Biointehnificirane vrste bakterij, kot so E. coli, pa tudi gensko spremenjene vrste sesalcev in rastlinskih celic se v biotehnični uporabijo za izražanje molekul. Za sprostitev teh sintetičnih bio-molekul je potrebna zanesljiva tehnika motenja celic. Ultrasonication visoke zmogljivosti je dokazana metoda za učinkovito in zanesljivo celično – zlahka razsežna na velike vhode. Hielscher Ultrasonics vam ponuja visoko zmogljivo ultrazvočno opremo za učinkovitost celične lyze, da bi proizvedli velike količine visokokakovostnih bio-molekul.

Ekstrakcija molekul iz celičnih tovarn

Za proizvodnjo široke palete biomolekulov se lahko različni inženirski mikrobi in rastlinske celice uporabljajo kot mikrobne celice, vključno z Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana i alge, izmedu mnogih drugih. Te celične tovarne lahko proizvajajo beljakovine, lipidi, biokemike, polimere, biogoriva in oleokemikale, ki se uporabljajo kot hrana ali surovina za industrijske aplikacije. Celice, ki se uporabljajo kot celične tovarne, so kulturene v zaprtih bioreaktorji, kjer lahko dosežejo visoko učinkovitost, specifičnost in nizko energetsko potrebo.
Če želite izolovati ciljne molekule iz bioinžinjerednih celičnih kultur, je treba celice prekiniti tako, da se znotrajcelični material sprosti. Ultrazvočni celični motilniki so dobro uveljavljeni kot zelo zanesljiva in učinkovita tehnika za razpad celic in sproščanje spojin.

Mikrobne celice so presnovno inženirizirane celice, ki se uporabljajo za sintezo različnih dragocenih spojin. Ultrazvočna motnja celic je učinkovita in zanesljiva metoda za sprostitev dragocenih spojin iz celične notranjosti.
študija in grafika: ©Villaverde, 2010.

Prednosti ultrazvočnih celičnih motil

Kot netermalna, blaga, a vendar zelo učinkovita tehnologija se ultrazvočni motilniki uporabljajo v laboratoriju in industriji za lajšanje celic in za izdelavo visokokakovostnih izvlekov, npr.

Power-Ultrazvok za učinkovito motnje mikrobnih celic tovarne

Mehanizem in učinki ultrazvočnih celičnih motil:
Ultrazvočna motnja celic je uporabila moč ultrazvočnih valov. Ultrazvočni homogenizator / celični disruptor je opremljen s sondo (alias sonotrode), izdelano iz zlitina titana, ki niha pri visoki frekvenci približno 20 kHz. To pomeni, da so ultrazvočni pari sonde 20.000 vibracij na sekundo v sonicano tekočino. Za ultrazvočne valove, ki se spojijo v tekočino, so značilni izmenično visokotlačni / nizkotlačni cikli. Med nizkotlačno ciklo se tekočina razširi in nastanejo minutni vakumski mehurčki. Ti zelo majhni mehurčki rastejo v več izmenično tlačni ciklih, dokler ne morejo absorbirati nobene nadaljnje energije. V tem trenutku mehurčki kavitacije nasilno implodacijo in ustvarjajo lokalno izjemno energetsko gosto okolje. Ta pojav je znan kot akustična kavitacija in je značilna lokalno zelo visoke temperature, zelo visoki pritiski in štrleče sile. Ta omejevalna obremenitev učinkovito zlomi celične stene in poveča prenos mase med celično notranjostjo in okoliškim topilom. Kot povsem mehanska tehnika se široko uporabljajo ultrazvočno ustvarjene omejevalni sile in priporočeni postopek za motnje bakterijskih celic, pa tudi za izolacijo beljakovin. Kot preprosta in hitra metoda prekinitve celic je sonikacija idealna za izolacijo majhnih, srednjih in velikih prostornin. Hielscherjeva digitalna ultrazvočnatorja sta opremljena z jasnim menijem nastavitev za natančna kontrola sonication. Vsi podatki sonication so samodejno shranjeni na vgrajeni SD kartici in so preprosto dostopni. Sofisticirane možnosti toplotne disifikacije, kot so zunanje hlajenje, sonication v načinu utripa itd. med ultrazvočnim razpadom zagotavljajo vzdrževanje idealne temperature procesa in s tem netaktnost ekstrahiranih toplotno občutljivih spojin.

Raziskave poudarjajo prednosti ultrazvočnih celic motnje in ekstrakcijo

Prof. Chemat et al. (2017) v študiji nadaljuje, da je "ekstrakcija, ki jo pomaga ultrazvok, zelena in ekonomsko upravičena alternativa konvencionalnim tehnikam za živila in naravne izdelke. Glavne prednosti so zmanjšanje časa ekstrakcije in predelave, količina uporabljene energije in topil, operacije na enoto in CO₂ emisije."
Gabig-Ciminska et al. (2014) je za sproščanje DNK uporabil visokotlačni homogenizator in ultrazvočni celični dezintegrator. V primerjavi z obema metodama motenj celic raziskovalna skupina ugotavlja, da je v zvezi s celično lyzo za sporno DNK "opravljena analiza z uporabo celičnih lysatov iz homogenizacije visokega tlaka. Potem smo ugotovili, da ima ultrazvočna motnja v celicah izjemne prednosti za ta namen. Je precej hiter in ga je mogoče obdelati za majhne količine vzorcev." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekule iz celičnih tovarn za proizvodnjo hrane

Tovarne mikrobnih celic so uspešna in učinkovita proizvodna metodologija z uporabo mikrobnih organizmov za proizvodnjo visokih donosov domorodnih in nenarodnih metabolitov s presnovnim bio-inženiringom mikrobnih mikroorganizmov, kot so bakterije, kvasovke, glive itd. Encimi v razsutem stanju so na primer proizvedeni z uporabo mikroorganizmov, kot so Aspergillus oryzae, glive in bakterije. Ti encimi v razsutem stanju se uporabljajo za proizvodnjo hrane in pijač ter za kmetijstvo, bioenergijo in oskrbo gospodinjstev.
Nekatere bakterije, kot sta Acetobacter xylinum in Gluconacetobacter xylinus, proizvajajo celuloza med postopkom fermentacije, kjer se nanofiberi sintetizujejo v procesu od spodaj navzgor. Bakterijska celuloza (znana tudi kot mikrobna celuloza) je kemično enakovredna rastlinski celulozni, vendar ima visoko stopnjo kristalnosti in visoke čistosti (brez lignina, hemikeluloze, pektina in drugih biogenih komponent) ter edinstveno strukturo tridimenzionalnega (3D) retikulativnega omrežja celuloze nanofiber. (prim. Zhong, 2020) V primerjavi z rastlinsko pridobljeno celuloto je bakterijska celuloza bolj trajnostna, proizvedena celuloza pa ne zahteva zapletenih korakov za čiščenje. Ultrasonication in ekstrakcija topila z uporabo NaOH ali SDS (natrijev dodecil sulfat) so zelo učinkoviti za izoliranje bakterijske celuloze iz bakterijskih celic.

Biomolekule iz celičnih tovarn za proizvodnjo farmacevtskih in cepiv

Eden izmed najminentnejših farmacevtskih izdelkov, pridobljenih iz celičnih tovarn, je človeški insulin. Za proizvodnjo biointenzina se uporabljajo pretežno E. coli in Saccharomyces cerevisiae. Ker bio-sintetiizirane nano-velikosti molekule ponujajo visoko biokompatibilnost, biološki nanodelci, kot je feritin, so ugodni za številne biomanufacturing aplikacije. Poleg tega je proizvodnja v presnovno inženirskih mikrobih pogosto bistveno učinkovitejša pri pridobljenih donosih. Na primer, proizvodnja artemizinske kisline, resveratrola in lycopena se je povečala desetkrat na več stokrat, in je že vzpostavljena ali je v razvoju za industrijsko proizvodnjo. (prim. Liu et al.; Mikrob. Celično dejstvo. 2017)
Na primer, biomolekule, ki temeljijo na beljakovinah, z samosastavljivimi lastnostmi, kot so feritin in virusom podobni delci, so še posebej zanimive za razvoj cepiva, saj posnemajo velikost in strukturo patogenov ter so prilagojene površinski konjugaciji antigenov za spodbujanje interakcije z imunskim celicami. Takšne molekule so izražene v tako imenovanih celičnih tovarnah (npr. inženirski sevi E. coli), ki proizvajajo določeno ciljno molekulo.

Protokol za ultrazvočno lyzo in E. coli BL21 za sproščanje feritina

Feritin je beljakovina, ki je primarna funkcija shranjevanje železa. Feritin kaže obetavne zmogljivosti kot samosestavljive nanodelce v cepivih, kjer se uporablja kot vozilo za dostavo cepiva (npr. beljakovine sars-Cov-2 spike). Znanstvena raziskava Sun et. al. (2016) kaže, da se rekombinantni feritin lahko sprosti kot topna oblika iz escherichia coli pri nizkih koncentracijah naCl (≤50 mmol/L). Za izražanje feritina v E. coli BL21 in sprostitev fertina je bil uspešno uporabljen naslednji protokol. Rekombinantni pET-28a/feritin plazmid se je spremenil v sev E coli BL21 (DE3). Feritin E coli BL21 (DE3) celice so bile kultivirane v rastnih medijih LB z 0,5 % kanamicina pri 37 °C in inducirano pri OD600 0,6 z 0,4 % izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid 3 ure pri 37 °C. Končna kultura je bila nato pobrana s centrifugacijo pri 8000g za 10 minut pri 4 °C, pelet pa je bil zbran. Nato je bil pelet ponovno posodobljen v LB mediju (1% NaCl, 1% Tipon, 0,5% ekstrakt kvasca)/lysis buffer (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.6) i različne koncentracije NaCl raztopine (0, 50, 100, 170, i 300 mmol/L). Za bakterijsko celično lizo so sonication uporabljali v pulznem načinu: npr. ultrasonicator UP400St pri 100% amplitudi z dejavnim ciklusom 5 sekund ON, 10 sekund OFF, za 40 ciklov) in nato centrifugirana pri 10 000g 15 minut pri 4 °C. Supernatant in padavine so analizirali z elektroforezo natrijevega dodecil sulfata poliakrilamid gela (SDS-PAGE). Vse gele, oblite z natrijevim dodecil sulfatom, so skenirali s skenerjem visoke ločljivosti. Gel slike so analizirali z uporabo Magic Chemi 1D programske opreme. Za optimalno jasnost so bili proteinski pasovi zaznani s prilagajanjem parametrov. Podatki za bende so bili pridobljeni iz tehničnih triplikatov. (prim. Sun et al., 2016)

Ultrazvočne celice disruptorji za industrijsko lysis celičnih tovarn

Ultrazvočna lysis in ekstrakcija je zanesljiva in udobna metoda za sproščanje presnovkov iz celičnih tovarn in s tem pomagati pri učinkovitosti proizvodnje ciljnih molekul. Ultrazvočni celični motilec so na voljo od laboratorija do industrijske velikosti in procesi se lahko povsem linealen.
Hielscher Ultrasonics je vaš usposobljeni partner za visoko zmognjene ultrazvočne motilke in ima dolgotrajne izkušnje na področju vsaditve ultrazvočnih sistemov v klop-top in industrijske nastavitve.
Ko gre za prefinjeno strojno in programsko opremo, Hielscher Ultrasonics sistemi za motnje celic izpolnjujejo vse zahteve za optimalno upravljanje procesov, enostavno delovanje in prijaznost uporabnika. Stranke in uporabnik Hielscher ultrasonicators cenijo korist, ki Hielscher ultrazvočne celice motilci in ekstraktorji omogočajo natančno spremljanje in nadzor procesov – z digitalnim zaslonom na dotik in daljinskim upravljalnikom brskalnika. Vsi pomembni podatki o sonikaciji (npr. neto energija, skupna energija, amplituda, trajanje, temperatura, tlak) se samodejno shranijo kot CSV datoteka na integrirani SD-kartici. To pomaga doseči pomnoževalne in ponavljajoče se rezultate ter olajša standardizacijo procesov ter izpolnjevanje dobrih proizvodnih praks (cGMP).
Seveda so Hielscher ultrazvočni procesorji zgrajeni za delovanje 24/7 pod polno obremenitvijo in jih je zato mogoče zanesljivo upravljati v nastavitvah industrijske proizvodnje. Zaradi visoke robustnosti in nizkega vzdrževanja je ugasnjenost ultrazvočne opreme res nizka. CIP (čisto-na mestu) in SIP (sterilizirajte-na-mestu) funkcije minimizirajo laboratorijsko čiščenje, še posebej, ker so vsi vlažilni deli gladke kovinske površine (brez skritih odprtink ali šob).

V spodnji tabeli vam daje podatek o približni zmogljivosti obdelave naših ultrasonicators: