Liza kvasovk v mikroploščah z uporabo visokointenzivnega ultrazvoka

Mikrobiologi in raziskovalci na področju bioloških ved, ki se ukvarjajo z Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii, in tudi pri drugih sistemih s kvasovkami se srečujemo z naslednjim izzivom: kvasovke so odporne, njihova ponovljiva liza je lahko težavna, ročno drobljenje vzorcev pa hitro postane ozko grlo, kadar je treba pregledati veliko sevov, klonov, gojitvenih pogojev ali ekspresijskih konstruktov.

Visokopretočna liza kvasovk za mikrobiologijo, molekularno biologijo in analizo beljakovin

Ultrazvočni aparati za mikroplošče podjetja Hielscher, kot sta UIP400MTP (400 W) in UIP550MTP (550 W), ponujajo rešitev z visoko zmogljivostjo za mehansko lizo kvasovk neposredno v mikroploščah. Namesto da bi vzorce obdelovali enega po enega s sondo, je mogoče celotne mikroplošče sonificirati pod enotnimi pogoji. Zaradi tega je ultrazvočna liza kvasovk hitrejša, bolj ponovljiva in lažje vključljiva v sodobne mikrobiološke postopke, izražanje beljakovin, presejanje encimov ter omične delovne tokove.
Ne glede na to, ali morate iz P. pastoris izolirati rekombinantne proteine, pripraviti kvasovke lizate za encimske teste, razgraditi S. cerevisiae za analizo beljakovin ali vzporedno pregledati več deset kvasovk klonov, ultrazvočni aparati za mikroplošče podjetja Hielscher zagotavljajo močno razgradnjo celic na podlagi kavitacije z natančnim nadzorom procesa.

Zakaj kvasovke potrebujejo učinkovito mehansko lizo

Kvasovke je težje razgraditi kot mnoge bakterijske ali sesalske celice, saj jih ščiti trdna celična stena, sestavljena predvsem iz polisaharidov, glukanov, manoproteinov in kitina. Ta celična stena zagotavlja mehansko stabilnost, hkrati pa omejuje sproščanje intracelularnih beljakovin, nukleinskih kislin, metabolitov in encimov.
Med običajne metode lize kvasovk spadajo drobljenje s kroglicami, encimska prebava, cikli zamrzovanja in odmrzovanja, kemična liza ter ultrazvočna obdelava s sondo. Te metode so sicer lahko učinkovite, vendar imajo tudi svoje omejitve. Mletje s kroglicami lahko povzroči nastanek ostankov in segrevanje, encimska prebava lahko poveča stroške in spremenljivost, sonikacija s sondo na posameznih vzorcih pa je zamudna, kadar je treba obdelati veliko število vzorcev.
Visokointenzivna, usmerjena ultrazvočna kavitacija premaga te omejitve z delovanjem močnih mehanskih strižnih sil, nihanj tlaka in mikrotovora na suspenzijo kvasovk. Rezultat je hitro razgradnjo celičnih sten in membran, izboljšano sproščanje snovi iz celic ter visoko ponovljiva priprava vzorcev v obliki plošč.

Ultrazvočna obdelava mikroplošč za vzporedno pripravo vzorcev kvasovk

Napravi Hielscher UIP400MTP in UIP550MTP sta namenjeni enakomerni ultrazvočni obdelavi mikroplošč, večluknjastih plošč, PCR-plošč in ustreznih stojal za vzorce. Za razliko od ultrazvočne obdelave s sondo vzorcev ni treba obdelovati posamično. Celotna plošča je izpostavljena nadzorovani ultrazvočni energiji, zaradi česar je ta delovni postopek izjemno primeren za vzporedno obdelavo vzorcev.

To je še posebej koristno za:

• Pregled Pekaški kvas mutanti ali ekspresijski sevi
• Liza Oče, pastir / K. phaffii kloni po ekspresiji rekombinantnega beljakovine
• Priprava kvasovih lizatov za encimske analize
• Ekstrakcija beljakovin za SDS-PAGE, Western blot, ELISA, LC-MS/MS ali testiranje aktivnosti
• Sproščanje intracelularnih metabolitov za metabolomiko
• Priprava vzorcev DNK in RNK po ustreznem nadaljnjem čiščenju
• Optimizacija liznih pufrov, dodatkov in pogojev ekstrakcije z visoko zmogljivostjo

Kako ultrazvočna kavitacija uniči kvasovke

Med ultrazvočno obdelavo usmerjeni visokozmogljivi ultrazvok v tekočem vzorcu povzroča izmenične cikle stiskanja in redčenja. Pri zadostni intenzivnosti ta nihanja tlaka povzročijo akustično kavitacijo. Kavitacijski mehurčki se oblikujejo, nihajo in sesedejo, pri čemer nastajajo lokalizirane strižne sile, mikro curki, turbulenca in močni tlakovni gradienti.
V suspenzijah kvasovk ti mehanski učinki oslabijo in pretrgajo celično steno ter celično membrano. Intracelularne beljakovine, encimi, nukleinske kisline in metaboliti se sprostijo v lizisni pufr. Ker gre za mehanski postopek, ga je mogoče uporabiti z mnogimi različnimi pufrskimi sistemi ter kombinirati z zaviralci proteaz, redukcijskimi sredstvi, detergenti, solmi ali blago encimsko predobdelavo.

Splošni protokol: Liza kvasovk v mikroploščah

Naslednji protokol predstavlja praktično izhodišče za lizo kvasovk z uporabo ultrazvočnega aparata za mikroplošče Hielscher UIP400MTP ali UIP550MTP. Parametre je treba optimizirati glede na sev kvasovk, gostoto celic, ciljno molekulo, sestavo pufra, vrsto plošče in nadaljnji preskus.

1. Pridobivanje in pranje kvasovk

Goji kvasovke iz rodov Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces ali druge kvasovke v želenih kultivacijskih pogojih. Celice pobirajte s centrifugiranjem in odstranite gojišče. Pelet sperite s hladno destilirano vodo, PBS ali izbranim lizirnim pufrom, da odstranite ostanke sestavin gojišča, ki bi lahko motili nadaljnje analize.
Za ekstrakcijo beljakovin vzorce hranite na hladnem in delajte hitro. Če obstaja nevarnost delovanja proteaz, vnaprej ohladite vse pufre in potrošni material.

2. Ponovno suspendirajte celični pelet

Kvasni pelet ponovno suspendirajte v primernem hladnem lizisnem pufru. Za učinkovito sproščanje beljakovin je pogosto prednostna visoka gostota celic. Kot izhodišče uporabite približno 10–20 % (m/v) mokrega celičnega peleta ali gosto suspenzijo, ki ustreza vrednosti OD₆₀₀ > 10, odvisno od preskusa.

Tipični pufri za lizo beljakovin kvasovk lahko vsebujejo:

• pufrski sistem, kot so Tris-HCl, fosfatni pufr ali HEPES
• sol, kot sta NaCl ali KCl
• koktajl zaviralcev proteaze
• neobvezno redukcijsko sredstvo, kot je DTT ali β-merkaptoetanol
• po želji detergent, kot so Triton X-100, NP-40, SDS ali CHAPS, odvisno od združljivosti z nadaljnjimi postopki
• neobvezni zaviralci fosfataze za raziskave fosforilacije

Pri zahtevnih sevih kvasovk ali za zelo nežno ekstrakcijo beljakovin je mogoče pred ultrazvočno obdelavo izvesti kratko predobdelavo z Zymolyase, Lyticase ali drugim encimom, ki razgrajuje celično steno. Ta encimska predobdelava ni obvezna, vendar lahko izboljša učinkovitost lize ali zmanjša potrebno intenzivnost ultrazvoka.

3. Vzorce prenesite v primerno mikroploščo

Suspenzijo kvasovk nalijte v mikroploščo, primerno za ultrazvočno obdelavo. Pogosto se daje prednost ploščam z okroglim dnom, saj izboljšujejo zbiranje vzorcev in zmanjšujejo mrtve cone. Za izboljšanje ponovljivosti uporabite enake količine vzorcev v vseh jamicah.
Ploščo zaprite z ustrezno tesnilno podlogo ali folijo, da preprečite izhlapevanje, nastajanje aerosolov in navzkrižno onesnaženje. Prepričajte se, da je tesnilo združljivo z izbranimi pogoji glede temperature in ultrazvoka.
Tipični delovni obsegi so odvisni od formata plošče in namena uporabe. Med običajne formate spadajo plošče s 96 luknjami, plošče z globokimi luknjami, plošče za PCR ali ustrezni nosilci za epruvete.

4. Nastavitev hlajenja

Za lizo kvasovk je potrebna visoka intenzivnost ultrazvoka, mehanska razgradnja pa povzroča nastajanje toplote. Nadzor temperature je zato ključnega pomena, zlasti pri analizi beljakovin, encimov, RNK ali fosforilacije.

Uporabite ustrezno strategijo hlajenja, na primer:

• vnaprej ohlajen puf za lizo
• predhodno ohlajene mikroplošče
• prekinitve hlajenja med posameznimi intervali ultrazvočne obdelave
• zunanje hlajenje platforme za ultrazvok, kjer je to primerno

Cilj je, da se vzorec ohrani dovolj hladen, da se prepreči denaturacija beljakovin, inaktivacija encimov, razgradnja RNK in toplotno pogojena spremenljivost vzorca.

5. Suspenzijo kvasovk obdelajte z ultrazvokom

Zaprto ploščo vstavite v ultrazvočni aparat za mikroplošče Hielscher UIP400MTP ali UIP550MTP in izberite program pulzne sonikacije. Priporočamo uporabo pulzne sonikacije, saj omogoča mehansko razbijanje v fazah »ON« in odvajanje toplote v fazah »OFF«.
Kot izhodišče za lizo kvasovk:

Pri zelo odpornih kvasovskih suspenzijah, gosto biomasi P. pastoris ali težavni ekstrakciji rekombinantnih beljakovin postopoma povečujte skupni čas delovanja. Pri toplotno občutljivih beljakovinah ali encimskih testih uporabite krajše impulze, daljše premore za ohlajevanje in nižjo začetno amplitudo.

Visoko zmogljiva liza kvasovk v večluknjastih ploščah z napravo UIP400MTP

6. Prečistite lizat

Po ultrazvočni obdelavi mikroploščo centrifugirajte ali vzorce prenesite v epruvete za centrifugiranje. Celične ostanke odstranite s centrifugiranjem pri ustrezni hitrosti in temperaturi. Supernatant zberite za nadaljnjo analizo.

Glede na namen uporabe se lizat lahko uporabi za:

• Kvantifikacija beljakovin
• preskusi encimske aktivnosti
• SDS-PAGE in Western blotting
• ELISA in imunološke analize
• LC-MS/MS proteomika
• analiza metabolitov
• Čiščenje DNK ali RNK

7. Optimizirajte in dokumentirajte metodo

Za ponovljivo lizo kvasovk zabeležite vse pomembne parametre, vključno s sevom, pogoji gojenja in optično gostoto (OD)₆₀₀, masa mokre celice, sestava pufra, tip plošče, volumen vzorca, amplituda, impulzni cikel, skupni čas vklopa, način hlajenja in končna temperatura vzorca.
Če je ultrazvočni aparat Hielscher opremljen z avtomatskim beleženjem podatkov, se lahko podatki o procesu uporabijo za dokumentacijo, razvoj metod, povečanje obsega proizvodnje in nadzor kakovosti.

Nasveti za optimizacijo lize kvasovk

Za čim večje sproščanje beljakovin uporabite gosto kvasovko suspenzijo, visoko ultrazvočno intenzivnost in zadosten skupni čas delovanja. Pri občutljivih beljakovinah zmanjšajte amplitudo, podaljšajte premore za hlajenje in ploščo med celotnim postopkom ohranjajte hladno.
Če je liza nepopolna, postopoma podaljšajte čas sonikacije, preizkusite encimsko predobdelavo, zmanjšajte viskoznost vzorca ali optimirajte pufersko raztopino. Če se beljakovine razgradijo ali izgubijo aktivnost, izboljšajte hlajenje, skrajšajte intervale vklopa (ON), dodajte inhibitorje in preverite, ali je sistem detergentov združljiv s ciljno beljakovino.
Ker se kvasovke med seboj znatno razlikujejo po strukturi celične stene, fazi rasti, ekspresijskem sistemu in gostoti biomase, se priporoča uporaba kratke optimizacijske matrike. Na primer, preizkusite tri amplitude, dva impulzna cikla in dva skupna časa vklopa, nato pa ocenite učinkovitost lize in celovitost beljakovin.

Prednosti ultrazvočnih naprav Hielscher za mikroplošče pri lizi kvasovk

Ultrazvočni aparati za mikroplošče podjetja Hielscher so idealni za laboratorije, ki potrebujejo ponovljivo lizo pri številnih vzorcih. Odpravljajo počasno obdelavo po en vzorec naenkrat, značilno za ultrazvočno obdelavo s sondo, ter zmanjšujejo variabilnost, ki jo povzročajo ročno pozicioniranje sonde, globina potopitve in razlike v ravnanju z vzorci.

Glavne prednosti so:

• Visoko zmogljiva obdelava: Hkrati obdelajte z ultrazvokom več vzorcev kvasovk v mikroploščah ali združljivih stojalih za vzorce.
• Pogoji za ponovljivost: Enaki pogoji ultrazvočne obdelave v vseh luknjah za enotne in primerljive rezultate lize.
• Brez navzkrižne kontaminacije sond: Vzorci ostanejo med ultrazvočno obdelavo zaprti, kar zmanjša prenos snovi in število korakov čiščenja.
• Primerno za robustne celice: Ultrazvok visoke intenzivnosti spodbuja razgradnjo celičnih sten kvasovk.
• Učinkovit potek dela: Idealno za presejanje sevov, klonov, pogojev ekspresije in pufrov za lizo.
• Učinkovit potek dela: Programirljive nastavitve, avtomatsko beleženje podatkov in primernost za laboratorijsko avtomatizacijo.

Uporaba v biotehnologiji kvasovk in raziskavah na področju življenjskih znanosti

Ultrazvočna liza kvasovk v mikroploščah podpira številne raziskovalne in presejalne delovne tokove. Pri ekspresiji rekombinantnih beljakovin je mogoče klone P. pastoris in S. cerevisiae lizirati vzporedno, da se primerjajo ravni ekspresije ali encimska aktivnost. V sistemski biologiji in omiki standardizirana liza izboljša primerljivost med različnimi pogoji. V mikrobiologiji ultrazvok omogoča hitro pripravo lizatov iz različnih sevov, gojiščnih pogojev ali obremenitvenih obdelav.
Med tipična področja uporabe spadajo:

• ekstrakcija beljakovin iz kvasovk
• preskušanje rekombinantnih beljakovin
• presoja encimske aktivnosti
• izbira klonov po transformaciji
• optimizacija fermentacije
• priprava vzorcev za proteomiko
• priprava vzorcev za metabolomiko
• raziskave o poškodbah celične stene
• mikrobiološki testi z visoko zmogljivostjo

Zanesljiva liza kvasovk se začne z nadzorovano ultrazvočno obdelavo

Liza kvasovk je lahko zahtevna, ko se število vzorcev poveča, vendar ultrazvočni aparati za mikroplošče podjetja Hielscher poskrbijo, da je postopek hitrejši, čistejši in bolj ponovljiv. Modela UIP400MTP in UIP550MTP raziskovalcem omogočata obdelavo celotnih plošč pod določenimi ultrazvočnimi pogoji, s čimer se poveča zmogljivost in hkrati zmanjša potreba po ročnem ravnanju.
Za mikrobiologe, molekularne biologe, raziskovalce beljakovin in biotehnološke laboratorije je ultrazvočna obdelava mikroplošč močno orodje za učinkovito in ponovljivo sproščanje intracelularnih sestavin kvasovk.

Literatura / Reference