Ultrazvočni DNK Rezalni

• Med omejevanjem DNK in RNK se molekule DNK razčlenijo na manjše kose. DNA / RNA fragmentacija je eden od pomembnih korakov priprave vzorca, potrebnih za ustvarjanje knjižnic za zaporedje naslednje generacije (NGS).
• Ultrazvočni DNK striženje uporabi sile akustične kavitacije prekiniti DNA ali RNA v kosih 100 – 5KB bp.
• Ultrazvočne striženje omogoča natančno fragmentacijo DNA in Prilagojeno želene dolžine DNA.

DNA shearing z ultrasonication

Hielscher Ultrazvočna ponuja številne na osnovi ultrazvočnih rešitve za DNA, RNA in kromatina striženje. Izbirate lahko med sondo tipa ultrasonicators a (npr UP100H) za neposredno sonifikacijo ob uporabi microtip, ali uporabiti VialTweeeter ali ultrazvočni cuphorn za posredno pripravo DNA različnih vzorcev hkrati. Hielscher ponuja idealno napravo upoštevamo vaše potrebe: vreme imate 1 ali največ do 10 vzorcev, količine iz mikrolitral do litra – Hielscher ultrazvočni procesorji so na voljo, da ustrezajo vašim zahtevam za pripravo DNA, RNA in kromatina fragmentov na pravo dolžino. Obnovljivost, enostavno upravljanje in natančno krmiljenje omogočajo zanesljivo knjižnici za naslednje generacije zaporedja.
V nasprotju z encimsko fragmentiranje DNA, ultrazvočni striženje uporablja čiste mehanske strižne sile brez dodajanja kemikalij. Z natančno nastavitev procesnih parametrov, ultrazvočni striženje proizvaja visoko molekulsko fragmente masa DNA (plazmid in genomske DNA).
Očiščene nukleinske kisline lahko pomnožimo pred ali po koraku razdrobljenost.
Parametri sonifikacijo (moč, pulz ciklus / poruši, čas in temperatura) se lahko varno krmili prek nastavitev programske opreme.

Protokoli za ultrazvočno DNA Rezanje

Za Kromatin imuno Vsebnost

Na kratko, celice smo posodili v posodah s premerom 60 mm (400.000 na posodo) in transfigurirali s siRNA RhoA (kot je opisano); Po 72 urah smo jih inkubirali s formaldehidom (končna koncentracija, 1%) 10 min pri 37 ° C, da smo povezali proteine ​​z DNA. Reakcijo navzkrižne zveze smo pogasili z dodatkom ene desetine prostornine 1,25 mol / L glicina in dobili 125 mmol / L končno koncentracijo. Celice smo dvakrat sprali z ledeno hladnim PBS, ponovno suspendirali v pufru za radioimmunoprecipitacijo [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksiholat, 0,1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl )], ki vsebuje 1 mmol / L fenilmetilsulfonil fluorida, 1 Ag / ml aprotinina in 1 Ag / ml pepstatina A in se 30 minut hrani na ledu. Potem so celični lizati sonicirali na ledu z Hielscher UP200S ultrazvok ultrazvočne naprave (3 x 40 s, amplituda 40%, ciklus 1; Hielscher Ultrazvočna GmbH), dokler zamreženih chromatins so narezal dobimo DNA fragmente med 200 in 1000 bp. Ena desetina celotne lizata smo uporabili za kvantitativno vsebnosti prisotne DNA v različnih vzorcih in velja “Skupni vnos DNA”. Supernatante smo inkubirali z DNA lososove sperme / proteina agaroze-50% suspenziji za zmanjšanje nespecifične ozadje. Imunoprecipitacije smo nato naredili preko noči pri 4 ° C s 5 Ag anti-NF-NB p65 (podeželju) ali brez protitelesa (negativna kontrola). Te Supernatante smo dopolnili s 5 mol / l NaCl in segrevamo preko noči pri 65 ° C, da se vrne protein DNA navzkrižnih povezav. Imunokompleksov smo nadalje obdelali z DNase- in RNaze prosto proteinaze K, in DNA smo očistili s fenolom / ekstrakcijo s kloroformom in obarjanjem z etanolom. PCR smo izvedli s posebnimi primerji, ki ustreza zaporedju v promotorski regiji človeškega iNOS gena (P1 premaz: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 premaz: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier sod., 2008)

Študije EGFP-izrazom

Za ekspresijo študijah rekombinantnega seva L. tarentolae P10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Nemčija) z genom za EGFP (Enhanced zeleni fluorescentni protein), kromosomsko ssu integrirano, gojimo v različnih medijih, kot je predhodno opisano in dodatno dopolnili s 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Biološka znanost, Nemčija). Med gojenjem, so bili 1 ml vzorce centrifugirali (2000 x g, 20 ° C, 10 min) in izperemo z 0,9% raztopino NaCl. Pelet smo resuspendirali v pufru (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) in dezintegrira z ultrazvočnim razbijanjem s ultrazvočno procesor UP400S (Uporaba energije ~ 400 Ws). Celični ostanki so bili odstranjeni s centrifugiranjem (6000 x g, 4 ° C, 5 min) in analizirali z natrijevim dodecil sulfatom - poliakrilamidnem gelu z elektroforezo (SDS-PAGE) pod redukcijskimi pogoji po metodi Laemmli (1970) z 12,5% polyacralamide geli . EGFP-izraz je bila preučena v mešanem kulturi. (Fritsche in sod. 2007)

kromatin imuno

kromatin imunoprecipitacije Test smo izvedli z uporabo čipa-IT^Tm Express (Active Motiv, Carlsbad, CA, ZDA) po navodilih proizvajalca z nekaterimi spremembami. Na kratko, diferencirane človeški podocytes so zamrežen z 1% formaldehida 10 minut pri sobni temperaturi. Celice smo sprali z ledeno mrzlo PBS in fiksiranje Reakcijo smo prekinili z dodatkom 0,125 M glicin 5 minut pri sobni temperaturi. Celice smo ponovno izprali z ledeno mrzlo PBS in postrgamo iz posode. Celice smo peletirani s centrifugiranjem in ponovno suspendirali v pufru za lizo. Po centrifugiranju smo peletirani jedra resuspendirali v rezalnem pufru, inkubirali na ledu 30 minut in kromatin je narezal s sonikacijo, npr UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Nemčija) pri 25% moči 5 impulzov po 20 sek na ledu v fragmente približno 200-600 bp. Centrirali smo šaržni kromatin in odvzeli supernatant. Za imunoprecipitacije je bilo 60 μl kromatina inkubirano z 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ZDA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) ali protiteles NF-κB p50 (Abcam) ali z zajcem IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, ZDA), kot negativen nadzor, čez noč pri 4 ° C z nežno rotacijo. Imunokompleksi, vezani na magnetne kroglice, so bili zbrani z magnetnim stojalom, veliko oprali, proteini in DNA pa so bili preusmerjeni in DNA eluirani za PCR analizo v realnem času. (Ristola in sodelavci 2009)

EHEC priprava DNK za analizo čip diod

Razporeditev celičnih lizatov in ekstrahiramo DNA
Bakterijske pelete suspendirane v PBS do želene končne koncentracije smo obdelali z Ultrazvok motnje UP100H (Hielscher GmbH, Nemčija), opremljen z mikrotipom MS1 (premer 1 mm). Delovna frekvenca je bila 30 kHz, efektivna izhodna moč pa je bila 100 W. Med delovanjem so bili vzorci ohlajeni v ledeni kopeli, mešani in centrifugirani. Vzorce smo uporabili za študije pretočne citometrije, za kasnejše ravnanje pa smo vzorce izpostavili toplotni obdelavi (95 ° C, 5 min). Surove celične lizate smo obdelali z mešanico fenola: kloroforma: izoamil alkohola (25: 24: 1). Enak volumen te mešanice smo dodali vzorcu lizata, raztopino močno vdihnili 15 s in centrifugirali pri 15000 xg 2 minuti pri sobni temperaturi (RT) okoli 22 ° C. Topno vodno fazo, ki vsebuje genomsko DNA, smo skrbno ločili in zbrali v novi sterilni eppendorfski cevki.
Nato so bili vzorci sonicated za fragmentiranje DNA. Stopnja sonikacije je bila izvedena v enakih pogojih kot je opisano zgoraj. Da bi ocenili učinke drobljenja na genomsko DNA, smo vzorce analizirali z uporabo elektroforeze agaroznega gela.
(…) Vzorce, ki so bile predhodno sončene v teku 2,5 min, so bile po toplotni obdelavi in ​​centrifugiranju podvržene ekstrakcijskemu koraku. Izpuščena DNA dvakrat ekstrahiramo z mešanico fenol: kloroform: izoamil alkohol in nato izpostavimo drugi sonikaciji za 0-15 min. Elektroforezo agaroznega gela je bila uporabljena za določitev porazdelitve velikosti DNA, izpostavljene ultrazvočni fragmentaciji po ekstrakciji (slika na zgornji desni strani). Visoko razdrobljena DNK je bila očitna zaradi prisotnosti DNA smeara in ne pasov z visoko molekularno težo, ki so bili odstranjeni iz vzorcev sonicated 2,5 min ali več. Daljša sonikacija postopoma zmanjšuje dolžine fragmentov na približno 150-600 bp, sonication pa 15 min, še bolj pa jih degradira, kar lahko vidimo predvsem z zgornjim delom brisov. Tako se je povprečna velikost fragmenta DNA postopno znižala z ultrazvočnim časom in 5-minutno obdelavo, ki je omogočila pridobivanje velikosti fragmentov DNA, ki so najbolj primerni za teste matrične matrike. Končno je bil pripravljen postopek priprave DNK analize, ki obsega prvi 2 min ultrazvočne obdelave, ekstrakcijo DNK (2 x) in nadaljnjo 5-minutno sonikacijo. (Basselet et al., 2008)

Kromatin imunoprecipitacije (chip)

Celice HEK293 smo kultivirali, kot je opisano zgoraj, in fiksirali z 2 mM disukcinimidil-glutaratom 45 minut pri sobni temperaturi. Kasneje smo celice sprali dvakrat s PBS. Kromatin smo 10 minut zamenjali pri sobni temperaturi z 1% (v / v) formaldehidom in dvakrat sprali z ledeno hladnim PBS. Reakcijo navzkrižne povezave smo prekinili z inkubacijo z glicinom pri končni koncentraciji 0,125 M 5 minut pri sobni temperaturi. Po inkubaciji s tripsinom smo celice očistili iz celične kulture in dvakrat sprali s PBS. Celični pelet je bil resuspendiran v liznem pufru (5 mM Cevi, pH 8,0, 85 mM KCl in 0,5% (v / v) Nonidet P-40), inkubiran na ledu 10 minut in homogeniziran z homogenizatorjem Dounce. Kasneje so jedra peletirali s centrifugiranjem (3500 xg, 5 min, 4 ° C) in resuspendirali v jedrskem pufru (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA in 1% (m / v) SDS). Nukleus je prekinil soniciranje s tremi 20-ih impulzov v a UP50H ultrazvočne (Hielscher Ultraschall Technologie) pri nastavitvi cikla 0,5 in amplitudo 30%, pri čemer dobimo genomske DNA fragmentov z velikostjo razkladanjem 200 - 1000 bp. Za čip, je bila 50g DNA razredčimo 4-krat v imunoprecipitacije pufru (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCI, 1,2 mM EDTA, 1.1% (v / v) Triton X-100, in 0,01% (m / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analiza histon sprememba, ki jo kromatina imuno (chip)

Na kratko, 6 x 10⁶ celice dvakrat spiramo s PBS in prekrivamo povezavo na kulturo plošče 15 minut pri sobni temperaturi v prisotnosti 0,5% formaldehida. Reakcijo prekomepljenja smo ustavili z dodajanjem 0,125 M glicina. Vsi nadaljnji koraki so bili izvedeni pri 48 ° C. Vsi pufri so bili predhodno ohlajeni in vsebovali zaviralce proteaze (Complete Mini, Roche). Celice smo dvakrat izprali s PBS in nato stekli. Skupljene pelete smo raztopili v 1 ml puferu za lizo (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) in sonicirali v hladni etanolski kopeli 10 ciklov pri 100% amplitudi z uporabo UP50H ultrazvočne (Hielscher, Teltow, Nemčija). Kromatin razdrobljenost smo vizualizirali na 1% agaroznem gelu. Dobljeni delci so v 200-500pb območju. Topen kromatin dobimo s centrifugiranjem sonificiramo vzorce 14,000g 10 minut pri 48 ° C. Topni frakciji smo razredčili 1/10 v pufru za redčenje (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), nato smo razdelili in shranili pri 80 ° C do uporabe. (Rodriguez in sod. 2008)