bolezen, pritlikavost, miokardni infarkt, kongestivno srčno popuščanje, cerebralna apopleksija, multipla skleroza, nevtropenija, trombocitopenija, anemija, hepatitis, revmatoidni artritis, astma, Crohnova bolezen in zdravljenje raka. (prim. Phuc V. Pham, v Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Literatura / Reference
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonicator za sočasno ultrazvočno razbijanje 10 vzorcev, npr. za motečenje celic BL21
Visoko zmogljiva ultrazvoka! Hielscherjeva paleta izdelkov zajema celoten spekter od kompaktnega laboratorijskega ultrazvočnega aparata preko namiznih enot do popolnoma industrijskih ultrazvočnih sistemov.