Ultrazvokna obdelava mikroplošč v proteomiki po metodi »shotgun« – Navodila za uporabo

Proteomika po metodi »shotgun« temelji na učinkoviti in ponovljivi pripravi vzorcev, s katero se kompleksno biološko gradivo pretvori v peptide, pripravljene za analizo z LC-MS/MS. Ultrazvočni aparat za mikroplošče UIP400MTP podpira ta proces, saj omogoča standardizirano, vzporedno ultrazvočno obdelavo vzorcev majhnega volumna, s čimer laboratorijem pomaga izboljšati razbijanje, ekstrakcijo in ponovno raztapljanje v delovnih postopkih, ki temeljijo na mikroploščah. Ta aplikacijski opis prikazuje, kako je mogoče sonikator UIP400MTP vključiti v pripravo proteomskih vzorcev, pri čemer kot laboratorijsko preizkušen primer uporablja objavljen delovni tok z ekstracelularnimi veziklami iz študij PLA2G12A/Th17.

Ultrazvok mikroplošč za bolj ponovljivo proteomiko po metodi »shotgun«

Za raziskovalce na področju proteomike je ponovljiva priprava vzorcev ključnega pomena za pridobivanje visokokakovostnih podatkov LC-MS/MS. Ultrazvočni aparat za mikroplošče UIP400MTP omogoča standardizirano, vzporedno ultrazvočno obdelavo v delovnih postopkih, ki temeljijo na mikroploščah, ter v postopkih z majhnimi volumni in visoko zmogljivostjo.

To je še posebej koristno za laboratorije, ki se ukvarjajo z:

• Veliki sklopi vzorcev, ki zahtevajo enotno obdelavo v številnih luknjah
• Surovine z omejenim vnosom, pri katerih je treba izgubo vzorcev in spremenljivost zmanjšati na minimum
• Vzorci z visoko vsebnostjo lipidov, kot so ekstracelularne vezikle
• Kompleksni biološki preparati, ki zahtevajo učinkovito razgradnjo, ekstrakcijo ali ponovno raztapljanje
• Primerjalna proteomika s širokim spektrom, pri kateri je ključnega pomena ponovljivost v različnih pogojih in ponovitvah

Z vključitvijo ultrazvočne obdelave mikroplošč pred prebavo lahko raziskovalci izboljšajo pripravljenost vzorcev za:

• Ekstrakcija in ponovna raztopitev beljakovin
• Prebava s tripsinom/Lys-C
• Zbiranje podatkov z metodo Nano-LC/MS/MS
• Kvantitativna proteomska analiza v nadaljnjih fazah

 

Z zaupanjem povečajte obseg priprave vzorcev za proteomiko!
Preberite, kako ultrazvok na mikroploščah pomaga zmanjšati variabilnost pri ročnem delu, izboljšati razgradnjo vzorcev ter pripraviti kompleksne biološke vzorce za zanesljivo analizo LC-MS/MS.

Zahteva za informacije


E-poštni naslov (obvezno)


Izdelek ali področje zanimanja



Strinjam se s Politiko zasebnosti









Zahtevajte informacije

Ultrazvok na mikroploščah lahko prinaša naslednje prednosti:

• Osrednje zmogljivosti za proteomiko
• Raziskovalni laboratoriji za električna vozila
• Laboratoriji za imunologijo in celično biologijo
• Skupine za translacijsko raziskovanje
• Ekipe na področju življenjskih znanosti, ki prehajajo od priprave posameznih vzorcev k delovnim tokovom z večjo zmogljivostjo

Priprava vzorcev z visoko zmogljivostjo za analizo proteoma ekstracelularnih veziklov

Kaj je proteomika s tehnologijo Shotgun?

Proteomika po metodi »shotgun« je postala osrednja analitična strategija za karakterizacijo kompleksnih bioloških vzorcev, od lizatov celih celic in tkivnih ekstraktov do prečiščenih organelov, ekstracelularnih veziklov in kliničnih vzorcev z majhno količino izhodnega materiala. Njena glavna prednost je v povezavi med prebavo beljakovin, visokoločljivo tekočinsko kromatografijo s tandemsko masno spektrometrijo ter računalniškim sklepanjem o beljakovinah na podlagi peptidov. Vendar se kakovost končnega niza podatkov o proteomu določi že dolgo preden vzorec prispe do masnega spektrometra. Učinkovita razgradnja vzorca, solubilizacija beljakovin, odstranjevanje motilnih snovi, ponovljiva encimska prebava in zanesljivo pridobivanje peptidov so odločilni dejavniki za globino pokritosti in kvantitativno zanesljivost.
Za raziskovalce na področju proteomike in laboratorije za biološke znanosti, ki delajo z omejenimi ali dragocenimi vzorci, je priprava vzorcev pogosto ozko grlo.

Izziv ekstracelularnih veziklov v proteomiki

Ekstracelularne vezikle (EV) na primer predstavljajo posebej zahtevno skupino vzorcev. Gre za membransko omejene, z lipidi bogate delce v nanometrskem obsegu z relativno nizkim izkoristkom beljakovin in visokim tveganjem za prenos lipidov, soli, detergentov, serumskih beljakovin in drugih sestavin matriksa. Te lastnosti lahko vplivajo na učinkovitost prebave, kromatografsko zmogljivost, stabilnost pri elektrosprayu in identifikacijo peptidov. Postopek priprave za proteomiko EV mora zato biti dovolj močan, da razgradi strukture veziklov in raztopi beljakovinsko vsebino, hkrati pa mora ostati združljiv z nadaljnjo encimsko prebavo in analizo LC-MS/MS.
V tem kontekstu ultrazvočna obdelava, združljiva z mikroploščami, ponuja praktičen pristop za ponovljivo in vzporedno obdelavo vzorcev. Hielscherjevi modeli ultrazvočnih aparatov za mikroplošče UIP400MTP (400 W) in UIP550MTP (550 W) so zasnovani za ultrazvočno obdelavo vzorcev v večluknjastih ploščah in posodah z majhnim volumnom, kar omogoča delovne tokove z večjo zmogljivostjo kot pri običajnih ultrazvočnih aparatih z eno sondo. Za proteomske laboratorije je ta format privlačen, ker lahko zmanjša variabilnost pri ročnem delu, izboljša vzporedno obdelavo več vzorcev in se bolj naravno vključi v poteke priprave vzorcev na podlagi plošč.

Primer poteka dela

Nedavni proteomski postopek za analizo ekstracelularnih veziklov v biologiji Th17-celic, ki jih aktivira PLA2G12A, ponuja koristen, v laboratoriju preizkušen primer, kako je mogoče ultrazvočni aparat za mikroplošče UIP400MTP vključiti v pripravo vzorcev za proteomiko po metodi »shotgun«. V tej seriji študij so bili vzorci ekstracelularnih veziklov obdelani za proteomsko analizo z uporabo obdelave z metanolom, sonikacije z UIP400MTP, centrifugiranja, sušenja, prebave s tripsinom/Lys-C ter nano-tokovne LC-tandemske MS visoke ločljivosti. O isti biološki raziskavi je bilo najprej poročano v predtisku na bioRxiv, nato pa objavljeno v reviji »Cell Reports«, kjer je proteomska analiza pomagala opredeliti, kako PLA2G12A spreminja proteine v tovoru EV v okviru patogenih odzivov T-celic.

Sonikator z več vdolbinicami UIP400MTP

Zakaj ultrazvočno obdelavo mikroplošč?
Naprava UIP400MTP omogoča standardizirano, vzporedno ultrazvočno obdelavo vzorcev majhnega volumna. To je koristno, kadar so pomembni ponovljivost, majhna količina vzorca in zmogljivost obdelave več vzorcev hkrati.

Seznam za preverjanje kakovosti

• Preverite, ali je vnos beljakovinskega ekvivalenta EV enak v vseh vzorcih.
• Uporabite naključne ali uravnotežene sheme obdelave vzorcev.
• Obseg metanola, čas ultrazvočne obdelave, čas sušenja in obseg razgradnje morajo biti vedno enaki.
• Spremljajte izkoristek peptidov in identifikacijo vseh beljakovin.
• Preverite stopnjo neuspešnega cepitve in porazdelitev dolžin peptidov.
• Preverite obliko kromatografskega vrha in ponovljivost retencijskega časa.
• Vključite prazna mesta za spremljanje prenosa.
• Za obsežnejše študije uporabite združene vzorce za nadzor kakovosti.
• Ocenite koeficient variacije za ponovitev.
• Uporabite metodo PCA ali sorodne metode za prepoznavanje vplivov serije ali izjemnih vzorcev.

Priporočila za vodenje zapisnikov

Pri objavi ali dokumentiranju tega delovnega postopka navedite količino vnesenega EV, format plošče, volumen metanola, amplitudo in čas ultrazvočne obdelave z napravo UIP400MTP, pogoje centrifugiranja, metodo sušenja, pufersko raztopino za prebavo, koncentracijo encima, čas prebave, pogoje zakisanja, platformo LC-MS/MS, način pridobivanja podatkov, različico programske opreme, bazo podatkov, prag FDR, metodo normalizacije ter statistični delovni postopek.
Vsi ultrazvočni aparati za mikroplošče podjetja Hielscher samodejno beležijo pomembne parametre procesa, kot so amplituda, trajanje ultrazvočne obdelave in temperatura, skupaj z datumom in uro, v obliki datoteke CSV na vgrajeni SD-kartici. Beleženje podatkov za ponovljivost in nadzor kakovosti še nikoli ni bilo lažje!

Podrobna analiza študije: Proteomika EV Shotgun v študiji PLA2G12A

Študija PLA2G12A ponuja konkreten primer uporabe UIP400MTP v delovnem postopku »shotgun« proteomike. Biološko vprašanje je bilo, kako izločena fosfolipaza PLA2G12A spreminja ekstracelularne vezikle, ki izvirajo iz celic Th17, in s tem vpliva na diferenciacijo patogenih T-celic. Avtorji so pokazali, da PLA2G12A deluje na membrane ekstracelularnih veziklov (EV) in pri tem proizvaja lizofosfolipide, vključno z 1-oleoil-lizofosfatidiletanolaminom, ter da signalizacija lizofosfatidne kisline prek LPA2 prispeva k diferenciaciji celic Th17. Poleg signalizacije prek lipidov so študije preučevale tudi vsebino EV, vključno z vsebnostjo RNA in beljakovin, zaradi česar je proteomika po metodi »shotgun« postala pomemben del strategije karakterizacije.
V delovnem postopku priprave EV so bile celice Th17 gojene v gojišču, ki je vsebovalo fetalno goveje serum, iz katerega so bili odstranjeni eksosomi. Supernatanti iz kulture so bili najprej centrifugirani za odstranitev celic, filtrirani skozi 0,22 µm filter, koncentrirani z ultrafiltracijo/ultracentrifugacijo, oprani, ponovno suspendirani v PBS in količinsko določeni z BCA-testom za beljakovine. Ta predhodna priprava EV je zagotovila, da se je v proteomski delovni tok lahko prenesla določena količina EV-materiala, enakovredna količini beljakovin.
Za proteomsko analizo po metodi »shotgun« so avtorji uporabili vzorce EV, ki so ustrezali 5 µg beljakovinskih ekvivalentov. Te vzorce so posušili v PCR-epruvetah in jim dodali 25 µL metanola. Nato so vzorce 3 minute obdelovali z ultrazvokom z uporabo ultrazvočnega aparata za mikroplošče UIP400MTP. Po sonikaciji so vzorce centrifugirali pri 4 °C 20 minut pri 19.000 × g. Po odstranitvi 20 µL supernatanta so vzorce centrifugirali do suhega. Beljakovine so nato z ultrazvokom raztopili v 4 µL raztopine tripsina/Lys-C v koncentraciji 100 ng/µL v 50 mM amonijevem bikarbonatu. Prebavo smo izvajali 2 uri pri 37 °C ob pretresanju s hitrostjo 300 rpm. Prebavni produkt smo nakisali z 1 µL 1,25-odstotne trifluoroocetne kisline in ga analizirali z nano-tokovno LC-tandemsko masno spektrometrijo visoke ločljivosti.
Ta delovni postopek izpostavlja več koristnih načel za proteomiko EV z majhnim vnosom. Prvič, vnos je bil normaliziran glede na beljakovinski ekvivalent, kar je pomembno pri primerjavi EV iz različnih genotipov ali obdelav. Drugič, pred sonikacijo je bil uporabljen metanol, ki je podprl razgradnjo in ekstrakcijo, hkrati pa se je izognil uporabi detergentnih sistemov, ki bi lahko otežili LC-MS/MS. Tretjič, korak sonikacije je bil kratek in standardiziran, kar omogoča vzporedno obdelavo vzorcev. Četrtič, prebava s tripsinom/Lys-C je bila izvedena v zelo majhnem volumnu, kar zmanjšuje razredčenje in omogoča izkoristek peptidov pri majhnih količinah vzorca. Nazadnje je neposreden prehod od prebave k zakisanju in LC-MS/MS zmanjšal nepotrebne korake pri ravnanju z vzorci.
Pri nadaljnji LC-MS/MS metodi je bila uporabljena ločitev z reverzno fazo z nano-pretokom, povezana z masnim spektrometrom Q-Exactive HF Orbitrap. Vzorci so bili zadržani na predkoloni C18, nato pa ločeni na analitični koloni z notranjim premerom 50 µm pri pretoku 200 nL/min in temperaturi 40 °C. Gradient je v 60 minutah prešel od nizke vsebnosti organskega topila do 35 % topila B, čemur je sledilo izpiranje z visoko vsebnostjo organskega topila in ponovno uravnoteženje. Pridobivanje MS-podatkov je potekalo v načinu pozitivnih ionov z uporabo podatkovno neodvisnega pridobivanja s kolizijsko disociacijo z višjo energijo. Surove datoteke DIA so bile analizirane z uporabo programa DIA-NN 1.8 s spektralno knjižnico, napovedano in silico.