Priprava plazmidov z ultrazvočno obdelavo

Ultrasonication je zanesljiva tehnika za fragmentacijo plazmidne DNK. Natančno nadzorovana amplituda, način pulziranja in nadzor temperature so najpomembnejše lastnosti ultrazvočnega aparata za neškodljivo fragmentacijo plazmidov. Poleg tega uporaba nekaterih sredstev pomaga zaščititi pred razgradnjo plazmidov. Hielscher Ultrasonics ponuja različne rešitve za nadzorovano fragmentacijo plazmidov iz posameznih vial, hkrati ultrazvočno razbijanje številnih vzorcev in plošč z več vdolbicami. Preberite več o uspešni ultrazvočni fragmentaciji plazmidov!

Striženje plazmidov z ultrazvokom

Ko so vzorci DNK izpostavljeni ultrazvočnim valovom, ultrazvočno ustvarjene vibracije ustvarijo akustično kavitacijo v tekočini, ki z mehanskimi silami striži ali razbija molekule DNK z visoko molekulsko maso. Sonication je najbolj razširjena metoda za poskuse striženja DNK v razsutem stanju, vključno z aplikacijami, kot je kromatinska imunoprecipitacija (ChIP), za katero so majhne velikosti fragmentov ključnega pomena za doseganje visoke ločljivosti. (prim. Tseng et al., 2012)
Plazmidni DNK (pDNA) je specifična oblika DNK, za katero je značilna oblika obroča in jo najdemo v bakterijah in nekaterih evkariontih.
Supercoiled pDNA je želena oblika plazmidne DNK, saj kaže najboljše rezultate v nadaljnjih procesih, kot so avtomatizirano zaporedje in transfekcija. Ultrasonication je primeren za uspešno fragmentacijo pDNA, vključno s superzvito pDNA.
(2008) so pokazali, da je ultrazvočna razbijanje plazmidov, za katero je znano, da fragmentira superzvito DNK, učinkovit način za izboljšanje dolžine branja zaporedja phred20 do te mere, da se bistveno ne razlikujejo od kontrolne predloge Beckmana Coulterja ali encimsko lineariziranih plazmidov.

Uporaba plazmidnih vektorjev

Plazmidi se pogosto uporabljajo kot orodje za kloniranje, prenos in manipulacijo genov. Ko se plazmidi eksperimentalno uporabljajo za te namene, se imenujejo vektorji. Fragmenti DNK ali geni se lahko vstavijo v plazmidni vektor, s čimer se ustvari tako imenovani rekombinantni plazmid. Plazmidni vektorji se uporabljajo kot nosilci za vožnjo rekombinantne DNK v gostiteljsko celico in so ključni sestavni del molekularnega kloniranja.
“Nevirusni vektorji se obsežno preučujejo zaradi njihove potencialne uporabe v genski terapiji za zdravljenje različnih zapletenih bolezni. Nevirusni vektorji ščitijo plazmidno DNK pred fizikalno, kemično in encimsko razgradnjo in dostavljajo molekulo DNA na ciljno mesto. Na primer, kationski liposomi, hitozan in drugi pozitivno nabiti nanodelci tvorijo komplekse s plazmidno DNK z elektrostatičnimi interakcijami. Vendar pa so lahko oblikovani kationski liposomi / plazmidni kompleksi DNA razmeroma veliki (tj. 300–400 nm) in heterogene narave, zaradi česar jih je težko uporabiti v farmacevtskih aplikacijah. Velike in heterogene plazmidne DNK / liposome, plazmidne DNK / aerosole in plazmidne DNK / peptidne komplekse lahko zmanjšamo na manjše in homogene delce z ultrazvočno razglasitvijo.” (Sarker et al., 2019)
Pomemben primer uporabe plazmidnih vektorjev je CRISPR-Cas9. Sistem CRISPR-Cas9 se običajno dostavi celicam kot en sam velik plazmid ali več manjših plazmidov, ki kodirajo ciljno zaporedje, vodnik CRISPR in Cas9.

Ultrazvočna priprava nanodelcev PLGA, obremenjenih z DNA, z nanoprecipitacijo

(2020) so uporabili poli(mlečno-ko-glikolno kislino) (PLGA), da bi oblikovali nosilec nanodelcev za dostavo modela plazmida CRISPR-Cas9 v primarne makrofage, pridobljene iz kostnega mozga. Za nanoprecipitacijo nanodelcev PLGA so bili uporabljeni PLGA z dvema različnima končnima skupinama (estrske in aminske skupine) s ciljem, da pozitivno nabiti aminski končni pokrovčki povečajo učinkovitost inkapsulacije in obremenitev zaradi interakcij naboja med njimi in negativno nabito hrbtenico DNK. V 50 ml polipropilenski stožčasti centrifugalni epruveti je bilo 100 mg Pluronic F127 raztopljeno v 20 ml avtoklavirane DI vode z vrtinčnim mešanjem, ki mu je sledilo 30 minut nežne ultrazvočne razbijanja z ultrazvočno kopeljo (glej CupHorn). Dodana je bila avtoklavirana magnetna mešalna palica in raztopina je bila mešana pri 600 vrtljajih na minuto 30 minut, medtem ko so bile narejene druge raztopine. Namesto steklene posode je bila uporabljena plastična laboratorijska posoda, da bi zmanjšali nespecifično adsorpcijo DNK. Raztopine PLGA, raztopljene v DMF (44,48 mg/ml), in TIPS pentacena, raztopljenega v THF (0,667 mg/ml), so bile izdelane ločeno. PLGA je bil mirno prepuščen mokri v DMF 30 minut, preden je bil sonikiran 30 minut. (za celoten protokol glej Jo et al., 2020)

Zaščita plazmidne DNK med ultrazvočnim razbijanjem

DNA, vključno s plazmidi in superzvitimi plazmidi, je zelo občutljiva razgradnja. Vse razpoložljive metode fragmentacije so znane po določenih pomanjkljivostih. Ultrazvočna fragmentacija DNK je ena izmed prednostnih metod, saj nadzorovana ultrazvočna razbijanje v kombinaciji z zaščitnimi ukrepi omogoča zmanjšanje strižne in toplotne poškodbe verig DNA.
Poleg nizkih nastavitev amplitude, načina pulziranja in nadzora temperature med ultrazvočnim striženjem DNK je uporaba nekaterih sredstev pokazala pomemben zaščitni učinek proti razgradnji DNA. Na primer, različni polimeri, peptidi in lipidi ščitijo plazmidno DNK med ultrazvokom.

Stabilnost plazmidne DNK in plazmidnih DNA / IL nanokompleksov proti ultrazvočnemu strižnemu stresu je bila raziskana z uporabo elektroforeznega testa agaroznega gela. Tako plazmidni DNK kot plazmidni DNK / IL nanokompleksi so bili izpostavljeni ultrazvočni strižni napetosti za različne časovne točke. Plazmidna DNK je bila izpostavljena ultrazvočni strižni napetosti 0, 10, 20, 30 in 40 minut. Vendar pa so bili nanokompleksi plazmidne DNK / IL izpostavljeni ultrazvočni strižni napetosti 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 in 120 minut.
(študija in slika: ©Sarker et al., 2019)

(2019) so pokazali, da ko so bile nanostrukture plazmidne DNA / ionske tekočine (pDNA / IL) izpostavljene ultrazvočni strižni napetosti za 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 in 120 min in kompleksirane s komercialno dostopnim kationskim sredstvom za dostavo genov lipofektamin, je bil odstotek fluorescentnih pozitivnih celic 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65 % oziroma 50 % (glej spodnjo tabelo). Odstotek fluorescentnih pozitivnih celic se je povečal, ko so bile nanostrukture izpostavljene ultrazvočni strižni napetosti 10 in 20 minut, nato pa so se počasi zmanjševale.

Vpliv ionske tekočine [Bmim] [PF6] na dostavo plazmidne DNA v celice COS7. Nanokompleksi plazmidne DNA / IL (ionska tekočina) so bili izpostavljeni ultrazvočni strižni napetosti do 120 minut in kompleksirani z LA, preden so bili dostavljeni v celice COS7. Podatki kažejo povprečno število (%) GFP pozitivnih celic HeLa, preštetih v 10 različnih mikroskopskih poljih, poskus pa je bil izveden večkrat v treh različnih dneh. (Študija in grafikon: ©Sarker et al., 2019)

Ultrazvočna priprava lizata

Protokol ultrazvočne lize celic
Začnite z obogatenim vzorcem celic, ki je bil pripravljen z metodo ločevanja celic (npr. Imunomagnetno ločevanje celic, fluorescenčno aktivirano razvrščanje celic (FACS), centrifugiranje gradienta gostote, izolacija celic imunodensete).
Vzorci celic morajo pokazati prostornino pufra za lizo, ki je primerna za poskusni cilj in ultrazvočni aparat tipa sonde.
Hipotonični pufri so zaželeni, saj izboljšajo ultrazvočno lizo celic. Pomembno je, da se aditivi in koncentracija soli uporabljajo na ustrezen način.
Izberite svojo ultrazvočno napravo za lizo: Za posredno ultrazvočno razbijanje vial priporočamo VialTweeter ali CupHorn. Za plošče z več vdolbicami je UIP400MTP idealen ultrazvočni aparat. Najbolj primerna je klasična ultrazvočna obdelava sonde, ultrazvočni homogenizator, kot je UP100H ali UP200Ht z mikro konico.
Protokol za ultrazvočno razbijanje tipa sonde: Ultrazvočno sondo vstavite v volumen vzorca v epruveti za mikrocentrifugo in sonikirajte približno 10 sekund. Glede na vzorec DNK se lahko ultrazvočno razbijanje ponovi še enkrat ali dvakrat. Zahtevani ultrazvočni vnos energije (Ws / ml) je odvisen od viskoznosti vzorca in vrste DNK. Hlajenje z ledeno kopeljo in pulzacijskim načinom ultrazvočnega aparata pomaga preprečiti toplotno razgradnjo vzorca.
Po ultrazvočni lizi se vzorec centrifugira, da se ločijo ostanki peletov (ki vsebujejo nelizirane celice, jedra in nelizirane organele)
Če se vzorec ne obdela takoj naprej, se lahko shrani pri ustrezni temperaturi, da se ohrani njegova sposobnost preživetja.

Ultrazvočni aparati za fragmentacijo DNK

Hielscher Ultrasonics ponuja različne ultrazvočne platforme za fragmentacijo DNA, RNA in kromatina. Te različne platforme vključujejo ultrazvočne sonde (sonotrode), posredne ultrazvočne raztopine za hkratno pripravo vzorcev več cevi ali plošč z več vdolbicami (npr. 96-vdolbine plošče, mikrotitrijske plošče), sonoreaktorje in ultrazvočne cuphorns. Vse platforme za striženje DNK poganjajo frekvenčno uglašeni, visoko zmogljivi ultrazvočni procesorji, ki jih je mogoče natančno nadzorovati in dajejo ponovljive rezultate.

Ultrazvočni procesorji za vsako število in velikost vzorca

S Hielscherjevimi ultrazvočnimi aparati z več vzorci VialTweeter (za do 10 epruvet) in UIP400MTP (za mikroplošče / plošče z več jamicami) je enostavno mogoče skrajšati čas obdelave vzorca zaradi intenzivne in natančno nadzorovane ultrazvočne obdelave, hkrati pa doseči želeno porazdelitev velikosti fragmentov DNK in donos. Ultrazvočna fragmentacija DNK naredi korake priprave plazmidov učinkovite, zanesljive in razširljive. Protokole je mogoče linearno skalirati od enega do številnih vzorcev z uporabo stalnih ultrazvočnih parametrov.
Ultrazvočni sondatorji z enim do petimi prsti so idealni za pripravo manjših vzorcev. Hielscherjevi laboratorijski ultrazvočni aparati so na voljo z različnimi stopnjami moči, tako da lahko izberete idealen ultrazvočni motilec za vašo aplikacijo, povezano z DNK.