Sonikacija v mikroploščah pri proteomiki shotgun – opis uporabe

Proteomika shotgun temelji na učinkoviti in ponovljivi pripravi vzorcev, s katero kompleksni biološki material pretvorimo v peptide, pripravljene za LC-MS/MS. Sonikator za mikroplošče UIP400MTP podpira ta proces, saj omogoča standardizirano vzporedno sonikacijo vzorcev majhnih volumnov ter laboratorijem pomaga izboljšati razrušitev, ekstrakcijo in ponovno solubilizacijo v delovnih postopkih z mikroploščami. Ta opis uporabe pojasnjuje, kako je mogoče UIP400MTP vključiti v pripravo vzorcev za proteomiko, pri čemer kot laboratorijsko preizkušen primer uporablja objavljeni delovni postopek za zunajcelične vezikle iz raziskav PLA2G12A/Th17.

Sonikacija v mikroploščah za bolj ponovljivo proteomiko shotgun

Za raziskovalce na področju proteomike je ponovljiva priprava vzorcev ključna za visokokakovostne podatke LC-MS/MS. Sonikator za mikroplošče UIP400MTP podpira standardizirano vzporedno sonikacijo v delovnih postopkih s ploščami ter v postopkih za majhne volumne z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev.

Posebej uporaben je za laboratorije, ki delajo z:

• Velikimi nabori vzorcev, ki zahtevajo dosledno obdelavo v številnih vdolbinicah
• Materialom z majhno vhodno količino, pri katerem je treba izgubo vzorca in variabilnost čim bolj zmanjšati
• Vzorci, bogatimi z lipidi, kot so zunajcelični vezikli
• Kompleksnimi biološkimi pripravki, ki zahtevajo učinkovito razrušitev, ekstrakcijo ali ponovno solubilizacijo
• Primerjalno proteomiko shotgun, pri kateri je bistvena ponovljivost med pogoji in ponovitvami

Z vključitvijo sonikacije v mikroploščah pred proteolitično razgradnjo lahko raziskovalci izboljšajo pripravljenost vzorcev za:

• Ekstrakcijo in ponovno solubilizacijo beljakovin
• Proteolitično razgradnjo s tripsinom/Lys-C
• Zajem podatkov z nano-LC/MS/MS
• Nadaljnjo kvantitativno proteomsko analizo

Sonikacija v mikroploščah lahko koristi:

• Osrednjim laboratorijem za proteomiko
• Laboratorijem za raziskovanje EV
• Laboratorijem za imunologijo in celično biologijo
• Skupinam za translacijske raziskave
• Ekipam na področju ved o življenju, ki prehajajo s priprave posameznih vzorcev na delovne postopke z večjo zmogljivostjo obdelave vzorcev

Priprava vzorcev z visoko zmogljivostjo obdelave za analizo proteoma zunajceličnih veziklov

Kaj je proteomika shotgun?

Proteomika shotgun je postala osrednja analitska strategija za karakterizacijo kompleksnih bioloških vzorcev, od lizatov celotnih celic in tkivnih ekstraktov do prečiščenih organelov, zunajceličnih veziklov in kliničnih vzorcev z majhno vhodno količino. Njena ključna prednost je povezovanje proteolitične razgradnje beljakovin, tekočinske kromatografije s tandemsko masno spektrometrijo visoke ločljivosti in računalniškega sklepanja o beljakovinah na podlagi peptidov. Vendar je kakovost končnega nabora podatkov o proteomu določena že dolgo pred tem, ko vzorec doseže masni spektrometer. Učinkovita razrušitev vzorca, solubilizacija beljakovin, odstranjevanje motečih snovi, ponovljiva encimska razgradnja in zanesljivo pridobivanje peptidov so odločilni za globino pokritosti in kvantitativno zanesljivost.
Za raziskovalce na področju proteomike in laboratorije na področju ved o življenju, ki delajo z omejenimi količinami vzorcev ali dragocenimi vzorci, je priprava vzorcev pogosto ozko grlo.

Izziv zunajceličnih veziklov v proteomiki

Zunajcelični vezikli (EVs) na primer predstavljajo posebej zahtevno skupino vzorcev. Gre za nanometrske delce, obdane z membrano in bogate z lipidi, z razmeroma majhnim izkoristkom beljakovin ter veliko možnostjo prenosa lipidov, soli, detergentov, serumskih beljakovin in drugih sestavin matriksa v nadaljnje korake. Te lastnosti lahko motijo učinkovitost proteolitične razgradnje, kromatografsko učinkovitost, stabilnost elektrorazprševanja in identifikacijo peptidov. Delovni postopek priprave za proteomiko EV mora biti zato dovolj učinkovit, da razruši strukture veziklov in solubilizira beljakovinski tovor, hkrati pa mora ostati združljiv z nadaljnjo encimsko razgradnjo in analizo LC-MS/MS.
V tem kontekstu ultrazvočna obdelava, združljiva z mikroploščami, ponuja praktičen pristop k ponovljivi vzporedni obdelavi vzorcev. Modela sonikatorjev za mikroplošče Hielscher UIP400MTP (400 W) in UIP550MTP (550 W) sta zasnovana za sonikacijo vzorcev v ploščah z več vdolbinicami in posodah za majhne volumne ter podpirata delovne postopke z večjo zmogljivostjo obdelave vzorcev kot običajni sonikatorji z eno sondo. Za proteomske laboratorije je ta format privlačen, ker lahko zmanjša variabilnost ročnega dela, izboljša vzporedno obdelavo več vzorcev in se bolj naravno vključi v zaporedja priprave vzorcev na ploščah.

Primer delovnega postopka

Nedavni delovni postopek za proteomiko zunajceličnih veziklov v raziskavah biologije celic Th17, ki jo usmerja PLA2G12A, je uporaben, laboratorijsko preizkušen primer vključitve sonikatorja za mikroplošče UIP400MTP v pripravo vzorcev za proteomiko shotgun. V tej seriji raziskav so vzorce EV obdelali za analizo proteoma z obdelavo z metanolom, sonikacijo z UIP400MTP, centrifugiranjem, sušenjem, proteolitično razgradnjo s tripsinom/Lys-C in tekočinsko kromatografijo z nanopretokom (LC), sklopljeno s tandemsko masno spektrometrijo visoke ločljivosti (MS). O bioloških raziskavah so leta 2026 poročali Mochizuki-Ono in sodelavci; proteomska analiza je pomagala opredeliti, kako PLA2G12A spreminja beljakovine tovora EV v kontekstu patogenih odzivov celic T.

Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP

Zakaj sonikacija v mikroploščah?
UIP400MTP omogoča standardizirano vzporedno sonikacijo vzorcev majhnih volumnov. To je uporabno, kadar so pomembni ponovljivost, majhna vhodna količina vzorca in zmogljivost obdelave več vzorcev.


Kontrolni seznam za nadzor kakovosti

• Potrdite, da je vhodna količina EV, izražena kot beljakovinski ekvivalent, pri vseh vzorcih enaka.
• Uporabite naključne ali uravnotežene razporeditve vzorcev za obdelavo.
• Ohranite enake volumne metanola, čase sonikacije, čase sušenja in volumne proteolitične razgradnje.
• Spremljajte izkoristek peptidov in skupno število identificiranih beljakovin.
• Preverite delež necepljenih mest in porazdelitev dolžin peptidov.
• Preglejte obliko kromatografskih vrhov in ponovljivost retencijskih časov.
• Vključite slepe vzorce za spremljanje prenosa ostankov med vzorci.
• Pri večjih raziskavah uporabite združene vzorce za nadzor kakovosti (QC).
• Ocenite koeficient variacije ponovitev.
• Uporabite PCA ali sorodne metode za prepoznavanje učinkov serij ali odstopajočih vzorcev.

Priporočila za beleženje

Pri objavljanju ali dokumentiranju tega delovnega postopka navedite vhodno količino EV, format plošče, volumen metanola, amplitudo in čas sonikacije z UIP400MTP, pogoje centrifugiranja, metodo sušenja, pufer za proteolitično razgradnjo, koncentracijo encima, čas proteolitične razgradnje, pogoje zakisljevanja, platformo LC-MS/MS, način zajema podatkov, različico programske opreme, podatkovno zbirko, prag FDR, metodo normalizacije in statistični delovni postopek.
Vsi sonikatorji za mikroplošče Hielscher samodejno beležijo pomembne procesne parametre, kot so amplituda, trajanje sonikacije in temperatura, z datumskim in časovnim žigom v datoteko CVS na vgrajeni kartici SD. Beleženje podatkov za ponovljivost in nadzor kakovosti še nikoli ni bilo lažje!

Podrobnosti raziskave: proteomika shotgun EV v raziskavi PLA2G12A

Raziskava PLA2G12A ponuja konkreten primer uporabe UIP400MTP v delovnem postopku proteomike shotgun. Biološko vprašanje je bilo, kako izločena fosfolipaza PLA2G12A spreminja zunajcelične vezikle, ki izvirajo iz celic Th17, in s tem vpliva na diferenciacijo patogenih celic T. Avtorji so pokazali, da PLA2G12A deluje na membrane EV in ustvarja lizofosfolipide, vključno z 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine, ter da nadaljnje signaliziranje lizofosfatidne kisline prek LPA2 prispeva k diferenciaciji Th17. Poleg lipidnega signaliziranja so raziskave proučevale tudi tovor EV, vključno z vsebnostjo RNA in beljakovin, zaradi česar je bila proteomika shotgun pomembna sestavina strategije karakterizacije.
V delovnem postopku priprave EV so celice Th17 gojili v gojišču, ki je vsebovalo fetalni goveji serum z odstranjenimi eksosomi. Supernatante kultur so najprej centrifugirali, da so odstranili celice, filtrirali skozi filter 0,22 µm, koncentrirali z ultrafiltracijo/ultracentrifugiranjem, sprali, resuspendirali v PBS in kvantificirali s testom BCA za beljakovine. Ta predhodna priprava EV je zagotovila, da je bilo mogoče v proteomski delovni postopek vključiti določeno količino materiala EV, izraženo kot beljakovinski ekvivalent.
Za proteomsko analizo shotgun so avtorji uporabili vzorce EV, ki so ustrezali 5 µg beljakovinskih ekvivalentov. Te vzorce so posušili v epruvetah PCR in dodali 25 µL metanola. Nato so vzorce sonicirali 3 minute s sonikatorjem za mikroplošče UIP400MTP. Po sonikaciji so vzorce centrifugirali pri 4°C 20 minut pri 19.000 × g. Po odstranitvi 20 µL supernatanta so vzorce centrifugirali do suhega. Beljakovine so nato s sonikacijo raztopili v 4 µL raztopine tripsina/Lys-C s koncentracijo 100 ng/µL v 50 mM amonijevem hidrogenkarbonatu. Proteolitično razgradnjo so izvajali 2 uri pri 37°C s stresanjem pri 300 rpm. Razgradni produkt so zakisali z 1 µL 1,25% trifluoroocetne kisline in ga analizirali s tekočinsko kromatografijo z nanopretokom, sklopljeno s tandemsko masno spektrometrijo visoke ločljivosti.
Ta delovni postopek poudarja več uporabnih načel za proteomiko EV z majhno vhodno količino. Prvič, vhodno količino so normalizirali glede na beljakovinski ekvivalent, kar je pomembno pri primerjavi EV iz različnih genotipov ali obravnav. Drugič, metanol so uporabili pred sonikacijo, s čimer so podprli razrušitev in ekstrakcijo ter se izognili detergentnim sistemom, ki lahko otežijo LC-MS/MS. Tretjič, korak sonikacije je bil kratek in standardiziran, kar je združljivo z vzporedno obdelavo vzorcev. Četrtič, proteolitično razgradnjo s tripsinom/Lys-C so izvedli v zelo majhnem volumnu, s čimer so zmanjšali redčenje in podprli pridobivanje peptidov pri majhni vhodni količini. Nazadnje je neposreden prehod od proteolitične razgradnje k zakisljevanju in LC-MS/MS zmanjšal število nepotrebnih korakov rokovanja.
Nadaljnja metoda LC-MS/MS je uporabljala reverznofazno ločevanje z nanopretokom, sklopljeno z masnim spektrometrom Q-Exactive HF Orbitrap. Vzorce so zadržali na predkoloni C18, nato pa jih ločili na analitski koloni z notranjim premerom 50 µm pri 200 nL/min in 40°C. Gradient je v 60 minutah prešel od nizkega deleža organskega topila do 35% topila B, čemur sta sledila spiranje z visokim deležem organskega topila in ponovna vzpostavitev ravnotežja. Zajem podatkov MS so izvedli v načinu pozitivnih ionov z zajemom podatkov, neodvisnim od podatkov, in trčno disociacijo pri višji energiji. Datoteke s surovimi podatki DIA so analizirali z DIA-NN 1.8 in spektralno knjižnico, napovedano in silico.