Sinteza peptidov v trdni fazi – Večja učinkovitost z ultrazvokom
Sinteza peptidov v trdni fazi (SPPS) je običajna metoda za sintezo peptidov. Ultrasonication je zanesljivo orodje za intenziviranje sinteze peptidov v trdni fazi, kar ima za posledico višje donose, izboljšano čistost, brez racemizacije in znatno pospešeno hitrost reakcije. Hielscher Ultrasonics ponuja različne ultrazvočne rešitve za sintezo, cepitev in raztapljanje peptidov.
Ultrazvočna sinteza peptidov v trdni fazi
Ultrasonication se že široko uporablja kot intenzivna metoda v organski sintezi in je dobro znana po svojih prednostih, kot so drastično skrajšani reakcijski časi, višji izkoristki, manj stranskih produktov, sprožitev poti, ki jih ni bilo mogoče doseči na druge načine, in / ali boljša selektivnost. Velike koristi je mogoče doseči tudi, če je ultrazvočno razbijanje povezano z reakcijami sinteze peptidov. Rezultati raziskav so pokazali, da ultrazvočno podprta sinteza peptidov doseže optimiziran donos peptidov z visoko čistostjo, brez racemizacije v kratkem reakcijskem času.
- Visoki donos peptidov
- Bistveno hitrejša sinteza
- Višja čistost peptidov
- Brez racemizacije
- Vzporedna sinteza različnih peptidov
- Prilagodljivo za kateri koli obseg
Ultrazvočni cuphorn za enakomerno ultrazvočno razbijanje več reaktorskih posod za izboljšano sintezo peptidov.
Slika, ki prikazuje Merrifieldovo sintezo peptidov v trdni fazi. Ultrazvok se uporablja za pospeševanje in izboljšanje sintezne reakcije ter za ločevanje sintetiziranih peptidov od smole.
Grafika: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Študija | Preučevani peptid(i) | Reakcijski čas (klasična metoda v primerjavi z metodo US-SPPS) | Čistost surove nafte (klasična metoda v primerjavi z metodo US-SPPS) | Racemizacija in stranske reakcije | Ključne ugotovitve |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański in sod. (2019) | Met-enkefalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfin | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3 % → 60,6–89,9 % | Pri Cys/His ni bilo opaziti ničesar, niti pri 70 °C | ~7–12-krat hitrejša sinteza; znatno izboljšana čistost, zlasti pri zaporedjih, ki so nagnjena k agregaciji, kot je TAT. |
| Silva in sod. (2021) | Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (samo v ZDA) | 73–84 % → 72–82 % (Pep1/Pep2) | Ni bilo preizkušeno; opazili smo rahlo zmanjšanje čistosti pri Pep2 | 14-kratno skrajšanje časa za Pep1; surovi izkoristki so se znatno povečali. |
| Merlino in sod. (2019) | Modelni pentapeptidi, peptidi z dolžino do 44 merov, “Težka zaporedja” (Aβ 1–42, ACP 65–74) | 60 min → 30 min (model) | 84 % → 93 % (model); znatno višja od temperature pri toplotnem ogrevanju (~45 °C) | Pri enantiomerih Cys/His ni bilo opaznega povečanja | Zelo učinkovita za zahtevne sekvence oziroma sekvence, pri katerih se pogosto pojavlja agregacija; omogoča zmanjšanje presežka reagenta ob ohranjanju visoke čistosti. |
Sinteza peptidov v trdni fazi izboljšana z ultrazvokom
Sinteza peptidov v trdni fazi (SPPS) je kemična reakcija, ki omogoča sestavljanje peptidne verige z zaporednimi reakcijami aminokislinskih derivatov na netopni porozni podlagi. Vendar pa je tradicionalna sinteza peptidov v trdni fazi razmeroma neučinkovit in počasen proces. Zato je ultrazvočna intenzifikacija sinteze peptidov zelo cenjeno orodje za učinkovitejšo in hitrejšo sintezo peptidov.
Silva in sod. (2021) so primerjali “klasičen” fluorenilmetoksikarbonilna (Fmoc) sinteza peptidov v trdni fazi (SPPS) z ultrazvokom (US) na podlagi priprave treh peptidov, in sicer peptida Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2), specifičnega za receptor rastnega faktorja fibroblastov 3 (FGFR3), ter novih peptidov Pep2 (RQMATADEA-NH2) in Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS s podporo ZDA je v primerjavi z “klasičen” metoda. Zanimivo je, da je ultrazvokom podprta SPPS omogočila pridobitev Pep1 v višji stopnji čistosti (82 %) kot “klasičen” SPPS (73 %). Zaradi znatnega skrajšanja časa in visoke čistoče surovega peptida se je raziskovalna skupina odločila, da bo metodo SPPS s pomočjo ultrazvoka uporabila tudi za velik peptid Pep3, ki vsebuje veliko število hidrofobnih aminokislin in homooligosekvenc. Zanimivo je, da je bila sinteza tega 25-mernega peptida dosežena v manj kot 6 urah (347 min) z zmerno čistoto (približno 49 %).
Hitrejša sinteza peptidov s sintezo peptidov v trdni fazi z uporabo ultrazvočnega mešanja.
(Študija in analiza: Wołczański et al., 2019)
Merlino in sod. (2019) so prav tako izvedli obsežno študijo vpliva ultrazvoka na sintezo peptidov v trdni fazi na osnovi Fmoc, kar je omogočilo sintezo različnih biološko aktivnih peptidov (do 44-mer), pri čemer so dosegli izjemne prihranke pri porabi materiala in reakcijskem času. Dokazali so, da ultrazvok ni poslabšal glavnih stranskih reakcij in je izboljšal sintezo peptidov, ki imajo “Težka zaporedja”, ki ultrazvočno spodbuja sintezo peptidov v trdni fazi (US-SPPS) med trenutnimi visoko učinkovitimi strategijami sinteze peptidov.
Razpoložljivost visoko zmogljivih sistemov za ultrazvočno (zvočno) sintezo peptidov omogoča bistveno izboljšane stopnje sinteze in povečanje čistosti surovin. (prim. Wołczański et al., 2019)
Preiskava racemizacije. Primerjava pomembnih 1H NMR spektrov modelov peptidov, sintetiziranih ročno z uporabo klasičnega pristopa pri sobni temperaturi v primerjavi z ultrazvočno metodo pri povišani temperaturi. Kemični premiki His in Cys α-protonov in metilenske skupine Acm (leve plošče), ɣ-metil protonov Val (desne plošče) kažejo, da ultrazvočna razbijanje pri 70 °C ne povzroča racemizacije.
(Študija in analiza: Wołczański et al., 2019)
Ultrazvočna cepitev peptidov
Po sintezi peptidov v trdni fazi (SPPS) je treba sintetizirane peptide razcepiti iz polimernih smol. Ta korak je znan tudi kot dezaščita. Ko primerjamo običajno tresenje in ultrazvočno razcepitev peptidov iz smole, metoda tresenja zahteva približno 1 uro, medtem ko se ultrazvočna cepitev lahko doseže v 15 do 20 minutah. Ultrazvočna cepitev peptidov se lahko uporablja za cepitev zaščitenih aminokislin in peptidov, povezanih s polistirenskimi smolami prek benzilnih estrskih vezi.
Ultrazvočna cepitev peptidov iz polistirenske smole daje visoke donose peptidov visoke čistosti, brez racemizacije, v hitrem postopku.
(študija in grafika: ©Anuradha in Ravindranath, 1995)
Ultrazvočno vznemirjen reaktor za izboljšano in pospešeno sintezo peptidov. Na sliki je prikazana ikona ultrazvočni aparat UP200St v reaktorju z mešanim steklom.
Visoko zmogljivi ultrazvočni aparati za sintezo peptidov
Hielscher Ultrasonics ponuja različne ultrazvočne rešitve za neposredno in posredno ultrazvočno razbijanje. Zmogljivi in natančno nadzorovani ultrazvočni procesorji dovajajo natančno pravo količino ultrazvočne energije v reakcijsko posodo. Ne glede na to, ali kot sintezno posodo uporabljate brizge, epruvete, plošče z več vdolbicami ali steklene reaktorje, Hielscher Ultrasonics ponuja najprimernejši ultrazvočni aparat za vašo peptidno aplikacijo.
- prilagojeni peptidi
- obsežna proizvodnja peptidov
- Peptidne knjižnice
Številne sinteze peptidov se izvajajo v brizgah (npr. Reaktorji z brizgami). Hielscherjev ultrazvočni mešalec brizg ultrazvočno izloči peptidno raztopino, ki povezuje ultrazvočne valove skozi steno brizge v tekočino. Ultrazvočno mešalo brizg je ena izmed najbolj priljubljenih ultrazvočnih rešitev za ultrazvočno podprto sintezo peptidov.
Ultrazvočni cuphorn je primerno orodje za sonikiranje do 5 reaktorskih posod, medtem ko lahko VialTweeter sprejme do deset reakcijskih cevi in dodatno pet večjih posode prek vpenjalne opreme.
Za druge vrste reaktorjev, kot sta reaktorja v trdni fazi Merrifield ali Kamysz, ter druge posode in reaktorje iz polipropilena ali borosilikata, podjetje Hielscher ponuja sonikatorje za posredno in neposredno sonikacijo s prilagojenim pritrdilnim sistemom ali prirobnico.
Seveda je mogoče večje steklene reaktorje z mešalnikom, npr. za sintezo v raztopinski fazi, brez težav opremiti z ultrazvočnimi sondami (znanimi tudi kot sonotrode ali ultrazvočni rogi) katere koli velikosti.
- različne vrste ultrazvočnih aparatov
- neposredno in posredno ultrazvočno razbijanje
- natančen nadzor intenzivnosti
- natančen nadzor temperature
- kontinuirani ali pulzni ultrazvok
- pametne funkcije, programabilne naprave
- Na voljo za poljubno količino
- linearna razširljivost
Za sintezo peptidov v trdni fazi v ploščah z več jamicami/mikrotitrskih ploščah je naprava UIP400MTP idealna izbira. Ultrazvočna kavitacija se posredno in enakomerno prenaša v številne jamice za vzorce, kar zagotavlja vrhunski prenos mase in sintezno reakcijo. Oglejte si spodnji videoposnetek, da si ogledate Ultrazvočni aparat za mikroplošče UIP400MTP v akciji!
Kontaktirajte nas! / Vprašajte nas!
Hielscher Ultrasonics proizvaja visoko zmogljive ultrazvočne homogenizatorje za mešanje, disperzijo, emulgacijo in ekstrakcijo v laboratorijski, pilotni in industrijski ravni.
Zanimiva dejstva o ultrazvočni sintezi peptidov
Kaj so peptidi?
Peptidi so spojine, kjer je več aminokislin povezanih prek amidnih vezi, tako imenovanih peptidnih vezi. Ko je vezan v kompleksne strukture – Običajno je sestavljen iz 50 ali več aminokislin - te velike peptidne strukture se imenujejo beljakovine. Peptidi so bistveni gradnik življenja in izpolnjujejo številne funkcije v telesu.
Kako poteka sinteza peptidov?
V organski kemiji, molekularni biologiji in znanosti o življenju je sinteza peptidov proces proizvodnje peptidov. Peptidi se kemično sintetizirajo s kondenzacijsko reakcijo karboksilne skupine ene aminokisline v aminoskupino druge aminokisline. Strategije zaščitnih skupin (tudi zaščitnih skupin) se običajno uporabljajo, da bi se izognili neželenim stranskim reakcijam z različnimi stranskimi verigami aminokislin.
Kemična (in-vitro) sinteza peptidov se najpogosteje začne s spajanjem karboksilne skupine vhodne aminokisline (C-konec) na N-konec rastoče peptidne verige. V nasprotju s to sintezo C-to-N se naravna biosinteza beljakovin dolgih peptidov v živih organizmih pojavlja v nasprotni smeri. To pomeni, da je v biosintezi N-konec vhodne aminokisline povezan s C-koncem beljakovinske verige (N-to-C).
Večina raziskovalnih in razvojnih protokolov za sintezo peptidov temelji na metodah trdne faze, medtem ko je metode sinteze raztopine mogoče najti v obsežni industrijski proizvodnji peptidov.
Kakšno je trenutno stanje na področju sinteze peptidov?
SUS-SPPS (trajnostna SPPS z ultrazvokom) Dokazano je, da ta postopek skrajša na le dva koraka na cikel (kombinirano vezanje/zaključevanje/odstranjevanje zaščitne skupine + eno izpiranje), s čimer se znatno zmanjšata poraba topila in čas. (glej Mottola et al., 2025)
TAPS z ultrazvočno podporo je nova kombinacija, ki se je izkazala za uspešno pri celotnih sintezah (npr. lipobaktin) in jo podjetja CDMO preučujejo za proizvodnjo aktivnih farmacevtskih učinkovin (API).
Odkrijte prednosti sinteze peptidov z označevanjem, podprte z ultrazvokom!
neprekinjena obdelava se preučuje kot možnost za nadaljnje izboljšanje – Opisane so bile platforme za neprekinjeno sintezo v enem loncu s pomočjo sililiranih označevalcev.
Področje se približuje načelom zelene kemije, pri čemer ultrazvok in TAPS prispevata k zmanjšanju porabe topil, manjši porabi reagentov in večji trajnosti.
Literatura / Reference
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics proizvaja visoko zmogljive ultrazvočne homogenizatorje iz laboratorij k industrijska velikost.