Ultrazvočna priprava vzorcev s pomočjo filtra (FASP): izboljšanje proteomskih delovnih postopkov z napredno sonikacijo
Ultrazvočna priprava vzorcev s pomočjo filtra (FASP) postaja zelo učinkovita in ponovljiva metoda v sodobni proteomiki. Z vključitvijo nadzorovane sonikacije v ustaljene delovne postopke FASP lahko raziskovalci znatno izboljšajo ekstrakcijo beljakovin, učinkovitost prebave in splošno kakovost podatkov. Z naraščajočim povpraševanjem po visoko zmogljivi in ponovljivi pripravi vzorcev so usmerjeni sonikatorji, kot je sonikator za mikroplošče UIP400MTP, vse bolj pomembni za znanost in prakso.
Znanstveno ozadje: Zakaj je FASP pomemben v proteomiki?
Priprava vzorcev s filtriranjem (FASP) je postala zlati standard v proteomiki od spodaj navzgor, saj omogoča odstranjevanje detergentov, soli in drugih onesnaževalcev, hkrati pa omogoča učinkovito encimsko prebavo. Vendar se klasični protokoli FASP pogosto soočajo z omejitvami, povezanimi z nepopolno lizo, nedosledno prebavo in variabilnostjo vzorcev. – especially when dealing with complex or resilient biological cells or tissues.
Pri tem ima usmerjena ultrazvočna energija (sonikacija) odločilno prednost. Z mehanskimi strižnimi silami in kavitacijo sonikacija izboljša več kritičnih korakov v delovnem postopku FASP, ne da bi pri tem ogrozila celovitost beljakovin.
Sonikator z več vdolbinicami UIP400MTP olajša pripravo vzorca s pomočjo filtra (FASP).
Pozitivni učinki sonikacije pri ultrazvočni FASP
Sonikacija uvaja nadzorovano akustično kavitacijo – mikroskopsko nastajanje in razpadanje mehurčkov – ki ustvarja lokalizirane strižne sile in mikrotekanje.
Sonikacija izboljša alkiliranje in razgradnjo v ultrazvočni FASP, saj izboljša prenos mase in pospeši reakcijsko kinetiko. Uporaba ultrazvočne energije povzroča kavitacijo, kar vodi do lokaliziranega mikrotekanja in prehodnih strižnih sil, ki spodbujajo hitro mešanje in učinkovito prodiranje reagentov v beljakovinsko matrico ali okolje filtra. Med alkiliranjem to povzroči enakomernejšo in hitrejšo modifikacijo cisteinskih ostankov z jodoacetamidom. V fazi prebave sonikacija poveča dostopnost proteolitičnih cepilnih mest in izboljša interakcije med encimom in substratom, s čimer pospeši aktivnost tripsina in poveča učinkovitost prebave. Na splošno ultrazvočna obdelava skrajša čas obdelave, hkrati pa ohrani ali izboljša popolnost in ponovljivost reakcije.
Pri pripravi proteomskih vzorcev se ultrazvočni FASP prevede v:
- Učinkovitejše razbijanje celic in ekstrakcija beljakovin, tudi v težkih tkivih ali mikrobnih vzorcih
- Povečana topnost proteinov
- Izboljšana dostopnost encimov med prebavo
- krajši čas obdelave in večja ponovljivost
Za razliko od običajnih mehanskih ali kemičnih metod lize je ultrazvočna obdelava zelo nadzorovana in razširljiva, zato je še posebej primerna za standardizirane delovne postopke proteomike.
UIP400MTP ni ultrazvočna kopel. To je visoko intenzivna skodelica za osredotočeno ultrazvočno razbijanje. Ta zmogljiv brezkontaktni sonikator zagotavlja enakomerno ultrazvočno razbijanje v vseh vdolbinicah vaše standardne plošče. Imate natančen nadzor nad amplitudo, močjo in utripanjem. Vgrajen časovnik in temperaturna sonda zagotavljata dosledne rezultate. Sonikator s UIP400MTP ploščo hladi vzorce z vodno kopeljo (zunanji hladilnik ni obvezen).
Prednosti ultrazvočne FASP pred običajnimi pristopi
Vključitev sonikacije v protokole FASP zagotavlja merljive koristi, ki neposredno vplivajo na rezultate masne spektrometrije na nižji stopnji.
Ultrazvočni FASP omogoča popolnejše pridobivanje beljakovin, zlasti iz zahtevnih vzorcev, kot so vlaknasta tkiva ali biofilmi. Enakomerna porazdelitev energije zagotavlja dosledno obdelavo vseh ponovitev, kar zmanjšuje variabilnost – bistvena zahteva za kvantitativno proteomiko.
Poleg tega sonikacija pospeši kinetiko prebave, saj izboljša interakcijo med encimom in substratom. To pogosto pomeni krajši čas razgradnje in večji izkoristek peptidov, pri čemer se ohrani pokritost zaporedja.
Z vidika poteka dela ultrazvočni sistemi zmanjšujejo število ročnih posegov in odpravljajo potrebo po agresivni kemični obdelavi, ohranjajo celovitost vzorca in poenostavljajo standardizacijo protokola.
Vennov diagram, ki prikazuje večje število identificiranih proteinov z ultrazvočno FASP v primerjavi z nočno FASP
Slika in študija: ©Carvalho et al., 2020
Sonikator z več vdolbinicami UIP400MTP za pripravo vzorcev s filtriranjem (FASP)
Protokol: Visoko zmogljiv ultrazvočni FASP z UIP400MTP
For laboratories processing large sample cohorts, the UIP400MTP microplate sonicator enables simultaneous sonication of standard multi-well plates (e.g., 96-well plates), significantly increasing throughput and reproducibility.
V tej obliki se vzorci (običajno 50-200 µl na vdolbino) pripravijo neposredno v mikroplošče, ki so združljive z ultrafiltracijo ali nadaljnjo obdelavo. Pufri za lizo so podobni tistim, ki se uporabljajo v standardnih protokolih FASP.
UIP400MTP uporablja enakomerno ultrazvočno energijo v vseh vrtinah. Sonikacija se običajno izvaja pri 60-80-odstotni amplitudi 2-4 minute, odvisno od vrste vzorca. Temperaturo spremljajte z vgradnim temperaturnim senzorjem. Uporabljajte pulzno sonikacijo in po želji laboratorijsko hladilno napravo.
Vzorčni protokol:
- For the alkylation step, samples are sonicated using the microplate sonicator (UIP400MTP) at 40% amplitude for 7 cycles (30 s ON, 15 s OFF; total sonication time: 5 min 45 s).
- Po sonikaciji se raztopina jodoacetamida (IAA) odstrani s centrifugiranjem. Pred razgradnjo s tripsinom je treba vzorce sprati, da se odstranijo ostanki sečnine, močnega kaotropnega sredstva, ki zavira encimsko aktivnost. Zato vzorce dvakrat speremo z 200 μl 25 mM amonijevega bikarbonata (AmBic).
- Nato se doda 100 μl raztopine tripsina (razmerje med encimom in proteinom 1:30), pripravljene v 12,5 mM amonijevem bikarbonatu. Razgradnja beljakovin se nato izvede z napravo UIP400MTP pod enakimi pogoji sonikacije (40 % amplituda, 7 ciklov, 30 s ON / 15 s OFF; skupni čas: 5 min 45 s).
- Po sonikaciji se vzorci prenesejo na filtrirne plošče ali se obdelajo s sistemi FASP, ki temeljijo na ploščah. Stopnje redukcije in alkilacije se izvajajo na plošči, kar omogoča poenostavljen potek dela.
- Tripsinska razgradnja poteka pod nadzorovanimi pogoji (npr. 37 °C, 4-16 ur) z možnostjo kratke ultrazvočne stimulacije za pospešitev encimske aktivnosti in izboljšanje izkoristka peptidov.
- Peptidi se obnovijo s centrifugiranjem in so pripravljeni za analizo LC-MS/MS.
Ključna prednost tega sistema je, da lahko zagotovi enake pogoje obdelave v vseh vdolbinah, kar zmanjšuje vplive serije in omogoča zanesljive kvantitativne primerjave v obsežnih študijah proteomike.
Večcevni sonikator VialTweeter pospeši in izboljša pripravo vzorcev s pomočjo filtra (FASP) v proteomiki
Znanstveni pomen
Vključitev sonikacije v delovne postopke FASP ni le tehnična izboljšava – predstavlja metodološki napredek pri pripravi proteomskih vzorcev. Ker se področje pomika k večji zmogljivosti, avtomatizaciji in ponovljivosti, ultrazvočne tehnologije odpravljajo temeljna ozka grla pri obdelavi vzorcev.
Nedavne študije vse bolj poudarjajo pomen dosledne priprave vzorcev za zanesljivo odkrivanje biomarkerjev in kvantitativno proteomiko. Ultrazvočna FASP neposredno prispeva k temu cilju z izboljšanjem učinkovitosti ekstrakcije, doslednosti prebave in splošne robustnosti delovnega postopka.
Poleg tega je razširljivost ultrazvočnih sistemov – od posameznih stekleničk z VialTweeterjem do polnih mikroploščic z UIP400MTP – je v skladu z naraščajočim povpraševanjem po raziskovalnih in obsežnih kohortnih študijah proteomike.
Priskrbite si sonikator, ki vam bo olajšal delovni proces FASP!
Ultrazvočna priprava vzorcev s pomočjo filtra združuje dokazane prednosti FASP s fizikalnimi prednostmi sonikacije. Ultrazvočni sistemi z izboljšanjem lize, prebave in standardizacije delovnih postopkov ponujajo zmogljivo rešitev za sodobno proteomiko.
Sonikator VialTweeter za več epruvet in sonikator za mikroplošče UIP400MTP sta primer, kako lahko usmerjena ultrazvočna energija spremeni rutinsko pripravo vzorcev v učinkovitejši, ponovljivejši in znanstveno zanesljivejši postopek. – kar vodi do kakovostnejših proteomskih podatkov in globljih bioloških vpogledov.
Izberite najprimernejši sonikator za pripravo vzorcev s filtri
| Model Sonicator | Prednosti za FASP | Najboljša uporaba |
| UIP400MTP ultrazvočni aparat za mikroplošče | Enakomerna sonikacija po celotni mikropločevinki; zelo ponovljiv vnos energije; pospeši alkiljenje in encimsko prebavo v visoko zmogljivih delovnih postopkih; združljiv z avtomatizirano pripravo vzorcev. | Visoko zmogljivi delovni postopki FASP v 96-delčnih ali podobnih formatih plošč, vključno s presejalnimi aplikacijami za proteomiko. |
| VialTweeter Multi-Tube Sonicator | Hkratno, enakomerno sonificiranje več zaprtih epruvet; zmanjša navzkrižno kontaminacijo in izgubo vzorca; izboljša penetracijo in mešanje reagentov ter izboljša učinkovitost alkiljenja in razgradnje. | Vzporedna obdelava več vzorcev FASP z zmerno zmogljivostjo in visoko obnovljivostjo. |
| Cuphorn (posredna sonikacija “visokointenzivna kopel” za zaprte cevi) | Visoko intenzivna posredna sonikacija za zaprte posode; odličen nadzor temperature in obdelava brez kontaminacije; spodbuja učinkovit prenos mase brez neposrednega stika s sondo. | Processing of sample in various sample containers / sensitive or hazardous samples requiring closed containers and consistent energy distribution. |
| Sonikatorji z laboratorijsko sondo (neposredna sonikacija) | Največja ultrazvočna intenzivnost in prenos energije; hitra prekinitev in pospešitev reakcije; učinkovito za težko prebavljive ali zelo kompleksne beljakovinske vzorce. | Single-sample processing, larger samples or challenging matrices where maximum power and speed are required. |
Projektiranje, izdelava in svetovanje – Kakovost izdelana v Nemčiji
Hielscher ultrazvočni aparati so znani po svojih najvišjih standardih kakovosti in oblikovanja. Robustnost in enostavno upravljanje omogočata nemoteno integracijo naših ultrazvočnih aparatov v industrijske objekte. Težke pogoje in zahtevna okolja zlahka obvladajo Hielscher ultrasonicatorji.
Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visoko zmogljivim ultrazvočnim aparatom z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Seveda so Hielscher ultrazvočni aparati skladni s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.
Pogosto zastavljena vprašanja
Za kaj se uporablja priprava vzorca s pomočjo filtra?
Filter-Aided Sample Preparation (FASP) se uporablja za pripravo proteinskih vzorcev za proteomsko analizo na osnovi masne spektrometrije. Omogoča učinkovito odstranjevanje detergentov, soli in drugih onesnaževalcev z nizko molekulsko maso, hkrati pa proteine zadrži na filtru z mejno molekulsko maso, kjer jih je mogoče denaturirati, reducirati, alkilirati in encimsko razgraditi v peptide, primerne za analizo LC-MS/MS.
Kakšne so prednosti FASP v proteomiki?
Glavne prednosti FASP v proteomiki so sposobnost obdelave kompleksnih vzorcev, bogatih z detergenti, pri čemer proizvaja zelo čiste mešanice peptidov, združljive z masno spektrometrijo. Izboljša učinkovitost razgradnje in ponovljivost z izvajanjem reakcij v omejenem filtrirnem okolju, zmanjša izgubo vzorca v primerjavi z metodami, ki temeljijo na obarjanju, in omogoča učinkovito izmenjavo pufra. Na splošno FASP izboljšuje izkoristek peptidov, kakovost podatkov in pokritost proteomov, zaradi česar je zanesljiv in široko sprejet delovni postopek v proteomiki od spodaj navzgor.
Literatura / Reference
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
Brezkontaktni sonikator UIP400MTP olajša FASP v 96-delčnih ploščah
Hielscher Ultrasonics proizvaja visoko zmogljive ultrazvočne homogenizatorje iz laboratorij k industrijska velikost.