Hielscher Ultrasonics
Z veseljem bomo razpravljali o vašem postopku.
Pokličite nas: +49 3328 437-420
Pošljite nam e-pošto: info@hielscher.com

Ultrazvočna liza E. coli

  • Bakterije E. coli so najpogosteje uporabljene bakterije v mikrobiologiji in biotehnologiji.
  • Ultrazvočni motilci celic zagotavljajo zanesljive in ponovljive rezultate za lizo E. coli.
  • Intenzivna, a natančno nadzorovana kavitacija in strižne sile povzročijo popolno motnjo in visoke izkoristke ekstrakcije (npr. beljakovine, DNK).

Zakaj je ultrazvočna motnja celic E. coli najprimernejša metoda?

Ultrazvočni homogenizatorji ali ultrazvočni sondi ponujajo več prednosti za lizo E. coli, saj intenziven ultrazvok učinkovito moti celične stene in membrane. Ultrazvočni aparati tipa sonde se pogosto uporabljajo za lizo E. coli iz naslednjih razlogov:

  • Učinkovita motnja celičnih sten: E. coli ima poltogo celično steno, sestavljeno iz peptidoglikana, ki jo je težko zlomiti s tradicionalnimi metodami lize. Ultrazvočni zvočnik tipa sonde ustvarja intenzivne ultrazvočne valove, ki ustvarjajo kavitacijske mehurčke v tekočini, ki obdaja celice. Ko se ti mehurčki zrušijo, ustvarjajo hitre tekoče curke in udarne valove, ki povzročijo mehanske motnje celičnih sten in učinkovito sproščajo celično vsebino, kot so biomolekule.
  • Izboljšana penetracija: Ultrazvočni valovi, ki jih ustvarja sonda / sonotroda, lahko prodrejo globoko v vzorec, dosežejo večje število celic E. coli in jih enakomerno obdelajo. To pomaga zagotoviti, da je liza bolj enakomerna v celotnem vzorcu, kar ima za posledico večjo učinkovitost motenj celic.
  • Skrajšan čas obdelave: Energija, ki jo oddaja ultrazvočni aparat tipa sonde, je visoko koncentrirana in lokalizirana, kar vodi do hitre in učinkovite lize celic. V primerjavi z drugimi metodami, kot so premagovanje kroglic ali encimska liza, lahko ultrazvočno razbijanje doseže lizo E. coli v nekaj minutah ali celo sekundah. Medtem ko številne alternativne tehnike, kot je zamrzovanje in odmrzovanje, zahtevajo več krogov obdelave, ultrazvočna liza odpira celice v enem samem koraku.
  • Nadzor temperature: Najsodobnejši ultrazvočni aparati so opremljeni s temperaturnimi senzorji in pametno programsko opremo, ki omogoča nastavitev najvišje procesne temperature. Ultrazvočni aparat se samodejno ustavi, ko je dosežena temperaturna meja, in začne postopek ultrazvočnega razbijanja, ko je dosežena nastavljena temperaturna točka. Hlajenje vzorcev v ledeni kopeli je preprosta metoda za ohranjanje nizke temperature vzorca in preprečevanje toplotne razgradnje vzorca.
  • Razširljivost: Ultrazvočni aparati so na voljo v različnih velikostih, od ročnih naprav do velikih industrijskih modelov. Zaradi tega so primerni za obdelavo majhnih količin v laboratoriju ali povečanje za večje bioprocesne aplikacije, npr. proizvodnjo cepiv ali biosintezo molekul.
  • Vsestranskost: Ultrazvočni aparati se lahko uporabljajo za različne aplikacije, ki presegajo lizo celic, kot so striženje DNK, ekstrakcija beljakovin, homogenizacija tkiva, disperzija nanodelcev in emulgiranje. Zato vlaganje v ultrazvočni zvočnik tipa sonde zagotavlja vsestranskost v raziskovalnih ali industrijskih okoljih.
  • Ultrazvočni aparati s sondo, kot je UP200St, so zanesljivi homogenizatorji tkiv in celični drobilniki, zato se pogosto uporabljajo za pripravo vzorcev v genetiki, npr. za lizo E. coli

    Ekstrakcija beljakovin iz celic E. coli se učinkovito izvaja z ultrazvočna sonda UP200St

    Ultrazvočni aparat tipa sonde ponuja številne prednosti za lizo E. coli. Zanesljiv in natančen nadzor nad ultrazvočnimi procesnimi parametri omogoča optimizacijo obratovalnih parametrov, kot so moč, trajanje in ravnanje z vzorci, da se dosežejo želeni rezultati.
     

    Zahteva za informacije




    Upoštevajte naše Politika zasebnosti.




     

    Ta vadnica pojasnjuje, katera vrsta sonicatorja je najboljša za vaše naloge priprave vzorcev, kot so liza, motnje celic, izolacija beljakovin, fragmentacija DNA in RNA v laboratorijih, analiza in raziskave. Izberite idealno vrsto sonikatorja za vašo aplikacijo, prostornino vzorca, število vzorcev in prepustnost. Hielscher Ultrasonics ima idealen ultrazvočni homogenizator za vas!

    Kako najti popoln zvočnik za motnje celic in ekstrakcijo beljakovin v znanosti in analizi

    Sličica videoposnetka

    Ultrazvočna fragmentacija DNK se pogosto uporablja kot korak priprave vzorca v sekvenciranju naslednje generacije (NGS)

    Elektroforetske analize genomske DNK E. coli EDL933, podvržene 0 - 15 min ultrazvočni obdelavi. L označuje lestev DNK.
    (študija in slika: ©Basselet et al. 2008)

    Motnje celic z uporabo ultrazvočne kavitacije

    Homogenizatorji ultrazvočne sonde delujejo s približno 20.000 cikli na sekundo (pri 20kHz) in povzročajo kavitacijo v tekočinah ali suspenzijah. Akustična kavitacija, mikroskopska območja vakuumskih tlakov in visokih temperatur, ki raztrgajo celice. Čeprav lahko temperature dosežejo več tisoč stopinj Celzija, so volumni kavitacije tako majhni, da procesa bistveno ne segrevajo. Ultrazvok ustvarja akustično kavitacijo in strižne sile perforirajo ali razbijejo celično membrano bakterijskih celic, kot je E.coli. Hielscher ultrazvočni aparati omogočajo natančen nadzor nad procesnimi parametri, kot so ultrazvočna intenzivnost, amplituda, vnos energije in temperatura. S tem se lahko postopek ultrazvočne lize optimalno prilagodi tipu celice, celični kulturi in cilju procesa.
     

    Prednosti ultrazvočne lize

    • natančna kontrola lize (intenzivnost, amplituda, temperatura)
    • zanesljivi, ponovljivi rezultati
    • optimalna prilagoditev specifičnim vzorcem
    • Nadzor temperature
    • za zelo majhne do zelo velike vzorce (μl na litre)
    • Čisto mehanska obdelava
    • uporabniku prijazno, varno delovanje
    • Linearno povečanje od laboratorija do proizvodnje
    Ultrazvočna naprava VialTweeter omogoča hkratno pripravo vzorca do 10 vial v enakih procesnih pogojih. (Kliknite za povečavo!)

    VialTweeter za ultrazvočno lizo

    Zahteva za informacije




    Upoštevajte naše Politika zasebnosti.




    Ultrazvočni homogenizator v primerjavi z drugimi tehnikami lize

    Medtem ko je kemična in encimska liza lahko problematična – Ker lahko kemična liza spremeni strukturo beljakovin in povzroči težave s čiščenjem, encimska liza zahteva dolge inkubacijske čase in je ni mogoče ponoviti – Ultrazvočna motnja je prefinjena, hitra metoda motenj celic.
    Ultrazvočna liza temelji samo na mehanskih silah. Kemikalije niso dodane, ultrazvočno razbijanje razbije celično steno s strižnimi silami. Kemična liza lahko spremeni strukturo beljakovin in povzroči težave s čiščenjem. Encimska motnja zahteva dolge inkubacijske čase in ni ponovljiva. Ultrazvočna motnja celic bakterij E. coli je hitra, preprosta, zanesljiva in ponovljiva. Zato se Hielscherjevi ultrazvočni aparati uporabljajo v bioloških in biokemičnih laboratorijih po vsem svetu za pripravo vzorcev, preanalitike, in vitro diagonstiko in raznovrstne teste.

    Splošna priporočila za ultrazvočno lizo

    Sonication je najbolj priljubljena tehnika za liziranje zelo majhnih, srednjih in velikih količin celičnih suspenzij – od piko-litrov do 100 l / uro (z uporabo ultrazvočne pretočne celice). Celice se lizirajo s striženjem tekočine in kavitacijo. DNK se striži tudi med ultrazvočnim razbijanjem, zato celični suspenziji ni treba dodajati DNaze.
     

    Nadzor temperature med ultrazvočno lizo E. coli
    Ultrazvočni motilec celic UP100H (100W) za motnje celic in ekstrakcijo rastlinskih spojin.S predhodnim hlajenjem vzorca in ohranjanjem vzorca med ultrazvočnim razbijanjem na ledu je mogoče zlahka preprečiti toplotno razgradnjo vzorca.
    V idealnem primeru je treba vzorce med lizo hraniti ledeno hladne, vendar je za večino vzorcev dovolj, da se temperatura ne dvigne nad temperaturo kulture ali vira tkiva. Zato je priporočljivo, da suspenzijo držite na ledu in sonirate z več kratkimi ultrazvočnimi impulzi 5-10 sekund in premori 10-30 sekund. Med premori se lahko toplota razprši, da se ponovno vzpostavi nizka temperatura. Za večje vzorce celic so na voljo različni reaktorji pretočnih celic s hladilnimi plašči.
    Preberite tukaj podrobne nasvete in priporočila za uspešno ultrazvočno lizo!

    Protokoli za ultrazvočno pripravo lizatov E. coli

    Raziskovalci uporabljajo Hielscher ultrazvočne homogenizatorje za motnje celic E. coli. Spodaj lahko najdete različne preizkušene in preizkušene protokole za lizo E. coli z uporabo Hielscher ultrazvočnih homogenizatorjev za različne aplikacije, povezane z E. coli.
     

    Ta video posnetek prikazuje Hielscher ultrazvočni homogenizator UP100H, ultrazvočni aparat, ki se pogosto uporablja za pripravo vzorcev v laboratorijih.

    Ultrazvočni homogenizator UP100H

    Sličica videoposnetka

    Rast celic, premreženje in priprava izvlečkov celic E. coli z uporabo ultrazvoka

    Za SeqA in RNA polimerazo je bil ChIP-Chip E. coli MG1655 ali MG1655 ΔseqA gojen pri 37 °C na OD600 približno 0,15 v 50 ml LB (+ 0,2 % glukoze), preden je bilo dodanih 27 μl formaldehida (37 %) na ml medija (končna koncentracija 1 %). Premreževanje je bilo izvedeno pri počasnem stresanju (100 vrt / min) pri sobni temperaturi 20 minut, čemur je sledilo gašenje z 10 ml 2,5 M glicina (končna koncentracija 0,5 M). Za poskuse toplotnega šoka je bila E. coli MG1655 gojena v 65 ml LB gojišču pri 30 °C do OD600 približno 0,3. Nato se je 30 ml kulture preneslo v predhodno segreto bučko pri 43 °C, preostanek pa se je hranil pri 30 °C. Premreževanje in gašenje je bilo opisano zgoraj, le da so celice hranili pri 30 ali 43 ° C 5 minut, preden so se še naprej počasi tresli pri sobni temperaturi. Celice so bile zbrane s centrifugiranjem in dvakrat sprane s hladnim TBS (pH 7,5). Po resuspenziji v 1 ml pufra za lizo (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saharoza, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizocima) in inkubaciji pri 37 °C za 30 minut, ki ji je sledilo dodajanje 4 ml IP, so bile celice sonikirane na ledu z 12-kratnimi 30 sekundami in 30 sekundami z uporabo Hielscherjevega ultrazvočnega procesorja UP400St pri nastavitvi 100% moči. Po 10-minutnem centrifugiranju pri 9000 g je bilo 800 μl alikvotov supernatanta shranjenih pri -20 °C. (Waldminghaus 2010)
     

    Prekomerna proizvodnja in čiščenje encimov z ultrazvočno sondo

    Ultrasonicator UP100H je laboratorijski homogenizator, ki se pogosto uporablja za pripravo vzorcev plošč celične kulture.Za prekomerno proizvodnjo proteinov, označenih z dekahistidinom (His10), je bil E. coli BL21 (DE3) transformiran s konstrukti pET19b. Predkultura čez noč je bila pobrana s centrifugiranjem, 1% pa je bilo uporabljeno za inokulacijo ekspresijske kulture. Celice, ki nosijo pET19mgtB, so gojile pri 22 °C do optične gostote pri 600 nm (OD600) 0,7. Kulturo so prenesli na 17 °C in inducirali s 100 μM IPTG. Po 16 urah je bila kultura pobrana s centrifugiranjem pri 7.500 × g pri 4 °C. Celice so bile resuspendirane v 50 mM fosfatno pufrirani fiziološki raztopini (PBS) z 0,3 M NaCl pri pH 7,4 in prekinjene z ultrazvokom s sonotrodo S2 z mikro konico na Hielscherjevem ultrazvočnem UP200St pri ciklu 0,5 in amplitudi 75%.
    Prekomerna proizvodnja GtfC, označenega z dekahistidinom, je bila inducirana pri 37 °C pri OD600 0,6 s 100 μM IPTG. Celice so bile nato inkubirane 4 ure, pobrane in lizirane, kot je navedeno zgoraj za MgtB.
    Izvlečki surovih celic so bili centrifugirani pri 15.000 × g in 4 ° C, da se usedli celični ostanki. Očiščeni izvlečki so bili naloženi na 1-mililitrske kolone HisTrap FF Crude z uporabo sistema ÄKTAprime Plus. Encimi so bili prečiščeni v skladu s proizvajalčevim protokolom za gradientno elucijo beljakovin, označenih s His. Eluirane beljakovinske raztopine so bile dializirane dvakrat proti 1.000 volumnom 50 mM PBS, pH 7,4, z 0,3 M NaCl pri 4 °C. Čiščenje je bilo analizirano z 12% SDS-PAGE. Koncentracijo beljakovin smo določili z Bradfordovo metodo z uporabo Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
     

    Ultrazvočna ekstrakcija beljakovin iz bakterij E. coli
    Zanimiva beljakovina vabe (v tem primeru MTV1 Arabidopsis thaliana) se zlije z oznako GST in se izrazi v celicah BL21 Escherichia coli (E. coli).

    1. Vzemite po eno peletno zrno GST-MTV1 in GST (kar ustreza 50 ml bakterijske kulture) in jo resuspendirajte v 2,5 ml ledeno hladnega pufra za ekstrakcijo.
    2. Uporabite ultrazvočni UP100H (opremljen z MS3 mikrokonicno sonotrodo za majhne količine približno 2-5 ml), da motite bakterijske celice, dokler niso lizirane, kar kaže zmanjšana motnost in povečana viskoznost. To je treba izvajati na ledu in priporočljivo je sonikirati v intervalih (npr. 10 sekund ultrazvočnega razbijanja, ki mu sledi 10 sekund premora na ledu in tako naprej). Paziti je treba, da ne sonikira s previsoko intenzivnostjo. Če se odkrije penjenje ali nastanek bele oborine, je treba intenzivnost zmanjšati.
    3. Raztopino liziranih bakterij prenesemo v 1,5 ml epruvete za mikrocentrifugo in centrifugiramo pri 4 °C, 16.000 x g 20 minut.

     

    Ultrazvočne sonde uporabljajo sile akustične kavitacije, da motijo celice in izločijo molekule in DNK iz E.coli.

    Ultrazvočni aparati s sondo, kot je UP400St uporabite delovni princip akustične kavitacije za učinkovito lizo E.coli.

    Analiza izražanja in čiščenje rekombinantnega proteina z uporabo ultrazvočnega razbijanja

    Pelet E. coli je bil sonikiran s Hielscherjevim ultrazvočnim UP100H. V ta namen so celične pelete resuspendirali v ohlajenem pufru za lizo (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) in ohladili na ledu 10 minut. Nato je bila celična suspenzija sonicirana z 10 kratkimi izbruhi po 10 s, čemur je sledil interval 30 s za hlajenje. Končno so bili ostanki celic odstranjeni z ultracentrifugiranjem pri 4 ° C za 15 minut pri 14000 vrtljajih na minuto. Za potrditev izražanja rPR je bil supernatant uporabljen na 12% poliakrilamidnem gelu in analiziran s SDS-PAGE in Western blotting. Čiščenje rPR je bilo opravljeno z uporabo smole Ni2+-NTA (Invitrogen, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. V tej fazi je bila uporabljena naravna metoda čiščenja. Čistost prečiščenega proteina je bila ocenjena z elektroforezo na 12% poliakrilamidnem gelu in kasnejšim obarvanjem Coomassie modro. Koncentracijo prečiščenih beljakovin smo izmerili s kompletom za testiranje beljakovin Micro BCA (PIERCE, ZDA). (Azarnezhad et al. 2016)
     

    Ta videoposnetek prikazuje 200-vatni ultrazvočni cuphorn za razprševanje, homogenizacijo, ekstrakcijo ali razplinjevanje laboratorijskih vzorcev.

    Ultrazvočni Cuphorn (200 vatov)

    Sličica videoposnetka

    Ultrazvočni homogenizatorji za lizo E. coli

    Hielscher Ultrasonics načrtuje, proizvaja in dobavlja visoko zmogljive ultrazvočne homogenizatorje za zanesljivo in učinkovito lizo bakterij E. coli in drugih vrst celic, tkiv in celičnih kultur.
    Širok portfelj ultrazvočnih sond in posrednih sistemov za ultrazvočno razbijanje nam omogoča, da vam ponudimo idealen ultrazvočni homogenizator tkiva za vašo aplikacijo za motnje in ekstrakcijo celic.

    Projektiranje, izdelava in svetovanje – Kakovost izdelana v Nemčiji

    Hielscher ultrazvočne aparate je mogoče daljinsko upravljati prek nadzora brskalnika. Parametre ultrazvočnega razbijanja je mogoče spremljati in natančno prilagajati zahtevam procesa.Hielscher ultrazvočni aparati so znani po svojih najvišjih standardih kakovosti in oblikovanja. Pametna programska oprema, intuitiven meni, programabilne nastavitve in avtomatsko protokoliranje podatkov so le nekatere lastnosti Hielscher ultrazvočnih aparatov. Robustnost in enostavno upravljanje omogočata nemoteno integracijo naših ultrazvočnih aparatov v raziskovalne in biotehnološke objekte. Tudi težke pogoje in zahtevna okolja zlahka obvladajo Hielscher ultrazvočni aparati.

    Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visoko zmogljivim ultrazvočnim aparatom z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Seveda so Hielscher ultrazvočni aparati skladni s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.

    Spodnja tabela vam prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih aparatov:

    Obseg serije Pretok Priporočene naprave
    Plošče z več jamicami / mikrotitri n.a. UIP400MTP
    CupHorn za viale ali čašo n.a. Ultrazvočni CupHorn
    Ultrazvočni mikro-pretočni reaktor n.a. GDmini2
    do 10 vial z 0,5 do 1,5 ml n.a. VialTweeter
    0.5 do 1.5 ml n.a. VialTweeter
    1 do 500 ml 10 do 200 ml / min UP100H
    10 do 2000 ml 20 do 400 ml / min UP200Ht, UP400St
    0.1 do 20L 00,2 do 4 l/min UIP2000hdT
    10 do 100L 2 do 10 l/min UIP4000
    n.a. 10 do 100 l/min UIP16000
    n.a. Večji Grozd UIP16000

    Kontaktirajte nas! / Vprašajte nas!

    Vprašajte za več informacij

    Prosimo, uporabite spodnji obrazec, da zahtevate dodatne informacije o ultrazvočnih homogenizatorjih tkiv in celičnih drobilnikih, aplikacijah za lizo in cenah. Z veseljem se bomo z vami pogovorili o vašem postopku in vam ponudili ultrazvočni homogenizator, ki bo ustrezal vašim zahtevam!









    Prosimo, upoštevajte naše Politika zasebnosti.




    Videoposnetek prikazuje ultrazvočni sistem za pripravo vzorcev UIP400MTP, ki omogoča zanesljivo pripravo vzorcev vseh standardnih plošč z več vdolbicami z uporabo ultrazvoka visoke intenzivnosti. Tipične aplikacije UIP400MTP vključujejo lizo celic, striženje DNA, RNA in kromatina ter ekstrakcijo beljakovin.

    Ultrazvočni UIP400MTP za ultrazvočno razbijanje plošč z več vdolbinicami

    Sličica videoposnetka

    Dodatni protokoli za ultrazvočno lizo E. coli

    Allicin-modificirani proteini v E. coli z uporabo ultrazvočnega VialTweeterja

    VialTweeter na ultrazvočnem procesorju UP200STDoločanje vsebnosti sulfhidrila s preskusom 5,5′-ditiobis (2-nitrobenzojska kislina) (DTNB)
    Za inokulacijo minimalnega medija MOPS (1:100) je bila uporabljena kultura čez noč E. coli MG1655. Kultura je bila gojena aerobno, dokler ni bil dosežen A600 0,4. Kultura je bila razdeljena na tri 15-ml kulture za zdravljenje stresa. Neobdelana kultura je služila kot negativna kontrola. Eni od preostalih dveh kultur je bilo dodano 0,79 mM alicina (128 μg ml-1) ali 1 mM diamida. Kulture so bile inkubirane 15 min. 5 ml vsake kulture je bilo pobranih s centrifugiranjem (8.525 × g, 4 °C, 10 min). Celice so bile dvakrat sprane z 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, pred uporabo shranjene anaerobno) in centrifugirane (13.000 × g, 4 °C, 10 min). Celice so bile resuspendirane v pufru za lizo (PBS s 6 mM gvanidinijev HCl, pH 7,4) pred prekinitvijo pri 4 °C z ultrazvokom (VialTweeter ultrazvočni aparat, Hielscher GmbH, Nemčija) (3 × 1 min). Ostanki celic so bili peletirani s centrifugiranjem (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant je bil prenesen v 3,5-mililitrsko QS-makro kiveto (10 mm) z magnetno mešalno palico in zmešan z 1 ml liznega pufra. Izumrtje vzorcev so spremljali pri 412 nm s spektrofotometrom Jasco V-650, opremljenim s temperaturno nadzorovanim držalom celic PSC-718 pri sobni temperaturi. Dodano je bilo 100 μl 3 mM raztopine ditiobisa (2-nitrobenzojske kisline). Izumrtje so spremljali, dokler ni dosegla nasičenosti. Izračun koncentracije tiola je bil izveden z uporabo ekstinkcijskega koeficienta ε412 = 13.700 M-1 centimeter-1 za tio-2-nitrobenzojsko kislino (TNB). Koncentracije celičnega tiola so izračunali na podlagi volumna celic E. coli 6,7 × 10-15 litra in gostote celic A600 = 0,5 (kar ustreza 1 × 108 celice ml-1 kultura). (Müller et al. 2016)
     

    Določanje glutationa in vivo z ultrazvočnim celičnim drobilnikom

    E. coli MG1655 je bila gojena v minimalnem mediju MOPS v skupni prostornini 200 ml, dokler ni bila dosežena A600 0,5. Kultura je bila razdeljena na 50-ml kulture za zdravljenje stresa. Po 15 minutah inkubacije z 0,79 mM alicina, 1 mM diamidom ali dimetil sulfoksidom (kontrola) so bile celice pobrane pri 4.000 g pri 4 °C za 10 minut. Celice so bile dvakrat oprane s pufrom KPE pred resuspenzijo peletov v 700 μl pufra KPE. Za deproteinizacijo je bilo dodanih 300 l 10% (m/v) sulfosalicilne kisline, preden so celice prekinile z ultrazvokom (3 x 1 min; VialTweeter ultrazvočni aparat). Supernatanti so bili zbrani po centrifugiranju (30 min, 13.000 g, 4 °C). Koncentracije sulfosalicilne kisline so se zmanjšale na 1% z dodatkom 3 volumnov pufra KPE. Meritve skupnega glutationa in GSSG so bile izvedene, kot je opisano zgoraj. Koncentracije celičnega glutationa so izračunali na podlagi volumna celic E. coli 6,7×10-15 in gostoto celic A600 0,5 (kar ustreza 1×108 celice ml-1 kultura). Koncentracije GSH so bile izračunane tako, da se od skupnega glutationa odšteje 2[GSSG]. (Müller et al. 2016)

    Izražanje človeškega mAspAT v E. coli z uporabo ultrazvočnega homogenizatorja

    Ultrazvočni celični motilec UP400St (400W) za ekstrakcijo znotrajcelične snovi (npr. beljakovin, organelov, DNA, RNA itd.)Posamezna kolonija E. coli BL21 (DE3), ki vsebuje ekspresijski vektor v 30 ml medija Luria-Bertani (LB), ki vsebuje 100 μg/ml ampicilina, nato pa se goji pri 37 °C, dokler optična gostota (OD600) je dosegla 0,6. Celice so bile pobrane s centrifugiranjem pri 4.000 × g za 10 minut in resuspendirane v 3L svežem LB gojišču, ki je vsebovalo 100 μg/ml ampicilina.
    Nato je bila ekspresija beljakovin inducirana z 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozidem (IPTG) za 20 ur pri 16 °C. Celice so bile pobrane s centrifugiranjem pri 8.000 × g za 15 minut in sprane z puferom A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Približno 45 g (mokre teže) celic je bilo pridobljenih iz 3 l kulture. Po centrifugiranju so celične pelete ponovno suspendirali v 40 ml (za 1 l kulturo) ledeno hladnem ekstrakcijskem pufru A in lizirali z ultrazvokom pri ledeno hladni temperaturi z uporabo Hielscherjevega ultrazvočnega celičnega drobilnika UP400St. Liza celic je bila centrifugirana pri 12.000 vrtljajih na minuto 15 minut, da se ločijo topne (supernatant) in oborjene (pelete) frakcije. (Jiang et al. 2015)
     



    Dejstva, ki jih je vredno vedeti

    E.coli

    Escherichia coli (E. coli) je gram-negativna, fakultativno anaerobna, paličasta, koliformna bakterija iz rodu Escherichia, ki jo pogosto najdemo v spodnjem črevesju toplokrvnih organizmov (endotermov). Obstaja veliko število sevov E. coli (ali podtipov) z različnimi značilnostmi. Večina sevov E. coli je neškodljiva za ljudi, npr. sevi B in K-12, ki se običajno uporabljajo za raziskovalne aplikacije v laboratorijih. Vendar pa so nekateri sevi škodljivi in lahko povzročijo resne bolezni.
    E. coli ima pomembno vlogo v sodobnem biološkem inženiringu in industrijski mikrobiologiji, saj je bakterijo enostavno manipulirati. Običajne laboratorijske aplikacije, ki pogosto vključujejo uporabo E. coli, npr. za ustvarjanje rekombinantne deoksiribonukleinske kisline (DNK) ali za delovanje kot modelni organizem.
    E. coli je zelo vsestranski gostitelj za proizvodnjo heterolognih beljakovin in za proizvodnjo rekombinantnih beljakovin v E. coli so na voljo različni sistemi za ekspresijo beljakovin. Z uporabo plazmidov, ki omogočajo visoko raven izražanja beljakovin, se lahko v bakterije vnesejo geni, kar omogoča proizvodnjo takšnih beljakovin v velikih količinah v industrijskih fermentacijskih procesih.
    E. coli se uporabljajo kot tovarne celic za proizvodnjo insulina. Nadaljnje aplikacije vključujejo uporabo modificiranih celic E. coli za razvoj in proizvodnjo cepiv in imobiliziranih encimov, za proizvodnjo biogoriv in za bioremediacijo.
    Sev K-12 je mutantna oblika E. coli, ki prekomerno izraža encim alkalno fosfatazo (ALP). Ta mutacija nastane zaradi napake v genu, ki nenehno kodira encim. Če gen proizvede produkt brez kakršne koli inhibicije, je to znano kot konstitutivna aktivnost. Ta specifična mutantna oblika se uporablja za izolacijo in čiščenje encima ALP.
    Bakterije E. coli se pogosto uporabljajo tudi kot celične tovarne. Inženirski mikrobi (npr. Bakterije) in rastlinske celice se lahko uporabljajo kot tako imenovane celične tovarne. Te gensko spremenjene celice proizvajajo molekule, kemikalije, polimere, beljakovine in druge snovi, ki se uporabljajo na primer v farmacevtski, živilski in kemični industriji. Da bi sprostili molekule, ki nastanejo v notranjosti takšnih bioinženirskih celic, je ultrazvočna liza običajna metoda za prekinitev celičnih sten in prenos ciljnih snovi v okoliško tekočino. Preberite več o lizi bioinženirskih celic!

    Ultrazvočno striženje DNK

    Ultrazvočne strižne sile so pogosto uporabljena metoda za sproščanje molekul, organelov in beljakovin iz notranjosti celic ter za razbijanje verig DNK na koščke. Akustična kavitacija razbije celične stene in membrane, da izvleče DNK iz celic in ustvari fragmente približno 600 – Dolžina 800 bp, kar je idealno za analizo.
    Kliknite tukaj, če želite izvedeti več o ultrazvočnih homogenizatorjih za fragmentacijo DNK!

    Literatura / Reference


    Visoko zmogljiva ultrazvoka! Paleta izdelkov Hielscher zajema celoten spekter od kompaktnega laboratorijskega ultrazvočnega aparata preko namiznih enot do popolnoma industrijskih ultrazvočnih sistemov.

    Hielscher Ultrasonics proizvaja visoko zmogljive ultrazvočne homogenizatorje iz laboratorij k industrijska velikost.

    Z veseljem bomo razpravljali o vašem postopku.

    Let's get in contact.