Hielscher Ultrazvočna tehnologija

Ultrasonic lize E. Coli

  • E. coli bakterije so najpogosteje uporabljeni bakterije v mikrobiologije in biotehnologije.
  • Ultrazvočni celic motilci zagotavljajo zanesljive in ponovljive rezultate za razpad E. coli.
  • Intenzivno še natančno krmiliti kavitacijski in strižnih sil povzroči popolno motenj in visokimi dobitki pridobivanja (npr proteinov, DNK).

Mobilni motenj kavitacije

Escherichia coli bakterije so zanesljivo lizirali z uporabo ultrazvočnih homogenizers tkiva.Ultrazvočna sonda tipa homogenizatorji deluje s pribl. 20.000 ciklov na sekundo (pri 20 kHz) in povzroči kavitacijo v tekočinah ali supsensions. Akustične kavitacija mikroskopski področja vakuumskih podobnih pritiskov in visokih temperaturah, ki trgali celice narazen. Čeprav se lahko temperature dosežejo več tisoč stopinj Celzija, obseg kavitacija so tako majhne, ​​da se bistveno ne segreje proces. Ultrazvok ustvari akustični kavitacijo in strižnih sil predrejo ali pa uničijo celično membrano E.coli – glede na nastavitev naprave za ultrazvočno homogenizator.

Prednosti Ultrasonic lizo

  • natančna kontrola lize (intenzivnost, amplituda, temperatura)
  • optimalno prilagajanje na določene vzorce
  • nadzor temperature
  • zelo majhnih do zelo velikih vzorcih (ul do litrov)
  • čisto mehanska obdelava
  • linearna lestvica navzgor iz laboratorija do proizvodnje
Ultrazvočni Naprava VialTweeter omogoča hkratno pripravo vzorca do 10 vial pod enakimi pogoji procesa. (Kliknite za povečavo!)

VialTweeter za ultrazvočno lizo

Prošnja za informacije




Upoštevajte naše Politika zasebnosti.


Medtem ko kemične in enzymtic liza je lahko problematično – od kemijske lize more spremeniti strukture proteinov in uvesti probleme čiščenja in encimsko lizo zahteva dolg inkubacijski čas in ni ponovljiv – ultrazvočni motnje je prefinjeno, hiter mobilni metoda motnje.
Ultrazvočna Liza temelji samo na mehanskih sil. Št kemikalije se dodajo, ultrazvoka odmori celične stene, ki jih strižnih sil. Kemična Liza lahko spremeni beljakovinsko strukturo in uvede težave pri čiščenju. encimska motnja zahteva dolge inkubacijske čase in ni ponovljiva.

Splošna priporočila

UP400St ultrasonicator z reaktorjem tokaUltrazvoka je najbolj priljubljena tehnika za lizo zelo majhne, ​​srednje in velike količine celičnih suspenzij – od PICO-l do 100L / h (z uporabo ultrazvočne pretočno celico). Celice liziramo s tekočinsko striga in kavitacije. DNK je narezal tako med ultrazvočno razbijanje, tako da ni potrebno dodati DNaze v celični suspenziji.
Regulacija temperature:
S predhodno hlajenje vzorca in vodenje vzorca med ultrazvočno razbijanje na ledu, vzorec termična razgradnja vzorca z lahkoto preprečiti.
V idealnem primeru je treba vzorce hraniti ledeno mrzlo med lizo, vendar za večino vzorcev zadošča, če se temperatura ne dvigne nad temperaturo kulture ali vira tkiva. Zato je priporočljivo, obdržati vzmetenje na ledu in sonicate z več kratkih ultrazvočnih impulzov 5-10 sec in premori 10-30 sec. Med premori, toplota lahko razpršijo, da se ponovno vzpostavi nizko temperaturo. Za večje vzorce celic, so na voljo različni reaktorji pretoka celic s hladilnimi jopiči.

Protokoli za pripravo E. Coli lizatov

Analiza Ekspresija in čiščenje rekombinantnega proteina

Coli Pelet E. sonificiramo z ultrazvočno sistemom UP100H (Hielscher). V ta namen je bila celična pelete ponovno suspendirali v ohlajeni liza pufru (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) in ohladimo na ledu 10 minut. Potem smo suspenzijo celic sonificiramo z 10 majhnih paketih 10 s, čemur sledi interval 30 sekund za hlajenje. Nazadnje je celica ostanki odstranjeni z ultracentrifugiranjem pri 4 ° C 15 min pri 14000 obratih na minuto. Za potrditev RPR izražanja supernatant deluje na 12% poliakrilamidnem gelu in analiziramo s SDS-PAGE in Western blot. Čiščenje RPR je bila opravljena s pomočjo Ni2 +-NTA smole (Invitrogen, ZDA) po priročniku proizvajalca. V tej fazi, smo uporabili nativne Postopek za čiščenje. Čistost očiščenega proteina smo določili z uporabo elektroforeze na 12% poliakrilamidnem gelu in naknadno Coomassie modrilom. Prečiščena koncentracija proteinov smo merili z mikro BCA proteina analiznega kompleta (PIERCE, ZDA). (Azarnezhad et al. 2016)

Ultrazvočni celične motnje UP100H (100 W) za lizo, motnje celic in DNA striženje.

Ultrasonic homogenizator UP100H 100W

Mobilni rasti, Crosslinking in priprava E. coli celičnih ekstraktov

Za SeqA in RNA polimeraze čip-Chip E. coli MG1655 ali MG1655 ΔseqA smo gojili pri 37 ° C do OD600 približno 0,15 v 50 ml LB (+ 0,2% glukoze), preden dodamo 27 μl formaldehida (37%) na ml medija (končna koncentracija 1%). Premreženje smo izvajali pri počasnem tresenju (100 obratov na minuto) pri sobni temperaturi 20 minut, nato pa smo ga kalili z 10 ml 2,5 M glicina (končna koncentracija 0,5 M). Za eksperimente s toplotnim šokom smo E. coli MG1655 gojili v 65 ml LB mediju pri 30 ° C na OD600 okoli 0,3. Nato smo 30 ml kulture prenesli v vnaprej segreto bučo pri 43 ° C, preostali del pa smo hranili pri 30 ° C. Premreževanje in kaljenje je bilo, kot je opisano zgoraj, le da so bile celice shranjene pri 30 ali 43 ° C 5 minut pred nadaljnjim počasnim tresenjem pri sobni temperaturi. Celice smo zbrali s centrifugiranjem in dvakrat sprali s hladnim TBS (pH 7,5). Po resuspenziramo v 1 ml puferu za lizo (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saharoze, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lizocima) in inkubacijo pri 37 ° C 30 minut, čemur sledi dodatek 4 ml IP pufer, celice so bile sonicated na ledu s 12 krat 30 sec in 30 sec odmori na UP400St Ultrazvočni procesor (Hielscher Ultrazvočna GmbH) s 100% močjo. Po centrifugiranju 10 min pri 9000 g, so 800 ul aliquotes supernatanta shranili pri -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

Prevelike in čiščenje encimov.

Za prekomernim decahistidine (His10) -tagged proteine, je E. coli BL21 (DE3) transformirana z pET19b konstrukti. Čez noč predkultivacijo požanjemo s centrifugiranjem in 1% smo uporabili za inokulacijo ekspresijskega kulture. Celice, ki opravljajo pET19mgtB gojimo pri 22 ° C, dokler ne dosežemo optične gostote pri 600 nm (OD600) 0,7. Kulturo smo prenesli v 17 ° C in 100 um IPTG inducirana. Po 16 h smo kulture zberemo s centrifugiranjem pri 7.500 x g pri 4 ° C. Celice smo resuspendirali v 50 mM fosfatnim pufrom (PBS) z 0,3 M NaCl pri pH 7,4 in moten ultrazvoka z mikro konico sonotrode s2 pri UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Nemčija) pri ciklu 0,5 in amplitudo 75%.
Prekomerna proizvodnja decahistidine-označeni GtfC smo inducirali pri 37 ° C pri OD600 0,6 s 100 iM IPTG. Celice smo nato inkubirali 4 ure, pridelane in lizirali kot je navedeno zgoraj za MgtB.
Surova celične ekstrakte smo centrifugirali pri 15000 x g in 4 ° C v usedlinah celičnih ostankov. Očiščen ekstrakte smo naložili na 1 ml HisTrap FF Surova stolpcev z uporabo sistema ÄKTAprime plus (GE Healthcare). Encimi smo očistili po protokolu proizvajalca za gradientno elucijo His-označenih proteinov. Eluiranega proteina raztopine smo dvakrat dializiramo proti 1.000 volumni 50 mM PBS, pH 7,4, z 0,3 M NaCl pri 4 ° C. Čiščenje smo analizirali z 12% SDS-PAGE. Koncentracijo proteina določimo po Bradfordu uporabo roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Nemčija). (Rabausch et al. 2013)

Pridobivanje proteina iz bakterije E. coli
Vaba zanimivi protein (v tem primeru MTV1 Arabidopsis thaliana) spojen na GST tag in izražena v BL21 Escherichia coli (E. coli) celicah.
1. Vzemite Pilula GST-MTV1 in GST (kar ustreza 50 ml bakterijske kulture) in suspenzijo vsak v 2,5 ml ledeno mrzlo ekstrakcijskega pufra.
2. Uporabi ultrasonicator UP100H (Opremljena z MS3 microtip-sonotrode za majhne količine (2-5mL)), da prekinejo bakterijske celice, dokler niso liziramo, ki je označen z zmanjšanim motnosti in povečano viskoznostjo. To je treba opraviti na ledu, in je priporočljivo, da sonicate v presledkih (npr 10 sek sonifikacijo čemur sledi 10 sekund na ledu in tako naprej). Paziti je treba, da ne sonicate s previsoko intenzivnostjo. Če penjenje ali je zaznana tvorbo bele oborine, je treba znižati intenzivnost.
3. Prenos liziranih bakterij rešitev 1,5 ml mikrocentrifugirkah in centrifugiramo pri 4 ° C, 16.000 x g 20 minut.

-Alicin modificiranih proteinov v E. coli

VialTweeter je udoben ultrasonicator za majhen vzorec homogenizacijoDoločitev sulfhidril Vsebina z 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzojske kisline) (DTNB) Vsebnost
E. coli MG1655 preko noči kulturo smo uporabili za inokulacijo omela minimalnem gojišču (1: 100). Kulturo smo gojili aerobno dokler ni dosežen A600 0,4. Kulturo smo razdelili v tri 15 ml kultur za zdravljenje stresa. Nezdravljena kultura služila kot negativno kontrolo. 0,79 mM alicin (128 ug ml-1) Ali 1 mM diamida dodamo enem od preostalih dveh vsake kulture. Kulture smo inkubirali 15 minut. 5 ml vsake kulture zberemo s centrifugiranjem (8525 x g, 4 ° C, 10 min). Celice smo dvakrat sprali z 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2OVP4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, shranjena anaerobno pred uporabo) in centrifugirana (13000 × g, 4 ° C, 10 min). Celice ponovno suspendiramo v liznem pufru (PBS s 6 mM gvanidinijevim HCl, pH 7,4) pred motnjami pri 4 ° C z ultrasonizacijo (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Nemčija) (3 x 1 min). Celični ostanki so v obliki kroglic s centrifugiranjem (13000 x g, 4 ° C, 15 min). Supernatant smo prenesli v 3,5 ml QS-makro kiveto (10 mm) z palčko magnetnim in zmešamo z 1 ml liznega pufra. Gasilni vzorcev smo opazovali pri 412 nm z JASCO V-650 spektrometer, opremljen z nadzorovano temperaturo držalo celic PSC-718 (Jasco) pri sobni temperaturi. 100 nI raztopine s 3 mM ditiobis (2-nitrobenzojske kisline) dodamo. Izumrtje je spremljati, dokler ne doseže nasičenost. Izračun tiolne koncentracije smo izvedli z uporabo ekstinkcijski koeficient ε je412 = 13.700 M-1 Cm-1 za tio-2-nitrobenzojsko kislino (TNB). Cellular tiol Koncentracije so bili izračunani na osnovi volumna celic E. coli 6.7 x 10-15 l in gostoto celico600 = 0,5 (kar ustreza 1 x 108. celice ml-1 kultura). (Müller et al. 2016)

V Vivo Glutathione Določanje

E.coli MG1655 smo gojili v MOPS minimalnem gojišču v celotnem volumnu 200 ml, dokler se A600 0,5. Kulturo smo razdelili v 50-mililitrske kulture za stresno zdravljenje. Po 15 min inkubacije z 0,79 mM alicinom, 1 mM diamida ali dimetil sulfoksida (kontrola), so bile celice pridelane pri 4000 g pri 4 ° C 10 min. Celice dvakrat speremo s KPE puferom pred resuspendiranjem pelet v 700 μl KPE puferja. Za deprotinacijo smo dodali 300 l 10% (m / v) sulfosalicilne kisline pred prekinitvijo celic z ultrasonizacijo (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatante smo zbrali po centrifugiranju (30 min 13,000g, 4 ° C). Koncentracije sulfosalicilno kislino smo z dodatkom 3 volumnih KPE pufra znižal na 1%. Meritve celotne glutationa in GSSG smo izvedli, kot je opisano zgoraj. Cellular koncentracije glutation so bili izračunani na osnovi volumna E. coli celice 6,7×10-15 l in gostoto celico600 00,5 (kar ustreza 1×108. celice ml-1 kultura). Koncentracije GSH smo izračunali z odštevanjem 2 [GSSG] od celotne glutation. (Müller et al. 2016)

Ultrazvočne motnje za razpad celic in pridobivanje biološkega materiala (Kliknite za povečavo!)

Sonda tipa ultrasonicator UP400St

Ekspresija humane mAspAT v E. coli

Ultrazvočni celične motnje UP400St (400W) za ekstrakcijo znotrajcelične snovi (npr proteini, organeli, DNA, RNA itd)Enotna kolonije E. coli BL21 (DE3) zadrževanje ekspresijski vektor v 30 ml Luria-Bertani (LB) medij, ki vsebuje 100 ug / ml ampicilina, nato gojili na 37 ° C, dokler optična gostota (OD600) Je dosegel 0,6. Celice smo zbrali s centrifugiranjem pri 4000 x g 10 minut in ponovno suspendirali v 3L svežega LB mediju, ki vsebuje 100 ug / ml ampicilina.
Nato smo proteinski ekspresijo induciramo z 1 mM izopropil P-ᴅ-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) za 20 ur pri 16 ºC. Celice smo zbrali s centrifugiranjem pri 8000 x g za 15 minut in speremo s pufrom A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Približati 45g (mokra teža) celice smo dobili iz 3 L kulture. Po centrifugiranju smo celične pelete ponovno suspendirali v 40 ml (1 L kulture) ledeno mrzlega ekstrakcijskega pufra A, in lizirali z ultrazvokom na ledeno mrzle temperature z nizom UP400St instrument (Dr. Hielscher GmbH, Nemčija). Lizo celic smo centrifugirali pri 12000 obratih na minuto za 15 minut za ločevanje topne (supernatant) in oborimo (pelete) frakcij. (Jiang et al., 2015)

V spodnji tabeli vam daje podatek o približni zmogljivosti obdelave naših ultrasonicators:

serija Volume Pretok Priporočena naprave
00,5 do 1,5 ml ni podatkov VialTweeter
1 do 500ml 10 do 200 ml / min UP100H
10 do 2000 ml 20 do 400ml / min UP200Ht, UP400St
00,1 do 20L 00,2 do 4L / min UIP2000hdT
10 do 100L 2 do 10L / min UIP4000
ni podatkov 10 do 100L / min UIP16000
ni podatkov večja gruča UIP16000

Kontaktiraj nas! / Vprašajte nas!

Prosimo, uporabite spodnji obrazec, če želite zahtevati dodatne informacije o ultrazvočni homogenizaciji. Z veseljem vam bomo ponudili ultrazvočni sistem, ki bo ustrezal vašim zahtevam.









Prosimo, upoštevajte naše Politika zasebnosti.


Literatura / Reference



Dejstva je treba vedeti

E. coli

Escherichia coli (E. coli) je gram negativna, fakultativno anaerobna paličasta koliformna bakterija iz rodu Escherichia, ki se običajno nahaja v spodnjem črevesju toplekrvnih organizmov (endotermi). Obstaja veliko število sevov E. coli (ali podtipov) z različnimi značilnostmi. Večina sevov E. coli je neškodljiva za ljudi, npr. Sevov B in K-12, ki se običajno uporabljajo za raziskovalne aplikacije v laboratorijih. Vendar so nekateri sevi škodljivi in ​​lahko povzročijo hude bolezni.
E. coli igra pomembno vlogo v sodobni biološki inženiring in industrijske mikrobiologije, saj imajo bakterije je enostavno manipulirati. Skupna lab aplikacije, pri katerih gre za pogosto uporabo E. coli, npr ustvariti rekombinantne kislino (DNK) ali da delujejo kot model organizem.
E. coli je zelo vsestranski gostitelja za produkcijo heterolognih proteinov, in razdelilne ekspresijo sistemi so na voljo za proizvodnjo rekombinantnih proteinov v E. coli. Uporaba plazmidov, ki omogočajo visoko ekspresijo stopnja beljakovin, lahko gene uvedemo bakterij, ki omogoča proizvodnjo teh proteinov v velikih količinah v industrijskih fermentacijskih procesov.
E.coli se uporablja kot celične tovarne za proizvodnjo insulina. Dodatne aplikacije vključujejo uporabo modificiranih celic E. coli za razvoj in izdelavo cepiva in imobiliziranih encimov, za proizvodnjo biogoriva, kot tudi za biosanacijo.
Sev K-12 je mutantna oblika E. coli, ki prekomerno izraža encima alkalne fosfataze (ALP). Ta mutacija se pojavi zaradi okvare gena, ki nenehno kode za encim. Če gen daje izdelek brez inhibicije je to znano kot konstitutivno aktivnost. Ta posebna mutantna oblika se uporablja za izolacijo in čiščenje ALP encimov.

Ultrazvočni DNK Rezalni

Ultrazvočne strižnih sil so pogosto uporabljena metoda za ločevanje iz celice in prekinil DNK pramenov na koščke. Akustične kavitacije zlomi celične stene in membrane za pridobivanje DNK iz celic in ustvarjajo fragmente okoli 600 – 800 bp v dolžini, ki je idealen za analizo.
Kliknite tukaj, če želite izvedeti več o ultrazvočni homogenizers za fragmentacije DNK!