Ultrazvočna liza E. coli

Bakterije E. coli so najpogosteje uporabljene bakterije v mikrobiologiji in biotehnologiji.
Ultrazvočne naprave za razgradnjo celic zagotavljajo zanesljive in ponovljive rezultate pri lizi E. coli.
Intenzivna, vendar natančno nadzorljiva kavitacija in strižne sile omogočajo popolno razgradnjo in visoke izkoristke ekstrakcije (npr. beljakovin, DNA).

Zakaj je ultrazvočna razgradnja celic E. coli prednostna metoda?

Ultrazvočni homogenizatorji oziroma ultrazvočni procesorji s sondo ponujajo več prednosti pri lizi E. coli, saj intenziven ultrazvok učinkovito razgrajuje celične stene in membrane. Ultrazvočni procesorji s sondo se pogosto uporabljajo za lizo E. coli iz naslednjih razlogov:

Učinkovita razgradnja celičnih sten: E. coli ima poltogo celično steno, sestavljeno iz peptidoglikana, ki jo je s tradicionalnimi metodami lize lahko težko razgraditi. Ultrazvočni procesor s sondo ustvarja intenzivne ultrazvočne valove, ki v tekočini okoli celic tvorijo kavitacijske mehurčke. Ko ti mehurčki implodirajo, ustvarijo hitre tekočinske curke in udarne valove, ki povzročijo mehansko razgradnjo celičnih sten ter učinkovito sprostijo celično vsebino, kot so biomolekule.

Izboljšano prodiranje: Ultrazvočni valovi, ki jih ustvarja sonda / sonotroda, lahko prodrejo globoko v vzorec, dosežejo večje število celic E. coli in jih enakomerno obdelajo. To pomaga zagotoviti enakomernejšo lizo po celotnem vzorcu, kar poveča učinkovitost razgradnje celic.

Krajši čas obdelave: Energija, ki jo dovaja ultrazvočni procesor s sondo, je močno koncentrirana in lokalizirana, kar omogoča hitro in učinkovito lizo celic. V primerjavi z drugimi metodami, kot sta razgradnja s kroglicami ali encimska liza, lahko sonikacija doseže lizo E. coli v nekaj minutah ali celo sekundah. Medtem ko številne alternativne tehnike, kot sta zamrzovanje in odtajanje, zahtevajo več ciklov obdelave, ultrazvočna liza odpre celice v enem samem procesnem koraku.

Nadzor temperature: Najsodobnejši ultrazvočni procesorji so opremljeni s temperaturnimi senzorji in pametno programsko opremo, ki omogoča nastavitev najvišje procesne temperature. Ultrazvočni procesor se samodejno ustavi, ko je dosežena temperaturna meja, in začne postopek sonikacije, ko je dosežena nastavljena temperatura. Hlajenje vzorcev v ledeni kopeli je preprosta metoda za ohranjanje nizke temperature vzorca in preprečevanje razgradnje vzorca zaradi toplote.

Možnost povečanja obsega: Ultrazvočni procesorji s sondo so na voljo v različnih velikostih, od ročnih naprav do velikih industrijskih modelov. Zato so primerni za obdelavo majhnih prostornin v laboratoriju ali za povečanje obsega pri večjih bioprocesnih aplikacijah, npr. proizvodnji cepiv ali biosintezi molekul.

Vsestranskost: Ultrazvočni procesorji se lahko poleg lize celic uporabljajo za različne aplikacije, kot so strižna fragmentacija DNA, ekstrakcija beljakovin, homogenizacija tkiv, dispergiranje nanodelcev in emulgiranje. Naložba v ultrazvočni procesor s sondo zato zagotavlja vsestransko uporabo v raziskovalnem ali industrijskem okolju.

Ultrazvočni procesorji s sondo, kot je UP200St, so zanesljivi homogenizatorji tkiv in naprave za razgradnjo celic, zato se pogosto uporabljajo za pripravo vzorcev v genetiki, npr. za lizo E.coli

Ekstrakcija beljakovin iz celic E.coli se učinkovito izvaja z ultrazvočno sondo UP200St

Ultrazvočni procesor s sondo ponuja številne prednosti pri lizi E. coli. Zanesljiv in natančen nadzor ultrazvočnih procesnih parametrov omogoča optimizacijo delovnih parametrov, kot so moč, trajanje in ravnanje z vzorcem, za doseganje želenih rezultatov.

Ta vodič pojasnjuje, katera vrsta ultrazvočne naprave je najprimernejša za vaše postopke priprave vzorcev, kot so liza, razgradnja celic, izolacija beljakovin ter fragmentacija DNA in RNA v laboratorijih, analitiki in raziskavah. Izberite idealno vrsto ultrazvočne naprave glede na uporabo, prostornino in število vzorcev ter zmogljivost obdelave. Hielscher Ultrasonics ima idealen ultrazvočni homogenizator za vas!

Ultrazvočna fragmentacija DNA se pogosto uporablja kot korak priprave vzorcev pri sekvenciranju naslednje generacije (NGS)

Elektroforetske analize genomske DNA E. coli EDL933, izpostavljene ultrazvočni obdelavi 0 – 15 min. L označuje lestvico DNA.
(študija in slika: ©Basselet et al. 2008)

Razgradnja celic z ultrazvočno kavitacijo

Ultrazvočni homogenizatorji s sondo delujejo s približno 20.000 cikli na sekundo (pri 20kHz) in povzročajo kavitacijo v tekočinah ali suspenzijah. Akustična kavitacija ustvarja mikroskopska območja s tlaki, podobnimi vakuumu, in visokimi temperaturami, ki raztrgajo celice. Čeprav lahko temperature dosežejo več tisoč stopinj Celzija, so kavitacijske prostornine tako majhne, da procesa ne segrejejo bistveno. Akustična kavitacija in strižne sile, ki jih ustvarja ultrazvok, preluknjajo ali raztrgajo celično membrano bakterijskih celic, kot so E.coli. Ultrazvočni procesorji Hielscher omogočajo natančen nadzor procesnih parametrov, kot so ultrazvočna intenzivnost, amplituda, vnos energije in temperatura. Tako je mogoče postopek ultrazvočne lize optimalno prilagoditi vrsti celic, celični kulturi in cilju procesa.

Prednosti ultrazvočne lize

natančen nadzor lize (intenzivnost, amplituda, temperatura)
zanesljivi, ponovljivi rezultati
optimalna prilagoditev specifičnim vzorcem
nadzor temperature
za zelo majhne do zelo velike vzorce (od µL do litrov)
povsem mehanska obdelava
uporabniku prijazno in varno delovanje
linearno povečanje obsega od laboratorija do proizvodnje

Ultrazvočna naprava VialTweeter omogoča sočasno pripravo vzorcev v do 10 vialah pod enakimi procesnimi pogoji. (Kliknite za povečavo!)

VialTweeter za ultrazvočno lizo

Ultrazvočni homogenizator v primerjavi z drugimi tehnikami lize

Medtem ko sta kemična in encimska liza lahko problematični – saj lahko kemična liza spremeni strukture beljakovin in povzroči težave pri čiščenju, encimska liza pa zahteva dolge čase inkubacije in ni ponovljiva – je ultrazvočna razgradnja napredna in hitra metoda razgradnje celic.
Ultrazvočna liza temelji izključno na mehanskih silah. Kemikalije se ne dodajajo, sonikacija razgradi celično steno s strižnimi silami. Kemična liza lahko spremeni strukturo beljakovin in povzroči težave pri čiščenju. Encimska razgradnja zahteva dolge čase inkubacije in ni ponovljiva. Ultrazvočna razgradnja bakterijskih celic E.coli je hitra, preprosta, zanesljiva in ponovljiva. Zato se ultrazvočni procesorji Hielscher uporabljajo v bioloških in biokemičnih laboratorijih po vsem svetu za pripravo vzorcev, predanalitiko, diagnostiko in vitro in raznovrstne teste.

Splošna priporočila za ultrazvočno lizo

Sonikacija je najbolj priljubljena tehnika za lizo zelo majhnih, srednjih in velikih količin celičnih suspenzij – od pikolitrov do 100L/hr (z uporabo ultrazvočne pretočne celice). Celice se lizirajo zaradi striga v tekočini in kavitacije. Med sonikacijo se tudi DNA fragmentira zaradi striga, zato celični suspenziji ni treba dodajati DNaze.

Nadzor temperature med ultrazvočno lizo E.coli
S predhodnim hlajenjem vzorca in ohranjanjem vzorca na ledu med sonikacijo je mogoče preprosto preprečiti njegovo toplotno razgradnjo.
V idealnem primeru morajo vzorci med lizo ostati ledeno hladni, vendar pri večini vzorcev zadostuje, da temperatura ne preseže temperature kulture ali izvornega tkiva. Zato je priporočljivo suspenzijo hraniti na ledu in jo sonicirati z več kratkimi ultrazvočnimi pulzi po 5–10 sec s premori po 10–30 sec. Med premori se lahko toplota odvaja, da se ponovno vzpostavi nizka temperatura. Za večje celične vzorce so na voljo različni reaktorji s pretočnimi celicami in hladilnimi plašči.
Tukaj preberite podrobne nasvete in priporočila za uspešno ultrazvočno lizo!

Protokoli za ultrazvočno pripravo lizatov E. coli

Raziskovalci uporabljajo ultrazvočne homogenizatorje Hielscher za razgradnjo celic E.coli. Spodaj lahko najdete različne preizkušene in potrjene protokole za lizo E.coli z uporabo ultrazvočnih homogenizatorjev Hielscher za različne aplikacije, povezane z E. coli.

Rast celic, navzkrižno povezovanje in priprava celičnih ekstraktov E. coli z ultrazvokom

Za ChIP-Chip SeqA in polimeraze RNA so E. coli MG1655 ali MG1655 ΔseqA gojili pri 37°C do OD₆₀₀ približno 0,15 v 50 ml LB (+ 0,2% glukoze), nato pa dodali 27 μl formaldehida (37%) na ml gojišča (končna koncentracija 1%). Navzkrižno povezovanje so izvajali ob počasnem stresanju (100 rpm) pri sobni temperaturi 20 min, nato pa reakcijo ustavili z 10 ml 2,5 M glicina (končna koncentracija 0,5 M). Za poskuse s toplotnim šokom so E. coli MG1655 gojili v 65 ml gojišča LB pri 30°C do OD₆₀₀ približno 0,3. Nato so 30 ml kulture prenesli v predhodno segreto bučko pri 43°C, preostanek pa ohranili pri 30°C. Navzkrižno povezovanje in ustavitev reakcije sta potekala, kot je opisano zgoraj, le da so celice pred nadaljnjim počasnim stresanjem pri sobni temperaturi 5 min ohranjali pri 30 ali 43°C. Celice so zbrali s centrifugiranjem in jih dvakrat sprali s hladnim TBS (pH7.5). Po resuspendiranju v 1 ml pufra za lizo (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saharoze, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizocima) in inkubaciji pri 37°C 30 min ter nato dodatku 4 ml pufra IP so celice sonicirali na ledu 12-krat po 30 sec s premori po 30 sec z ultrazvočnim procesorjem Hielscher UP400St pri nastavitvi moči 100%. Po centrifugiranju 10 min pri 9000 g so 800 μl alikvote supernatanta shranili pri -20°C. (Waldminghaus 2010)

Čezmerna proizvodnja in čiščenje encimov z ultrazvočno sondo

Za čezmerno proizvodnjo beljakovin z dekahistidinsko oznako (His10) so E. coli BL21(DE3) transformirali s konstrukti pET19b. Prekonočno predkulturo so zbrali s centrifugiranjem in 1% uporabili za inokulacijo ekspresijske kulture. Celice, ki so vsebovale pET19mgtB, so gojili pri 22°C do optične gostote pri 600 nm (OD600) 0,7. Kulturo so prenesli na 17°C in inducirali s 100 μM IPTG. Po 16 h so kulturo zbrali s centrifugiranjem pri 7.500 × g in 4°C. Celice so resuspendirali v 50 mM s fosfatom pufrani fiziološki raztopini (PBS) z 0,3 M NaCl pri pH 7,4 in jih razgradili z ultrazvočno obdelavo z mikrosonotrodo S2 na ultrazvočnem procesorju Hielscher UP200St pri ciklu 0,5 in amplitudi 75%.
Čezmerno proizvodnjo GtfC z dekahistidinsko oznako so inducirali pri 37°C pri OD₆₀₀ 0,6 s 100 μM IPTG. Celice so nato inkubirali 4 h, jih zbrali in lizirali, kot je navedeno zgoraj za MgtB.
Surove celične ekstrakte so centrifugirali pri 15.000 × g in 4°C, da so se celični ostanki usedli. Zbistrene ekstrakte so nanesli na 1-ml kolone HisTrap FF Crude z uporabo sistema ÄKTAprime Plus. Encime so očistili po protokolu proizvajalca za gradientno elucijo beljakovin s histidinsko oznako. Eluirane raztopine beljakovin so dvakrat dializirali proti 1.000 prostorninam 50 mM PBS, pH 7,4, z 0,3 M NaCl pri 4°C. Čiščenje so analizirali z 12% SDS-PAGE. Koncentracijo beljakovin so določili po Bradfordovi metodi z uporabo Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

Ultrazvočna ekstrakcija beljakovin iz bakterij E. coli
Izbrano beljakovino, ki služi kot vaba (v tem primeru MTV1 iz Arabidopsis thaliana), združijo z oznako GST in jo izražajo v celicah BL21 Escherichia coli (E. coli).

Vzemite po eno usedlino GST-MTV1 in GST (kar ustreza 50 ml bakterijske kulture) ter vsako resuspendirajte v 2.5 mL ledeno hladnega ekstrakcijskega pufra.
Z ultrazvočnim procesorjem UP100H (opremljenim z mikrosonotrodo MS3 za majhne prostornine približno 2–5mL) razgradite bakterijske celice, dokler niso lizirane, kar nakazujeta zmanjšana motnost in povečana viskoznost. To je treba izvajati na ledu, priporočljiva pa je sonikacija v intervalih (npr. 10 sec sonikacije, nato 10 sec premora na ledu in tako naprej). Paziti je treba, da intenzivnost sonikacije ni previsoka. Če opazite penjenje ali nastajanje bele oborine, je treba intenzivnost zmanjšati.
Raztopino liziranih bakterij prenesite v 1.5 mL mikrocentrifugirke in centrifugirajte pri 4°C in 16.000 x g 20 min.

Ultrazvočne sonde uporabljajo sile akustične kavitacije za razgradnjo celic ter ekstrakcijo molekul in DNA iz E.coli.

Ultrazvočni procesorji s sondo, kot je UP400St, uporabljajo načelo delovanja akustične kavitacije za učinkovito lizo E.coli.

Analiza izražanja in čiščenje rekombinantne beljakovine s sonikacijo

Usedlino E. coli so sonicirali z ultrazvočnim procesorjem Hielscher UP100H. V ta namen so celično usedlino resuspendirali v ohlajenem pufru za lizo (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) in jo 10 min hladili na ledu. Nato so celično suspenzijo sonicirali z 10 kratkimi pulzi po 10 s, ki jim je sledil 30 s interval za hlajenje. Nazadnje so celične ostanke odstranili z ultracentrifugiranjem pri 4°C 15 min pri 14.000 rpm. Za potrditev izražanja rPR so supernatant ločili na 12% poliakrilamidnem gelu in analizirali s SDS-PAGE ter metodo Western blot. Čiščenje rPR so izvedli s smolo Ni2+-NTA (Invitrogen, ZDA) po navodilih proizvajalca. V tej fazi so uporabili metodo čiščenja v nativnih pogojih. Čistost očiščene beljakovine so ocenili z elektroforezo na 12% poliakrilamidnem gelu in naknadnim barvanjem s Coomassiejevim modrilom. Koncentracijo očiščene beljakovine so izmerili s kompletom za določanje beljakovin Micro BCA (PIERCE, ZDA). (Azarnezhad et al. 2016)

Ta videoposnetek prikazuje ultrazvočni Cuphorn z močjo 200 vatov za dispergiranje, homogeniziranje, ekstrakcijo ali razplinjevanje laboratorijskih vzorcev.

Ultrazvočni homogenizatorji za lizo E. coli

Hielscher Ultrasonics načrtuje, izdeluje in dobavlja visokozmogljive ultrazvočne homogenizatorje za zanesljivo in učinkovito lizo bakterij E. coli ter drugih vrst celic, tkiv in celičnih kultur.
Širok nabor ultrazvočnih sond in sistemov za posredno sonikacijo nam omogoča, da vam ponudimo idealen ultrazvočni homogenizator tkiv za vašo aplikacijo razgradnje celic in ekstrakcije.

Načrtovanje, proizvodnja in svetovanje – kakovost, izdelana v Nemčiji

Ultrazvočni procesorji Hielscher slovijo po najvišjih standardih kakovosti in zasnove. Pametna programska oprema, intuitiven meni, programirljive nastavitve in samodejno beleženje podatkov so le nekatere funkcije ultrazvočnih procesorjev Hielscher. Robustnost in preprosto upravljanje omogočata nemoteno vključitev naših ultrazvočnih procesorjev v raziskovalne in biotehnološke ustanove. Ultrazvočni procesorji Hielscher zlahka obvladujejo tudi težke razmere in zahtevna okolja.

Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visokozmogljivim ultrazvočnim procesorjem z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Ultrazvočni procesorji Hielscher so seveda skladni z zahtevami CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.

Spodnja tabela prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih procesorjev:

Prostornina šarže	Pretok	Priporočene naprave
plošče z več vdolbinicami / mikrotitrske plošče	n.a.	UIP400MTP
CupHorn za viale ali čašo	n.a.	Ultrazvočni CupHorn
ultrazvočni mikropretočni reaktor	n.a.	GDmini2
do 10 vial z 0,5 do 1,5mL	n.a.	VialTweeter
0,5 do 1,5mL	n.a.	VialTweeter
1 do 500mL	10 do 200mL/min	UP100H
10 do 2000mL	20 do 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 do 20L	0,2 do 4L/min	UIP2000hdT
10 do 100L	2 do 10L/min	UIP4000
n.a.	10 do 100L/min	UIP16000
n.a.	večji	sklop naprav UIP16000

Stopite v stik z nami! / Vprašajte nas!

Videoposnetek prikazuje ultrazvočni sistem za pripravo vzorcev UIP400MTP, ki omogoča zanesljivo pripravo vzorcev v vseh standardnih mikrotitrskih ploščah z ultrazvokom visoke intenzivnosti. Tipične uporabe naprave UIP400MTP vključujejo lizo celic, strižno fragmentacijo DNA, RNA in kromatina ter ekstrakcijo beljakovin.

Dodatni protokoli za ultrazvočno lizo E. coli

Beljakovine v E. coli, modificirane z alicinom, z uporabo ultrazvočne naprave VialTweeter

Določanje vsebnosti sulfhidrilnih skupin s testom s 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzojsko kislino) (DTNB)
Prekonočno kulturo E. coli MG1655 so uporabili za inokulacijo minimalnega gojišča MOPS (1:100). Kulturo so gojili aerobno, dokler ni bil dosežen A600 0,4. Kulturo so razdelili na tri 15-ml kulture za obdelavo s stresorji. Neobdelana kultura je služila kot negativna kontrola. Eni od preostalih dveh kultur so dodali 0,79 mM alicina (128 μg ml-1), drugi pa 1 mM diamida. Kulture so inkubirali 15 min. Iz vsake kulture so s centrifugiranjem (8.525 × g, 4°C, 10 min) zbrali celice iz 5 ml. Celice so dvakrat sprali z 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, pred uporabo shranjenega v anaerobnih pogojih) in centrifugirali (13.000 × g, 4°C, 10 min). Celice so resuspendirali v pufru za lizo (PBS s 6 mM gvanidinijevega HCl, pH 7,4) pred razgradnjo pri 4°C z ultrazvočno obdelavo (ultrazvočni procesor VialTweeter , Hielscher GmbH, Nemčija) (3 × 1 min). Celične ostanke so s centrifugiranjem (13.000 × g, 4 °C, 15 min) zbrali v usedlini. Supernatant so prenesli v 3.5-ml makrokiveto QS (10 mm) z magnetnim mešalom in ga zmešali z 1 ml pufra za lizo. Absorbanco vzorcev so spremljali pri 412 nm s spektrofotometrom Jasco V-650, opremljenim s temperaturno nadzorovanim držalom za kivete PSC-718, pri sobni temperaturi. Dodali so 100μl 3 mM raztopine ditiobis(2-nitrobenzojske kisline). Absorbanco so spremljali do nasičenja. Koncentracijo tiolov so izračunali z uporabo ekstinkcijskega koeficienta ϵ₄₁₂ = 13.700 M^-1 cm^-1 za tio-2-nitrobenzojsko kislino (TNB). Celične koncentracije tiolov so izračunali na podlagi prostornine celic E. coli 6,7 × 10^-15 litra in celične gostote A600 = 0,5 (kar ustreza 1 × 10⁸ celicam ml^-1 kulture). (Müller et al. 2016)

Določanje glutationa in vivo z ultrazvočno napravo za razgradnjo celic

E.coli MG1655 so gojili v minimalnem gojišču MOPS s skupno prostornino 200ml, dokler ni bil dosežen A600 0,5. Kulturo so razdelili na 50-ml kulture za obdelavo s stresorji. Po 15 min inkubacije z 0,79 mM alicina, 1 mM diamida ali dimetilsulfoksidom (kontrola) so celice zbrali pri 4.000g in 4°C 10 min. Celice so dvakrat sprali s pufrom KPE, nato pa usedline resuspendirali v 700µl pufra KPE. Za odstranitev beljakovin so dodali 300l 10% (w/v) sulfosalicilne kisline pred razgradnjo celic z ultrazvočno obdelavo (3 x 1 min; ultrazvočni procesor VialTweeter ). Supernatante so zbrali po centrifugiranju (30 min, 13.000g, 4°C). Koncentracije sulfosalicilne kisline so zmanjšali na 1% z dodatkom 3 prostornin pufra KPE. Meritve skupnega glutationa in GSSG so izvedli, kot je opisano zgoraj. Celične koncentracije glutationa so izračunali na podlagi prostornine celic E. coli 6,7×10^-15 litra in celične gostote A600 0,5 (kar ustreza 1×10⁸ celicam ml^-1 kulture). Koncentracije GSH so izračunali tako, da so od skupnega glutationa odšteli 2[GSSG] . (Müller et al. 2016)

Izražanje človeškega mAspAT v E. coli z ultrazvočnim homogenizatorjem

Posamezno kolonijo E. coli BL21 (DE3), ki je vsebovala ekspresijski vektor, so vnesli v 30 mL gojišča Luria-Bertani (LB), ki je vsebovalo 100μg/mL ampicilina, in jo nato gojili pri 37ºC, dokler optična gostota (OD₆₀₀) ni dosegla 0,6. Celice so zbrali s centrifugiranjem pri 4.000 × g 10 min in jih resuspendirali v 3L svežega gojišča LB, ki je vsebovalo 100μg/mL ampicilina.
Nato so izražanje beljakovin inducirali z 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) 20 h pri 16ºC. Celice so zbrali s centrifugiranjem pri 8.000 × g 15 min in jih sprali s pufrom A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Iz 3 L kulture so pridobili približno 45g celic (mokra masa). Po centrifugiranju so celične usedline resuspendirali v 40 mL (za 1 L kulture) ledeno hladnega ekstrakcijskega pufra A in jih lizirali z ultrazvočno obdelavo pri ledeno hladni temperaturi z ultrazvočno napravo za razgradnjo celic Hielscher UP400St. Celični lizat so centrifugirali pri 12.000 rpm 15 min, da so ločili topne (supernatant) in oborjene (usedlina) frakcije. (Jiang et al. 2015)

Sorodne teme

Koristna dejstva

E.coli

Escherichia coli (E. coli) je gramnegativna, fakultativno anaerobna, paličasta koliformna bakterija iz rodu Escherichia, ki jo pogosto najdemo v spodnjem delu črevesja toplokrvnih organizmov (endotermov). Obstaja veliko sevov (ali podtipov) E. coli z različnimi lastnostmi. Večina sevov E. coli je za ljudi neškodljiva, npr. seva B in K-12, ki se pogosto uporabljata za raziskovalne aplikacije v laboratorijih. Nekateri sevi pa so škodljivi in lahko povzročijo resne bolezni.
E. coli ima pomembno vlogo v sodobnem biološkem inženirstvu in industrijski mikrobiologiji, saj je z bakterijo preprosto manipulirati. Med pogoste laboratorijske aplikacije, pri katerih se uporablja E. coli, spadata npr. ustvarjanje rekombinantne deoksiribonukleinske kisline (DNA) in uporaba kot modelni organizem.
E. coli je zelo vsestranski gostitelj za proizvodnjo heterolognih beljakovin, za proizvodnjo rekombinantnih beljakovin v E. coli pa so na voljo številni sistemi izražanja beljakovin. Z uporabo plazmidov, ki omogočajo visoko raven izražanja beljakovin, je mogoče v bakterije vnesti gene, kar omogoča proizvodnjo velikih količin takih beljakovin v industrijskih fermentacijskih procesih.
E.coli se uporabljajo kot celične tovarne za proizvodnjo inzulina. Nadaljnje aplikacije vključujejo uporabo modificiranih celic E. coli za razvoj in proizvodnjo cepiv ter imobiliziranih encimov, proizvodnjo biogoriv in bioremediacijo.
Sev K-12 je mutantna oblika E. coli, ki čezmerno izraža encim alkalno fosfatazo (ALP). Ta mutacija nastane zaradi okvare gena, ki stalno kodira encim. Če gen proizvaja produkt brez kakršne koli inhibicije, to imenujemo konstitutivna aktivnost. Ta specifična mutantna oblika se uporablja za izolacijo in čiščenje encima ALP.
Bakterije E. coli se prav tako pogosto uporabljajo kot celične tovarne. Spremenjene mikrobe (npr. bakterije) in rastlinske celice je mogoče uporabljati kot tako imenovane celične tovarne. Te gensko spremenjene celice proizvajajo molekule, kemikalije, polimere, beljakovine in druge snovi, ki se uporabljajo na primer v farmacevtski, živilski in kemični industriji. Za sproščanje molekul, proizvedenih v notranjosti takih bioinženirsko spremenjenih celic, je ultrazvočna liza pogosta metoda za razgradnjo celičnih sten in prenos ciljnih snovi v okoliško tekočino. Preberite več o lizi bioinženirsko spremenjenih celic!

Ultrazvočna strižna fragmentacija DNA

Ultrazvočne strižne sile so pogosto uporabljena metoda za sproščanje molekul, organelov in beljakovin iz notranjosti celic ter za razbijanje verig DNA na dele. Akustična kavitacija razgradi celične stene in membrane, da se DNA ekstrahira iz celic in nastanejo fragmenti dolžine približno 600 – 800 bp, kar je idealno za analizo.
Kliknite tukaj, če želite izvedeti več o ultrazvočnih homogenizatorjih za fragmentacijo DNA!

Literatura / Viri

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Visokozmogljiva ultrazvočna tehnologija! Nabor izdelkov Hielscher pokriva celoten spekter od kompaktnega laboratorijskega ultrazvočnega procesorja prek namiznih enot do povsem industrijskih ultrazvočnih sistemov.

Hielscher Ultrasonics izdeluje visokozmogljive ultrazvočne homogenizatorje od laboratorijske do industrijske velikosti.