Ultrazvočna priprava vzorcev s pomočjo filtra (FASP): izboljšanje proteomskih delovnih postopkov z napredno sonikacijo
Ultrazvočna priprava vzorcev s pomočjo filtra (FASP) se uveljavlja kot zelo učinkovita in ponovljiva metoda v sodobni proteomiki. Z vključevanjem nadzorovane sonikacije v uveljavljene delovne postopke FASP lahko raziskovalci znatno izboljšajo ekstrakcijo proteinov, učinkovitost razgradnje in splošno kakovost podatkov. Zaradi vse večjih potreb po pripravi vzorcev z visoko zmogljivostjo obdelave in dobro ponovljivostjo pridobivajo sonikatorji z usmerjenim ultrazvokom, kot je sonikator za mikroplošče UIP400MTP, znanstveni in praktični pomen.
Znanstveni kontekst: zakaj je FASP pomembna v proteomiki
Priprava vzorcev s pomočjo filtra (FASP) je postala zlati standard v proteomiki po pristopu od spodaj navzgor, ker omogoča odstranjevanje detergentov, soli in drugih nečistoč ter hkrati učinkovito encimsko razgradnjo. Vendar imajo klasični protokoli FASP pogosto omejitve, povezane z nepopolno lizo, neenakomerno razgradnjo in variabilnostjo vzorcev – zlasti pri obravnavi kompleksnih ali odpornih bioloških celic ali tkiv.
Pri tem usmerjena ultrazvočna energija (sonikacija) zagotavlja odločilno prednost. Z ustvarjanjem mehanskih strižnih sil in kavitacije sonikacija izboljša več ključnih korakov v delovnem postopku FASP, ne da bi ogrozila integriteto proteinov.
Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP olajša pripravo vzorcev s pomočjo filtra (FASP)
Pozitivni učinki sonikacije pri ultrazvočni FASP
Sonikacija povzroča nadzorovano akustično kavitacijo – nastajanje in sesedanje mikroskopskih mehurčkov – ki ustvarja lokalizirane strižne sile in mikrotokove.
Sonikacija izboljša tako korak alkilacije kot korak razgradnje pri ultrazvočni FASP, saj izboljšuje prenos snovi in pospešuje reakcijsko kinetiko. Uporaba ultrazvočne energije povzroča kavitacijo, ki vodi do lokaliziranih mikrotokov in prehodnih strižnih sil, ki spodbujajo hitro mešanje in učinkovito prodiranje reagentov v proteinsko matrico ali okolje filtra. Med alkilacijo to povzroči enakomernejšo in hitrejšo modifikacijo cisteinskih ostankov z jodoacetamidom. Pri razgradnji sonikacija poveča dostopnost mest proteolitičnega cepljenja in izboljša interakcije med encimom in substratom, s čimer pospeši delovanje tripsina in izboljša učinkovitost razgradnje. Ultrazvočna obdelava na splošno skrajša čas obdelave, pri tem pa ohranja ali izboljšuje popolnost in ponovljivost reakcij.
Pri pripravi vzorcev za proteomiko ultrazvočna FASP omogoča:
- Učinkovitejšo razgradnjo celic in ekstrakcijo proteinov, tudi v trdovratnih tkivih ali mikrobnih vzorcih
- Izboljšano solubilizacijo proteinov
- Izboljšano dostopnost za encime med razgradnjo
- Krajši čas obdelave in večjo ponovljivost
V nasprotju s konvencionalnimi mehanskimi ali kemičnimi metodami lize je ultrazvočno obdelavo mogoče zelo dobro nadzorovati in prilagajati obsegu, zato je posebej primerna za standardizirane proteomske delovne postopke.
Prednosti ultrazvočne FASP pred konvencionalnimi pristopi
Vključitev sonikacije v protokole FASP zagotavlja merljive koristi, ki neposredno vplivajo na rezultate nadaljnje masne spektrometrije.
Ultrazvočna FASP omogoča popolnejše pridobivanje proteinov, zlasti iz zahtevnih vzorcev, kot so vlaknasta tkiva ali biofilmi. Enakomerna porazdelitev energije zagotavlja enotno obdelavo ponovitev in zmanjšuje variabilnost – kar je bistvena zahteva za kvantitativno proteomiko.
Poleg tega sonikacija pospešuje kinetiko razgradnje z izboljšanjem interakcije med encimom in substratom. To pogosto skrajša čas razgradnje in poveča izkoristek peptidov, pri tem pa ohranja pokritost zaporedij.
Z vidika delovnega postopka ultrazvočni sistemi zmanjšujejo potrebo po ročnih posegih in odpravljajo potrebo po agresivnih kemičnih obdelavah, s čimer ohranjajo integriteto vzorcev in poenostavljajo standardizacijo protokolov.
Vennov diagram prikazuje povečano število identificiranih proteinov z ultrazvočno FASP v primerjavi s FASP čez noč
Slika in študija: ©Carvalho et al., 2020
Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP za pripravo vzorcev s pomočjo filtra (FASP)
Protokol: ultrazvočna FASP z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev z UIP400MTP
Laboratorijem, ki obdelujejo velike skupine vzorcev, sonikator za mikroplošče UIP400MTP omogoča sočasno sonikacijo standardnih plošč z več vdolbinicami (npr. plošč s 96 vdolbinicami), kar znatno poveča zmogljivost obdelave vzorcev in ponovljivost.
V tem formatu se vzorci (običajno 50–200 µL na vdolbinico) pripravijo neposredno v mikroploščah, združljivih z ultrafiltracijo ali nadaljnjo obdelavo. Pufri za lizo so podobni tistim, ki se uporabljajo v standardnih protokolih FASP.
UIP400MTP enakomerno dovaja ultrazvočno energijo v vse vdolbinice. Sonikacija se običajno izvaja pri 60–80% amplitudi 2–4 minute, odvisno od vrste vzorca. Temperaturo spremljajte s priključljivim temperaturnim senzorjem. Uporabljajte pulzno sonikacijo in po želji laboratorijski hladilnik.
Primer protokola:
- Pri koraku alkilacije se vzorci sonicirajo s sonikatorjem za mikroplošče (UIP400MTP) pri 40% amplitudi v 7 ciklih (30 s VKLOP, 15 s IZKLOP; skupni čas sonikacije: 5 min 45 s).
- Po sonikaciji se raztopina jodoacetamida (IAA) odstrani s centrifugiranjem. Pred razgradnjo s tripsinom je treba vzorce sprati, da se odstrani preostala sečnina, močan kaotropni reagent, ki zavira encimsko aktivnost. Zato se vzorci dvakrat sperejo z 200 μL 25 mM amonijevega hidrogenkarbonata (AmBic).
- Nato se doda 100 μL raztopine tripsina (razmerje med encimom in proteini 1:30), pripravljene v 12.5 mM amonijevem hidrogenkarbonatu. Razgradnja proteinov se nato izvede z UIP400MTP pod enakimi pogoji sonikacije (40% amplituda, 7 ciklov, 30 s VKLOP / 15 s IZKLOP; skupni čas: 5 min 45 s).
- Po sonikaciji se vzorci prenesejo na filtrske plošče ali obdelajo s sistemi FASP na osnovi plošč. Koraka redukcije in alkilacije se izvedeta v plošči, kar ohranja poenostavljen delovni postopek.
- Razgradnja s tripsinom se izvaja pod nadzorovanimi pogoji (npr. 37°C, 4–16 ur), z možnostjo kratke ultrazvočne stimulacije za pospešitev encimske aktivnosti in izboljšanje izkoristka peptidov.
- Peptidi se pridobijo s centrifugiranjem in so pripravljeni za analizo LC-MS/MS.
Ključna prednost tega sistema je njegova sposobnost zagotavljanja enakih pogojev obdelave v vseh vdolbinicah, kar zmanjšuje učinke serij in omogoča zanesljive kvantitativne primerjave v obsežnih proteomskih študijah.
Sonikator za več epruvet VialTweeter pospešuje in izboljšuje pripravo vzorcev s pomočjo filtra (FASP) v proteomiki
Znanstveni pomen
Vključevanje sonikacije v delovne postopke FASP ni zgolj tehnična izboljšava – predstavlja metodološki napredek pri pripravi vzorcev za proteomiko. Ker se področje razvija v smeri večje zmogljivosti obdelave vzorcev, avtomatizacije in ponovljivosti, ultrazvočne tehnologije odpravljajo temeljna ozka grla pri obdelavi vzorcev.
Novejše študije vse bolj poudarjajo pomen enotne priprave vzorcev za zanesljivo odkrivanje biomarkerjev in kvantitativno proteomiko. Ultrazvočna FASP neposredno prispeva k temu cilju z izboljšanjem učinkovitosti ekstrakcije, enotnosti razgradnje in splošne robustnosti delovnega postopka.
Poleg tega prilagodljivost ultrazvočnih sistemov različnim obsegom – od posameznih vial z VialTweeter do celotnih mikroplošč z UIP400MTP – ustreza vse večjim potrebam tako po raziskovalnih proteomskih študijah kot po proteomskih študijah velikih kohort.
Priskrbite si sonikator za lažjo izvedbo svojega delovnega postopka FASP!
Ultrazvočna priprava vzorcev s pomočjo filtra združuje dokazane prednosti FASP s fizikalnimi prednostmi sonikacije. Z izboljšanjem lize in razgradnje ter standardizacijo delovnih postopkov ultrazvočni sistemi ponujajo zmogljivo rešitev za sodobno proteomiko.
Sonikator za več epruvet VialTweeter in sonikator za mikroplošče UIP400MTP ponazarjata, kako lahko usmerjena ultrazvočna energija rutinsko pripravo vzorcev spremeni v učinkovitejši, bolj ponovljiv in znanstveno robustnejši proces – kar na koncu vodi do kakovostnejših proteomskih podatkov in globljih bioloških spoznanj.
Izberite najprimernejši sonikator za svojo pripravo vzorcev s pomočjo filtra
| Model sonikatorja | Prednosti za FASP | Najprimernejša uporaba |
| Sonikator za mikroplošče UIP400MTP | Enakomerna sonikacija po celotnih mikroploščah; zelo ponovljiv vnos energije; pospešuje alkilacijo in encimsko razgradnjo v delovnih postopkih z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev; združljiv z avtomatizirano pripravo vzorcev. | Delovni postopki FASP z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev v ploščah s 96 vdolbinicami ali podobnih formatih plošč, vključno s proteomskimi presejalnimi aplikacijami. |
| Sonikator za več epruvet VialTweeter | Sočasna, enakomerna sonikacija več zaprtih epruvet; zmanjšuje navzkrižno kontaminacijo in izgubo vzorcev na najmanjšo možno mero; izboljšuje prodiranje reagentov in mešanje, s čimer izboljša učinkovitost alkilacije in razgradnje. | Vzporedna obdelava več vzorcev FASP z zmerno zmogljivostjo obdelave vzorcev in visoko ponovljivostjo. |
| CupHorn (posredna sonikacija v »visokointenzivni kopeli« za zatesnjene epruvete) | Visokointenzivna posredna sonikacija za zatesnjene posode; odličen nadzor temperature in obdelava brez kontaminacije; spodbuja učinkovit prenos snovi brez neposrednega stika s sondo. | Obdelava vzorca v različnih posodah za vzorce / občutljivih ali nevarnih vzorcev, ki zahtevajo zaprte posode in enakomerno porazdelitev energije. |
| Laboratorijski sonikatorji s sondo (neposredna sonikacija) | Največja ultrazvočna intenzivnost in prenos energije; hitra razgradnja in pospeševanje reakcij; učinkoviti za proteinske vzorce, ki jih je težko razgraditi ali so zelo kompleksni. | Obdelava posameznih vzorcev, večjih vzorcev ali zahtevnih matric, pri katerih sta potrebni največja moč in hitrost. |
Načrtovanje, proizvodnja in svetovanje – kakovost iz Nemčije
Ultrazvočne naprave Hielscher so znane po najvišjih standardih kakovosti in oblikovanja. Robustnost in preprosto upravljanje omogočata nemoteno vključevanje naših ultrazvočnih naprav v industrijske obrate. Ultrazvočne naprave Hielscher zlahka obvladujejo težke razmere in zahtevna okolja.
Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visokozmogljivim ultrazvočnim napravam z najsodobnejšo tehnologijo in uporabniško prijaznostjo. Seveda so ultrazvočne naprave Hielscher skladne z zahtevami CE ter izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.
Pogosto zastavljena vprašanja
Za kaj se uporablja priprava vzorcev s pomočjo filtra?
Priprava vzorcev s pomočjo filtra (FASP) se uporablja za pripravo proteinskih vzorcev za proteomsko analizo na osnovi masne spektrometrije. Omogoča učinkovito odstranjevanje detergentov, soli in drugih nečistoč z nizko molekulsko maso, pri tem pa zadrži proteine na filtru z mejno molekulsko maso, kjer jih je mogoče denaturirati, reducirati, alkilirati in encimsko razgraditi v peptide, primerne za analizo LC–MS/MS.
Katere so prednosti FASP v proteomiki?
Glavne prednosti FASP v proteomiki so njena sposobnost obdelave kompleksnih vzorcev in vzorcev, bogatih z detergenti, ob hkratnem pridobivanju zelo čistih peptidnih zmesi, združljivih z masno spektrometrijo. Izboljšuje učinkovitost in ponovljivost razgradnje z izvajanjem reakcij v omejenem okolju filtra, zmanjšuje izgubo vzorcev v primerjavi z metodami na osnovi obarjanja in omogoča učinkovito zamenjavo pufra. Na splošno FASP izboljšuje pridobivanje peptidov, kakovost podatkov in pokritost proteoma, zaradi česar je robusten in široko uveljavljen delovni postopek v proteomiki po pristopu od spodaj navzgor.
Literatura / viri
-
FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
Brezkontaktni sonikator UIP400MTP olajša FASP v ploščah s 96 vdolbinicami
Hielscher Ultrasonics proizvaja visokozmogljive ultrazvočne homogenizatorje v velikostih od laboratorijskih do industrijskih.