Ultrazvočna sinteza peptidov s tehniko TAGGING

Sinteza peptidov je temelj farmacevtskih raziskav in razvoja, vendar so običajne metode – sinteza peptidov na trdni fazi (SPPS) in klasično spajanje v raztopini – še vedno delovno intenzivne, potratne pri porabi reagentov in težavne za prenos v večje merilo. Učinkovitejša alternativa se je pojavila s kombinacijo dveh medsebojno neodvisnih strategij: tehnike TAGGING (začasna sidrna skupina) za sestavljanje peptidov v raztopini in ultrazvočne (sonokemijske) obdelave za pospeševanje spajanja, odstranjevanja zaščitnih skupin in obdelave reakcijske zmesi. Skupaj omogočata proizvodnjo terapevtskih peptidov – kot je lipopeptid lipobactin z antibiotičnim in protirakavim delovanjem – od gramskega do velikega proizvodnega merila, z visoko čistostjo, manjšo potrebo po čiščenju in bistveno manj ročnimi postopki.

Katere prednosti prinaša ultrazvočna sinteza peptidov?

• Ekonomičnost sinteze v raztopini: Reakcije potekajo v raztopini z bistveno manjšo porabo aminokislin kot pri sintezi peptidov na trdni fazi
• Čiščenje s filtracijo: Peptid, vezan na TAG, se obori v polarnih topilih, zato se intermediati izolirajo s preprosto filtracijo – kolonska kromatografija ali karakterizacija po vsakem koraku nista potrebni.
• Izjemen prihranek dela: Opustitev vmesnega čiščenja in preverjanj spektrov prihrani veliko delovnih ur v celotnem sklopu sinteznih postopkov.
• Sonokemijsko pospeševanje: Sonikacija skrajša vsak ključni korak – odstranjevanje zaščitne skupine Fmoc, spajanje stranskih verig, ciklizacijo in odstranjevanje vseh zaščitnih skupin – brez zmanjšanja selektivnosti.
• Visoki izkoristki, visoka čistost: Vsako spajanje fragmentov in končno sestavljanje lipobactina potekata z visokim izkoristkom; odstranjevanje vseh zaščitnih skupin daje ciljni produkt z izkoristkom ~83 %.
• Pripravljenost za veliko proizvodno merilo: Tehnika TAGGING je izrecno opisana kot tehnika, ki omogoča pripravo peptidov najvišje čistosti v velikem proizvodnem merilu, zato je praktična pot do gramskih in kilogramskih količin terapevtsko pomembnih lipopeptidov.
• Popolna združljivost metod: Pristop je popolnoma združljiv z običajno SPPS in kemijo v raztopini, zato se obstoječe strategije zaščitnih skupin (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) in reagenti za spajanje (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) uporabljajo nespremenjeni.

Kaj je tehnika TAGGING?

Pri pristopu TAG je peptidni fragment kovalentno pritrjen na odstranljivo sidrno skupino (TAG), podobno smoli, ki ostane v raztopini. To omogoča ravnanje z rastočo verigo kot s peptidom na trdni fazi, vendar v tekoči fazi:

• Po vsakem spajanju ali odstranjevanju zaščitnih skupin se peptid, vezan na TAG, pridobi v trdni obliki s preprosto filtracijo ali obarjanjem v polarnih medijih oziroma medijih z antitopili, topne nečistoče in stranski produkti pa se sperejo.
• Ker peptid ostane pritrjen na povezovalno skupino, se kolonska kromatografija in popolna karakterizacija vsakega intermediata večinoma opustita, kar prihrani veliko časa in dela.
• Reakcije lahko potekajo v raztopini z veliko manjšo porabo aminokislin kot pri SPPS, končni produkt pa se sprosti z odcepitvijo skupine TAG proti koncu sinteze.

 
Pri retrosintezi lipobactina so bili uporabljeni trije fragmenti – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH in lipidni fragment C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – ki so bili spojeni s strategijo kondenzacije fragmentov za pridobitev dolgega peptida z zelo visokimi izkoristki. (prim. Ramya et al., 2025)

Celotna sinteza peptida lipobactin s pomočjo TAG se pospeši s sonikacijo.
(Študija: Ramya et al., 2025)

Kako sonikacija izboljša sintezo peptidov v raztopini

Ultrazvočna obdelava se uporablja za intenziviranje in skrajševanje ključnih korakov v raztopini. Pri sintezi lipobactina, kot so jo opisali Ramya et al. (2025), se sonikacija uporablja za:

Ker kemija TAG že daje intermediate v obliki trdnih snovi, ki jih je mogoče filtrirati, se ultrazvočna obdelava in TAGGING dopolnjujeta: ultrazvok pospešuje prenos snovi, mešanje in reakcijsko kinetiko, sidro pa ohranja peptid v obliki trdne snovi, ki jo je mogoče izločiti, za čist potek dela z malo kromatografije.

Preprost prenos sinteze peptidov visoke čistosti v večje merilo s sonikacijo

Pogost izziv pri prenosu postopkov za peptide in peptidna zdravila iz laboratorija v proizvodnjo je ohranjanje sonokemijskega učinka pri večjih prostorninah in neprekinjenem toku. Hielscher to rešuje z neprekinjenim naborom ultrazvočnih procesorjev od laboratorijskega do polnega industrijskega merila, ki zagotavljajo validirano, ponovljivo moč in dokumentiran nadzor procesa.
 

Industrijski sonikator UIP4000hdT (4000W, 20kHz) za ultrazvočno izboljšano sintezo peptidov

Literatura / reference

• M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
• Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
• Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
• M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.