Ultrazvočno striženje DNK

Med striženjem DNK in RNA se dolge molekule DNK razčlenijo na manjše koščke, kar je ključni korak pri pripravi vzorcev za gradnjo knjižnice za sekvenciranje naslednje generacije (NGS). Ultrazvočno striženje DNK uporablja akustične kavitacijske sile za razbijanje DNK ali RNA na fragmente v razponu od 100 bp do 5 kb. Ta metoda omogoča natančen nadzor nad velikostjo fragmentov, kar olajša prilagajanje želeni dolžini DNK za optimalne rezultate zaporedja.

Striženje DNK z uporabo ultrasonication

Hielscher Ultrasonics ponuja različne ultrazvočne rešitve za striženje DNA, RNA in kromatina. Izbirate lahko med ultrazvočnimi aparati tipa sonde (npr. UP100H) za neposredno ultrazvočno razbijanje z uporabo mikrokonice ali uporabite VialTweeeter ali ultrazvočni cuphorn za posredno pripravo DNK različnih vzorcev hkrati. Hielscher ponuja idealno napravo glede na vaše potrebe: če imate 1 ali do 10 vzorcev, prostornine od mikrolitrov do litrov – Hielscher sonicatorji bodo izpolnili vaše zahteve za pripravo fragmentov DNA, RNA in kromatina na pravi dolžini. Ponovljivost, enostavno upravljanje in natančen nadzor omogočajo zanesljivo knjižnico za zaporedje naslednje generacije.
V nasprotju z encimsko fragmentacijo DNA, ultrazvočno striženje uporablja čiste mehanske strižne sile brez dodajanja kemikalij. Z natančno nastavitvijo procesnih parametrov ultrazvočno striženje proizvaja fragmente DNK z visoko molekulsko maso (plazmidna in genomska DNA).
Prečiščene nukleinske kisline se lahko povečajo pred ali po koraku fragmentacije.
Parametre ultrazvočnega razbijanja (moč, impulzni cikel / izbruhi, čas in temperatura) je mogoče varno nadzorovati z nastavitvami programske opreme.

Protokoli za ultrazvočno striženje DNK

za preskus imunoprecipitacije kromatina

Na kratko, celice so bile prevlečene v posode s premerom 60 mm (400.000 na posodo) in transfekirane z RhoA siRNA (kot je opisano); po 72 urah so jih inkubirali s formaldehidom (končna koncentracija, 1%) 10 minut pri 37 °C, da bi nanizno povezali beljakovine z DNK. Reakcija navzkrižnega povezovanja je bila ugasnjena z dodatkom ene desetine volumna 1,25 mol/l glicina, kar je dalo končno koncentracijo 125 mmol/l. Celice so dvakrat sprali z ledeno hladnim PBS, resuspendirali v pufru za radioimunoprecipitacijo [150 mmol/l NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksiholata, 0,1% SDS, 5 mmol/l EDTA, 50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,0)], ki je vseboval 1 mmol/l fenilmetilsulfonil fluorida, 1 Ag/ml aprotinina in 1 Ag/ml pepstatina A, in hranili na ledu 30 minut. Nato so celične lizate sonikirali na ledu z Hielscher UP200S ultrazvočni zvočnik (3 x 40 s, amplituda 40%, 1. cikel; Hielscher Ultrasonics GmbH), dokler niso bili striženi namreženi kromatini, da bi dobili fragmente DNK med 200 in 1.000 bp. Desetina celotnega lizata je bila uporabljena za kvantifikacijo količine DNK, ki je prisotna v različnih vzorcih in se je štela za “skupna vhodna DNK”. Supernatanti so bili inkubirani z lososovo spermo DNA/beljakovinsko agarozo-50% gnojevko, da bi zmanjšali nespecifično ozadje. Imunoprecipitacija je bila nato opravljena čez noč pri 4 °C s 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) ali brez protiteles (negativna kontrola). Te supernatante so dopolnili s 5 mol / L NaCl in segreli čez noč pri 65 ° C, da bi povrnili navzkrižne povezave protein-DNA. Imunokompleksi so bili nadalje obdelani z proteinazo K brez DNaze in RNaze, DNA pa je bila prečiščena z ekstrakcijo fenola / kloroforma in obarjanjem etanola. PCR je bil opravljen s specifičnimi primerji, ki ustrezajo zaporedju znotraj promotorske regije človeškega gena iNOS (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Študije izražanja EGFP

Za študije ekspresije je bil rekombinantni sev L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Nemčija) z genom za EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), integriran kromosomski ssu, gojen v različnih medijih, kot je opisano prej, in dodatno dopolnjen s 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Nemčija). Med gojenjem so odvzeli 1 ml vzorcev, centrifugirali (2000 × g, 20 °C, 10 min) in sprali z 0,9% raztopino NaCl. Pelet je bil resuspendiran v pufru (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) in razpadel s sonifikacijo z ultrazvočnim procesorjem UP400S (uporaba energije ∼ 400 Ws). Ostanke celic so odstranili s centrifugiranjem (6000 × g, 4 °C, 5 min) in analizirali z elektroforezo natrijevega dodecil sulfata in poliakrilamidnega gela (SDS-PAGE) v reducijskih pogojih po metodi Laemmlija (1970) z 12,5% poliakralamidnimi geli. Izražanje EGFP so preučevali v vznemirjeni kulturi. (Fritsche et al. 2007)

Kromatinska imunoprecipitacija

Test imunoprecipitacije kromatina je bil izveden z uporabo ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca z nekaterimi spremembami. Na kratko, diferencirani človeški podociti so bili 10 minut pri sobni temperaturi zamreženi z 1% formaldehidom. Celice so bile sprane z ledeno hladnim PBS in reakcija fiksacije je bila ustavljena z dodajanjem 0,125 M glicina za 5 minut pri sobni temperaturi. Celice so bile ponovno oprane z ledeno hladnim PBS in strgane iz posode. Celice so bile peletirane s centrifugiranjem in resuspendirane v pufru za lizo. Po centrifugiranju so bila peletirana jedra resuspendirana v strižnem pufru, inkubirana na ledu 30 minut, kromatin pa je bil strižen z ultrazvočnim razbijanjem, npr. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Nemčija) pri 25% moči 5 impulzov po 20 sekund na ledu v delce približno 200–600 bp. Striženi kromatin je bil nato centrifugiran in zbran supernatant. Za imunoprecipitacije je bilo 60 μl kromatina inkubirano z 1 μg protiteles Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ZDA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) ali NF-κB p50 (Abcam) ali z zajčjim IgG (Zymed Laboratories) kot negativno kontrolo, čez noč pri 4 °C z rahlim vrtenjem. Imunokompleksi, vezani na magnetne kroglice, so bili zbrani z magnetnim stojalom, obsežno oprani, navzkrižne povezave beljakovin / DNA pa so bile obrnjene in DNK eluirana za analizo PCR v realnem času. (Ristola et al. 2009)

Priprava DNK EHEC za analizo čipov

Razporeditev celičnih lizatov in ekstrahiranih DNK
Bakterijske pelete, suspendirane v PBS do želene končne koncentracije, so bile obdelane z ultrazvočni motilec UP100H (Hielscher GmbH, Nemčija) opremljen z mikrokonico MS1 (premer 1 mm). Delovna frekvenca je bila 30 kHz, efektivna izhodna moč pa 100 W. Med operacijo so vzorce ohladili v ledeno-vodni kopeli, zmešali in centrifugirali. Vzorci so bili uporabljeni za študije pretočne citometrije, za kasnejšo obdelavo pa so bili vzorci toplotno obdelani (95 °C, 5 min). Surovi celični lizati so bili obdelani z mešanico fenola: kloroforma, izoamil alkohola (25: 24: 1). Enak volumen te mešanice je bil dodan vzorcu lizata, raztopina je bila močno vrtinčana 15 s in centrifugirana pri 15.000 x g 2 minuti pri sobni temperaturi (RT) okoli 22 °C. Zgornja vodna faza, ki vsebuje genomsko DNK, je bila skrbno ločena in zbrana v novi sterilni Eppendorfovi cevi.
Nato so bili vzorci sonikirani, da bi fragmentirali DNK. Korak ultrazvočnega razbijanja je bil izveden v enakih pogojih, kot je opisano zgoraj. Za oceno učinkov fragmentacije na genomsko DNK so bili vzorci analizirani z uporabo elektroforeze v agaroznem gelu.
(…) Vzorci, ki so bili predhodno soničeni 2,5 minute, so bili po toplotni obdelavi in centrifugiranju podvrženi fazi ekstrakcije. Sproščena DNK je bila dvakrat ekstrahirana z mešanico fenola: kloroforma: izoamil alkohola, nato pa je bila izpostavljena drugi ultrazvočni obdelavi 0 - 15 minut. Elektroforeza agaroznega gela je bila uporabljena za določanje velikostne porazdelitve DNK, ki je bila podvržena ultrazvočni fragmentaciji po ekstrakciji (sl. v zgornjem desnem kotu). Zelo fragmentirana DNK je bila očitna iz prisotnosti brisa DNK in ne pasov z visoko molekulsko maso, ki so bili izločeni iz vzorcev, soniziranih 2,5 minute ali dlje. Daljše ultrazvočno razbijanje je postopoma zmanjšalo dolžino fragmentov na približno 150 - 600 bp, ultrazvočno razbijanje pa je 15 minut še dodatno razgradilo te fragmente, kar je razvidno predvsem iz zgornjega dela brisa. Tako se je povprečna velikost fragmentov DNK postopoma zmanjševala s časom ultrazvočne obdelave, 5-minutno zdravljenje pa je omogočilo pridobitev velikosti fragmentov DNA, ki so najprimernejši za teste čipov. Končno je bil vzpostavljen postopek priprave analita DNA, ki je obsegal prvi 2 minuti ultrazvočne obdelave, ekstrakcijo DNA (2×) in nato 5 minutno ultrazvočno obdelavo. (Basselet et al. 2008)

Kromatinska imunoprecipitacija (ChIP)

Celice HEK293 so kultivirali, kot je opisano zgoraj, in fiksirali z 2 mM disuccinimidil-glutaratom 45 minut pri sobni temperaturi. Nato so celice dvakrat oprali s PBS. Kromatin je bil 10 minut namrežen pri sobni temperaturi z uporabo 1% (v/v) formaldehida in dvakrat opran z ledeno hladnim PBS. Reakcijo navzkrižnega povezovanja so ustavili z inkubacijo z glicinom pri končni koncentraciji 0,125 M za 5 minut pri sobni temperaturi. Po inkubaciji s tripsinom so celice strgali iz posode za celične kulture in jih dvakrat sprali s PBS. Celična peleta je bila resuspendirana v pufru za lizo (5 mM cevi, pH 8,0, 85 mM KCl in 0,5% (v / v) Nonidet P-40), inkubirana na ledu 10 minut in homogenizirana z Dounce homogenizatorjem. Nato so bila jedra peletirana s centrifugiranjem (3500 x g, 5 min, 4 °C) in resuspendirana v pufru jeder (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA in 1% (m/v) SDS). Jedra so bila motena s ultrazvočno razbijanjem s tremi 20-sekundnimi impulzi v Zvočnik UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) pri nastavitvi cikla 0,5 in amplitude 30%, ki daje fragmente genomske DNA z velikostjo 200 - 1000 bp. Za ChIP je bilo 50 g DNA 4-krat razredčeno v imunoprecipitacijskem pufru (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v / v) Triton X-100 in 0,01% (w / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analiza modifikacije histona z imunoprecipitacijo kromatina (ChIP)

Na kratko, 6 x 10⁶ celice so dvakrat sprali s PBS in jih 15 minut premreželi na plošči za kulturo pri sobni temperaturi v prisotnosti 0,5% formaldehida. Reakcija navzkrižnega povezovanja je bila ustavljena z dodajanjem 0,125 M glicina. Vsi nadaljnji koraki so bili izvedeni pri 48 °C. Vsi pufri so bili predhodno ohlajeni in so vsebovali zaviralce proteaze (Complete Mini, Roche). Celice so bile dvakrat oprane s PBS in nato strgane. Zbrane pelete smo raztopili v 1 ml pufra za lizo (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) in jih sonikirali v hladni etanolni kopeli za 10 ciklov pri 100% amplitudi z uporabo Zvočnik UP50H (Hielscher, Teltow, Nemčija). Fragmentacija kromatina je bila vizualizirana v 1% agaroznem gelu. Dobljeni fragmenti so bili v območju 200–500 pb. Topni kromatin smo dobili s centrifugiranjem ultrazvočnih vzorcev pri 14.000 g 10 minut pri 48 °C. Topna frakcija je bila razredčena 1/10 v pufru za redčenje (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), nato alikvotirana in shranjena pri 80 °C do uporabe. (Rodriguez et al. 2008)