Ultrasonic lize E. Coli

  • E. coli bakterije so najpogosteje uporabljeni bakterije v mikrobiologije in biotehnologije.
  • Ultrazvočni celic motilci zagotavljajo zanesljive in ponovljive rezultate za razpad E. coli.
  • Intenzivno še natančno krmiliti kavitacijski in strižnih sil povzroči popolno motenj in visokimi dobitki pridobivanja (npr proteinov, DNK).

Zakaj je ultrazvočna celična motnja E. coli prednostna metoda?

Ultrazvočni homogenizatorji ali ultrazvočni tip sonde ponujajo več prednosti za lizo E. coli, saj intenzivni ultrazvok učinkovito moti celične stene in membrane. Ultrazvočniki tipa sonde se pogosto uporabljajo za lizo E. coli zaradi naslednjih razlogov:

  • Učinkovita motnja celičnih sten: E. coli ima poltogo celično steno, sestavljeno iz peptidoglikana, ki jo je težko prekiniti s tradicionalnimi metodami lize. Ultrazvočni tip sonde ustvarja intenzivne ultrazvočne valove, ki ustvarjajo kavitacijske mehurčke v tekočini, ki obdaja celice. Ko se ti mehurčki zrušijo, ustvarjajo hitre tekoče curke in udarne valove, ki povzročijo mehanske motnje celičnih sten in učinkovito sproščajo celične vsebine, kot so biomolekule.
  • Izboljšana penetracija: Ultrazvočni valovi, ki jih ustvarja sonda / sonotroda, lahko prodrejo globoko v vzorec, dosežejo večje število celic E. coli in jih enakomerno obdelajo. To pomaga zagotoviti, da je liza bolj enakomerna po celotnem vzorcu, kar ima za posledico večjo učinkovitost motenj celic.
  • Skrajšani čas obdelave: Energija, ki jo oddaja ultrazvočni tip sonde, je visoko koncentrirana in lokalizirana, kar vodi do hitre in učinkovite lize celic. V primerjavi z drugimi metodami, kot so pretepanje kroglic ali encimska liza, lahko ultrazvočno razbijanje doseže lizo E. coli v nekaj minutah ali celo sekundah. Medtem ko številne alternativne tehnike, kot je zamrzovanje-odmrzovanje, zahtevajo več krogov zdravljenja, ultrazvočna liza odpre celice v enem samem procesnem koraku.
  • Regulacija temperature: Najsodobnejši ultrazvočniki so opremljeni s temperaturnimi senzorji in pametno programsko opremo, ki omogoča nastavitev maksimalne temperature procesa. Ultrasonicator samodejno ustavi, ko je dosežena temperaturna meja in začne postopek ultrazvočnega razbijanja, ko je dosežena nastavljena temperaturna točka. Hlajenje vzorcev v ledeni kopeli je preprosta metoda za ohranjanje nizke temperature vzorca in preprečevanje razgradnje vzorca zaradi vročine.
  • Skalabilnost: Ultrazvočni aparati tipa sonde so na voljo v različnih velikostih, od ročnih naprav do velikih industrijskih modelov. Zaradi tega so primerni za predelavo majhnih količin v laboratoriju ali povečanje za večje biopredelovalne aplikacije, npr. proizvodnjo cepiv ali biosintezo molekul.
  • Vsestranskost: Ultrasonicators se lahko uporablja za različne aplikacije, ki presegajo lizo celic, kot so striženje DNA, ekstrakcija beljakovin, homogenizacija tkiva, disperzija nanodelcev in emulgiranje. Zato vlaganje v ultrazvočni tip sonde zagotavlja vsestranskost v raziskovalnih ali industrijskih okoljih.
  • Ultrazvočniki tipa sonde, kot je UP200St, so zanesljivi homogenizatorji tkiv in drobilniki celic, zato se pogosto uporabljajo za pripravo vzorcev v genetiki, npr. Za lizo E.coli

    Ekstrakcija beljakovin iz celic E. coli se učinkovito izvaja z ultrazvočna sonda UP200St

    Sonda tipa ultrasonicator ponuja številne prednosti za lizo E. coli. Zanesljiv in natančen nadzor nad parametri ultrazvočnega procesa omogoča optimizacijo obratovalnih parametrov, kot so moč, trajanje in ravnanje z vzorci, da dosežete želene rezultate.
     

    Prošnja za informacije




    Upoštevajte naše Politika zasebnosti.


     

    Ta vadnica pojasnjuje, katera vrsta sonikatorja je najboljša za vaše naloge priprave vzorcev, kot so liza, motnje celic, izolacija beljakovin, fragmentacija DNK in RNA v laboratorijih, analize in raziskave. Izberite idealno vrsto sonikatorja za vašo aplikacijo, volumen vzorca, številko vzorca in prepustnost. Hielscher Ultrasonics ima idealen ultrazvočni homogenizator za vas!

    Kako najti popoln Sonicator za motnje celic in ekstrakcijo beljakovin v znanosti in analizi

    Video sličica

    Ultrazvočna razdrobljenost DNK se pogosto uporablja kot korak priprave vzorca v zaporedju naslednje generacije (NGS)

    Elektroforezne analize genomske DNA E. coli EDL933 podvržene ultrazvočni razbijanju 0 - 15 min. L označuje lestev DNK.
    (študija in slika: Basselet et al., ©2008)

    Motnje celic z uporabo ultrazvočne kavitacije

    Homogenizatorji tipa ultrazvočne sonde delujejo s približno 20.000 cikli na sekundo (pri 20kHz) in povzročajo kavitacijo v tekočinah ali suspenzijah. Akustična kavitacija, mikroskopska območja vakuumskih tlakov in visokih temperatur, ki raztrgajo celice. Čeprav lahko temperature dosežejo več tisoč stopinj Celzija, so prostornine kavitacije tako majhne, da procesa bistveno ne segrejejo. Ultrazvok ustvarja akustično kavitacijo in strižne sile perforirajo ali razbijejo celično membrano bakterijskih celic, kot je E. coli. Hielscher ultrasonicatorji omogočajo natančen nadzor nad procesnimi parametri, kot so ultrazvočna intenzivnost, amplituda, vnos energije in temperatura. S tem se lahko proces ultrazvočne lize optimalno prilagodi tipu celice, celični kulturi in cilju procesa.
     

    Prednosti Ultrasonic lizo

    • natančna kontrola lize (intenzivnost, amplituda, temperatura)
    • zanesljivi in ponovljivi rezultati
    • optimalno prilagajanje na določene vzorce
    • nadzor temperature
    • zelo majhnih do zelo velikih vzorcih (ul do litrov)
    • Povsem mehanska obdelava
    • uporabniku prijazno, varno delovanje
    • linearna lestvica navzgor iz laboratorija do proizvodnje
    Ultrazvočni Naprava VialTweeter omogoča hkratno pripravo vzorca do 10 vial pod enakimi pogoji procesa. (Kliknite za povečavo!)

    VialTweeter za ultrazvočno lizo

    Prošnja za informacije




    Upoštevajte naše Politika zasebnosti.


    Ultrazvočni homogenizator v primerjavi z drugimi tehnikami lize

    Medtem ko je kemijska in encimska liza lahko problematična – od kemijske lize more spremeniti strukture proteinov in uvesti probleme čiščenja in encimsko lizo zahteva dolg inkubacijski čas in ni ponovljiv – ultrazvočni motnje je prefinjeno, hiter mobilni metoda motnje.
    Ultrazvočna liza temelji samo na mehanskih silah. Kemikalije niso dodane, ultrazvočno razbijanje razbije celično steno s strižnimi silami. Kemična liza lahko spremeni strukturo beljakovin in povzroči težave s čiščenjem. Encimske motnje zahtevajo dolge inkubacijske čase in jih ni mogoče ponoviti. Ultrazvočna celična motnja celic bakterij E.coli je hitra, enostavna, zanesljiva in ponovljiva. Zato se Hielscher ultrasonicators uporabljajo v bioloških in biokemičnih laboratorijih po vsem svetu za pripravo vzorcev, pre-ananlitike, in vitro diagonstike in mnogotere teste.

    Splošna priporočila za ultrazvočno lizo

    Ultrazvoka je najbolj priljubljena tehnika za lizo zelo majhne, ​​srednje in velike količine celičnih suspenzij – od PICO-l do 100L / h (z uporabo ultrazvočne pretočno celico). Celice liziramo s tekočinsko striga in kavitacije. DNK je narezal tako med ultrazvočno razbijanje, tako da ni potrebno dodati DNaze v celični suspenziji.
     

    Nadzor temperature med ultrazvočno lizo E. coli
    Ultrazvočni celični motilec UP100H (100W) za motnje celic in ekstrakcijo rastlinskih spojin.S predhodno hlajenje vzorca in vodenje vzorca med ultrazvočno razbijanje na ledu, vzorec termična razgradnja vzorca z lahkoto preprečiti.
    V idealnem primeru bi morali biti vzorci med lizo ledeno hladni, vendar je za večino vzorcev dovolj, če se temperatura ne dvigne nad temperaturo kulture ali vira tkiva. Zato je priporočljivo, da suspenzijo obdržite na ledu in sonikirate z več kratkimi ultrazvočnimi impulzi 5-10 sekund in premori 10-30 sekund. Med premori se lahko toplota razprši, da se ponovno vzpostavi nizka temperatura. Za večje vzorce celic so na voljo različni reaktorji pretočnih celic s hladilnimi plašči.
    Preberite tukaj podrobne nasvete in priporočila za uspešno ultrazvočno lizo!

    Protokoli za ultrazvočno pripravo lizatov E. coli

    Raziskovalci uporabljajo Hielscher ultrazvočne homogenizatorje za motnje celic E. coli. Spodaj lahko najdete različne preizkušene in dokazane protokole za lizo E.coli z uporabo Hielscher ultrazvočnih homogenizatorjev za različne aplikacije, povezane z E. coli.
     

    Ta video posnetek prikazuje Hielscher ultrazvočni homogenizer UP100H, ultrasonicator, ki se pogosto uporablja za pripravo vzorcev v laboratorijih.

    Ultrazvočni homogenizer UP100H

    Video sličica

    Rast celic, premreženje in priprava ekstraktov celic E. coli z uporabo ultrazvoka

    Za SeqA in RNA polimeraze čip-Chip E. coli MG1655 ali MG1655 ΔseqA smo gojili pri 37 ° C do OD600 približno 0,15 v 50 ml LB (+ 0,2% glukoze), preden dodamo 27 μl formaldehida (37%) na ml medija (končna koncentracija 1%). Premreženje smo izvajali pri počasnem tresenju (100 obratov na minuto) pri sobni temperaturi 20 minut, nato pa smo ga kalili z 10 ml 2,5 M glicina (končna koncentracija 0,5 M). Za eksperimente s toplotnim šokom smo E. coli MG1655 gojili v 65 ml LB mediju pri 30 ° C na OD600 približno 0,3. Nato smo 30 ml kulture prenesli v predhodno segreto bučko pri 43 °C, preostanek pa pri 30 °C. Premreženje in gašenje je bilo opisano zgoraj, le da so celice 5 minut hranili pri 30 ali 43 °C, preden so se pri sobni temperaturi še naprej počasi tresli. Celice so bile zbrane s centrifugiranjem in dvakrat sperene s hladno TBS (pH7,5). Po resuspendiranju v 1 ml liznem pufru (10 mM Tris (pH 8,0), 20 % saharoze, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizocima) in inkubaciji pri 37 °C 30 minut, čemur je sledilo dodajanje 4 ml IP pufra, so celice sonikirali na ledu z 12-krat 30 sekundami in 30 sekundnimi odmori z uporabo Hielscher ultrazvočnega procesorja UP400St pri nastavitvi moči 100%. Po 10-minutnem centrifugiranju pri 9000 g smo pri -20 °C shranili alikvote supernatanta 800 μl. (Waldminghaus 2010)
     

    Prekomerna proizvodnja in čiščenje encimov z ultrazvočno sondo

    Ultrasonicator UP100H je laboratorijski homogenizer, ki se pogosto uporablja za pripravo vzorcev plošč celične kulture.Za prekomerno proizvodnjo beljakovin z oznako dekahistidina (His10) je bila E. coli BL21(DE3) preoblikovana s konstrukti pET19b. Predkultura čez noč je bila pobrana s centrifugiranjem, 1% pa je bilo uporabljeno za inokulacijo izrazne kulture. Celice, ki nosijo pET19mgtB, so gojili pri 22 °C do optične gostote pri 600 nm (OD600) 0,7. Kultura je bila prenesena na 17 °C in inducirana s 100 μM IPTG. Po 16 urah smo kulturo pobrali s centrifugiranjem pri 7.500 × g pri 4 °C. Celice so bile resuspendirane v 50 mM fosfatno puferirani fiziološki raztopini (PBS) z 0,3 M NaCl pri pH 7,4 in motene z ultrasonication z S2 micro-tip sonotrode na Hielscher ultrasonicator UP200St v ciklu 0,5 in amplitudi 75%.
    Prekomerna proizvodnja decahistidine-označeni GtfC smo inducirali pri 37 ° C pri OD600 0,6 s 100 iM IPTG. Celice smo nato inkubirali 4 ure, pridelane in lizirali kot je navedeno zgoraj za MgtB.
    Ekstrakte surovih celic smo centrifugirali pri 15.000 × g in 4 °C, da bi umirili celične odpadke. Prečiščeni ekstrakti so bili naloženi na 1-ml surove kolone HisTrap FF s sistemom ÄKTAprime Plus. Encimi so bili očiščeni v skladu s proizvajalčevim protokolom za gradientno elucijo beljakovin, označenih z Hisom. Eluirane proteinske raztopine smo dvakrat dializirali proti 1.000 volumnom 50 mM PBS, pH 7,4, z 0,3 M NaCl pri 4 °C. Čiščenje je analiziralo 12% SDS-PAGE. Koncentracija beljakovin je bila določena z Bradfordovo metodo z uporabo Roti-Quant. (Rabausch et al., 2013)
     

    Ultrazvočna ekstrakcija beljakovin iz bakterije E. coli
    Vaba zanimivi protein (v tem primeru MTV1 Arabidopsis thaliana) spojen na GST tag in izražena v BL21 Escherichia coli (E. coli) celicah.

    1. Vzamemo eno peleto GST-MTV1 in GST (ki ustreza 50 ml bakterijske kulture) in ju resuspendiramo v 2,5 ml pufra za hladno ekstrakcijo ledu.
    2. Uporabite ultrazvočni UP100H (opremljen z MS3 microtip-sonotrode za majhne količine približno 2-5 ml), da motite bakterijske celice, dokler se ne lizirajo, kar kaže zmanjšana motnost in povečana viskoznost. To je treba izvesti na ledu, priporočljivo pa je sonikirati v intervalih (npr. 10-sekundno sonikiranje, ki mu sledi 10-sekundni premor na ledu in tako naprej). Paziti je treba, da ne sonikiramo s previsoko intenzivnostjo. Če se odkrije penjenje ali tvorba bele oborine, je treba intenzivnost zmanjšati.
    3. Prenesite raztopino liziranih bakterij v 1,5 ml mikrocentrifugalne epruvete in 20 minut centrifugirajte pri 16.000 x g pri 4 °C.

     

    Ultrazvočne sonde uporabljajo sile akustične kavitacije, da motijo celice in izvlečejo molekule in DNA iz E. coli.

    Ultrasonicatorji tipa sonde, kot je UP400St uporabite načelo delovanja akustične kavitacije za učinkovito lizo E. coli.

    Ekspresivna analiza in čiščenje rekombinantnega proteina z ultrazvočno razbijanjem

    Peleta E. coli je bila sonikirana z ultrazvočnim Hielscher UP100H. V ta namen smo celične pelete resuspendirali v ohlajenem liznem pufru (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) in 10 minut ohladili na ledu. Nato je bila celična suspenzija sonikirana z 10 kratkimi izbruhi 10 s, čemur je sledil interval 30 s za hlajenje. Končno so bili ostanki celic odstranjeni z ultracentrifugiranjem pri 4 ° C za 15 minut pri 14000 vrt / min. Za potrditev rPR ekspresije je bil supernatant izveden na 12% poliakrilamidnem gelu in analiziran s SDS-PAGE in Western blotting. Čiščenje rPR je potekalo z uporabo smole Ni2+-NTA (Invitrogen, ZDA) v skladu s proizvajalčevimi navodili. V tej fazi je bila uporabljena domača metoda čiščenja. Čistost prečiščenega proteina je bila ocenjena z elektroforezo na 12% poliakrilamidnem gelu in kasnejšim Coomassie modrim barvanjem. Koncentracijo prečiščenih beljakovin so merili s kompletom za analizo beljakovin Micro BCA (PIERCE, ZDA). (Azarnezhad et al., 2016)
     

    Ta video prikazuje 200 vatov ultrazvočni cuphorn za razpršanje, homogenizacijo, ekstrakcijo ali razpihanje laboratorijskih vzorcev.

    Ultrazvočni Cuphorn (200 W)

    Video sličica

    Ultrazvočni homogenizatorji za lizo E. coli

    Hielscher Ultrasonics oblikuje, proizvaja in dobavlja visoko zmogljive ultrazvočne homogenizatorje za zanesljivo in učinkovito lizo bakterij E. coli in drugih vrst celic, tkiv in celičnih kultur.
    Širok portfelj ultrazvočnih sond in posrednih sistemov ultrazvočnega razbijanja nam omogoča, da vam ponudimo idealen ultrazvočni homogenizator tkiva za vašo aplikacijo za motnje in ekstrakcijo celic.

    Oblikovanje, izdelava in svetovanje – Kakovost izdelana v Nemčiji

    Hielscher ultrasonicatorji se lahko daljinsko upravljajo prek nadzora brskalnika. Parametre sonikacije je mogoče spremljati in prilagajati natančno zahtevam postopka.Hielscher ultrasonicators so dobro znani po svojih najvišjih standardih kakovosti in oblikovanja. Pametna programska oprema, intuitiven meni, programabilne nastavitve in samodejni protokol podatkov so le nekatere značilnosti Hielscher ultrasonicators. Robustnost in enostavno upravljanje omogočata nemoteno integracijo naših ultrazvočnih naprav v raziskovalne in biotehnološke objekte. Tudi grobe razmere in zahtevna okolja zlahka ravnajo Hielscher ultrasonicators.

    Hielscher Ultrasonics je iso certificirano podjetje in dal poseben poudarek na visokozmogiji ultrasonicators, ki vključujejo najmotejšo tehnologijo in prijaznost uporabnika. Seveda, Hielscher ultrasonicators so CE skladni in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.

    V spodnji tabeli vam daje podatek o približni zmogljivosti obdelave naših ultrasonicators:

    serija VolumePretokPriporočena naprave
    multi-well / mikrotiter ploščeni podatkovUIP400MTP
    CupHorn za viale ali čašoni podatkovUltrazvočni cuphorn
    ultrazvočni reaktor z mikro pretokomni podatkovGDmini2
    do 10 vial z 0,5 do 1,5 mlni podatkovVialTweeter
    00,5 do 1,5 mlni podatkovVialTweeter
    1 do 500ml10 do 200 ml / minUP100H
    10 do 2000 ml20 do 400ml / minUP200Ht, UP400St
    00,1 do 20L00,2 do 4L / minUIP2000hdT
    10 do 100L2 do 10L / minUIP4000
    ni podatkov10 do 100L / minUIP16000
    ni podatkovvečjagruča UIP16000

    Kontaktiraj nas! / Vprašajte nas!

    Vprašajte za več informacij

    Prosimo, uporabite spodnji obrazec, da zahtevate dodatne informacije o ultrazvočnih homogenizatorjih tkiv in drobilcih celic, aplikacijah za lizo in cenah. Z veseljem se bomo z vami pogovorili o vašem procesu in vam ponudili ultrazvočni homogenizator, ki izpolnjuje vaše zahteve!









    Prosimo, upoštevajte naše Politika zasebnosti.


    Video prikazuje ultrazvočni sistem za pripravo vzorcev UIP400MTP, ki omogoča zanesljivo pripravo vzorca vseh standardnih večglasnih plošč z uporabo ultrazvoka visoke intenzivnosti. Tipične aplikacije UIP400MTP vključujejo celično lizo, DNK, RNK in kromatin omejevanje, kot tudi ekstrakcijo beljakovin.

    Ultrasonicator UIP400MTP za multi-dobro sonication plošče

    Video sličica

    Dodatni protokoli za ultrazvočno lizo E. coli

    Allicin modificirane beljakovine v E. coli z uporabo ultrazvočnega VialTweeterja

    VialTweeter na ultrazvočnem procesorju UP200STDoločitev sulfhidril Vsebina z 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzojske kisline) (DTNB) Vsebnost
    Kultura E. coli MG1655 čez noč je bila uporabljena za inokulacijo minimalnega medija MOPS (1:100). Kultura je rasla aerobno, dokler ni bil dosežen A600 0,4. Kultura je bila razdeljena na tri 15-mililitrske kulture za zdravljenje stresa. Neobdelana kultura je služila kot negativna kontrola. 0,79 mM alicina (128 μg ml-1) ali 1 mM diamida smo dodali eni od preostalih dveh kultur. Kulture smo inkubirali 15 minut. 5 ml vsake kulture smo pobrali s centrifugiranjem (8.525 × g, 4 °C, 10 min). Celice smo dvakrat sprali z 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, shranili anaerobno pred uporabo) in centrifugirali (13.000 × g, 4 °C, 10 min). Celice so bile resuspendirane v liznem pufru (PBS s 6 mM gvanidinijevim HCl, pH 7,4) pred prekinitvijo pri 4 °C z ultrazvočnim razbijanjem (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Nemčija) (3 × 1 min). Ostanke celic smo peletirali s centrifugiranjem (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant smo z magnetno mešalno palico prenesli v 3,5-mililitrsko QS-makro kiveto (10 mm) in zmešali z 1 ml pufra za lizo. Izumrtje vzorcev smo spremljali pri 412 nm s spektrofotometrom Jasco V-650, opremljenim s temperaturno nadzorovanim držalom celic PSC-718 pri sobni temperaturi. Dodali smo 100 μl 3 mM raztopine ditiobisa (2-nitrobenzojske kisline). Izumrtje so spremljali, dokler ni doseglo nasičenosti. Izračun koncentracije tiola je bil izveden z uporabo ekstinkcijskega koeficienta ε412 = 13.700 M-1 Cm-1 za tio-2-nitrobenzojsko kislino (TNB). Cellular tiol Koncentracije so bili izračunani na osnovi volumna celic E. coli 6.7 x 10-15 liter in gostota celic A600 = 0,5 (kar ustreza 1 × 108. celice ml-1 kultura). (Müller et al. 2016)
     

    Določanje glutationa in vivo z uporabo drobilnika ultrazvočnih celic

    E.coli MG1655 je bil gojen v minimalnem mediju MOPS v skupnem volumnu 200 ml, dokler ni bil dosežen A600 0,5. Kultura je bila razdeljena na 50-mililitrske kulture za zdravljenje stresa. Po 15 minutah inkubacije z 0,79 mM alicina, 1 mM diamidom ali dimetil sulfoksidom (kontrola) so celice 10 minut pobrali pri 4.000 g pri 4 °C. Celice smo dvakrat sprali s KPE pufrom pred resuspenzijo peletov v 700 μl KPE pufra. Za deproteinacijo smo pred prekinitvijo celic z ultrazvočnim razbijanjem dodali 300l 10% (w / v) sulfosalicilne kisline (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatante smo zbrali po centrifugiranju (30 min 13,000g, 4 ° C). Koncentracije sulfosalicilno kislino smo z dodatkom 3 volumnih KPE pufra znižal na 1%. Meritve celotne glutationa in GSSG smo izvedli, kot je opisano zgoraj. Cellular koncentracije glutation so bili izračunani na osnovi volumna E. coli celice 6,7×10-15 liter in gostota celic A600 0,5 (kar ustreza 1×108. celice ml-1 kultura). Koncentracije GSH smo izračunali z odštevanjem 2 [GSSG] od celotne glutation. (Müller et al. 2016)

    Izražanje človeškega mAspAT v E. coli z uporabo ultrazvočnega homogenizatorja

    Ultrazvočni celične motnje UP400St (400W) za ekstrakcijo znotrajcelične snovi (npr proteini, organeli, DNA, RNA itd)Enotna kolonije E. coli BL21 (DE3) zadrževanje ekspresijski vektor v 30 ml Luria-Bertani (LB) medij, ki vsebuje 100 ug / ml ampicilina, nato gojili na 37 ° C, dokler optična gostota (OD600) Je dosegel 0,6. Celice smo zbrali s centrifugiranjem pri 4000 x g 10 minut in ponovno suspendirali v 3L svežega LB mediju, ki vsebuje 100 ug / ml ampicilina.
    Nato je bila ekspresija beljakovin inducirana z 1 mM izopropilnim β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozidom (IPTG) 20 ur pri 16 ° C. Celice smo pobrali s centrifugiranjem 15 minut pri 8.000 × g in sprali s pufrom A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Približno 45 g celic (mokre teže) smo pridobili iz 3 L kulture. Po centrifugiranju so bili celični peleti resuspendirani v 40 ml (za 1 L kulturo) ledeno hladnem ekstrakcijskem pufru A in lizirani z ultrazvočnim razbijanjem pri ledeno hladni temperaturi z uporabo Hielscher ultrazvočne celične drobilnice UP400St. Lizo celic so 15 minut centrifugirali pri 12.000 obratih na minuto, da bi ločili topne (supernatant) in oborjene (peletne) frakcije. (Jiang et al., 2015)
     



    Dejstva je treba vedeti

    E. coli

    Escherichia coli (E. coli) je gram negativna, fakultativno anaerobna paličasta koliformna bakterija iz rodu Escherichia, ki se običajno nahaja v spodnjem črevesju toplekrvnih organizmov (endotermi). Obstaja veliko število sevov E. coli (ali podtipov) z različnimi značilnostmi. Večina sevov E. coli je neškodljiva za ljudi, npr. Sevov B in K-12, ki se običajno uporabljajo za raziskovalne aplikacije v laboratorijih. Vendar so nekateri sevi škodljivi in ​​lahko povzročijo hude bolezni.
    E. coli igra pomembno vlogo v sodobni biološki inženiring in industrijske mikrobiologije, saj imajo bakterije je enostavno manipulirati. Skupna lab aplikacije, pri katerih gre za pogosto uporabo E. coli, npr ustvariti rekombinantne kislino (DNK) ali da delujejo kot model organizem.
    E. coli je zelo vsestranski gostitelja za produkcijo heterolognih proteinov, in razdelilne ekspresijo sistemi so na voljo za proizvodnjo rekombinantnih proteinov v E. coli. Uporaba plazmidov, ki omogočajo visoko ekspresijo stopnja beljakovin, lahko gene uvedemo bakterij, ki omogoča proizvodnjo teh proteinov v velikih količinah v industrijskih fermentacijskih procesov.
    E. coli se uporablja kot celične tovarne za proizvodnjo insulina. Nadaljnje uporabe vključujejo uporabo spremenjenih celic E. coli za razvoj in proizvodnjo cepiv in imobiliziranih encimov, proizvodnjo biogoriv in bioremediacijo.
    Sev K-12 je mutantna oblika E. coli, ki prekomerno izraža encima alkalne fosfataze (ALP). Ta mutacija se pojavi zaradi okvare gena, ki nenehno kode za encim. Če gen daje izdelek brez inhibicije je to znano kot konstitutivno aktivnost. Ta posebna mutantna oblika se uporablja za izolacijo in čiščenje ALP encimov.
    Bakterije E. coli se pogosto uporabljajo tudi kot celične tovarne. Inženirski mikrobi (npr. bakterije) in rastlinske celice se lahko uporabljajo kot tako imenovane celične tovarne. Te gensko spremenjene celice proizvajajo molekule, kemikalije, polimere, beljakovine in druge snovi, ki se uporabljajo na primer v farmacevtski, živilski in kemični industriji. Da bi sprostili molekule, proizvedene v notranjosti takšnih bioinženidnih celic, je ultrazvočna liza pogosta metoda za motnje celičnih sten in prenos ciljnih snovi v okoliško tekočino. Preberite več o lysis bioinengineered celic!

    Ultrazvočni DNK Rezalni

    Ultrazvočne strižne sile so pogosto uporabljena metoda za sproščanje molekul, organelov in beljakovin iz notranjosti celice ter za razbijanje verig DNK na koščke. Akustična kavitacija razbije celične stene in membrane, da izvleče DNK iz celic in ustvari fragmente okoli 600 – 800 bp v dolžini, ki je idealen za analizo.
    Kliknite tukaj, če želite izvedeti več o ultrazvočni homogenizers za fragmentacije DNK!

    Literatura/reference


    Ultrazvočne visoke zmogljivosti! Paleta izdelkov Hielscher zajema celoten spekter iz kompaktnega laboratorijskega ultrazvočnikatorja nad enotami na vrhu klopi do polnoindustrijskih ultrazvočnih sistemov.

    Hielscher Ultrasonics proizvaja visoko zmogljivost ultrazvočnih homogenizatorjev iz laboratorij do industrijske velikosti.


    Z veseljem bomo razpravljali o vašem procesu.

    Pojdiva v stik.