Ultrasonic lize E. Coli
- E. coli bakterije so najpogosteje uporabljeni bakterije v mikrobiologije in biotehnologije.
- Ultrazvočni celic motilci zagotavljajo zanesljive in ponovljive rezultate za razpad E. coli.
- Intenzivno še natančno krmiliti kavitacijski in strižnih sil povzroči popolno motenj in visokimi dobitki pridobivanja (npr proteinov, DNK).
Zakaj je ultrazvočna celična motnja E. coli prednostna metoda?
Ultrazvočni homogenizatorji ali ultrazvočni tip sonde ponujajo več prednosti za lizo E. coli, saj intenzivni ultrazvok učinkovito moti celične stene in membrane. Ultrazvočniki tipa sonde se pogosto uporabljajo za lizo E. coli zaradi naslednjih razlogov:
Ekstrakcija beljakovin iz celic E. coli se učinkovito izvaja z ultrazvočna sonda UP200St
Sonda tipa ultrasonicator ponuja številne prednosti za lizo E. coli. Zanesljiv in natančen nadzor nad parametri ultrazvočnega procesa omogoča optimizacijo obratovalnih parametrov, kot so moč, trajanje in ravnanje z vzorci, da dosežete želene rezultate.
Elektroforezne analize genomske DNA E. coli EDL933 podvržene ultrazvočni razbijanju 0 - 15 min. L označuje lestev DNK.
(študija in slika: Basselet et al., ©2008)
Motnje celic z uporabo ultrazvočne kavitacije
Homogenizatorji tipa ultrazvočne sonde delujejo s približno 20.000 cikli na sekundo (pri 20kHz) in povzročajo kavitacijo v tekočinah ali suspenzijah. Akustična kavitacija, mikroskopska območja vakuumskih tlakov in visokih temperatur, ki raztrgajo celice. Čeprav lahko temperature dosežejo več tisoč stopinj Celzija, so prostornine kavitacije tako majhne, da procesa bistveno ne segrejejo. Ultrazvok ustvarja akustično kavitacijo in strižne sile perforirajo ali razbijejo celično membrano bakterijskih celic, kot je E. coli. Hielscher ultrasonicatorji omogočajo natančen nadzor nad procesnimi parametri, kot so ultrazvočna intenzivnost, amplituda, vnos energije in temperatura. S tem se lahko proces ultrazvočne lize optimalno prilagodi tipu celice, celični kulturi in cilju procesa.
- natančna kontrola lize (intenzivnost, amplituda, temperatura)
- zanesljivi in ponovljivi rezultati
- optimalno prilagajanje na določene vzorce
- nadzor temperature
- zelo majhnih do zelo velikih vzorcih (ul do litrov)
- Povsem mehanska obdelava
- uporabniku prijazno, varno delovanje
- linearna lestvica navzgor iz laboratorija do proizvodnje
VialTweeter za ultrazvočno lizo
Ultrazvočni homogenizator v primerjavi z drugimi tehnikami lize
Medtem ko je kemijska in encimska liza lahko problematična – od kemijske lize more spremeniti strukture proteinov in uvesti probleme čiščenja in encimsko lizo zahteva dolg inkubacijski čas in ni ponovljiv – ultrazvočni motnje je prefinjeno, hiter mobilni metoda motnje.
Ultrazvočna liza temelji samo na mehanskih silah. Kemikalije niso dodane, ultrazvočno razbijanje razbije celično steno s strižnimi silami. Kemična liza lahko spremeni strukturo beljakovin in povzroči težave s čiščenjem. Encimske motnje zahtevajo dolge inkubacijske čase in jih ni mogoče ponoviti. Ultrazvočna celična motnja celic bakterij E.coli je hitra, enostavna, zanesljiva in ponovljiva. Zato se Hielscher ultrasonicators uporabljajo v bioloških in biokemičnih laboratorijih po vsem svetu za pripravo vzorcev, pre-ananlitike, in vitro diagonstike in mnogotere teste.
Splošna priporočila za ultrazvočno lizo
Ultrazvoka je najbolj priljubljena tehnika za lizo zelo majhne, srednje in velike količine celičnih suspenzij – od PICO-l do 100L / h (z uporabo ultrazvočne pretočno celico). Celice liziramo s tekočinsko striga in kavitacije. DNK je narezal tako med ultrazvočno razbijanje, tako da ni potrebno dodati DNaze v celični suspenziji.
Nadzor temperature med ultrazvočno lizo E. coli
S predhodno hlajenje vzorca in vodenje vzorca med ultrazvočno razbijanje na ledu, vzorec termična razgradnja vzorca z lahkoto preprečiti.
V idealnem primeru bi morali biti vzorci med lizo ledeno hladni, vendar je za večino vzorcev dovolj, če se temperatura ne dvigne nad temperaturo kulture ali vira tkiva. Zato je priporočljivo, da suspenzijo obdržite na ledu in sonikirate z več kratkimi ultrazvočnimi impulzi 5-10 sekund in premori 10-30 sekund. Med premori se lahko toplota razprši, da se ponovno vzpostavi nizka temperatura. Za večje vzorce celic so na voljo različni reaktorji pretočnih celic s hladilnimi plašči.
Protokoli za ultrazvočno pripravo lizatov E. coli
Raziskovalci uporabljajo Hielscher ultrazvočne homogenizatorje za motnje celic E. coli. Spodaj lahko najdete različne preizkušene in dokazane protokole za lizo E.coli z uporabo Hielscher ultrazvočnih homogenizatorjev za različne aplikacije, povezane z E. coli.
Rast celic, premreženje in priprava ekstraktov celic E. coli z uporabo ultrazvoka
Za SeqA in RNA polimeraze čip-Chip E. coli MG1655 ali MG1655 ΔseqA smo gojili pri 37 ° C do OD600 približno 0,15 v 50 ml LB (+ 0,2% glukoze), preden dodamo 27 μl formaldehida (37%) na ml medija (končna koncentracija 1%). Premreženje smo izvajali pri počasnem tresenju (100 obratov na minuto) pri sobni temperaturi 20 minut, nato pa smo ga kalili z 10 ml 2,5 M glicina (končna koncentracija 0,5 M). Za eksperimente s toplotnim šokom smo E. coli MG1655 gojili v 65 ml LB mediju pri 30 ° C na OD600 približno 0,3. Nato smo 30 ml kulture prenesli v predhodno segreto bučko pri 43 °C, preostanek pa pri 30 °C. Premreženje in gašenje je bilo opisano zgoraj, le da so celice 5 minut hranili pri 30 ali 43 °C, preden so se pri sobni temperaturi še naprej počasi tresli. Celice so bile zbrane s centrifugiranjem in dvakrat sperene s hladno TBS (pH7,5). Po resuspendiranju v 1 ml liznem pufru (10 mM Tris (pH 8,0), 20 % saharoze, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizocima) in inkubaciji pri 37 °C 30 minut, čemur je sledilo dodajanje 4 ml IP pufra, so celice sonikirali na ledu z 12-krat 30 sekundami in 30 sekundnimi odmori z uporabo Hielscher ultrazvočnega procesorja UP400St pri nastavitvi moči 100%. Po 10-minutnem centrifugiranju pri 9000 g smo pri -20 °C shranili alikvote supernatanta 800 μl. (Waldminghaus 2010)
Prekomerna proizvodnja in čiščenje encimov z ultrazvočno sondo
Za prekomerno proizvodnjo beljakovin z oznako dekahistidina (His10) je bila E. coli BL21(DE3) preoblikovana s konstrukti pET19b. Predkultura čez noč je bila pobrana s centrifugiranjem, 1% pa je bilo uporabljeno za inokulacijo izrazne kulture. Celice, ki nosijo pET19mgtB, so gojili pri 22 °C do optične gostote pri 600 nm (OD600) 0,7. Kultura je bila prenesena na 17 °C in inducirana s 100 μM IPTG. Po 16 urah smo kulturo pobrali s centrifugiranjem pri 7.500 × g pri 4 °C. Celice so bile resuspendirane v 50 mM fosfatno puferirani fiziološki raztopini (PBS) z 0,3 M NaCl pri pH 7,4 in motene z ultrasonication z S2 micro-tip sonotrode na Hielscher ultrasonicator UP200St v ciklu 0,5 in amplitudi 75%.
Prekomerna proizvodnja decahistidine-označeni GtfC smo inducirali pri 37 ° C pri OD600 0,6 s 100 iM IPTG. Celice smo nato inkubirali 4 ure, pridelane in lizirali kot je navedeno zgoraj za MgtB.
Ekstrakte surovih celic smo centrifugirali pri 15.000 × g in 4 °C, da bi umirili celične odpadke. Prečiščeni ekstrakti so bili naloženi na 1-ml surove kolone HisTrap FF s sistemom ÄKTAprime Plus. Encimi so bili očiščeni v skladu s proizvajalčevim protokolom za gradientno elucijo beljakovin, označenih z Hisom. Eluirane proteinske raztopine smo dvakrat dializirali proti 1.000 volumnom 50 mM PBS, pH 7,4, z 0,3 M NaCl pri 4 °C. Čiščenje je analiziralo 12% SDS-PAGE. Koncentracija beljakovin je bila določena z Bradfordovo metodo z uporabo Roti-Quant. (Rabausch et al., 2013)
Ultrazvočna ekstrakcija beljakovin iz bakterije E. coli
Vaba zanimivi protein (v tem primeru MTV1 Arabidopsis thaliana) spojen na GST tag in izražena v BL21 Escherichia coli (E. coli) celicah.
- Vzamemo eno peleto GST-MTV1 in GST (ki ustreza 50 ml bakterijske kulture) in ju resuspendiramo v 2,5 ml pufra za hladno ekstrakcijo ledu.
- Uporabite ultrazvočni UP100H (opremljen z MS3 microtip-sonotrode za majhne količine približno 2-5 ml), da motite bakterijske celice, dokler se ne lizirajo, kar kaže zmanjšana motnost in povečana viskoznost. To je treba izvesti na ledu, priporočljivo pa je sonikirati v intervalih (npr. 10-sekundno sonikiranje, ki mu sledi 10-sekundni premor na ledu in tako naprej). Paziti je treba, da ne sonikiramo s previsoko intenzivnostjo. Če se odkrije penjenje ali tvorba bele oborine, je treba intenzivnost zmanjšati.
- Prenesite raztopino liziranih bakterij v 1,5 ml mikrocentrifugalne epruvete in 20 minut centrifugirajte pri 16.000 x g pri 4 °C.
Ultrasonicatorji tipa sonde, kot je UP400St uporabite načelo delovanja akustične kavitacije za učinkovito lizo E. coli.
Ekspresivna analiza in čiščenje rekombinantnega proteina z ultrazvočno razbijanjem
Peleta E. coli je bila sonikirana z ultrazvočnim Hielscher UP100H. V ta namen smo celične pelete resuspendirali v ohlajenem liznem pufru (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) in 10 minut ohladili na ledu. Nato je bila celična suspenzija sonikirana z 10 kratkimi izbruhi 10 s, čemur je sledil interval 30 s za hlajenje. Končno so bili ostanki celic odstranjeni z ultracentrifugiranjem pri 4 ° C za 15 minut pri 14000 vrt / min. Za potrditev rPR ekspresije je bil supernatant izveden na 12% poliakrilamidnem gelu in analiziran s SDS-PAGE in Western blotting. Čiščenje rPR je potekalo z uporabo smole Ni2+-NTA (Invitrogen, ZDA) v skladu s proizvajalčevimi navodili. V tej fazi je bila uporabljena domača metoda čiščenja. Čistost prečiščenega proteina je bila ocenjena z elektroforezo na 12% poliakrilamidnem gelu in kasnejšim Coomassie modrim barvanjem. Koncentracijo prečiščenih beljakovin so merili s kompletom za analizo beljakovin Micro BCA (PIERCE, ZDA). (Azarnezhad et al., 2016)
Ultrazvočni homogenizatorji za lizo E. coli
Hielscher Ultrasonics oblikuje, proizvaja in dobavlja visoko zmogljive ultrazvočne homogenizatorje za zanesljivo in učinkovito lizo bakterij E. coli in drugih vrst celic, tkiv in celičnih kultur.
Širok portfelj ultrazvočnih sond in posrednih sistemov ultrazvočnega razbijanja nam omogoča, da vam ponudimo idealen ultrazvočni homogenizator tkiva za vašo aplikacijo za motnje in ekstrakcijo celic.
Oblikovanje, izdelava in svetovanje – Kakovost izdelana v Nemčiji
Hielscher ultrasonicators so dobro znani po svojih najvišjih standardih kakovosti in oblikovanja. Pametna programska oprema, intuitiven meni, programabilne nastavitve in samodejni protokol podatkov so le nekatere značilnosti Hielscher ultrasonicators. Robustnost in enostavno upravljanje omogočata nemoteno integracijo naših ultrazvočnih naprav v raziskovalne in biotehnološke objekte. Tudi grobe razmere in zahtevna okolja zlahka ravnajo Hielscher ultrasonicators.
Hielscher Ultrasonics je iso certificirano podjetje in dal poseben poudarek na visokozmogiji ultrasonicators, ki vključujejo najmotejšo tehnologijo in prijaznost uporabnika. Seveda, Hielscher ultrasonicators so CE skladni in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.
V spodnji tabeli vam daje podatek o približni zmogljivosti obdelave naših ultrasonicators:
| serija Volume | Pretok | Priporočena naprave |
|---|---|---|
| multi-well / mikrotiter plošče | ni podatkov | UIP400MTP |
| CupHorn za viale ali čašo | ni podatkov | Ultrazvočni cuphorn |
| ultrazvočni reaktor z mikro pretokom | ni podatkov | GDmini2 |
| do 10 vial z 0,5 do 1,5 ml | ni podatkov | VialTweeter |
| 00,5 do 1,5 ml | ni podatkov | VialTweeter |
| 1 do 500ml | 10 do 200 ml / min | UP100H |
| 10 do 2000 ml | 20 do 400ml / min | UP200Ht, UP400St |
| 00,1 do 20L | 00,2 do 4L / min | UIP2000hdT |
| 10 do 100L | 2 do 10L / min | UIP4000 |
| ni podatkov | 10 do 100L / min | UIP16000 |
| ni podatkov | večja | gruča UIP16000 |
Kontaktiraj nas! / Vprašajte nas!
Dodatni protokoli za ultrazvočno lizo E. coli
Allicin modificirane beljakovine v E. coli z uporabo ultrazvočnega VialTweeterja
Določitev sulfhidril Vsebina z 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzojske kisline) (DTNB) Vsebnost
Kultura E. coli MG1655 čez noč je bila uporabljena za inokulacijo minimalnega medija MOPS (1:100). Kultura je rasla aerobno, dokler ni bil dosežen A600 0,4. Kultura je bila razdeljena na tri 15-mililitrske kulture za zdravljenje stresa. Neobdelana kultura je služila kot negativna kontrola. 0,79 mM alicina (128 μg ml-1) ali 1 mM diamida smo dodali eni od preostalih dveh kultur. Kulture smo inkubirali 15 minut. 5 ml vsake kulture smo pobrali s centrifugiranjem (8.525 × g, 4 °C, 10 min). Celice smo dvakrat sprali z 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, shranili anaerobno pred uporabo) in centrifugirali (13.000 × g, 4 °C, 10 min). Celice so bile resuspendirane v liznem pufru (PBS s 6 mM gvanidinijevim HCl, pH 7,4) pred prekinitvijo pri 4 °C z ultrazvočnim razbijanjem (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Nemčija) (3 × 1 min). Ostanke celic smo peletirali s centrifugiranjem (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant smo z magnetno mešalno palico prenesli v 3,5-mililitrsko QS-makro kiveto (10 mm) in zmešali z 1 ml pufra za lizo. Izumrtje vzorcev smo spremljali pri 412 nm s spektrofotometrom Jasco V-650, opremljenim s temperaturno nadzorovanim držalom celic PSC-718 pri sobni temperaturi. Dodali smo 100 μl 3 mM raztopine ditiobisa (2-nitrobenzojske kisline). Izumrtje so spremljali, dokler ni doseglo nasičenosti. Izračun koncentracije tiola je bil izveden z uporabo ekstinkcijskega koeficienta ε412 = 13.700 M-1 Cm-1 za tio-2-nitrobenzojsko kislino (TNB). Cellular tiol Koncentracije so bili izračunani na osnovi volumna celic E. coli 6.7 x 10-15 liter in gostota celic A600 = 0,5 (kar ustreza 1 × 108. celice ml-1 kultura). (Müller et al. 2016)
Določanje glutationa in vivo z uporabo drobilnika ultrazvočnih celic
E.coli MG1655 je bil gojen v minimalnem mediju MOPS v skupnem volumnu 200 ml, dokler ni bil dosežen A600 0,5. Kultura je bila razdeljena na 50-mililitrske kulture za zdravljenje stresa. Po 15 minutah inkubacije z 0,79 mM alicina, 1 mM diamidom ali dimetil sulfoksidom (kontrola) so celice 10 minut pobrali pri 4.000 g pri 4 °C. Celice smo dvakrat sprali s KPE pufrom pred resuspenzijo peletov v 700 μl KPE pufra. Za deproteinacijo smo pred prekinitvijo celic z ultrazvočnim razbijanjem dodali 300l 10% (w / v) sulfosalicilne kisline (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatante smo zbrali po centrifugiranju (30 min 13,000g, 4 ° C). Koncentracije sulfosalicilno kislino smo z dodatkom 3 volumnih KPE pufra znižal na 1%. Meritve celotne glutationa in GSSG smo izvedli, kot je opisano zgoraj. Cellular koncentracije glutation so bili izračunani na osnovi volumna E. coli celice 6,7×10-15 liter in gostota celic A600 0,5 (kar ustreza 1×108. celice ml-1 kultura). Koncentracije GSH smo izračunali z odštevanjem 2 [GSSG] od celotne glutation. (Müller et al. 2016)
Izražanje človeškega mAspAT v E. coli z uporabo ultrazvočnega homogenizatorja
Enotna kolonije E. coli BL21 (DE3) zadrževanje ekspresijski vektor v 30 ml Luria-Bertani (LB) medij, ki vsebuje 100 ug / ml ampicilina, nato gojili na 37 ° C, dokler optična gostota (OD600) Je dosegel 0,6. Celice smo zbrali s centrifugiranjem pri 4000 x g 10 minut in ponovno suspendirali v 3L svežega LB mediju, ki vsebuje 100 ug / ml ampicilina.
Nato je bila ekspresija beljakovin inducirana z 1 mM izopropilnim β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozidom (IPTG) 20 ur pri 16 ° C. Celice smo pobrali s centrifugiranjem 15 minut pri 8.000 × g in sprali s pufrom A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Približno 45 g celic (mokre teže) smo pridobili iz 3 L kulture. Po centrifugiranju so bili celični peleti resuspendirani v 40 ml (za 1 L kulturo) ledeno hladnem ekstrakcijskem pufru A in lizirani z ultrazvočnim razbijanjem pri ledeno hladni temperaturi z uporabo Hielscher ultrazvočne celične drobilnice UP400St. Lizo celic so 15 minut centrifugirali pri 12.000 obratih na minuto, da bi ločili topne (supernatant) in oborjene (peletne) frakcije. (Jiang et al., 2015)
Dejstva je treba vedeti
E. coli
Escherichia coli (E. coli) je gram negativna, fakultativno anaerobna paličasta koliformna bakterija iz rodu Escherichia, ki se običajno nahaja v spodnjem črevesju toplekrvnih organizmov (endotermi). Obstaja veliko število sevov E. coli (ali podtipov) z različnimi značilnostmi. Večina sevov E. coli je neškodljiva za ljudi, npr. Sevov B in K-12, ki se običajno uporabljajo za raziskovalne aplikacije v laboratorijih. Vendar so nekateri sevi škodljivi in lahko povzročijo hude bolezni.
E. coli igra pomembno vlogo v sodobni biološki inženiring in industrijske mikrobiologije, saj imajo bakterije je enostavno manipulirati. Skupna lab aplikacije, pri katerih gre za pogosto uporabo E. coli, npr ustvariti rekombinantne kislino (DNK) ali da delujejo kot model organizem.
E. coli je zelo vsestranski gostitelja za produkcijo heterolognih proteinov, in razdelilne ekspresijo sistemi so na voljo za proizvodnjo rekombinantnih proteinov v E. coli. Uporaba plazmidov, ki omogočajo visoko ekspresijo stopnja beljakovin, lahko gene uvedemo bakterij, ki omogoča proizvodnjo teh proteinov v velikih količinah v industrijskih fermentacijskih procesov.
E. coli se uporablja kot celične tovarne za proizvodnjo insulina. Nadaljnje uporabe vključujejo uporabo spremenjenih celic E. coli za razvoj in proizvodnjo cepiv in imobiliziranih encimov, proizvodnjo biogoriv in bioremediacijo.
Sev K-12 je mutantna oblika E. coli, ki prekomerno izraža encima alkalne fosfataze (ALP). Ta mutacija se pojavi zaradi okvare gena, ki nenehno kode za encim. Če gen daje izdelek brez inhibicije je to znano kot konstitutivno aktivnost. Ta posebna mutantna oblika se uporablja za izolacijo in čiščenje ALP encimov.
Bakterije E. coli se pogosto uporabljajo tudi kot celične tovarne. Inženirski mikrobi (npr. bakterije) in rastlinske celice se lahko uporabljajo kot tako imenovane celične tovarne. Te gensko spremenjene celice proizvajajo molekule, kemikalije, polimere, beljakovine in druge snovi, ki se uporabljajo na primer v farmacevtski, živilski in kemični industriji. Da bi sprostili molekule, proizvedene v notranjosti takšnih bioinženidnih celic, je ultrazvočna liza pogosta metoda za motnje celičnih sten in prenos ciljnih snovi v okoliško tekočino. Preberite več o lysis bioinengineered celic!
Ultrazvočni DNK Rezalni
Ultrazvočne strižne sile so pogosto uporabljena metoda za sproščanje molekul, organelov in beljakovin iz notranjosti celice ter za razbijanje verig DNK na koščke. Akustična kavitacija razbije celične stene in membrane, da izvleče DNK iz celic in ustvari fragmente okoli 600 – 800 bp v dolžini, ki je idealen za analizo.
Kliknite tukaj, če želite izvedeti več o ultrazvočni homogenizers za fragmentacije DNK!
Literatura/reference
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics proizvaja visoko zmogljivost ultrazvočnih homogenizatorjev iz laboratorij do industrijske velikosti.