Sinteza peptidov na trdni fazi – učinkovitejša s sonikacijo

Sinteza peptidov na trdni fazi (SPPS) je običajna metoda za sintezo peptidov. Obdelava z ultrazvokom je zanesljivo orodje za intenziviranje sinteze peptidov na trdni fazi, ki omogoča večje izkoristke, izboljšano čistost, odsotnost racemizacije in znatno večjo hitrost reakcije. Hielscher Ultrasonics ponuja različne ultrazvočne rešitve za sintezo, odcepljanje in raztapljanje peptidov.

Ultrazvočna sinteza peptidov na trdni fazi

Obdelava z ultrazvokom se že široko uporablja kot metoda intenziviranja v organski sintezi in je dobro znana po svojih prednostih, kot so drastično krajši reakcijski časi, večji izkoristki, manj stranskih produktov, sprožitev reakcijskih poti, ki jih drugače ne bi bilo mogoče doseči, in/ali boljša selektivnost. Velike koristi je mogoče doseči tudi z vnosom ultrazvočne energije v reakcije sinteze peptidov. Rezultati raziskav so pokazali, da sinteza peptidov s pomočjo ultrazvoka v kratkem reakcijskem času doseže optimiziran izkoristek peptidov z visoko čistostjo, brez racemizacije.

Prednosti ultrazvočne sinteze peptidov

Visoki izkoristki peptidov
Znatno hitrejša sinteza
Večja čistost peptidov
Brez racemizacije
Vzporedna sinteza različnih peptidov
Možnost prilagoditve kateremu koli volumnu

Ultrazvočni cuphorn za enakomerno sonikacijo več reaktorskih posod, npr. za izboljšano sintezo peptidov.

Ultrazvočni cuphorn za enakomerno sonikacijo več reaktorskih posod za izboljšano sintezo peptidov.

Shematski prikaz Merrifieldove sinteze peptidov na trdni fazi, ki jo je mogoče intenzivirati s sonikacijo.

Grafični prikaz Merrifieldove sinteze peptidov na trdni fazi. Obdelava z ultrazvokom se uporablja za spodbujanje in izboljšanje reakcije sinteze ter za odcepljanje sintetiziranih peptidov od smole.
Grafični prikaz: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)

Študija	Proučevani peptidi	Reakcijski čas (klasična metoda v primerjavi z US-SPPS)	Čistost surovega produkta (klasična metoda v primerjavi z US-SPPS)	Racemizacija in stranske reakcije	Ključne ugotovitve
Wołczański et al. (2019)	Met-enkefalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfin	600–1920 min → 48–284 min	24,2–71,3% → 60,6–89,9%	Pri Cys/His niso opazili nobene, niti pri 70°C	~7–12x hitrejša sinteza; znatno izboljšanje čistosti, zlasti pri zaporedjih, nagnjenih k agregaciji, kot je TAT.
Silva et al. (2021)	Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer)	>3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (samo US)	73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2)	Ni bilo preizkušeno; pri Pep2 so opazili rahlo zmanjšanje čistosti	14x krajši čas za Pep1; izkoristki surovih produktov so se znatno povečali.
Merlino et al. (2019)	Modelni pentapeptidi, peptidi do 44-merov, »zahtevna zaporedja« (Aβ 1-42, ACP 65-74)	60 min → 30 min (model)	84% → 93% (model); znatno večja kot pri toplotnem segrevanju (~45°C)	Brez znatnega povečanja deleža enantiomerov Cys/His	Zelo učinkovita pri zahtevnih zaporedjih oziroma zaporedjih, nagnjenih k agregaciji; omogoča manjši presežek reagentov ob ohranjanju visoke čistosti.

Sinteza peptidov na trdni fazi, izboljšana z ultrazvokom

Sinteza peptidov na trdni fazi (SPPS) je kemijska reakcija, ki omogoča sestavljanje peptidne verige z zaporednimi reakcijami derivatov aminokislin na netopnem poroznem nosilcu. Vendar je tradicionalna sinteza peptidov na trdni fazi razmeroma neučinkovit in počasen proces. Zato je ultrazvočno intenziviranje sinteze peptidov zelo cenjeno orodje za učinkovitejšo in hitrejšo sintezo peptidov.
Silva et al. (2021) so primerjali »klasično« sintezo peptidov na trdni fazi (SPPS) s fluorenilmetoksikarbonilno (Fmoc) zaščitno skupino in SPPS s pomočjo ultrazvoka (US) na podlagi priprave treh peptidov, in sicer peptida Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2), specifičnega za receptor 3 za rastni dejavnik fibroblastov (FGFR3), ter novih peptidov Pep2 (RQMATADEA-NH2) in Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS s pomočjo US je v primerjavi s »klasično« metodo omogočila 14-krat krajši čas sestavljanja peptida Pep1 in 4-krat krajši čas sestavljanja peptida Pep2. Zanimivo je, da je SPPS s pomočjo ultrazvoka dala Pep1 z večjo čistostjo (82%) kot »klasična« SPPS (73%). Znatno skrajšanje časa v kombinaciji z doseženo visoko čistostjo surovega peptida je raziskovalno skupino spodbudilo k uporabi SPPS s pomočjo US za velik peptid Pep3, ki vsebuje veliko hidrofobnih aminokislin in homooligomernih zaporedij. Izjemno je, da je bila sinteza tega 25-mernega peptida dosežena v manj kot 6 urah (347 min) z zmerno čistostjo (pribl. 49%).

Ultrazvočna sinteza peptidov na trdni fazi (US-SPPS) je učinkovita tehnika za sintezo peptidov, ki preprečuje racemizacijo.

Hitrejša sinteza peptidov s sintezo na trdni fazi z uporabo ultrazvočnega mešanja.
(Študija in analiza: Wołczański et al., 2019)

Merlino et al. (2019) so prav tako izvedli obsežno študijo učinkov ultrazvoka na sintezo peptidov na trdni fazi z zaščitno skupino Fmoc, ki je omogočila sintezo različnih biološko aktivnih peptidov (do 44-merov) z izjemnim prihrankom materiala in reakcijskega časa. Dokazali so, da obdelava z ultrazvokom ni poslabšala glavnih stranskih reakcij in je izboljšala sintezo peptidov z »zahtevnimi zaporedji«, s čimer se sinteza peptidov na trdni fazi, spodbujena z ultrazvokom (US-SPPS), uvršča med sedanje zelo učinkovite strategije sinteze peptidov.

Razpoložljivost visokozmogljivih sistemov za ultrazvočno (sonično) sintezo peptidov omogoča znatno večje hitrosti sinteze in večjo čistost surovih produktov. (prim. Wołczański et al., 2019)

Ultrazvočna sinteza peptidov omogoča visoke izkoristke peptidov z visoko čistostjo, pri čemer se prepreči racemizacija.

Proučevanje racemizacije. Primerjava pomembnih spektrov 1H NMR modelnih peptidov, sintetiziranih ročno s klasičnim pristopom pri sobni temperaturi in z ultrazvočno metodo pri povišani temperaturi. Kemijski premiki α-protonov His in Cys ter metilenske skupine Acm (levi prikazi) in ɣ-metilnih protonov Val (desni prikazi) kažejo, da sonikacija pri 70°C ne povzroča racemizacije.
(Študija in analiza: Wołczański et al., 2019)

Ultrazvočno odcepljanje peptidov

Po sintezi peptidov na trdni fazi (SPPS) je treba sintetizirane peptide odcepiti od polimernih smol. Ta korak je znan tudi kot odstranitev zaščitnih skupin. Pri primerjavi običajnega stresanja in obdelave z ultrazvokom za odcepljanje peptidov od smole metoda stresanja zahteva pribl. 1 uro, ultrazvočno odcepljanje pa je mogoče izvesti v 15 do 20 min. Ultrazvočno odcepljanje peptidov se lahko uporablja za odcepljanje zaščitenih aminokislin in peptidov, vezanih na polistirenske smole prek benzilnih estrskih vezi.

Ultrazvočno odcepljanje je hitra in zanesljiva tehnika za ločevanje sintetiziranih peptidov od polistirenske smole.

Ultrazvočno odcepljanje peptidov od polistirenske smole v hitrem postopku omogoča visoke izkoristke peptidov z visoko čistostjo, brez racemizacije.
(študija in grafični prikaz: ©Anuradha in Ravindranath, 1995)

Reaktor z ultrazvočnim mešanjem za izboljšano sintezo peptidov.

Reaktor z ultrazvočnim mešanjem za izboljšano in pospešeno sintezo peptidov. Slika prikazuje ultrazvočno napravo UP200St v steklenem reaktorju z mešalom.

Visokozmogljive ultrazvočne naprave za sintezo peptidov

Hielscher Ultrasonics ponuja različne ultrazvočne rešitve za neposredno in posredno sonikacijo. Zmogljivi ultrazvočni procesorji, ki jih je mogoče natančno krmiliti, dovajajo v reakcijsko posodo natanko pravo količino ultrazvočne energije. Ne glede na to, ali kot posode za sintezo uporabljate brizge, epruvete, plošče z več vdolbinicami ali steklene reaktorje, Hielscher Ultrasonics ponuja najprimernejšo ultrazvočno napravo za vašo uporabo pri peptidih.

Ultrazvočni sistemi Hielscher so idealni za sintezo

peptidov po meri
pri proizvodnji peptidov v velikem obsegu
peptidnih knjižnic

Številne sinteze peptidov se izvajajo v brizgah (npr. v reaktorjih v obliki brizg s fritami). Ultrazvočni mešalnik za brizge Hielscher sonificira peptidno raztopino tako, da ultrazvočne valove vnaša skozi steno brizge v tekočino. Ultrazvočni mešalnik za brizge je ena najbolj priljubljenih ultrazvočnih rešitev za sintezo peptidov s pomočjo ultrazvoka.
Ultrazvočni cuphorn je primerno orodje za sonikacijo do 5 reaktorskih posod, VialTweeter pa lahko sprejme do deset reakcijskih epruvet in še dodatnih pet večjih posod z dodatkom za pritrditev z objemko.
Za druge vrste reaktorjev, kot sta Merrifieldov ali Kamyszev reaktor za trdno fazo, ter druge polipropilenske ali borosilikatne posode in reaktorje Hielscher ponuja ultrazvočne naprave za posredno in neposredno sonikacijo s prilagojeno pritrditvijo z objemko ali prirobnico.

Seveda je mogoče večje steklene reaktorje z mešalom, npr. za sintezo v raztopini, preprosto opremiti z ultrazvočnimi sondami (znanimi tudi kot sonotrode ali ultrazvočni rogovi) katere koli velikosti.

Prednosti ultrazvočnih naprav Hielscher za sintezo peptidov

različne vrste ultrazvočnih naprav
neposredna in posredna sonikacija
natančen nadzor intenzivnosti
natančen nadzor temperature
neprekinjen ali pulzni ultrazvok
pametne funkcije, programirljive naprave
na voljo za kateri koli volumen
linearna prilagodljivost obsegu

Za sintezo peptidov na trdni fazi v ploščah z več vdolbinicami oziroma mikrotitrskih ploščah je UIP400MTP idealna naprava. Ultrazvočna kavitacija se posredno in enakomerno vnaša v številne vdolbinice z vzorci za vrhunski prenos snovi in reakcijo sinteze. Oglejte si spodnji videoposnetek in si oglejte ultrazvočno napravo za mikroplošče UIP400MTP v delovanju!

Ultrazvočni homogenizator UIP400MTP omogoča sonikacijo plošč z več vdolbinicami in mikrotitrskih plošč za celično lizo, fragmentacijo DNA, dispergiranje ali homogenizacijo.

Stopite v stik z nami! / Vprašajte nas!

Ultrazvočni homogenizatorji z visokim strigom se uporabljajo pri laboratorijski obdelavi, obdelavi z namiznimi napravami ter pilotni in industrijski obdelavi.

Hielscher Ultrasonics izdeluje visokozmogljive ultrazvočne homogenizatorje za mešanje, dispergiranje, emulgiranje in ekstrakcijo v laboratorijskem, pilotnem in industrijskem obsegu.

Sorodne teme

Koristna dejstva o ultrazvočni sintezi peptidov

Kaj so peptidi?

Peptidi so spojine, v katerih je več aminokislin povezanih z amidnimi vezmi, tako imenovanimi peptidnimi vezmi. Ko so povezani v kompleksne strukture – običajno sestavljene iz 50 ali več aminokislin –, se te velike peptidne strukture imenujejo beljakovine. Peptidi so bistveni gradniki življenja in opravljajo številne funkcije v telesu.

Kako poteka sinteza peptidov?

V organski kemiji, molekularni biologiji in vedah o življenju je sinteza peptidov proces pridobivanja peptidov. Peptidi se kemijsko sintetizirajo s kondenzacijsko reakcijo karboksilne skupine ene aminokisline z amino skupino druge aminokisline. Običajno se uporabljajo strategije z zaščitnimi skupinami (imenovanimi tudi varovalne skupine), da bi preprečili neželene stranske reakcije z različnimi stranskimi verigami aminokislin.
Kemijska sinteza peptidov (in vitro) se najpogosteje začne s spajanjem karboksilne skupine prihajajoče aminokisline (C-konec) z N-koncem rastoče peptidne verige. V nasprotju s to sintezo v smeri od C do N naravna biosinteza beljakovin iz dolgih peptidov v živih organizmih poteka v nasprotni smeri. To pomeni, da se pri biosintezi N-konec prihajajoče aminokisline poveže s C-koncem beljakovinske verige (od N do C).
Večina raziskovalnih in razvojnih protokolov za sintezo peptidov temelji na metodah na trdni fazi, medtem ko se metode sinteze v raztopini uporabljajo pri industrijski proizvodnji peptidov v velikem obsegu.

Kakšno je trenutno stanje tehnike pri sintezi peptidov?
SUS-SPPS (trajnostna SPPS s pomočjo ultrazvoka) dokazano skrajša proces na samo dva koraka na cikel (združeno spajanje/blokiranje reaktivnih mest/odstranitev zaščitnih skupin + enkratno izpiranje), kar znatno zmanjša porabo topil in čas. (prim. Mottola et al., 2025)
TAPS s pomočjo ultrazvoka je nastajajoča kombinacija z dokazanim uspehom pri totalnih sintezah (npr. lipobactin), ki jo pogodbene organizacije za razvoj in proizvodnjo (CDMO) raziskujejo za proizvodnjo aktivnih farmacevtskih učinkovin (API).
Odkrijte prednosti sinteze peptidov z označevanjem TAGGING s pomočjo ultrazvoka!
Neprekinjena obdelava se raziskuje kot nadaljnja izboljšava – opisane so bile platforme za neprekinjeno sintezo v eni posodi s pomočjo sililiranih oznak.
Področje se razvija v smeri načel zelene kemije, pri čemer tako ultrazvok kot TAPS prispevata k manjši porabi topil, manjšim količinam reagentov in izboljšani trajnostnosti.

Literatura / Reference

Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.

Visokozmogljiva ultrazvočna tehnologija! Ponudba izdelkov Hielscher pokriva celoten spekter od kompaktne laboratorijske ultrazvočne naprave prek namiznih naprav do povsem industrijskih ultrazvočnih sistemov.

Hielscher Ultrasonics izdeluje visokozmogljive ultrazvočne homogenizatorje v velikostih od laboratorijskih do industrijskih.