Priprava plazmidov z ultrazvočno obdelavo

Ultrazvočna obdelava je zanesljiva tehnika za fragmentacijo plazmidne DNA. Natančno nastavljiva amplituda, pulzni način delovanja in nadzor temperature so najpomembnejše lastnosti ultrazvočne naprave za fragmentacijo plazmidov brez poškodb. Poleg tega uporaba določenih sredstev pomaga zaščititi plazmide pred razgradnjo. Hielscher Ultrasonics ponuja različne rešitve za nadzorovano fragmentacijo plazmidov v posameznih vialah, hkratno sonikacijo številnih vzorcev in obdelavo plošč z več vdolbinicami. Izvedite več o uspešni ultrazvočni fragmentaciji plazmidov!

Striženje plazmidov z ultrazvočno obdelavo

Ko so vzorci DNA izpostavljeni ultrazvočnim valovom, ultrazvočno ustvarjeni tresljaji v tekočini povzročijo akustično kavitacijo, ki z mehanskimi silami striže ali lomi molekule DNA z veliko molekulsko maso. Sonikacija je najpogosteje uporabljena metoda pri poskusih striženja DNA v večjih količinah, vključno z aplikacijami, kot je kromatinska imunoprecipitacija (ChIP), pri katerih so majhni fragmenti nujno potrebni za doseganje visoke ločljivosti. (prim. Tseng et al., 2012)
Plazmidna DNA (pDNA) je posebna oblika DNA, za katero je značilna obročasta oblika in ki jo najdemo v bakterijah in nekaterih evkariontih.
Superzvita pDNA je želena oblika plazmidne DNA, saj daje najboljše rezultate v nadaljnjih postopkih, kot sta avtomatizirano sekvenciranje in transfekcija. Ultrazvočna obdelava je primerna za uspešno fragmentacijo pDNA, vključno s superzvito pDNA.
Thompson et al. (2008) so pokazali, da je sonikacija plazmidov, za katero je znano, da fragmentira superzvito DNA, učinkovit način za izboljšanje dolžin odčitkov zaporedij s kakovostjo phred20 do te mere, da se ne razlikujejo bistveno od odčitkov kontrolne matrice podjetja Beckman Coulter ali encimsko lineariziranih plazmidov.

Uporaba plazmidnih vektorjev

Plazmidi se pogosto uporabljajo kot orodja za kloniranje, prenos in spreminjanje genov. Kadar se plazmidi v poskusih uporabljajo v te namene, jih imenujemo vektorji. Fragmente DNA ali gene je mogoče vstaviti v plazmidni vektor in tako ustvariti tako imenovani rekombinantni plazmid. Plazmidni vektorji se uporabljajo kot prenašalci za vnos rekombinantne DNA v gostiteljsko celico in so ključna sestavina molekulskega kloniranja.
“Nevirusni vektorji se obsežno preučujejo zaradi možnosti njihove uporabe v genskem zdravljenju različnih zapletenih bolezni. Nevirusni vektorji ščitijo plazmidno DNA pred fizikalno, kemično in encimsko razgradnjo ter dostavijo molekulo DNA na ciljno mesto. Kationski liposomi, hitozan in drugi pozitivno nabiti nanodelci na primer z elektrostatskimi interakcijami tvorijo komplekse s plazmidno DNA. Vendar so kompleksi kationskih liposomov/plazmidne DNA, ki zlahka nastanejo, razmeroma veliki (tj. 300–400 nm) in po svoji naravi heterogeni, kar otežuje njihovo uporabo v farmacevtskih aplikacijah. Velike in heterogene komplekse plazmidne DNA/liposomov, plazmidne DNA/aerosolov in plazmidne DNA/peptidov je mogoče z ultrazvočno obdelavo zmanjšati na manjše, homogene delce.” (Sarker et al., 2019)
Pomemben primer uporabe plazmidnih vektorjev je CRISPR–Cas9. Sistem CRISPR–Cas9 se v celice običajno vnese kot en sam velik plazmid ali več manjših plazmidov, ki kodirajo ciljno zaporedje, vodilo CRISPR in Cas9.

Ultrazvočna priprava nanodelcev PLGA z vključeno DNA z nanoprecipitacijo

Jo et al. (2020) so uporabili poli(mlečno-ko-glikolno kislino) (PLGA) za tvorbo nanodelčnega nosilca za dostavo modelnega plazmida CRISPR–Cas9 v primarne makrofage, pridobljene iz kostnega mozga. Za nanoprecipitacijo nanodelcev PLGA so uporabili PLGA z dvema različnima končnima skupinama (estrsko in aminsko skupino), da bi pozitivno nabite aminske končne skupine povečale učinkovitost enkapsulacije in vsebnost vključene DNA zaradi interakcij med njihovim nabojem in negativno nabitim ogrodjem DNA. V 50 mL polipropilenski konični centrifugirki so z vrtinčnim mešanjem raztopili 100 mg Pluronic F127 v 20 mL avtoklavirane deionizirane vode, čemur je sledilo 30 min blage sonikacije v ultrazvočni kopeli (glejte CupHorn). Dodali so avtoklavirano magnetno mešalno paličico in raztopino mešali pri 600 RPM 30 min, medtem ko so pripravljali druge raztopine. Ves čas so namesto steklenega uporabljali plastični laboratorijski pribor, da bi čim bolj zmanjšali nespecifično adsorpcijo DNA. Ločeno so pripravili raztopino PLGA v DMF (44,48 mg/ ml) in raztopino TIPS pentacena v THF (0,667 mg/ml). PLGA so pustili 30 min mirovati v DMF, da se je omočil, nato pa so ga sonikirali 30 min. (za celoten protokol glejte Jo et al., 2020)

Zaščita plazmidne DNA med sonikacijo

DNA, vključno s plazmidi in superzvitimi plazmidi, je zelo občutljiva za razgradnjo. Vse razpoložljive metode fragmentacije imajo določene znane pomanjkljivosti. Ultrazvočna fragmentacija DNA je ena od prednostnih metod, saj nadzorovana sonikacija v kombinaciji z zaščitnimi ukrepi omogoča zmanjšanje poškodb verig DNA zaradi striga in toplote.
Poleg nastavitev nizke amplitude, pulznega načina delovanja in nadzora temperature med ultrazvočnim striženjem DNA je tudi uporaba določenih sredstev pokazala pomemben zaščitni učinek pred razgradnjo DNA. Različni polimeri, peptidi in lipidi na primer ščitijo plazmidno DNA med ultrazvočno obdelavo.

Stabilnost plazmidne DNA in nanokompleksov plazmidne DNA/IL pri ultrazvočni strižni obremenitvi so preučevali z elektroforezo na agaroznem gelu. Tako plazmidno DNA kot nanokomplekse plazmidne DNA/IL so različno dolgo izpostavljali ultrazvočni strižni obremenitvi. Plazmidno DNA so ultrazvočni strižni obremenitvi izpostavili za 0, 10, 20, 30 in 40 minut. Nanokomplekse plazmidne DNA/IL pa so ultrazvočni strižni obremenitvi izpostavili za 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 in 120 minut.
(študija in slika: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) so pokazali, da so po izpostavitvi nanostruktur plazmidne DNA / ionske tekočine (pDNA/IL) ultrazvočni strižni obremenitvi za 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 in 120 min ter tvorbi kompleksov s komercialno dostopnim kationskim sredstvom za dostavo genov lipofektaminom deleži fluorescenčno pozitivnih celic znašali 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% in 50% v navedenem zaporedju (glejte spodnji graf). Delež fluorescenčno pozitivnih celic se je povečal, ko so bile nanostrukture ultrazvočni strižni obremenitvi izpostavljene 10 in 20 min, nato pa se je počasi zmanjševal.

Vpliv ionske tekočine [Bmim][PF6] na dostavo plazmidne DNA v celice COS7. Nanokomplekse plazmidne DNA/IL (ionske tekočine) so izpostavili ultrazvočni strižni obremenitvi do 120 minut in pred dostavo v celice COS7 z LA tvorili komplekse. Podatki prikazujejo povprečno število (%) celic HeLa, pozitivnih na GFP, preštetih v 10 različnih mikroskopskih vidnih poljih, poskus pa je bil večkrat izveden v treh različnih dneh. (Študija in graf: ©Sarker et al., 2019)

Ultrazvočna priprava lizata

Protokol ultrazvočne lize celic
Začnite z obogatenim vzorcem celic, pripravljenim z metodo ločevanja celic (npr. imunomagnetno ločevanje celic, fluorescenčno aktivirano razvrščanje celic (FACS), centrifugiranje v gostotnem gradientu, imunogostotna izolacija celic).
Vzorci celic morajo vsebovati volumen liznega pufra, ki je primeren za cilj poskusa in ultrazvočno napravo s sondo.
Prednost imajo hipotonični pufri, saj izboljšajo ultrazvočno lizo celic. Pomembno je ustrezno uporabljati dodatke in izbrati ustrezno koncentracijo soli.
Izberite napravo za ultrazvočno lizo: Za posredno sonikacijo vial priporočamo VialTweeter ali CupHorn. Za plošče z več vdolbinicami je UIP400MTP idealna ultrazvočna naprava. Za klasično sonikacijo s sondo pa je najprimernejši ultrazvočni homogenizator, kot je UP100H ali UP200Ht z mikrokonico.
Protokol sonikacije s sondo: Sondo ultrazvočne naprave vstavite v vzorec v mikrocentrifugirki in sonikirajte približno 10 sekund. Glede na vzorec DNA je mogoče sonikacijo ponoviti še enkrat ali dvakrat. Potreben vnos ultrazvočne energije (Ws/mL) je odvisen od viskoznosti vzorca in vrste DNA. Hlajenje z ledeno kopeljo in pulzni način delovanja ultrazvočne naprave pomagata preprečiti toplotno razgradnjo vzorca.
Po ultrazvočni lizi vzorec centrifugiramo, da ločimo ostanke v usedlini (ki vsebujejo nelizirane celice, jedra in nelizirane organele).
Če vzorca ne obdelamo takoj naprej, ga lahko lahko shranimo pri ustrezni temperaturi, da ohranimo njegovo viabilnost.

Ultrazvočne naprave za fragmentacijo DNA

Hielscher Ultrasonics ponuja različne platforme na osnovi ultrazvoka za fragmentacijo DNA, RNA in kromatina. Te različne platforme vključujejo ultrazvočne sonde (sonotrode), rešitve za posredno sonikacijo za hkratno pripravo vzorcev v več epruvetah ali ploščah z več vdolbinicami (npr. ploščah s 96 vdolbinicami, mikrotitrskih ploščah), sonoreaktorje in ultrazvočne naprave CupHorn. Vse platforme za striženje DNA poganjajo visokozmogljivi ultrazvočni procesorji z uglašeno frekvenco, ki omogočajo natančno nadzorovanje in zagotavljajo ponovljive rezultate.

Ultrazvočni procesorji za poljubno število in velikost vzorcev

Z ultrazvočnima napravama Hielscher za obdelavo več vzorcev VialTweeter (za do 10 epruvet) in UIP400MTP (za mikroplošče/plošče z več vdolbinicami) je zaradi intenzivne in natančno nadzorovane ultrazvočne obdelave mogoče preprosto skrajšati čas obdelave vzorcev ter hkrati doseči želeno porazdelitev velikosti fragmentov DNA in izkoristek. Ultrazvočna fragmentacija DNA omogoča učinkovite, zanesljive in razširljive korake priprave plazmidov. Z uporabo stalnih ultrazvočnih parametrov je mogoče protokole linearno razširiti z enega na številne vzorce.
Ultrazvočne naprave s sondo z enim do petimi prsti so idealne za pripravo manjšega števila vzorcev. Laboratorijske ultrazvočne naprave Hielscher so na voljo z različnimi stopnjami moči, tako da lahko izberete idealno ultrazvočno napravo za razgradnjo za svojo aplikacijo, povezano z DNA.