Proteomski delovni tokovi z visoko zmogljivo prebavo beljakovin

Proteomika je bistveno področje za razumevanje bioloških procesov in sistemov, pri čemer je prebava beljakovin kritičen korak v njenem poteku dela. Tradicionalno se prebava beljakovin izvaja v raztopini z uporabo proteolitičnih encimov, kot je tripsin, ki specifično hidrolizira peptidne vezi na lizinskih in argininskih ostankih. Ta proces ustvarja peptide, ki so primerni za ionizacijo in fragmentacijo v aplikacijah masne spektrometrije (MS). Vendar pa konvencionalne metode razgradnje zahtevajo 12–24 ur, da se doseže dokončanje, kar ustvarja pomembna ozka grla v proteomskih delovnih tokovih.
Ultrasonication ponuja močno alternativo, ki dramatično skrajša čas prebave z ur na le nekaj minut. V kombinaciji z naprednimi sonikatorji z več vzorci, kot so Hielscher CupHorn, VialTweeter in ultrazvočni UIP400MTP s 96 vdolbicami, ultrasonication omogoča pospešeno, visoko zmogljivo proteomiko. Te tehnologije racionalizirajo delovne tokove, skrajšajo čas priprave vzorcev in povečujejo učinkovitost, ne da bi pri tem ogrozili obnovljivost ali kakovost podatkov.

Vloga ultrazvočne energije pri prebavi beljakovin

Ultrasonication uporablja usmerjene ultrazvočne valove za ustvarjanje kavitacije - lokaliziranih mikromehurčkov, ki se zrušijo in ustvarijo intenzivne strižne sile. Ta pojav povečuje prenos mase, spodbuja mešanje encimov s substrati in razvija beljakovinske strukture, ki izpostavljajo mesta cepitve proteolitičnim encimom, kot je tripsin.
Rezultat? Znatno skrajšanje časa razgradnje brez ogrožanja učinkovitosti ali obnovljivosti.

Ultrazvočno izboljšana proteolitična prebava: metodologija in rezultati

Protokol pospešene prebave

Ultrazvočno podprta prebava združuje proteolitične encime in ultrazvočno energijo za pospešitev delovnega toka. Na primer, z uporabo Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) potek prebave poteka na naslednji način:

1. Redukcija: Vzorci beljakovin (0,5 mg/ml, 20 μL) se obdelajo z DTT (2 μL, 110 mM) v amonijevem bikarbonatnem pufru (12,5 mM). Sonication se uporablja pri 50% amplitudi 5 minut.
2. Alkilacija: Po dodajanju IAA (2 μL, 400 mM) se ultrazvočno razbijanje ponovi pod enakimi pogoji.
3. Prebava: Vzorci se razredčijo in inkubirajo z imobiliziranimi nanodelci tripsina. Zadnji krog ultrazvočnega razbijanja (5 minut) zaključi prebavo. Peptidi se ločijo, posušijo in shranijo za analizo MS.

Ta ultrazvočna metoda skrajša skupni čas priprave z 12 ur na manj kot 30 minut. Kljub pospešenemu procesu donos in kakovost peptidov ostajata skladna s tradicionalnimi metodami čez noč.

Učinkovitost ultrazvočne prebave beljakovin

V primerjalnih študijah z uporabo proteomov E. coli:

• Identifikacija beljakovin: Ultrazvočno prebavljeni vzorci so v 5 minutah identificirali 777 beljakovin v primerjavi z 817 v 12 urah. Skupne identifikacije beljakovin so presegle 70%.
• Obnovljivost: Ponovljene analize so pokazale korelacijske vrednosti nad 98% znotraj vsake metode, kar dokazuje zanesljivost.
• Selektivnost: Nekatere beljakovine so bile prednostno prebavljene z vsako metodo, pri čemer je ultrazvočna prebava dala prednost 65 beljakovinam in prebavi čez noč 54 beljakovinam. Takšne nianse razlike poudarjajo edinstven potencial ultrazvočne razprave za specifične aplikacije.

Rezultati kvantifikacije beljakovin brez označevanja sedmih beljakovin v E. coli
Vzorca. Naslednje beljakovine so bile dodane na dveh različnih ravneh, kot je navedeno v stolpcu
imenovan kot "Theo Ratio". Theo razmerje je teoretično razmerje med dvema nivojema, ki se uporabljata v tem
poskus. goveji serumski albumin (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1 kazein (CASA1),
α-S2 kazein (CASA2), citokrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) in karboanhidraza 2
(CAH2). Razmerja so bila izračunana z uporabo intenzivnosti beljakovin LFQ, pridobljenih iz MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Študija in grafika: © Martins et al., 2019)

Tripsin, imobiliziran z nanodelci

Integracija imobiliziranih nanodelcev tripsina (npr. T-FMNP) z ultrasonication še dodatno izboljša proteomske delovne tokove. Ti nanodelci zagotavljajo veliko površino za interakcije encim-substrat, kar povečuje učinkovitost. Pri uporabi za kompleksne proteome, kot je E. coli, kombinirana metoda doseže:

• Hitrost: Popolna prebava v 5 minutah.
• Natančnost: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Razširljivost: Prilagoditev platformam z več vrtinami, kot je UIP400MTP, omogoča visoko zmogljivo obdelavo.

Kliknite tukaj za podroben protokol z navodili po korakih!
(prim. Martins et al., 2019)

Proteolitična razgradnja z visoko hitrostjo in visoko zmogljivostjo s Hielscher sonicatorji

Najboljši modeli sonikatorjev za proteomiko

Hielscher Ultrasonics ponuja različne modele sonikatorjev za hkratno pripravo več vzorcev, kar omogoča visoko zmogljive delovne tokove. Ne glede na to, ali delate z vialami, epruvetami, ploščami z več jamicami (npr. Plošče s 6, 24, 96 jamicami) ali petrijevkami – Ponujamo vam idealne sonikatorje za vaše poskuse.

UIP400MTP sonikator z več vdolbicami

Za vrhunsko prepustnost UIP400MTP omogoča ultrazvočno obdelavo plošč s 96 jamicami. Združljiv s katero koli standardno mikroploščo, UIP400MTP ne zahteva dragih lastniških izdelkov za enkratno uporabo in vam daje svobodo, da izberete najboljšo ploščo z več jamicami za vaše raziskave. Z zagotavljanjem enakomerne energije po plošči omogoča hitro zmanjšanje, alkilacijo in prebavo do 200 kompleksnih proteomov v samo 1 uri. Ta raven avtomatizacije in učinkovitosti je ključnega pomena za visoko zmogljivo proteomiko in klinične aplikacije. Preberite več o zvočniku z več vdolbinicami!

VialTweeter

VialTweeter je prilagojen laboratorijem, ki zahtevajo sočasno ultrazvočno razbijanje do 10 vial ali epruvet. Njegov neinvazivni pristop odpravlja tveganje navzkrižne kontaminacije, hkrati pa zagotavlja ponovljivo prebavo beljakovin. Ta naprava je idealna za raziskovalce, ki delajo z omejenimi količinami vzorcev ali različnimi vrstami vzorcev.
Preberite več o večcevnem sonikatorju VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonicator CupHorn je zmogljiva naprava, zasnovana za hkratno obdelavo več vzorcev v zaprtih posodah. Zagotavlja enakomerno ultrazvočno porazdelitev energije in natančen nadzor temperature. Sposobnost obdelave do petih vzorcev hkrati, skupaj z združljivostjo z zmanjšanimi, alkiliranimi in prebavljenimi delovnimi tokovi, naredi CupHorn zanesljivo orodje za proteomiko, ki temelji na MS.
Preberite več o CupHorn SonoReactor!

Protokol po korakih za ultrazvočno podprto proteolitično razgradnjo z uporabo tripsina, imobiliziranega z nanodelci

(2019) je optimiziran za hitro prebavo beljakovin z uporabo ultrazvočne energije in tripsina imobiliziranega z nanodelci (T-FMNP). Opisani koraki zagotavljajo učinkovito redukcijo, alkilacijo in proteolizo, primerno za aplikacije masne spektrometrije (MS).
Koraki protokola

1. Zmanjšanje disulfidnih vezi
   • Dodamo 2 μl raztopine DTT (110 mM) 20 μl vzorca beljakovin (0,5 mg/ml) v pufru AmBic.
   • Epruveto za vzorec postavite v sonoreaktor UP200St-CupHorn.
   • Sonikirajte vzorec 2,5 minute pri 50% amplitudi (200 W, 26 kHz).
   • Za kratek čas se ustavite, da se ohladite, nato pa sonikirajte še 2,5 minute pod enakimi pogoji.
2. Alkilacija reduciranih cisteinskih ostankov
   • V reducirani vzorec beljakovin dodamo 2 μl raztopine IAA (400 mM).
   • Sonikirajte 2,5 minute pri 50% amplitudi, da olajšate alkilacijo.
   • Premor za hlajenje, nato sonikirajte še 2,5 minute.

   Opomba: Zmanjšajte izpostavljenost alkiliranega vzorca svetlobi, da preprečite razgradnjo IAA.

3. Redčenje vzorca
   • Vzorec alkiliranih beljakovin razredčimo do končne prostornine 100 μl z uporabo 25 mM AmBic pufra, ki vsebuje 4 % acetonitrila (v/v).
   • Temeljito premešamo z nežnim pipetiranjem.
4. Proteolitična prebava s tripsinom, imobiliziranim z nanodelci
   • Razredčenemu vzorcu beljakovin dodamo 20 μl raztopine T-FMNP (3 mg/ml).
   • Sonikirajte zmes v sonoreaktorju 2,5 minute pri 50% amplitudi.
   • Premor za hlajenje, nato sonicate še 2,5 minute pod enakimi pogoji.
5. Ločevanje nanodelcev tripsina
   • Z magnetom ločite T-FMNP od supernatanta, ki vsebuje prebavljene peptide.
   • Supernatant prenesemo v novo epruveto za mikrocentrifugo.
6. Peptidni pripravek za analizo MS
   • Supernatant, ki vsebuje peptide, posušimo v vakuumski centrifugi.
   • Posušene peptide shranjujte pri -20 °C do nadaljnje analize z masno spektrometrijo.