Ultrazvočna liza bioinženirskih celic v industrijski proizvodnji
Bioinženirske vrste bakterij, kot so E. coli, kot tudi gensko spremenjene vrste sesalcev in rastlinskih celic, se pogosto uporabljajo v biotehnologiji za izražanje molekul. Za sprostitev teh sintetiziranih biomolekul je potrebna zanesljiva tehnika motenj celic. Visoko zmogljiva ultrazvočna obdelava je dokazana metoda za učinkovito in zanesljivo lizo celic – enostavno razširljiv na velike zmogljivosti. Hielscher Ultrasonics vam ponuja visoko zmogljivo ultrazvočno opremo za učinkovito lizo celic, da bi proizvedli velike količine visokokakovostnih biomolekul.
Ekstrakcija molekul iz celičnih tovarn
Za proizvodnjo širokega spektra biomolekul se lahko kot tovarne mikrobnih celic uporabljajo različni inženirski mikrobi in rastlinske celice, vključno z Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana in alge, med mnogimi drugimi. Te celične tovarne lahko proizvajajo beljakovine, lipide, biokemikalije, polimere, biogoriva in oleokemikalije, ki se uporabljajo kot hrana ali surovina za industrijsko uporabo. Celice, ki se uporabljajo kot celične tovarne, se gojijo v zaprtih bioreaktorjih, kjer lahko dosežejo visoko učinkovitost, specifičnost in nizke energetske zahteve.
Za izolacijo ciljnih molekul iz bioinženirskih celičnih kultur je treba celice prekiniti, tako da se sprosti znotrajcelični material. Ultrazvočni motilci celic so dobro uveljavljeni kot zelo zanesljiva in učinkovita tehnika za razpad celic in sproščanje spojin.

Ultrazvočni celični dezintegratorji, kot so UIP2000hdT se uporabljajo za izolacijo spojin iz tovarn mikrobnih celic.

Tovarne mikrobnih celic so metabolično inženirske celice, ki se uporabljajo za sintezo različnih dragocenih spojin. Ultrazvočna motnja celic je učinkovita in zanesljiva metoda za sproščanje dragocenih spojin iz notranjosti celice.
študija in grafika: ©Villaverde, 2010.
Prednosti ultrazvočnih motilcev celic
Kot netoplotna, blaga, vendar zelo učinkovita tehnologija se ultrazvočni motilci uporabljajo v laboratoriju in industriji za lizo celic in proizvodnjo visokokakovostnih izvlečkov, npr. Uporabljajo se za izolacijo molekul iz celičnih tovarn.
- Visoka učinkovitost
- Netoplotna, idealna za temperaturno občutljive snovi
- Zanesljivi, ponovljivi rezultati
- Natančna kontrola obdelave
- Linearno razširljiv na večje zmogljivosti
- Na voljo za industrijske proizvodne zmogljivosti
Močni ultrazvok za učinkovito prekinitev tovarn mikrobnih celic
Mehanizem in učinki ultrazvočnih motilcev celic:
Ultrazvočna motnja celic je uporabila moč ultrazvočnih valov. Ultrazvočni homogenizator / motilec celic je opremljen s sondo (aka sonotrode) iz titanove zlitine, ki niha pri visoki frekvenci približno 20 kHz. To pomeni, da ultrazvočna sonda združi 20.000 vibracij na sekundo v ultrazvočno tekočino. Za ultrazvočne valove, povezane s tekočino, so značilni izmenični visokotlačni / nizkotlačni cikli. Med nizkotlačnim ciklom se tekočina razširi in nastanejo majhni vakuumski mehurčki. Ti zelo majhni mehurčki rastejo v več izmeničnih tlačnih ciklih, dokler ne morejo absorbirati nadaljnje energije. Na tej točki kavitacijski mehurčki silovito implodirajo in lokalno ustvarijo izjemno energetsko gosto okolje. Ta pojav je znan kot akustična kavitacija in zanj so značilne lokalno zelo visoke temperature, zelo visoki tlaki in strižne sile. Te strižne napetosti učinkovito razbijejo celične stene in povečajo prenos mase med notranjostjo celice in okoliškim topilom. Kot čisto mehanska tehnika se pogosto uporabljajo ultrazvočno generirane strižne sile in priporočen postopek za motnje bakterijskih celic, kot tudi za izolacijo beljakovin. Kot preprosta in hitra metoda motenj celic je ultrazvočna obdelava idealna za izolacijo majhnih, srednjih in velikih volumnov. Hielscherjevi digitalni ultrazvočni aparati so opremljeni z jasnim menijem nastavitev za natančen nadzor ultrazvočnega razbijanja. Vsi podatki o ultrazvočni obdelavi se samodejno shranijo na vgrajeno kartico SD in so preprosto dostopni. Prefinjene možnosti odvajanja toplote, kot so zunanje hlajenje, ultrazvočno razbijanje v pulznem načinu itd. Med postopkom ultrazvočnega razpadanja, zagotavljajo vzdrževanje idealne procesne temperature in s tem nedotaknjenost ekstrahiranih toplotno občutljivih spojin.
Raziskave poudarjajo prednosti ultrazvočnih motenj in ekstrakcije celic
Prof. Chemat et al. (2017) v svoji študiji nadaljuje, da je "ekstrakcija z ultrazvokom zelena in ekonomsko izvedljiva alternativa konvencionalnim tehnikam za hrano in naravne proizvode. Glavne prednosti so zmanjšanje časa ekstrakcije in obdelave, količina porabljene energije in topil, operacije enot in CO2 emisije."
(2014) so v svoji študiji za lizo spor uporabili visokotlačni homogenizator in ultrazvočni celični dsintegrator, da bi sprostili DNK. S primerjavo obeh metod motenj celic raziskovalna skupina ugotavlja, da je bila v zvezi z lizo celic za sporo DNK "analiza opravljena z uporabo celičnih lizatov iz homogenizacije visokega tlaka. Nato smo ugotovili, da ima ultrazvočna motnja celic izjemne prednosti za ta namen. Je precej hiter in ga je mogoče obdelati za majhne količine vzorcev. (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Industrijski ultrazvočni celični dezintegrator UIP4000hdT (4000 W, 20 kHz) za neprekinjeno inline izolacijo in čiščenje sintetiziranih spojin iz mikrobnih celičnih tovarn.
Biomolekule iz celičnih tovarn za proizvodnjo hrane
Tovarne mikrobnih celic so izvedljiva in učinkovita proizvodna metodologija, ki uporablja mikrobne organizme za proizvodnjo visokih donosov naravnih in tujerodnih metabolitov s presnovnim bioinženiringom mikrobnih mikroorganizmov, kot so bakterije, kvasovke, glive itd. Encimi v razsutem stanju se na primer proizvajajo z uporabo mikroorganizmov, kot so Aspergillus oryzae, glive in bakterije. Ti encimi v razsutem stanju se uporabljajo za proizvodnjo hrane in pijače, pa tudi v kmetijstvu, bioenergiji in negi gospodinjstev.
Nekatere bakterije, kot sta Acetobacter xylinum in Gluconacetobacter xylinus, proizvajajo celulozo med fermentacijskim procesom, kjer se nanovlakna sintetizirajo v procesu od spodaj navzgor. Bakterijska celuloza (znana tudi kot mikrobna celuloza) je kemično enakovredna rastlinski celulozi, vendar ima visoko stopnjo kristalnosti in visoko čistost (brez lignina, hemiceluloze, pektina in drugih biogenih sestavin) ter edinstveno strukturo celulozne tridimenzionalne (3D) mrežaste mreže. (prim. Zhong, 2020) V primerjavi s celulozo rastlinskega izvora je bakterijska celuloza bolj trajnostna in proizvedena celuloza je čista in ne zahteva zapletenih korakov čiščenja. Ultrasonication in ekstrakcija s topilom z uporabo NaOH ali SDS (natrijev dodecil sulfat) sta zelo učinkovita za izolacijo bakterijske celuloze iz bakterijskih celic.
Biomolekule iz celičnih tovarn za farmacevtsko proizvodnjo in proizvodnjo cepiv
Eden najpomembnejših farmacevtskih izdelkov, pridobljenih iz celičnih tovarn, je humani insulin. Za bioinženirsko proizvodnjo insulina se uporabljata predvsem E. coli in Saccharomyces cerevisiae. Ker biosintetizirane nano-velike molekule ponujajo visoko biokompatibilnost, so biološki nanodelci, kot je feritin, koristni za številne bioproizvodne aplikacije. Poleg tega je proizvodnja metabolično spremenjenih mikrobov pogosto bistveno učinkovitejša pri pridobljenih donosih. Na primer, proizvodnja artemisinske kisline, resveratrola in likopena se je povečala desetkrat na več stokrat in je že uveljavljena ali je v razvoju za industrijsko proizvodnjo. (prim. Liu et al.; Mikrob. Dejstvo o celici. 2017)
Na primer, nano-velike biomolekule na osnovi beljakovin s samosestavljajočimi lastnostmi, kot so feritin in virusom podobni delci, so še posebej zanimive za razvoj cepiv, saj posnemajo velikost in strukturo patogenov in so primerne za površinsko konjugacijo antigenov za spodbujanje interakcije z imunskimi celicami. Takšne molekule so izražene v tako imenovanih celičnih tovarnah (npr. Inženirski sevi E. coli), ki proizvajajo določeno ciljno molekulo.
Protokol za ultrazvočno lizo in E. coli BL21 za sproščanje feritina
Feritin je beljakovina, katere primarna funkcija je shranjevanje železa. Feritin kaže obetavne zmogljivosti kot samosestavljajoči nanodelci v cepivih, kjer se uporablja kot nosilec za dostavo cepiva (npr. Koničasti proteini SARS-Cov-2). Znanstvene raziskave Sun et. al. (2016) kaže, da se rekombinantni feritin lahko sprosti kot topna oblika iz Escherichia coli pri nizkih koncentracijah NaCl (≤50 mmol / L). Za izražanje feritina v E. coli BL21 in sprostitev fertina je bil uspešno uporabljen naslednji protokol. Rekombinantni plazmid pET-28a/feritin je bil pretvorjen v sev E. coli BL21 (DE3). Celice feritina E coli BL21 (DE3) so gojili v rastnem mediju LB z 0,5% kanamicinom pri 37 °C in inducirali pri OD600 0,6 z 0,4% izopropil-β-D-tiogalaktopiranozidem 3 ure pri 37 °C. Končna kultura je bila nato pobrana s centrifugiranjem pri 8000 g za 10 minut pri 4 ° C, pelet pa je bil zbran. Nato je bil pelet resuspendiran v LB gojišču (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% ekstrakt kvasa)/pufru za lizo (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) in različnih koncentracijah raztopine NaCl (0, 50, 100, 170 in 300 mmol/L). Za analizo bakterijskih celic je bila ultrazvočna razbijanja uporabljena v impulznem načinu: npr. z uporabo Ultrazvočni aparat UP400St pri 100 % amplitude z delovnim ciklom 5 sekund vklopljeno, 10 sekund IZKLOPLJENO, 40 ciklov) in nato centrifugiramo pri 10 000 g 15 minut pri 4 °C. Supernatant in oborina sta bila analizirana s poliakrilamidno gelno elektroforezo natrijevega dodecil sulfata (SDS-PAGE). Vsi geli, obarvani z natrijevim dodecil sulfatom, so bili skenirani s skenerjem visoke ločljivosti. Slike gela so analizirali s programsko opremo Magic Chemi 1D. Za optimalno jasnost so bili proteinski pasovi odkriti s prilagajanjem parametrov. Podatki za pasove so bili ustvarjeni iz tehničnih triizvodov. (prim. Sun et al., 2016)
Ultrazvočni motilci celic za industrijsko lizo celičnih tovarn
Ultrazvočna liza in ekstrakcija je zanesljiva in udobna metoda za sproščanje metabolitov iz celičnih tovarn, s čimer pomaga pri učinkoviti proizvodnji ciljnih molekul. Ultrazvočni motilci celic so na voljo od laboratorija do industrijske velikosti, procesi pa se lahko popolnoma linearno razširijo.
Hielscher Ultrasonics je vaš kompetenten partner za visoko zmogljive ultrazvočne motilce in ima dolgoletne izkušnje na področju vsaditve ultrazvočnih sistemov v namiznih in industrijskih okoljih.
Ko gre za sofisticirano strojno in programsko opremo, Hielscher Ultrasonics sistemi za prekinitev celic izpolnjujejo vse zahteve za optimalno krmiljenje procesov, enostavno upravljanje in prijaznost do uporabnika. Kupci in uporabniki Hielscher ultrazvočnih aparatov cenijo prednost, ki jo Hielscher ultrazvočni celični motilci in ekstraktorji omogočajo natančno spremljanje in nadzor procesov – prek digitalnega zaslona na dotik in daljinskega upravljalnika brskalnika. Vsi pomembni podatki o ultrazvočnem razbijanju (npr. neto energija, skupna energija, amplituda, trajanje, temperatura, tlak) se samodejno shranijo kot datoteka CSV na integrirano kartico SD. To pomaga doseči ponovljive in ponovljive rezultate ter olajša standardizacijo procesov in izpolnjevanje dobrih proizvodnih praks (cGMP).
Seveda so Hielscher ultrazvočni procesorji zgrajeni za 24/7 delovanje pri polni obremenitvi in jih je zato mogoče zanesljivo upravljati v industrijskih proizvodnih okoljih. Zaradi visoke robustnosti in nizkega vzdrževanja je čas izpada ultrazvočne opreme res nizek. Funkcije CIP (čiščenje na mestu) in SIP (sterilizacija na mestu) zmanjšujejo naporno čiščenje, še posebej, ker so vsi mokri deli gladke kovinske površine (brez skritih odprtin ali šob).
Spodnja tabela vam prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih aparatov:
Obseg serije | Pretok | Priporočene naprave |
---|---|---|
1 do 500 ml | 10 do 200 ml / min | UP100H |
10 do 2000 ml | 20 do 400 ml / min | UP200Ht, UP400St |
0.1 do 20L | 00,2 do 4 l/min | UIP2000hdT |
10 do 100L | 2 do 10 l/min | UIP4000hdT |
n.a. | 10 do 100 l/min | UIP16000 |
n.a. | Večji | Grozd UIP16000 |
Kontaktirajte nas! / Vprašajte nas!
Literatura / Reference
- Sun, W., Jiao, C., Xiao, Y., Wang, L., Yu, C., Liu, J., Yu, Y., Wang, L. (2016):Salt-Dependent Aggregation and Assembly of E Coli-Expressed Ferritin. Dose-Response, March 2016.
- Rodrigues, M.Q.; Alves, P.M.; Roldão, A. (2021): Functionalizing Ferritin Nanoparticles for Vaccine Development. Pharmaceutics 2021, 13, 1621.
- Farid Chemat, Natacha Rombaut, Anne-Gaëlle Sicaire, Alice Meullemiestre, Anne-Sylvie Fabiano-Tixier, Maryline Abert-Vian (2017): Ultrasound assisted extraction of food and natural products. Mechanisms, techniques, combinations, protocols and applications. A review. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 34, 2017. 540-560.
- Villaverde, Antonio (2010): Nanotechnology, bionanotechnology and microbial cell factories. Microbial Cell Factories 2010 9:53.
Dejstva, ki jih je vredno vedeti
Sono-bioreaktorji
Ultrazvok se po eni strani uporablja za motnje celic, da bi sprostili znotrajcelične spojine, vendar se uporablja z blažjimi amplitudami in / ali kot pulzirajoči ultrazvočni izbruhi, ultrazvočna razbijanje lahko močno poveča presnovno produktivnost mikrobnih, rastlinskih in živalskih celic v bioreaktorjih, s čimer se povečajo biotehnološki procesi. Ultrazvočne sonde se lahko preprosto integrirajo v bioreaktorje (tako imenovane sono-bioreaktorje), da se poveča učinkovitost živih biokatalizatorjev. Hielscher ultrazvočni aparati omogočajo natančno nadzorovane ultrazvočne pogoje, ki jih je mogoče optimalno natančno prilagoditi visoki katalitični pretvorbi živih celic. Preberite več o Hielscherjevih ultrazvočnih sondah za sonobioreaktorje in učinkih ultrazvočno izboljšane biokatalize!
Tovarne celic in sinteza metabolitov
Različni mikroorganizmi lahko sintetizirajo podobne metabolite, na primer za proizvodnjo aminokislin Corynebacterium, Brevibacterium in Escherichia coli so bili uspešno uporabljeni; vitamini so bili sintetizirani z uporabo Propionibacterium in Pseudomonas; organske kisline izhajajo iz Aspergillus, Lactobacillus, Rhizopus; medtem ko encime lahko proizvajata Aspergillus in Bacillus; antibiotike lahko proizvajata Streptomyces in Penicillium; medtem ko se za proizvodnjo bioloških površinsko aktivnih snovi običajno tvorijo Pseudomonas, Bacillus in Lactobacillus kot celične tovarne.
E. coli kot tovarne mikrobnih celic
Bakterija E. coli in njeni številni sevi se pogosto uporabljajo v molekularni biologiji in je postala eden prvih učinkovitih celičnih modelov, ki se uporabljajo kot tovarne mikrobnih celic za proizvodnjo rekombinantnih beljakovin, biogoriv in različnih drugih kemikalij. E. coli ima naravno sposobnost proizvajanja več spojin, ki je bila izboljšana z bioinženiringom in genskimi spremembami. Na primer, s prenosom heterolognih encimov je bila spremenjena sposobnost E. coli, da proizvaja številne izdelke, da bi razvili nove biosintetične poti.
(Antonio Valle, Jorge Bolívar: Chapter 8 – Escherichia coli, the workhorse cell factory for the production of chemicals. In: Editor(s): Vijai Singh, Microbial Cell Factories Engineering for Production of Biomolecules, Academic Press, 2021. 115-137.)
Streptomices kot tovarne mikrobnih celic
Streptomyces je največja skupina aktinomicetov; Vrste Streptomyces so zelo razširjene v vodnih in kopenskih ekosistemih. Člani rodu Streptomyces so komercialno zanimivi zaradi svoje sposobnosti za proizvodnjo ogromnega števila biomolekul in bioaktivnih sekundarnih metabolitov. Proizvaja klinično uporabne antibiotike, kot so tetraciklini, aminoglikozidi, makrolidi, kloramfenikol in rifamicini. Poleg antibiotikov zdravilo Streptomyces proizvaja tudi druge zelo dragocene farmacevtske izdelke, vključno z zdravili proti raku, imunostimulacijskimi, imunosupresivnimi, antioksidativnimi sredstvi, insekticidi in antiparazitskimi zdravili, ki imajo široko medicinsko in kmetijsko uporabo.
Vrste Streptomyces proizvajajo vrsto encimov, ki so medicinsko pomembni, vključno z L-asparaginazo, urikazo in holesterol oksidazo. Številni aktinomiceti lahko proizvajajo industrijsko pomembne encime, kot so celulaze, hitinaze, hitozanaze, α-amilaze, proteaze in lipaze. Številni aktinomiceti lahko proizvajajo različne pigmente, ki so potencialno dobra alternativa sintetičnim barvam. Vrste Streptomyces imajo veliko zmogljivost za proizvodnjo aktivnih površinskih biomolekul, vključno z bioemulgatorji in biološkimi površinsko aktivnimi snovmi. Antidiabetično akarbozo so proizvedli sevi zdravila Streptomyces z mikrobno fermentacijo. Vrste Streptomyces so pokazale sposobnost sinteze zaviralcev holesterola, kot je pravastatin. V zadnjem času se vrste Streptomyces lahko uporabljajo kot okolju prijazne "nanotovarne" za sintezo nanodelcev. Nekatere vrste Streptomyces so obetavne za proizvodnjo vitamina B12.
(Noura El-Ahmady El-Naggar: Chapter 11 – Streptomyces-based cell factories for production of biomolecules and bioactive metabolites, In: Editor(s): Vijai Singh, Microbial Cell Factories Engineering for Production of Biomolecules, Academic Press, 2021. 183-234.)

Hielscher Ultrasonics proizvaja visoko zmogljive ultrazvočne homogenizatorje iz laboratorij k industrijska velikost.