Ultrazvočna sinteza peptidov s tehniko TAGGING
Sinteza peptidov je temelj farmacevtskega raziskovanja in razvoja, vendar konvencionalne metode – sinteza peptidov v trdni fazi (SPPS) in klasično vezanje v raztopinski fazi – ostajajo delovno intenzivni, potratni z reagenti in težko prilagodljivi za večji obseg. Učinkovitejša alternativa se je pojavila v kombinaciji dveh ortogonalnih strategij: tehnike TAGGING (temporary anchoring group) za sestavljanje peptidov v raztopini in ultrazvočne (sonokemične) obdelave za pospešitev korakov vezave, odstranitve zaščitne skupine in nadaljnje obdelave. Skupaj omogočata proizvodnjo terapevtskih peptidov v obsegu od gramov do velikih količin. – kot je na primer lipopeptid lipobaktin, ki deluje kot antibiotik in protirakovo sredstvo – z visoko stopnjo čistosti, manjšo obremenitvijo pri čiščenju in bistveno manj ročnimi postopki.
Kakšne so prednosti ultrazvočne sinteze peptidov?
- Ekonomika v fazi rešitve: Reakcije potekajo v raztopini z znatno manjšo porabo aminokislin kot pri sintezi peptidov v trdni fazi
- Čiščenje s filtriranjem: Peptid, vezan na TAG, se v polarnih topilih useda, zato se vmesni produkti izolirajo s preprosto filtracijo – ni potrebna kolonska kromatografija niti karakterizacija po posameznih korakih.
- Znatno zmanjšanje delovne obremenitve: Odprava vmesnih postopkov čiščenja in spektralnih pregledov prihrani znatno število delovnih ur v celotnem poteku sinteze.
- Sonokemično pospeševanje: Ultrazvok skrajša vsak ključni korak – Odstranjevanje Fmoc-zaščitne skupine, vezava stranskih verig, ciklizacija in splošno odstranjevanje zaščitnih skupin – brez poseganja v selektivnost.
- Visoki donosi, visoka čistost: Vsako vezanje fragmentov in končna sestava lipobaktina potekata z visokim izkoristkom; s splošnim odstranjevanjem zaščitnih skupin se ciljna spojina pridobi z izkoristkom ~83 %.
- Pripravljenost za delovanje v velikem obsegu: Tehnika TAGGING je izrecno opisana kot tehnika, ki omogoča pripravo peptidov v velikih količinah z najvišjo stopnjo čistosti, kar jo naredi za praktičen način pridobivanja gramskih in kilogramskih količin terapevtsko pomembnih lipopeptidov.
- Popolna združljivost metod: Ta pristop je popolnoma združljiv s konvencionalno SPPS in kemijo v raztopini, zato se obstoječe strategije zaščitnih skupin (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) in vezalna sredstva (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) uporabljajo nespremenjeno.
Povejte nam, s kakšnimi izzivi se soočate pri sintezi peptidov. Naši strokovnjaki za ultrazvok vam priporočajo idealno konfiguracijo ultrazvočnega aparata za vaše cilje pri proizvodnji peptidov!
Industrijski sonikator UIP2000hdT z reaktorjem za farmacevtske serije za izboljšano sintezo peptidov
Kaj je tehnika TAGGING?
Pri TAG-metodi je peptidni fragment kovalentno vezan na odstranljivo, smoli podobno sidrno skupino (TAG), ki ostane v raztopini. To omogoča, da se z rastočo verigo ravna kot s peptidom v trdni fazi, vendar v tekoči fazi:
- Po vsakem vezanju ali odstranitvi zaščitne skupine se peptid, vezan na TAG, izolira v trdnem stanju s preprosto filtracijo ali obarvanjem v polarnih/antisolventnih medijih, medtem ko se topne nečistote in stranski produkti izperejo.
- Ker peptid ostane vezan na vezni člen, sta kolonska kromatografija in celovita karakterizacija vsakega vmesnega produkta v veliki meri odveč, kar prinaša znatno prihranek časa in človeškega truda.
- Reakcije se lahko izvajajo v raztopinski fazi, pri čemer se porabi veliko manj aminokislin kot pri SPPS, končni produkt pa se sprosti z odcepitvijo TAG-skupine proti koncu sinteze.
Pri lipobaktinu so pri retrosintezi uporabili tri fragmente – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH in lipidni fragment C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – v kombinaciji s strategijo kondenzacije fragmentov, s čimer se doseže dolg peptid z zelo visokim izkoristkom. (glej Ramya et al., 2025)
Popolna sinteza peptida lipobaktina s pomočjo tehnologije TAG se pospeši z ultrazvokom.
(Študija: Ramya in sod., 2025)
Kako ultrazvok izboljša sintezo peptidov v raztopinski fazi
Ultrazvok se uporablja za intenziviranje in skrajšanje ključnih korakov v fazi raztopine. Pri sintezi lipobaktina, kot jo opisujejo Ramya in sod. (2025), se ultrazvok uporablja za:
Ker se pri TAG-kemiji vmesni produkti že pridobivajo v obliki trdnih snovi, ki jih je mogoče filtrirati, se ultrazvok in TAGGING medsebojno dopolnjujeta: ultrazvok pospeši prenos mase, mešanje in reakcijsko kinetiko, medtem ko sidro ohranja peptid v obliki trdne snovi, ki jo je mogoče izločiti, kar omogoča čisti delovni postopek z minimalno uporabo kromatografije.
Sonicator UP200St: Reaktor z ultrazvočnim mešanjem za pospešeno sintezo peptidov.
Enostavno povečanje obsega proizvodnje peptidov visoke čistosti z ultrazvokom
Pogost izziv pri prenosu postopkov za proizvodnjo peptidov in peptidnih zdravil iz laboratorija v serijsko proizvodnjo je ohranjanje sonokemičnega učinka pri večjih volumnih in neprekinjenem pretoku. Podjetje Hielscher to rešuje s celovito ponudbo ultrazvočnih procesorjev, od laboratorijske do polne industrijske ravni, ki zagotavljajo validirano, ponovljivo moč in dokumentirano nadzorovanje procesa.
Industrijski ultrazvočni aparat UIP4000hdT (4000 W, 20 kHz) za sintezo peptidov z ultrazvočno podporo
Pogosta vprašanja o sintezi peptidov TAG s pomočjo ultrazvoka
Kaj je sinteza peptidov v tekoči fazi (LPPS)?
Sinteza peptidov v tekoči fazi (LPPS) je metoda postopnega sestavljanja peptidov v raztopini z uporabo klasičnih orodij organske kemije. Je ena od štirih glavnih metod za ustvarjanje peptidov in je znana po tem, da je stroškovno učinkovita, prilagodljiva in najbolj okolju prijazna med pristopi k sintezi peptidov. Še posebej je primerna za krajše peptide, čeprav se pri daljših zaporedjih lahko pojavijo težave zaradi izzivov pri ohranjanju enakomernosti reakcij, topnosti in odstranjevanju neželenih stranskih produktov.
Kako ultrazvok izboljša sintezo peptidov v tekoči fazi?
Ultrazvok (sonikacija) izboljša LPPS, saj pospeši tako fazo vezave kot fazo odstranjevanja zaščitne skupine. Ultrazvočni valovi izboljšajo prenos mase in reakcijsko kinetiko, kar vodi do:
- Krajši odzivni časi: cikle vklapljanja in izklapljanja zaščite je mogoče znatno skrajšati
- Višji donosi: bolj popolna pretvorba na vsakem koraku
- Večja čistost surovega proizvoda: manj nepopolnih stranskih produktov sklopitve
- Manjša poraba reagentov: zaradi hitrejših in učinkovitejših reakcij je potrebnih manj ekvivalentov vezalnih reagentov in aminokislin
Kaj je sinteza peptidov s pomočjo tehnologije TAG (TAPS)?
Sinteza peptidov s pomočjo oznak (TAPS) je poseben primer sinteze peptidov v tekoči fazi, pri kateri se peptidi postopoma sestavljajo v raztopini z uporabo topnih organskih oznak namesto trdnega nosilca. Ti označevalci, podobno kot trdni nosilci v SPPS, poenostavljajo izolacijo po vsakem sintezni koraku, saj omogočajo ločevanje s pomočjo precipitacije, filtracije ali ekstrakcije. Označevalci se morajo raztopiti v organskih topilih, hkrati pa ostati ločeni od drugih snovi.
Kako ultrazvok izboljša postopek označevanja?
Ko se ultrazvok združi s sintezo s pomočjo TAG, so prednosti naslednje:
- Hitrejši cikli povezovanja in razklapljanja – ultrazvok pospeši reakcije v raztopini, s čimer skrajša čas, potreben za vsak korak
- Izboljšana topnost in prenos snovi – ultrazvočna kavitacija pomaga ohranjati homogenost označenega peptida v raztopini, kar je ključnega pomena, saj je topnost glavna prednost metode TAPS v primerjavi s SPPS
- Zmanjšana količina reagenta – višja učinkovitost reakcije pomeni, da je potrebnih manj ekvivalentov aminokislin in reagentov za sklopitev
- Bolj popolne reakcije – zmanjšanje količine stranskih produktov nepopolnega sklopljanja, kar vodi do višje čistosti surovega proizvoda in poenostavljenega nadaljnjega čiščenja
Pomemben primer je popolna sinteza lipobaktina s pomočjo tehnike TAG in ob uporabi ultrazvoka, ki je pokazala, da je tehnika TAGGING popolnoma združljiva z metodami v raztopinski fazi ter da ultrazvok omogoča visoke izkoristke v vseh fazah postopka. (glej Ramya et al., 2025)
Katere dolžine peptidov je mogoče pridobiti z ultrazvokom podprtim postopkom TAPS?
Kratki do srednje dolgi peptidi (~5–20 aminokislin) so idealno področje, na katerem TAPS zagotavlja visoko čistost in zanesljive rezultate.
Do daljših peptidov je mogoče priti s strategijo kondenzacije fragmentov: manjši fragmenti (6–10-meri) se sintetizirajo na nosilcu, nato pa se med seboj povežejo, da se oblikuje ciljni peptid v polni dolžini.
Za zelo dolge ali zapletene cilje se lahko uporabi hibridni pristop SPPS/TAPS.
Odkrijte, kako je ultrazvok izboljšal sintezo peptidov v trdni fazi (SPPS)!
Ali je mogoče sintezo peptidov v tekoči fazi z uporabo ultrazvoka razširiti na industrijsko proizvodnjo?
Da, industrijski ultrazvočni aparati – kot so modeli Hielscher UIP2000hdT ali UIP4000hdT – se lahko vgradijo v reaktorje za serijsko proizvodnjo in pretočne celice, kar omogoča proizvodnjo peptidov v velikem obsegu. Naknadna vgradnja v obstoječe reaktorje omogoča izboljšanje uveljavljenih postopkov sinteze peptidov.
Katere so glavne prednosti ultrazvočnega LPPS v primerjavi s klasičnim LPPS?
- Hitrost: Reakcijski časi so se pri vsakem koraku spojevanja in odstranitve zaščitne skupine drastično skrajšali.
- Učinkovitost: Višji izkoristki na posamezno stopnjo vodijo do višjega skupnega izkoristka pri peptidih z več ostanki.
- Trajnost: manj ekvivalentov reagentov in morda tudi manj topila zaradi hitrejših reakcij.
- Dostopnost: za to je potrebna le standardna ultrazvočna kopel, brez posebne opreme.
- Združljivost: deluje s standardnimi reagenti za vezavo (DIC, HATU, TBTU, Oxyma itd.) in strategijami zaščite z zaščitnimi skupinami (Boc, Fmoc).
Literatura / Reference
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
Ultrazvočni CupHorn za intenzivno ultrazvočno obdelavo zaprtih epruvet in viale za sterilno ultrazvočno obdelavo peptidov.
Hielscher Ultrasonics proizvaja visoko zmogljive ultrazvočne homogenizatorje iz laboratorij k industrijska velikost.