Ultrazvočna liza celic, spremenjenih z bioinženirstvom, v industrijski proizvodnji

Bakterijske vrste, spremenjene z bioinženirstvom, kot je E. coli, ter gensko spremenjene vrste sesalskih in rastlinskih celic se v biotehnologiji pogosto uporabljajo za izražanje molekul. Za sproščanje teh sintetiziranih biomolekul je potrebna zanesljiva tehnika razgradnje celic. Visokozmogljiva sonikacija je preizkušena metoda za učinkovito in zanesljivo lizo celic – njeno zmogljivost je mogoče preprosto povečati za obdelavo velikih količin. Hielscher Ultrasonics vam ponuja visokozmogljivo ultrazvočno opremo za učinkovito lizo celic za proizvodnjo velikih količin visokokakovostnih biomolekul.

Ekstrakcija molekul iz celičnih tovarn

Za proizvodnjo širokega nabora biomolekul se lahko kot mikrobne celične tovarne uporabljajo različni inženirsko spremenjeni mikroorganizmi in rastlinske celice, med drugim Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, cianobakterije, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana in alge. Te celične tovarne lahko proizvajajo beljakovine, lipide, biokemikalije, polimere, biogoriva in oleokemikalije, ki se uporabljajo kot hrana ali surovine za industrijsko uporabo. Celice, ki se uporabljajo kot celične tovarne, gojijo v zaprtih bioreaktorjih, kjer lahko dosežejo visoko učinkovitost, specifičnost in majhne potrebe po energiji.
Za izolacijo ciljnih molekul iz kultur celic, spremenjenih z bioinženirstvom, je treba celice razgraditi, da se sprosti znotrajcelični material. Ultrazvočne naprave za razgradnjo celic so dobro uveljavljene kot zelo zanesljiva in učinkovita tehnika za razgradnjo celic in sproščanje spojin.

Mikrobne celične tovarne so celice, spremenjene z metaboličnim inženirstvom, ki se uporabljajo za sintezo različnih dragocenih spojin. Ultrazvočna razgradnja celic je učinkovita in zanesljiva metoda za sproščanje dragocenih spojin iz notranjosti celic.
študija in grafični prikaz: ©Villaverde, 2010.

Prednosti ultrazvočnih naprav za razgradnjo celic

Ultrazvočne naprave za razgradnjo celic se kot netoplotna, blaga, vendar zelo učinkovita tehnologija uporabljajo v laboratorijih in industriji za lizo celic in pridobivanje visokokakovostnih ekstraktov, ki se na primer uporabljajo za izolacijo molekul iz celičnih tovarn.

Močnostni ultrazvok za učinkovito razgradnjo mikrobnih celičnih tovarn

Mehanizem in učinki ultrazvočnih naprav za razgradnjo celic:
Ultrazvočna razgradnja celic izkorišča moč ultrazvočnih valov. Ultrazvočni homogenizator / naprava za razgradnjo celic je opremljen s sondo (imenovano tudi sonotroda) iz titanove zlitine, ki niha pri visoki frekvenci približno 20 kHz. To pomeni, da ultrazvočna sonda v tekočino, obdelovano s sonikacijo, sklopi 20.000 nihajev na sekundo. Za ultrazvočne valove, sklopljene v tekočino, so značilni izmenjujoči se cikli visokega / nizkega tlaka. Med ciklom nizkega tlaka se tekočina razširi in nastanejo drobni vakuumski mehurčki. Ti zelo majhni mehurčki rastejo skozi več izmenjujočih se tlačnih ciklov, dokler ne morejo več absorbirati dodatne energije. Takrat kavitacijski mehurčki silovito implodirajo in lokalno ustvarijo okolje z izjemno visoko energijsko gostoto. Ta pojav je znan kot akustična kavitacija, zanj pa so značilne lokalno zelo visoke temperature, zelo visoki tlaki in strižne sile. Te strižne napetosti učinkovito razbijajo celične stene in povečujejo prenos snovi med notranjostjo celice in okoliškim topilom. Kot povsem mehanska tehnika se ultrazvočno ustvarjene strižne sile široko uporabljajo in so priporočen postopek za razgradnjo bakterijskih celic ter izolacijo beljakovin. Sonikacija je kot preprosta in hitra metoda razgradnje celic idealna za izolacijo pri majhnih, srednjih in velikih prostorninah. Digitalne ultrazvočne naprave Hielscher so opremljene s preglednim menijem nastavitev za natančen nadzor sonikacije. Vsi podatki o sonikaciji se samodejno shranijo na vgrajeno kartico SD in so preprosto dostopni. Napredne možnosti odvajanja toplote, kot so zunanje hlajenje, sonikacija v pulznem načinu itd., med ultrazvočno razgradnjo zagotavljajo vzdrževanje idealne procesne temperature in s tem ohranitev nepoškodovanosti ekstrahiranih toplotno občutljivih spojin.

Raziskave poudarjajo prednosti ultrazvočne razgradnje celic in ekstrakcije

Prof. Chemat in sod. (2017) v svoji študiji povzemajo, da je »ekstrakcija s pomočjo ultrazvoka okolju prijazna in ekonomsko izvedljiva alternativa običajnim tehnikam za živila in naravne izdelke. Glavne prednosti so skrajšanje časa ekstrakcije in obdelave, zmanjšanje količine porabljene energije in topil, števila enotskih operacij ter emisij CO₂ «.
Gabig-Ciminska in sod. (2014) so v svoji študiji za lizo spor za sproščanje DNA uporabili visokotlačni homogenizator in ultrazvočno napravo za razgradnjo celic. Raziskovalna skupina je ob primerjavi obeh metod razgradnje celic glede lize celic za pridobivanje DNA iz spor sklenila: »Analiza je bila izvedena z uporabo celičnih lizatov, pridobljenih z visokotlačno homogenizacijo. Pozneje smo ugotovili, da ima ultrazvočna razgradnja celic za ta namen izjemne prednosti. Je precej hitra in jo je mogoče uporabiti pri majhnih prostorninah vzorcev.« (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekule iz celičnih tovarn za proizvodnjo živil

Mikrobne celične tovarne so izvedljiva in učinkovita proizvodna metoda, pri kateri se mikrobni organizmi uporabljajo za doseganje visokih izkoristkov naravnih in tujih metabolitov z metaboličnim bioinženirstvom mikroorganizmov, kot so bakterije, kvasovke, glive itd. Encime v velikih količinah na primer proizvajajo z uporabo mikroorganizmov, kot so Aspergillus oryzae, glive in bakterije. Ti encimi se uporabljajo za proizvodnjo živil in pijač ter v kmetijstvu, bioenergetiki in negi gospodinjstva.
Nekatere bakterije, kot sta Acetobacter xylinum in Gluconacetobacter xylinus, med fermentacijo proizvajajo celulozo, pri čemer se nanovlakna sintetizirajo po postopku od spodaj navzgor. Bakterijska celuloza (znana tudi kot mikrobna celuloza) je kemično enakovredna rastlinski celulozi, vendar ima visoko stopnjo kristaliničnosti in visoko čistost (brez lignina, hemiceluloze, pektina in drugih biogenih sestavin) ter edinstveno strukturo tridimenzionalne (3D) mreže, prepletene iz celuloznih nanovlaken. (cf. Zhong, 2020) V primerjavi s celulozo rastlinskega izvora je bakterijska celuloza bolj trajnostna, proizvedena celuloza pa je čista in ne zahteva zapletenih korakov čiščenja. Sonikacija in ekstrakcija s topilom z uporabo NaOH ali SDS (natrijevega dodecil sulfata) sta zelo učinkoviti za izolacijo bakterijske celuloze iz bakterijskih celic.

Biomolekule iz celičnih tovarn za proizvodnjo farmacevtskih izdelkov in cepiv

Eden najpomembnejših farmacevtskih izdelkov, pridobljenih iz celičnih tovarn, je humani inzulin. Za proizvodnjo inzulina z bioinženirstvom se uporabljata predvsem E. coli in Saccharomyces cerevisiae. Ker imajo biosintetizirane molekule nanometrskih velikosti visoko biokompatibilnost, so biološki nanodelci, kot je feritin, koristni za številne uporabe v bioproizvodnji. Poleg tega je proizvodnja v mikroorganizmih, spremenjenih z metaboličnim inženirstvom, pogosto bistveno učinkovitejša glede doseženih izkoristkov. Proizvodnja artemizininske kisline, resveratrola in likopena se je na primer povečala od desetkrat do več stokrat in je že uveljavljena v industrijskem merilu ali pa se za to merilo razvija. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Na primer, biomolekule nanometrskih velikosti na osnovi beljakovin z lastnostmi samosestavljanja, kot so feritin in virusom podobni delci, so posebej zanimive za razvoj cepiv, saj posnemajo tako velikost kot strukturo patogenov in omogočajo konjugacijo antigenov na površini za spodbujanje interakcije z imunskimi celicami. Takšne molekule se izražajo v tako imenovanih celičnih tovarnah (npr. inženirsko spremenjenih sevih E. coli), ki proizvajajo določeno ciljno molekulo.

Protokol za ultrazvočno lizo E. coli BL21 za sproščanje feritina

Feritin je beljakovina, katere glavna funkcija je shranjevanje železa. Feritin kaže obetavne možnosti uporabe v obliki samosestavljajočih se nanodelcev v cepivih, kjer se uporablja kot dostavni nosilec cepiva (npr. koničastih beljakovin SARS-Cov-2). Znanstvena raziskava Sun in sod. (2016) kaže, da je mogoče rekombinantni feritin sprostiti iz Escherichia coli v topni obliki pri nizkih koncentracijah NaCl (≤50 mmol/L). Za izražanje feritina v E. coli BL21 in njegovo sproščanje so uspešno uporabili naslednji protokol. Rekombinantni plazmid pET-28a/ferritin so s transformacijo vnesli v sev E coli BL21 (DE3). Celice E coli BL21 (DE3), ki izražajo feritin, so gojili v gojišču LB z 0,5% kanamicina pri 37°C in pri OD600 0,6 inducirali z 0,4% izopropil-β-D-tiogalaktopiranozida za 3 ure pri 37°C. Končno kulturo so nato pobrali s centrifugiranjem pri 8000g za 10 minut pri 4°C in zbrali sediment. Nato so sediment resuspendirali v gojišču LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% kvasnega ekstrakta)/pufru za lizo (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) oziroma v raztopinah NaCl različnih koncentracij (0, 50, 100, 170 in 300 mmol/L). Za lizo bakterijskih celic so uporabili sonikacijo v pulznem načinu: npr. z uporabo ultrazvočne naprave UP400St pri 100% amplitudi z delovnim ciklom 5 sekund VKLOPLJENO, 10 sekund IZKLOPLJENO, za 40 ciklov), nato pa centrifugirali pri 10 000g za 15 minut pri 4°C. Supernatant in oborino so analizirali z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu z natrijevim dodecil sulfatom (SDS-PAGE). Vse gele, obarvane z natrijevim dodecil sulfatom, so skenirali s skenerjem visoke ločljivosti. Slike gelov so analizirali s programsko opremo Magic Chemi 1D. Za optimalno razločnost so beljakovinske pasove zaznavali s prilagajanjem parametrov. Podatke za pasove so pridobili iz treh tehničnih ponovitev. (cf. Sun et al., 2016)

Ultrazvočne naprave za razgradnjo celic za industrijsko lizo celičnih tovarn

Ultrazvočna liza in ekstrakcija sta zanesljiva in priročna metoda za sproščanje metabolitov iz celičnih tovarn, s čimer podpirata učinkovito proizvodnjo ciljnih molekul. Ultrazvočne naprave za razgradnjo celic so na voljo v velikostih od laboratorijskih do industrijskih, procese pa je mogoče povečati povsem linearno.
Hielscher Ultrasonics je vaš strokovno usposobljeni partner za visokozmogljive ultrazvočne naprave za razgradnjo celic in ima dolgoletne izkušnje z vgradnjo ultrazvočnih sistemov v namizne in industrijske postavitve.
Sistemi za razgradnjo celic Hielscher Ultrasonics z napredno strojno in programsko opremo izpolnjujejo vse zahteve za optimalen nadzor procesa, preprosto upravljanje in prijaznost do uporabnika. Kupci in uporabniki ultrazvočnih naprav Hielscher cenijo prednost, da ultrazvočne naprave za razgradnjo celic in ekstraktorji Hielscher omogočajo natančno spremljanje in nadzor procesa – prek digitalnega zaslona na dotik in daljinskega upravljanja v brskalniku. Vsi pomembni podatki o sonikaciji (npr. neto energija, skupna energija, amplituda, trajanje, temperatura, tlak) se samodejno shranijo kot datoteka CSV na vgrajeno kartico SD. To pomaga doseči obnovljive in ponovljive rezultate ter olajša standardizacijo procesa in izpolnjevanje zahtev dobre proizvodne prakse (cGMP).
Ultrazvočni procesorji Hielscher so seveda izdelani za delovanje 24/7 pri polni obremenitvi, zato lahko zanesljivo delujejo v industrijskem proizvodnem okolju. Zaradi visoke robustnosti in majhnih potreb po vzdrževanju je čas izpada ultrazvočne opreme res kratek. Funkciji CIP (čiščenje na mestu) in SIP (sterilizacija na mestu) zmanjšujeta potrebo po zamudnem čiščenju, zlasti ker imajo vsi deli v stiku s tekočino gladke kovinske površine (brez skritih odprtin ali šob).

Spodnja tabela prikazuje okvirno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih naprav: