Proteomski delovni postopki z visoko zmogljivostjo razgradnje beljakovin

Proteomika je ključno področje za razumevanje bioloških procesov in sistemov, razgradnja beljakovin pa je bistven korak v njenih delovnih postopkih. Tradicionalno razgradnja beljakovin poteka v raztopini s proteolitičnimi encimi, kot je tripsin, ki specifično hidrolizira peptidne vezi na lizinskih in argininskih ostankih. Pri tem nastanejo peptidi, ki so zelo primerni za ionizacijo in fragmentacijo pri uporabi masne spektrometrije (MS). Vendar običajne metode razgradnje za dokončanje zahtevajo 12–24 ur, kar ustvarja pomembna ozka grla v proteomskih delovnih postopkih.
Sonikacija ponuja učinkovito alternativo, saj čas razgradnje močno skrajša z več ur na le nekaj minut. V kombinaciji z naprednimi sonikatorji za več vzorcev, kot so Hielscher CupHorn, VialTweeter in sonikator za plošče s 96 vdolbinicami UIP400MTP, omogoča pospešeno proteomsko obdelavo z visoko zmogljivostjo. Te tehnologije poenostavljajo delovne postopke, skrajšujejo čas priprave vzorcev in povečujejo učinkovitost, ne da bi pri tem zmanjšale ponovljivost ali kakovost podatkov.

Vloga ultrazvočne energije pri razgradnji beljakovin

Sonikacija uporablja usmerjene ultrazvočne valove za ustvarjanje kavitacije – lokaliziranih mikromehurčkov, ki se sesedejo in pri tem ustvarijo močne strižne sile. Ta pojav izboljša prenos snovi, spodbuja mešanje encimov s substrati in razvija beljakovinske strukture, s čimer mesta cepitve postanejo dostopna proteolitičnim encimom, kot je tripsin.
Rezultat? Znatno skrajšanje časa razgradnje brez zmanjšanja učinkovitosti ali ponovljivosti.

Z ultrazvokom izboljšana proteolitična razgradnja: metodologija in rezultati

Protokol pospešene razgradnje

Razgradnja s pomočjo ultrazvoka združuje proteolitične encime in ultrazvočno energijo za pospešitev delovnih postopkov. Na primer, pri uporabi naprave Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) delovni postopek razgradnje poteka takole:

1. Redukcija: Vzorce beljakovin (0,5 mg/mL, 20 µL) obdelamo z DTT (2 µL, 110 mM) v pufru amonijevega hidrogenkarbonata (12,5 mM). Sonikacijo izvajamo pri 50% amplitudi 5 minut.
2. Alkilacija: Po dodatku IAA (2 µL, 400 mM) sonikacijo ponovimo pod enakimi pogoji.
3. Razgradnja: Vzorce razredčimo in inkubiramo z nanodelci z imobiliziranim tripsinom. Zadnji cikel sonikacije (5 minut) zaključi razgradnjo. Peptide ločimo, posušimo in shranimo za analizo z MS.

Ta ultrazvočna metoda skrajša skupni čas priprave z 12 ur na manj kot 30 minut. Kljub pospešenemu postopku izkoristek in kakovost peptidov ostajata primerljiva s tradicionalnimi metodami, ki potekajo čez noč.

Učinkovitost ultrazvočne razgradnje beljakovin

V primerjalnih študijah s proteomi E. coli:

• Identifikacija beljakovin: V ultrazvočno razgrajenih vzorcih so v 5 minutah identificirali 777 beljakovin, v primerjavi z 817 v 12 urah. Delež beljakovin, identificiranih z obema metodama, je presegel 70%.
• Ponovljivost: Ponovljene analize so pri vsaki metodi pokazale korelacijske vrednosti nad 98%, kar dokazuje zanesljivost.
• Selektivnost: Vsaka metoda je prednostno razgradila določene beljakovine: ultrazvočna razgradnja je bila ugodnejša za 65 beljakovin, razgradnja čez noč pa za 54 beljakovin. Takšne subtilne razlike poudarjajo edinstven potencial sonikacije za specifične uporabe.

Rezultati kvantifikacije brez označevanja sedmih beljakovin, dodanih v vzorec E. coli
. Naslednje beljakovine so bile dodane na dveh različnih ravneh, kot je navedeno v stolpcu
z naslovom »Theo Ratio«. Theo Ratio je teoretično razmerje med ravnema, uporabljenima v tem
poskusu. Goveji serumski albumin (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1 kazein (CASA1),
α-S2 kazein (CASA2), citokrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) in karboanhidraza 2
(CAH2). Razmerja so bila izračunana na podlagi intenzitet beljakovin LFQ, pridobljenih s programom MaxQuant pri
analizi. Za primerjavo vrednosti, pridobljenih z vsako metodo, je bil uporabljen Studentov t-test (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Študija in grafični prikaz: © Martins et al., 2019)

Tripsin, imobiliziran na nanodelcih

Združevanje nanodelcev z imobiliziranim tripsinom (npr. T-FMNPs) s sonikacijo dodatno izboljša proteomske delovne postopke. Ti nanodelci zagotavljajo veliko površino za interakcije med encimom in substratom, kar poveča učinkovitost. Pri uporabi na kompleksnih proteomih, kot je proteom E. coli, kombinirana metoda dosega:

• Hitrost: Popolna razgradnja v 5 minutah.
• Točnost: Kvantifikacija beljakovin, primerljiva s tradicionalnimi metodami (p > 0,01, n=3).
• Možnost povečanja obsega obdelave: Prilagoditev platformam z več vdolbinicami, kot je UIP400MTP, omogoča visoko zmogljivost obdelave vzorcev.

Kliknite tukaj za podroben protokol z navodili po korakih!
(prim. Martins et al., 2019)

Hitra proteolitična razgradnja z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev s sonikatorji Hielscher

Najboljši modeli sonikatorjev za proteomiko

Hielscher Ultrasonics ponuja različne modele sonikatorjev za sočasno pripravo več vzorcev, ki omogočajo delovne postopke z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev. Ne glede na to, ali delate z vialami, epruvetami, ploščami z več vdolbinicami (npr. ploščami s 6, 24 ali 96 vdolbinicami) ali petrijevkami – ponujamo vam idealne sonikatorje za vaše poskuse.

Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP

Za največjo zmogljivost obdelave vzorcev UIP400MTP omogoča ultrazvočno obdelavo plošč s 96 vdolbinicami. UIP400MTP je združljiv z vsako standardno mikroploščo, ne zahteva dragega lastniškega potrošnega materiala za enkratno uporabo in vam omogoča, da za svoje raziskave svobodno izberete najboljšo ploščo z več vdolbinicami. Z enakomernim dovajanjem energije po celotni plošči omogoča hitro redukcijo, alkilacijo in razgradnjo do 200 kompleksnih proteomov v samo 1 uri. Ta stopnja avtomatizacije in učinkovitosti je ključna za proteomiko z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev in klinično uporabo. Izvedite več o sonikatorju za plošče z več vdolbinicami!

VialTweeter

VialTweeter je prilagojen laboratorijem, ki potrebujejo sočasno sonikacijo do 10 vial ali epruvet. Njegov neinvazivni pristop odpravlja tveganja navzkrižne kontaminacije in hkrati zagotavlja ponovljivo razgradnjo beljakovin. Ta naprava je idealna za raziskovalce, ki delajo z omejenimi volumni vzorcev ali različnimi vrstami vzorcev.
Izvedite več o sonikatorju za več epruvet VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonikator CupHorn je zmogljiva naprava, zasnovana za sočasno obdelavo več vzorcev v zaprtih posodah. Zagotavlja enakomerno porazdelitev ultrazvočne energije in natančen nadzor temperature. Možnost sočasne obdelave do petih vzorcev skupaj z združljivostjo z delovnimi postopki, ki vključujejo redukcijo, alkilacijo in razgradnjo, omogoča, da je CupHorn zanesljivo orodje za proteomiko na osnovi MS.
Izvedite več o CupHorn SonoReactor!

Protokol po korakih za proteolitično razgradnjo s pomočjo sonikacije in tripsina, imobiliziranega na nanodelcih

Ta protokol avtorjev Martins et al. (2019) je optimiziran za hitro razgradnjo beljakovin z ultrazvočno energijo in tripsinom, imobiliziranim na nanodelcih (T-FMNPs). Opisani koraki zagotavljajo učinkovito redukcijo, alkilacijo in proteolizo, primerno za uporabo pri masni spektrometriji (MS).
Koraki protokola

1. Redukcija disulfidnih vezi
   • 20 µL vzorcu beljakovin (0,5 mg/mL) v pufru AmBic dodajte 2 µL raztopine DTT (110 mM).
   • Epruveto z vzorcem postavite v sonoreaktor UP200St-CupHorn.
   • Vzorec sonicirajte 2,5 minute pri 50% amplitudi (200 W, 26 kHz).
   • Za kratek čas prekinite obdelavo, da omogočite ohlajanje, nato sonicirajte še 2,5 minute pod enakimi pogoji.
2. Alkilacija reduciranih cisteinskih ostankov
   • Reduciranemu vzorcu beljakovin dodajte 2 µL raztopine IAA (400 mM).
   • Sonicirajte 2,5 minute pri 50% amplitudi, da pospešite alkilacijo.
   • Prekinite obdelavo za ohlajanje, nato sonicirajte še 2,5 minute.

   Opomba: Izpostavljenost alkiliranega vzorca svetlobi zmanjšajte na najmanjšo možno mero, da preprečite razgradnjo IAA.

3. Redčenje vzorca
   • Alkilirani vzorec beljakovin razredčite do končnega volumna 100 µL s 25 mM pufrom AmBic, ki vsebuje 4% acetonitrila (v/v).
   • Temeljito premešajte z nežnim pipetiranjem.
4. Proteolitična razgradnja s tripsinom, imobiliziranim na nanodelcih
   • Razredčenemu vzorcu beljakovin dodajte 20 µL raztopine T-FMNP (3 mg/mL).
   • Zmes sonicirajte v sonoreaktorju 2,5 minute pri 50% amplitudi.
   • Prekinite obdelavo za ohlajanje, nato sonicirajte še 2,5 minute pod enakimi pogoji.
5. Ločevanje nanodelcev z imobiliziranim tripsinom
   • Z magnetom ločite T-FMNPs od supernatanta, ki vsebuje peptide, nastale pri razgradnji.
   • Supernatant prenesite v novo mikrocentrifugirno epruveto.
6. Priprava peptidov za analizo z MS
   • Supernatant, ki vsebuje peptide, posušite v vakuumski centrifugi.
   • Posušene peptide shranite pri -20°C do nadaljnje analize z masno spektrometrijo.