Biosintezna proizvodnja oligosaharidov človeškega mleka

Biosinteza oligosaharidov človeškega mleka (HMO) s fermentacijo ali encimskimi reakcijami je kompleksen proces, ki porablja vire in ima pogosto nizek izkoristek. Ultrazvočna obdelava poveča prenos snovi med substratom in celičnimi tovarnami ter spodbuja rast in presnovo celic. Sonikacija tako intenzivira fermentacijo in biokemijske procese, kar omogoča hitrejšo in učinkovitejšo proizvodnjo HMO.

Oligosaharidi človeškega mleka

Oligosaharidi človeškega mleka (HMO), znani tudi kot glikani človeškega mleka, so molekule sladkorjev, ki spadajo v skupino oligosaharidov. Med pomembne primere HMO spadajo 2’-fukozillaktoza (2′-FL), lakto-N-neotetraoza (LNnT), 3’-galaktozillaktoza (3′-GL) in difukozillaktoza (DFL).
Čeprav človeško materino mleko vsebuje več kot 150 različnih struktur HMO, se trenutno na komercialni ravni proizvajata in kot prehranska dodatka v mlečnih formulah za dojenčke uporabljata le 2′-fukozillaktoza (2′-FL) in lakto-N-neotetraoza (LNnT).
Oligosaharidi človeškega mleka (HMO) so znani po svojem pomenu v prehrani dojenčkov. Oligosaharidi človeškega mleka so edinstvena vrsta hranil, ki v dojenčkovem črevesju delujejo kot prebiotiki, antiadhezivne protimikrobne snovi in imunomodulatorji ter bistveno prispevajo k razvoju možganov. HMO so prisotni izključno v človeškem materinem mleku; mleko drugih sesalcev (npr. krav, koz, ovc, kamel itd.) ne vsebuje teh specifičnih oblik oligosaharidov.
Oligosaharidi človeškega mleka so tretja najobilneje zastopana trdna sestavina človeškega mleka, ki je lahko v vodi prisotna v raztopljeni, emulgirani ali suspendirani obliki. Laktoza in maščobne kisline so najobilneje zastopane trdne snovi v človeškem mleku. HMO so prisotni v koncentraciji 0,35–0,88 unč (9,9–24,9 g)/ L. Znanih je približno 200 strukturno različnih oligosaharidov človeškega mleka. Prevladujoči oligosaharid pri 80% vseh žensk je 2′-fukozillaktoza, ki je v človeškem materinem mleku prisotna v koncentraciji približno 2,5 g/ L.
Ker se HMO ne prebavijo, k prehrani ne prispevajo kalorij. Kot neprebavljivi ogljikovi hidrati delujejo kot prebiotiki in jih selektivno fermentira zaželena črevesna mikroflora, zlasti bifidobakterije.

Biosinteza oligosaharidov človeškega mleka

Celične tovarne in encimski / kemoencimski sistemi so tehnologije, ki se trenutno uporabljajo za sintezo HMO. Za proizvodnjo HMO v industrijskem merilu so fermentacija mikrobnih celičnih tovarn, biokemijska sinteza in različne encimske reakcije izvedljivi načini bioproizvodnje HMO. Iz ekonomskih razlogov je biosinteza z mikrobnimi celičnimi tovarnami trenutno edina tehnika, ki se uporablja za industrijsko proizvodnjo HMO.

Fermentacija HMO z uporabo mikrobnih celičnih tovarn

E.coli, Saccharomyces cerevisiae in Lactococcus lactis se pogosto uporabljajo kot celične tovarne za bioproizvodnjo bioloških molekul, kot so HMO. Fermentacija je biokemijski proces, pri katerem mikroorganizmi pretvarjajo substrat v ciljne biološke molekule. Mikrobne celične tovarne kot substrat uporabljajo enostavne sladkorje, ki jih pretvarjajo v HMO. Ker so enostavni sladkorji (npr. laktoza) obilno dostopen in poceni substrat, ostaja proces biosinteze stroškovno učinkovit.
Na hitrost rasti in biokonverzije vpliva predvsem prenos hranil (substrata) do mikroorganizmov. Hitrost prenosa snovi je eden glavnih dejavnikov, ki vplivajo na sintezo produkta med fermentacijo. Ultrazvočna obdelava je dobro znana po spodbujanju prenosa snovi.
Med fermentacijo je treba razmere v bioreaktorju stalno spremljati in uravnavati, da lahko celice rastejo čim hitreje in nato proizvajajo ciljne biomolekule (npr. oligosaharide, kot so HMO; inzulin; rekombinantne beljakovine). Teoretično se nastajanje produkta začne takoj, ko začne celična kultura rasti. Vendar se zlasti pri gensko spremenjenih celicah, kot so gensko preoblikovani mikroorganizmi, običajno sproži pozneje z dodajanjem kemične snovi substratu, ki poveča izražanje ciljne biomolekule. Ultrazvočne bioreaktorje (sonobioreaktorje) je mogoče natančno krmiliti, kar omogoča specifično stimulacijo mikrobov. To vodi do hitrejše biosinteze in večjih izkoristkov.
Ultrazvočna liza in ekstrakcija: fermentacijo kompleksnih HMO lahko omejujejo nizki fermentacijski titri in produkti, ki ostanejo znotraj celic. Ultrazvočna liza in ekstrakcija se uporabljata za sproščanje znotrajceličnega materiala pred čiščenjem in nadaljnjimi procesi obdelave.

Ultrazvočno spodbujena fermentacija

Hitrost rasti mikrobov, kot so Escherichia coli, gensko preoblikovana E.coli, Saccharomyces cerevisiae in Lactococcus lactis, je mogoče povečati s povečanjem hitrosti prenosa snovi in prepustnosti celične stene z nadzorovano nizkofrekvenčno ultrazvočno obdelavo. Kot blaga, netoplotna tehnika obdelave ultrazvočna obdelava v fermentacijsko brozgo vnaša izključno mehanske sile.
Akustična kavitacija: načelo delovanja sonikacije temelji na akustični kavitaciji. Ultrazvočna sonda (sonotroda) sklaplja nizkofrekvenčne ultrazvočne valove v medij. Ultrazvočni valovi potujejo skozi tekočino in ustvarjajo izmenjujoče se cikle visokega tlaka (stiskanje) / nizkega tlaka (redčenje). S stiskanjem in raztezanjem tekočine v izmenjujočih se ciklih nastajajo drobni vakuumski mehurčki. Ti majhni vakuumski mehurčki rastejo več ciklov, dokler ne dosežejo velikosti, pri kateri ne morejo absorbirati dodatne energije. Na tej točki največje rasti vakuumski mehurček silovito implodira in ustvari lokalno ekstremne razmere, znane kot pojav kavitacije. V kavitacijski »vroči točki« je mogoče opaziti velike razlike v tlaku in temperaturi ter intenzivne strižne sile s tekočinskimi curki s hitrostjo do 280m/sec. Ti kavitacijski učinki omogočajo temeljit prenos snovi in sonoporacijo (perforacijo celičnih sten in celičnih membran). Hranila iz substrata se prenašajo do živih celih celic in v njihovo notranjost, tako da so celične tovarne optimalno prehranjene, rast in pretvorba pa potekata hitreje. Ultrazvočni bioreaktorji so preprosta, a zelo učinkovita strategija za obdelavo biomase v procesu biosinteze v eni posodi.
Dobro je znano, da natančno nadzorovana, blaga sonikacija intenzivira fermentacijske procese.
Sonikacija izboljša »produktivnost številnih bioprocesov, ki vključujejo žive celice, z izboljšanjem privzema substrata, povečano proizvodnjo ali rastjo zaradi povečanja poroznosti celic ter potencialno povečanim sproščanjem celičnih sestavin.« (Naveena et al. 2015)
Preberite več o fermentaciji s pomočjo ultrazvoka!

Naveena et al. (2015) so ugotovili, da ultrazvočna intenzifikacija ponuja več prednosti pri bioprocesiranju, vključno z nizkimi obratovalnimi stroški v primerjavi z drugimi možnostmi obdelave za izboljšanje procesa, preprostim upravljanjem in skromnimi zahtevami glede moči.

Visokozmogljivi ultrazvočni fermentacijski reaktorji

Fermentacijski procesi vključujejo žive mikroorganizme, kot so bakterije ali kvasovke, ki delujejo kot celične tovarne. Pri uporabi sonikacije za spodbujanje prenosa snovi ter povečanje hitrosti rasti in pretvorbe mikroorganizmov je ključnega pomena natančno nadzorovanje ultrazvočne intenzitete, da se prepreči uničenje celičnih tovarn.
Hielscher Ultrasonics je specialist za načrtovanje, proizvodnjo in distribucijo visokozmogljivih ultrazvočnih naprav, ki jih je mogoče natančno krmiliti in nadzorovati za zagotavljanje vrhunskih izkoristkov fermentacije.

Nadzor procesa ni bistven le za visoke izkoristke in vrhunsko kakovost, temveč omogoča tudi ponavljanje in reproduciranje rezultatov. Zlasti pri stimulaciji celičnih tovarn je prilagoditev parametrov sonikacije posameznim celicam bistvena za doseganje visokih izkoristkov in preprečevanje razgradnje celic. Zato so vsi digitalni modeli ultrazvočnih naprav Hielscher opremljeni z inteligentno programsko opremo, ki omogoča prilagajanje, spremljanje in spreminjanje parametrov sonikacije. Ultrazvočni procesni parametri, kot so amplituda, temperatura, tlak, trajanje sonikacije, delovni cikli in vnos energije, so bistveni za spodbujanje proizvodnje HMO s fermentacijo.
Inteligentna programska oprema ultrazvočnih naprav Hielscher samodejno beleži vse pomembne procesne parametre na vgrajeno kartico SD. Samodejno beleženje podatkov o procesu sonikacije je temelj standardizacije procesa ter obnovljivosti / ponovljivosti, ki sta potrebni za dobro proizvodno prakso (GMP).

Ultrazvočni reaktorji za fermentacijo

Hielscher ponuja ultrazvočne sonde različnih velikosti, dolžin in geometrij, ki se lahko uporabljajo tako za šaržno kot za neprekinjeno pretočno obdelavo. Ultrazvočni reaktorji, znani tudi kot sonobioreaktorji, so na voljo za vse prostornine in pokrivajo ultrazvočno bioprocesiranje od majhnih laboratorijskih vzorcev do pilotne in polne komercialne proizvodnje.
Dobro je znano, da položaj ultrazvočne sonotrode v reakcijski posodi vpliva na porazdelitev kavitacije in mikrotokov v mediju. Sonotrodo in ultrazvočni reaktor je treba izbrati glede na prostornino celične brozge, ki jo obdelujemo. Čeprav je sonikacijo mogoče izvajati tako šaržno kot neprekinjeno, je za velike proizvodne količine priporočljiva uporaba sistema z neprekinjenim pretokom. Pri prehodu skozi ultrazvočno pretočno celico je ves celični medij izpostavljen natanko enaki sonikaciji, kar zagotavlja najučinkovitejšo obdelavo. Široka ponudba ultrazvočnih sond in reaktorjev s pretočnimi celicami Hielscher Ultrasonics omogoča sestavo idealnega sistema za ultrazvočno bioprocesiranje.

Hielscher Ultrasonics – od laboratorija prek pilotnega merila do proizvodnje

Hielscher Ultrasonics pokriva celoten spekter ultrazvočne opreme, od kompaktnih ročnih ultrazvočnih homogenizatorjev za pripravo vzorcev do namiznih in pilotnih sistemov ter zmogljivih industrijskih ultrazvočnih enot, ki zlahka obdelajo več tovornjakov materiala na uro. Zaradi vsestranskih in prilagodljivih možnosti namestitve in pritrditve je mogoče ultrazvočne naprave Hielscher preprosto vključiti v vse vrste šaržnih reaktorjev, šaržnih reaktorjev z dohranjevanjem ali sistemov z neprekinjenim pretokom.
Različni dodatki in prilagojeni deli omogočajo idealno prilagoditev vašega ultrazvočnega sistema zahtevam vašega procesa.
Ultrazvočni procesorji Hielscher, zasnovani za delovanje 24/7 pri polni obremenitvi in za intenzivno uporabo v zahtevnih razmerah, so zanesljivi in potrebujejo le malo vzdrževanja.
Spodnja tabela prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih naprav: