Plasmid priprava z ultrasonication

Ultrasonication je zanesljiva tehnika fragment plazmid DNK. Natančno kontrolirana amplituda, način utripanja in uravnavanje temperature so najpomembnejše značilnosti ultrazvočnega senzorja za nemoteče razdrobljenost plazmida. Poleg tega uporaba nekaterih sredstev pomaga zaščititi pred razgradnjami plazme. Hielscher Ultrasonics ponuja različne rešitve za nadzorovano razdrobljenost plazmida iz enojnih vial, hkratno sonication številnih vzorcev, kot tudi več-dobro plošč. Preberite več o uspešni ultrazvočni razdrobljenosti plazmida!

Plasmid shearing z ultrasonication

Ko se vzorci DNK podvržejo ultrazvočnim valovom, ultrazvočno ustvarjene vibracije ustvarijo akustično kavitacijo v tekočini, ki s pomočjo mehanskih sil omejuje ali zlomi molekule DNK visoke molekulske mase. Sonication je najbolj razširjena metoda za presejalne poskuse DNA v razsutem stanju, vključno z aplikacijami, kot je Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), za katere so majhne velikosti fragmentov absolutno ključnega pomena za pridobitev visoke ločljivosti. (prim. Tseng et al., 2012)
Plazmidna DNK (pDNA) je specifična oblika DNK, značilna je po obliki prstana in se nahaja v bakterijah in nekaterih evkariotih.
Supercoiled pDNA je želena oblika plazmidske DNK, saj kaže najboljše rezultate v procesih navzdol, kot so avtomatizirano zaporedje in transfekcija. Ultrasonication je primerna za fragment pDNA, vključno s supercoiled pDNA, uspešno.
Thompson et al. (2008) je pokazal, da je plazmidna sonikacija, za katero je znano, da fragmentira supercoiled DNK, učinkovit način za izboljšanje zaporedja phred20 dolžin branja do točke, da se bistveno ne razlikujejo od beckman Coulterove kontrolne predloge ali encimsko lineariziranih plazmidov.

Uporaba plazmid vektorjev

Plazmidi se pogosto uporabljajo kot orodje za kloniranje, prenos in manipulacijo genov. Kadar se plazmidi eksperimentalno uporabljajo v te namene, se imenujejo vektorji. DNA fragmenti ali geni se lahko vstavijo v plazmidski vektor in tako ustvarijo tako imenovani rekombinantni plazmid. Plazmidski vektorji se uporabljajo kot vozila za pogon rekombinantne DNK v gostiteljsko celico in so ključna sestavina molekularnega kloniranja.
“Nevirusni vektorji se obsežno proučujejo za njihovo morebitno uporabo pri genski terapiji za zdravljenje različnih zapletenih bolezni. Nevirusni vektorji ščitijo plazmidno DNK pred fizikalno, kemično in encimsko razgradnjajo in dostavili molekulo DNK na ciljno mesto. Na primer, kcationični liposomi, chitosan in drugi pozitivno nabojni nanodelci tvorijo komplekse s plazmidno DNK z elektrostatičnimi interakcijami. Vendar pa so lahko oblikovani kcationični liposomi/plazmidni DNA kompleksi razmeroma veliki (to je 300–400 nm) in heterogene narave, zaradi česar jih je težko uporabljati v farmacevtskih aplikacijah. Velike in heterogene plazmične DNK/liposome, plazmidno DNK/aerosole in plazmidske DNA/peptidne komplekse lahko zmanjšamo na manjše, homogene delce pa z ultrasonikacijo.” (Sarker et al., 2019)
Izmerjen primer za uporabo plazmidnih vektorjev je CRISPR–Cas9. Sistem CRISPR–Cas9 je običajno dostavljen celicam kot en velik plazmid ali več manjših plazmidov, ki kodirajo ciljno zaporedje, VODNIK CRISPR in Cas9.

Ultrazvočna priprava NANOdelcev, naloženih z DNA PLGA, z nanoprecipitacijo

Jo et al. (2020) je uporabil poli(mlečno-ko-glikolno kislino) (PLGA) za oblikovanje nosilca nanodelcev za dostavo modelov PLAZMID CRISPR–Cas9 v primarni kostni mozeg, pridobljene makrofage. Pri nanoprecipitaciji nanodelcev PLGA so uporabili PLGA z dvema različnima končnima skupinama (skupine estra in amina) s ciljem, da pozitivno nabite končne kape amina povečajo učinkovitost enkapsulacije in nalaganje zaradi interakcij z nabojem med njim in negativno nabito hrbtenico DNK. V 50 ml polipropilenske konične centrifuge cevi, 100 mg Pluronic F127 je bila raztopila v 20 ml avtoklaved DI vode z mešanjem vrtljajev, ki mu sledi 30 min nežne sonikacije z uporabo ultrazvočne kopeli (glej CupHorn). Dodana je bila samodejna magnetna mešalnica, raztopina pa je bila 30 min zmešana s 600 RPM, medtem ko so bile druge rešitve narejene. Plastična labware je bila uporabljena namesto steklene posode skozi celotno za zmanjšanje nespecifičnega adsorpcije DNK. Raztopine PLGA, raztopljene v DMF (44, 48 mg/ ml) in TIPS pentacenu, raztopljene v THF (0,667 mg/ml), so bile narejene ločeno. PLGA je bila v DMF 30 min pustila mirno moko, preden je bila sonica 30 min. (za celoten protokol glej Jo et al., 2020)

Plazmidska DNA zaščita med sonikacijo

DNK, vključno s plazmidi in super-prehlajenimi plazmidi, so zelo občutljiva razgradnja. Vse razpoložljive metode razdrobljenosti so znane po nekaterih slabostih. Ultrazvočna razdrobljenost DNK je ena izmed prednostnih metod, saj nadzorovana sonication v kombinaciji z zaščitnimi ukrepi omogoča zmanjšanje omejevanje- in toplotno- povzročijo števanje DNA sklopov.
Poleg nizkih nastavitev amplitude, načina utripanja in uravnavanja temperature med ultrazvočnim omejevanjem DNK je uporaba nekaterih sredstev pokazala pomemben zaščitni učinek pred razgradnjajo DNK. Na primer, različni polimeri, peptidi in lipidi ščitijo plazmidno DNK med ultrasonikacijo.

Stabilnost plazmidne DNK in plazmidnih dnk/IL nanokompleksov proti ultrazvočnemu stresu zmešnjave so preiskali s testom elektroforeze agaroze gela. Tako plazmidna DNK kot plazmidna DNK/IL nanokomplekse so bili izpostavljeni ultrazvočni skica stres za različne časovne točke. Plazmidna DNK je bila izpostavljena ultrazvočnim stresom 0, 10, 20, 30 in 40 minut. Vendar pa so bili plazmični DNK/IL nanokompleksi izpostavljeni ultrazvočnim stresom 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 in 120 minut.
(študija in slika: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) je pokazal, da so bile v nanostrukturah plazmidske DNK / ionske tekočine (pDNA/IL) izpostavljene ultrazvočni omejevalni stres za 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, i 120 min i kompleksovano sa trgovinsko razpoložljivim kcationskim genom za dostava lipofektamina, procent fluorescentnih pozitivnih celica je 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65 %, oziroma 50 %(glej spodnji grafikon). Odstotek fluorescentnih pozitivnih celic se je povečal, ko so bile nanostrukture 10 in 20 min podvržene ultrazvočnim stresom, nato pa so se počasi zniževali.

Vpliv ionske tekočine [Bmim][PF6] na dostava plazmidske DNK v celice COS7. Plazmid DNA/IL (ionska tekočina) nanokomplekse so bili izpostavljeni ultrazvočni strižen stres do 120 minut in zapleten z LA pred dostavo v celice COS7. Podatki kažejo povprečno število (%) celic GFP pozitivnih hela, preštetih v 10 različnih mikroskopskih poljih, poskus pa je bil izveden večkrat v treh različnih dneh. (Študija in grafikon: ©Sarker et al., 2019)

Ultrazvočni pripravek iz lysata

Ultrazvočni celični lysis protokol
Začnite z obogatenim vzorcem celic, ki je bil pripravljen z metodo ločevanja celic (npr. ločitev imunomagnetičnih celic, razvrščanje celic s fluorescenco (FACS), centrifugacijo gradienta gostote, izoliranost celic z imunodensnostjo).
Vzorci celic morajo pokazati prostornino odbojnika za lyzo, ki je primerna za poskusni cilj in ultrazvočnikator tipa sonde.
Prednost imajo hipotonski odbojniki, saj krepijo ultrazvočno celično lyzo. Pomembno je, da se aditivi in koncentracija soli uporabljajo na ustrezen način.
Izberite napravo za ultrazvočno lizo: Za posredno sonikacijo vial priporočamo VialTweeter ali CupHorn. Za večplastne plošče je UIP400MTP idealen ultrazvočnitor. In klasična sonda tipa sonication, ultrazvočni homogenizer kot UP100H ali UP200Ht z mikro-konico so najbolj primerni.
Protokol za sondo tipa sonication: Ultrazvočno sondo v prostornino vzorca postavite v mikrocentrifugno cev in sonicirajte približno 10 sekund. Glede na VZOREC DNK se lahko sonication ponovi še enkrat ali dvakrat. Zahtevani ultrazvočni vnos energije (Ws/mL) je odvisen od viskoznosti vzorca in tipa DNK. Hlajenje preko ledene kopeli in pulzacijskega načina ultrazvočnega sistema pomaga preprečiti, da bi bil vzorec termo degradirana.
Po ultrazvočni lysis, vzorec centrifugiranje za ločevanje peletnih ostankov (ki vsebujejo neosedenih celic, jedrc in neoslanih organele)
Če vzorec ni takoj obdelan naprej, ga je mogoče shraniti na ustrezni temperaturi, da se ohrani njegova sposobnost preživetja.

Ultrasonicatorji za fragmentacijo DNK

Hielscher Ultrasonics ponuja različne ultrazvočno zasnovane platforme za DNA, RNK, in kromatin fragmentacijo. Te različne platforme vključujejo ultrazvočne sonde (sonotrodes), posredne raztopine za sonication za hkratno pripravo vzorca več cevi ali več-dobro plošč (npr. 96-dobro plošče, mikrotiter plošče), sonoreaktorji, in ultrazvočni cuphorns. Vse platforme za omejevanje DNK napajajo frekvenčni, visokozmogljivi ultrazvočni procesorji, ki so natančno pod nadzorom in prinašajo pomnilljive rezultate.

Ultrazvočni procesorji za vsako vzorčno številko in velikost

Z Multi-sample ultrasonicators Hielscher VialTweeter (za do 10 epruvete) in UIP400MTP (za mikroplate/ večplastne plošče) je enostavno mogoče zmanjšati čas obdelave vzorcev zaradi intenzivne in natančno nadzorovati ultrasonication, medtem ko pridobi želeno porazdelitev velikosti DNA fragmentov in donos. Ultrazvočna DNA fragmentacija naredi plazmid priprave korake učinkovite, zanesljive in skalatične. Protokole je mogoče lineano meriti od enega do številnih vzorcev z uporabo stalnih ultrazvočnih parametrov.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.