Ultrazvočno striženje DNA

Pri striženju DNA in RNA se dolge molekule DNA fragmentirajo na manjše dele, kar je ključen korak pri pripravi vzorcev za izdelavo knjižnic za sekvenciranje naslednje generacije (NGS). Ultrazvočno striženje DNA uporablja sile akustične kavitacije za razgradnjo DNA ali RNA na fragmente velikosti od 100 bp do 5 kb. Ta metoda omogoča natančen nadzor velikosti fragmentov in prilagajanje želeni dolžini DNA za optimalne rezultate sekvenciranja.

Striženje DNA z ultrazvokom

Hielscher Ultrasonics ponuja različne ultrazvočne rešitve za striženje DNA, RNA in kromatina. Izberite sonikator s sondo (npr. UP100H) za neposredno sonikacijo z mikrokonico ali uporabite VialTweeeter oziroma ultrazvočni cuphorn za posredno pripravo DNA iz različnih vzorcev hkrati. Hielscher ponuja idealno napravo glede na vaše potrebe: ne glede na to, ali imate 1 ali do 10 vzorcev s prostorninami od mikrolitrov do litrov – sonikatorji Hielscher bodo izpolnili vaše zahteve za pripravo fragmentov DNA, RNA in kromatina ustrezne dolžine. Ponovljivost, preprosta uporaba in natančen nadzor omogočajo zanesljivo knjižnico za sekvenciranje naslednje generacije.
V nasprotju z encimsko fragmentacijo DNA ultrazvočno striženje uporablja izključno mehanske strižne sile brez dodajanja kakršnih koli kemikalij. Z natančno nastavitvijo procesnih parametrov ultrazvočno striženje ustvarja fragmente DNA z visoko molekulsko maso (plazmidna in genomska DNA).
Prečiščene nukleinske kisline je mogoče pomnožiti pred korakom fragmentacije ali po njem.
Parametre sonikacije (moč, pulzni cikel / nizi impulzov, čas in temperatura) je mogoče varno nadzorovati s programskimi nastavitvami.

Protokoli za ultrazvočno striženje DNA

Za test imunoprecipitacije kromatina

Na kratko, celice so nasadili v posodice s premerom 60mm (400.000 na posodico) in jih transficirali z RhoA siRNA (kot je opisano); po 72 h so jih inkubirali s formaldehidom (končna koncentracija, 1%) 10 min pri 37°C, da bi navzkrižno povezali beljakovine z DNA. Reakcijo navzkrižnega povezovanja so ustavili z dodatkom desetine prostornine glicina s koncentracijo 1,25 mol/L, s čimer so dosegli končno koncentracijo 125 mmol/L. Celice so dvakrat sprali z ledeno hladnim PBS, jih resuspendirali v pufru za radioimunoprecipitacijski test [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksiholata, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)], ki je vseboval 1 mmol/L fenilmetilsulfonil fluorida, 1 Ag/mL aprotinina in 1 Ag/mL pepstatina A, ter jih 30 min hranili na ledu. Nato so celične lizate na ledu sonicirali z napravo Hielscher UP200S za ultrazvočno sonikacijo (3 x 40 s, amplituda 40%, cikel 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), dokler niso navzkrižno povezanega kromatina razstrigli v fragmente DNA velikosti med 200 in 1.000 bp. Desetino celotnega lizata so uporabili za kvantifikacijo količine DNA v različnih vzorcih in jo obravnavali kot »celotno vhodno DNA«. Supernatante so inkubirali s 50% suspenzijo DNA iz semenčic lososa/beljakovinske agaroze, da bi zmanjšali nespecifično ozadje. Imunoprecipitacijo so nato izvedli čez noč pri 4°C s 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) ali brez protitelesa (negativna kontrola). Tem supernatantom so dodali 5 mol/L NaCl in jih čez noč segrevali pri 65°C, da bi razgradili navzkrižne povezave med beljakovinami in DNA. Imunske komplekse so dodatno obdelali s proteinazo K brez DNaz in RNaz, DNA pa so prečistili z ekstrakcijo s fenolom/kloroformom in obarjanjem z etanolom. PCR so izvedli s specifičnimi začetnimi oligonukleotidi, ki ustrezajo zaporedju znotraj promotorske regije človeškega gena iNOS (začetni oligonukleotid p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; začetni oligonukleotid p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Študije izražanja EGFP

Za študije izražanja so rekombinantni sev L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Nemčija) z genom za EGFP (izboljšani zeleni fluorescenčni protein), integriranim v kromosomsko mesto ssu, gojili v različnih gojiščih, kot je bilo opisano predhodno, in jim dodatno dodali nourseotricin v koncentraciji 100 mg l^-1 (Jena Bioscience, Nemčija). Med gojenjem so odvzeli vzorce po 1 ml, jih centrifugirali (2000 × g, 20°C, 10 min) in sprali z 0,9% raztopino NaCl. Usedlino so resuspendirali v pufru (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) in jo razgradili s sonikacijo z ultrazvočnim procesorjem UP400S (vnos energije ∼ 400 Ws). Celične ostanke so odstranili s centrifugiranjem (6000 × g, 4°C, 5 min) in jih analizirali z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu z natrijevim dodecilsulfatom (SDS-PAGE) v redukcijskih pogojih po metodi Laemmlija (1970) z 12,5% poliakrilamidnimi geli. Izražanje EGFP so preučevali v kulturi z mešanjem. (Fritsche et al. 2007)

Imunoprecipitacija kromatina

Test imunoprecipitacije kromatina so izvedli z uporabo kompleta ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, ZDA) po navodilih proizvajalca z nekaterimi spremembami. Na kratko, diferencirane človeške podocite so navzkrižno povezovali z 1% formaldehidom 10 min pri sobni temperaturi. Celice so sprali z ledeno hladnim PBS in reakcijo fiksacije ustavili z dodatkom 0,125 M glicina za 5 min pri sobni temperaturi. Celice so ponovno sprali z ledeno hladnim PBS in jih postrgali s posodice. Celice so s centrifugiranjem posedli in resuspendirali v liznem pufru. Po centrifugiranju so posedena jedra resuspendirali v pufru za striženje, jih 30 min inkubirali na ledu in kromatin razstrigli s sonikacijo, npr. z napravo UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Nemčija) pri 25% moči s 5 impulzi po 20 sec na ledu v fragmente velikosti približno 200–600 bp. Razstriženi kromatin so nato centrifugirali in zbrali supernatant. Za imunoprecipitacije so 60 μl kromatina inkubirali z 1 μg protiteles proti Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ZDA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Združeno kraljestvo) ali NF-κB p50 (Abcam) oziroma s kunčjim IgG (Zymed Laboratories) kot negativno kontrolo, čez noč pri 4°C ob nežnem vrtenju. Imunske komplekse, vezane na magnetne kroglice, so zbrali z magnetnim stojalom, jih temeljito sprali, razgradili navzkrižne povezave med beljakovinami in DNA ter eluirali DNA za analizo s PCR v realnem času. (Ristola et al. 2009)

Priprava DNA EHEC za analizo z mikromrežo na čipu

Priprava celičnih lizatov in ekstrahirane DNA
Bakterijske usedline, suspendirane v PBS do želene končne koncentracije, so obdelali z ultrazvočnim razgrajevalnikom UP100H (Hielscher GmbH, Nemčija), opremljenim z mikrokonico MS1 (premer 1mm). Delovna frekvenca je bila 30 kHz, efektivna izhodna moč pa 100 W. Med delovanjem so vzorce hladili v kopeli z ledom in vodo, jih mešali in centrifugirali. Vzorce so uporabili za študije pretočne citometrije, za nadaljnjo obdelavo pa so jih toplotno obdelali (95°C, 5 min). Surove celične lizate so obdelali z mešanico fenola:kloroforma:izoamilnega alkohola (25:24:1). Vzorcu lizata so dodali enako prostornino te mešanice, raztopino 15 s intenzivno mešali na vrtinčnem mešalniku in jo centrifugirali pri 15.000 x g 2 min pri sobni temperaturi (RT), približno 22°C. Zgornjo vodno fazo, ki je vsebovala genomsko DNA, so previdno ločili in zbrali v novi sterilni epruveti Eppendorf.
Nato so vzorce sonicirali, da bi fragmentirali DNA. Korak sonikacije so izvedli v enakih pogojih, kot so opisani zgoraj. Za oceno učinkov fragmentacije na genomsko DNA so vzorce analizirali z elektroforezo v agaroznem gelu.
(…) Vzorce, ki so jih predhodno sonicirali 2,5 min, so po toplotni obdelavi in centrifugiranju obdelali s korakom ekstrakcije. Sproščeno DNA so dvakrat ekstrahirali z mešanico fenola:kloroforma:izoamilnega alkohola in jo nato ponovno sonicirali 0 – 15 min. Za določitev porazdelitve velikosti DNA, ki je bila po ekstrakciji ultrazvočno fragmentirana, so uporabili elektroforezo v agaroznem gelu (slika zgoraj desno). Močno fragmentirana DNA je bila razvidna iz prisotnosti razmaza DNA namesto pasov z visoko molekulsko maso, ki so izginili iz vzorcev, soniciranih 2,5 min ali dlje. Daljša sonikacija je postopoma zmanjšala dolžine fragmentov na približno 150 – 600 bp, sonikacija 15 min pa je te fragmente še dodatno razgradila, kar je razvidno predvsem iz zgornjega dela razmaza. Povprečna velikost fragmentov DNA se je torej postopoma zmanjševala s časom ultrazvočne obdelave, obdelava 5 min pa je omogočila pridobitev velikosti fragmentov DNA, ki so najprimernejše za teste z mikromrežami na čipih. Nazadnje so določili postopek priprave analita DNA, ki vključuje najprej 2 min ultrazvočne obdelave, ekstrakcijo DNA (2×) in nato sonikacijo 5 min. (Basselet et al. 2008)

Imunoprecipitacija kromatina (ChIP)

Celice HEK293 so gojili, kot je opisano zgoraj, in jih fiksirali z 2 mM disukcinimidil glutarata 45 min pri sobni temperaturi. Nato so celice dvakrat sprali s PBS. Kromatin so navzkrižno povezovali 10 min pri sobni temperaturi z uporabo 1% (v/v) formaldehida in ga dvakrat sprali z ledeno hladnim PBS. Reakcijo navzkrižnega povezovanja so ustavili z inkubacijo z glicinom pri končni koncentraciji 0,125 M 5 min pri sobni temperaturi. Po inkubaciji s tripsinom so celice postrgali s posodice za celično kulturo in jih dvakrat sprali s PBS. Celično usedlino so resuspendirali v liznem pufru (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl in 0,5% (v/v) Nonidet P-40), jo 10 min inkubirali na ledu in homogenizirali s homogenizatorjem Dounce. Nato so jedra posedli s centrifugiranjem (3500 x g, 5 min, 4 °C) in jih resuspendirali v pufru za jedra (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA in 1% (w/v) SDS). Jedra so razgradili s sonikacijo s tremi 20-s impulzi z sonikatorjem UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) pri nastavitvi cikla 0,5 in amplitudi 30%, s čimer so dobili fragmente genomske DNA, ki so bili večinoma velikosti 200 – 1000 bp. Za ChIP so 50g DNA razredčili 4-krat v imunoprecipitacijskem pufru (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 in 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analiza modifikacij histonov z imunoprecipitacijo kromatina (ChIP)

Na kratko, 6 x 10⁶ celic so dvakrat sprali s PBS in jih na plošči za gojenje navzkrižno povezovali 15 min pri sobni temperaturi v prisotnosti 0,5% formaldehida. Reakcijo navzkrižnega povezovanja so ustavili z dodatkom 0,125 M glicina. Vse nadaljnje korake so izvedli pri 48°C. Vsi pufri so bili predhodno ohlajeni in so vsebovali zaviralce proteaz (Complete Mini, Roche). Celice so dvakrat sprali s PBS in jih nato postrgali. Zbrane usedline so raztopili v 1 ml liznega pufra (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) in jih sonicirali v hladni etanolni kopeli 10 ciklov pri 100% amplitudi z sonikatorjem UP50H (Hielscher, Teltow, Nemčija). Fragmentacijo kromatina so prikazali v 1% agaroznem gelu. Dobljeni fragmenti so bili v območju 200–500pb. Topni kromatin so pridobili s centrifugiranjem soniciranih vzorcev pri 14.000g 10 min pri 48°C. Topno frakcijo so razredčili v razmerju 1/10 v pufru za redčenje (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), jo nato razdelili na alikvote in do uporabe hranili pri 80°C. (Rodriguez et al. 2008)