Proteomski protokol: brezkontaktna sonikacija izboljša pripravo peptidnih vzorcev za MS

Proteomika od spodaj navzgor je postala temelj sodobnega odkrivanja bioloških označevalcev, strukturne biologije in klinične diagnostike. Z razgradnjo proteinov v peptide pred analizo z masno spektrometrijo (MS) lahko raziskovalci dosežejo večjo pokritost zaporedij in zanesljivejšo kvantifikacijo. Vendar priprava bioloških vzorcev z veliko kompleksnostjo za MS ostaja tehnično zahtevna. Nedavni metodološki napredki kažejo, kako lahko nadzorovana ultrazvočna obdelava – zlasti z brezkontaktnim sonikatorjem za več epruvet VialTweeter in sonikatorjem za mikrotitrske plošče UIP400MTP – znatno poenostavi ta potek dela, izboljša ponovljivost in prepreči pogosta ozka grla pri uporabi instrumentov.
Oglejte si podroben protokol priprave vzorcev za pridobivanje peptidov ustrezne velikosti za analizo z MS.

Kdo naj uporablja brezkontaktno sonikacijo za pripravo peptidnih vzorcev?

• Laboratoriji za proteomiko od spodaj navzgor in odkrivanje: Raziskovalci, ki pripravljajo vzorce z veliko kompleksnostjo za postopke LC-MS ali MALDI in potrebujejo dosledno pridobivanje peptidov z visokim izkoristkom iz različnih bioloških matriksov.
• Uporabniki tehnologije S-Trap™ in lovljenja v suspenziji: Skupine, ki se zanašajo na čiščenje z mikrokolonami in potrebujejo nadzorovano strižno fragmentacijo DNA za preprečevanje zamašitve kolon ter zagotavljanje nemotenega nanašanja in encimske razgradnje vzorcev.
• Skupine za klinične in translacijske raziskave: Laboratoriji, ki obdelujejo tkivo, celice, plazmo, serum ali cerebrospinalno tekočino in pri katerih sta ključnega pomena ponovljivost med serijami in ohranjena celovitost vzorcev.
• Skupine za kvantitativno in ciljno MS: Laboratoriji, ki izvajajo stroge primerjalne študije, pri katerih sonikatorji s sondo povzročajo tveganja navzkrižne kontaminacije, ki bi lahko ogrozila kvantifikacijo peptidov z nizko zastopanostjo.
• Osrednje raziskovalne enote in dejavnosti z veliko zmogljivostjo obdelave vzorcev: Skupine, ki hkrati obdelujejo več bioloških ponovitev in jim koristi blokovna sonikacija več zaprtih epruvet z napravo VialTweeter, ki odpravi čiščenje sonde, skrajša čas ročnega dela in ohranja aseptične pogoje.
• Raziskovalci PTM in strukture proteinov: Raziskovalci, ki potrebujejo nežno obdelavo z nadzorovano temperaturo za ohranjanje labilnih modifikacij in doseganje največje pokritosti zaporedij med lizo celic in homogenizacijo.

Pregled protokola: od tkiva in celic do peptidov, pripravljenih za MS

Široko uporabljani potek dela v proteomiki od spodaj navzgor, ki so ga opisali Wojtkiewicz in sod., zagotavlja robustno metodo za pripravo peptidnih vzorcev iz različnih bioloških matriksov, ki omogoča povečanje obsega obdelave. Protokol izhaja iz 50–100 mg hitro zamrznjenega tkiva ali 1–20 milijonov celic ter vključuje tehnologijo lovljenja v suspenziji (S-Trap™) za učinkovito odstranjevanje detergentov, soli in kontaminantov pred encimsko razgradnjo.
Po lizi, kvantifikaciji proteinov, redukciji in alkilaciji se vzorec nakisa in nanese na centrifugirno kolono S-Trap™, kjer poteka razgradnja s trypsin/lysC. Nastali peptidi se eluirajo, posušijo in analizirajo z LC-MS. Pri uporabi 50 mg človeškega srčnega tkiva ta potek dela dosledno zagotavlja dovolj peptidov za 30–40 injiciranj, pri čemer se v vsaki analizi identificira več kot 4.000 različnih proteinov. Čeprav sta kemijska obdelava in čiščenje s kolonami dobro opredeljena, je uspešnost celotnega postopka močno odvisna od začetnih korakov fizične razgradnje in obdelave DNA.
Protokol priporoča uporabo sonikatorja za več epruvet VialTweeter za lizo celic s sonikacijo in strižno fragmentacijo DNA – oba koraka sta ključna za analizo peptidov.

Ultrazvočna liza celic in tkiv za ekstrakcijo proteinov

V poteku dela v proteomiki od spodaj navzgor je sonikacija ključni korak pri lizi celičnih vzorcev za ekstrakcijo proteinov za poznejšo analizo z masno spektrometrijo. Po dodajanju pufra za lizo celic s SDS celičnemu peletu se vzorci ultrazvočno obdelajo s sonikatorjem za več epruvet VialTweeter. Protokol uporablja 1,5 mL mikrocentrifugirne epruvete in določa delovanje sonikatorja pri 30% moči z 10 sekundami vklopa in 10 sekundami izklopa, kar se ponovi v 3 ciklih. Po 1 minuti čakanja se cikel ponovi še dvakrat. Vzorci se neprekinjeno hladijo z ledom.
Ta postopek ne pomaga le pri razgradnji celic, temveč je posebej potreben za strižno fragmentacijo genomske DNA, sproščene med lizo. Učinkovita strižna fragmentacija DNA je ključna za zmanjšanje viskoznosti vzorca in preprečevanje zamašitve kolon S-Trap™, s čimer se zagotavljata optimalen izkoristek pridobivanja proteinov in zanesljiva poznejša encimska razgradnja za pridobivanje peptidov.

Ključna vloga ultrazvočne strižne fragmentacije DNA

Ena najpogostejših težav v postopkih na osnovi tehnologije S-Trap™ je zamašitev kolone, ki jo skoraj izključno povzroča genomska DNA z veliko molekulsko maso, sproščena med homogenizacijo celic ali tkiv. Nefragmentirana DNA močno poveča viskoznost vzorca, ujame peptide in zamaši mikroporozno sorbentno plast S-Trap™.
Ultrazvočna obdelava rešuje to težavo z mehansko fragmentacijo DNA v majhne, topne fragmente. Z dovajanjem nadzorovane akustične energije VialTweeter učinkovito strižno fragmentira nukleinske kisline, ne da bi pri tem nastajala čezmerna toplota ali se vnašali tuji kontaminanti. To zmanjšanje viskoznosti zagotavlja nemoteno nanašanje vzorcev, dosleden pretok skozi kolono in neprekinjeno kinetiko encimske razgradnje.

Optimizirani parametri sonikacije z napravo VialTweeter

Protokol določa režim sonikacije z visoko ponovljivostjo, optimiziran za ohranjanje celovitosti bioloških vzorcev in združljivost s poznejšo analizo MS. Pri obdelavi vzorcev v 1.5mL mikrocentrifugirnih epruvetah z brezkontaktnim blokovnim sonikatorjem Hielscher VialTweeter naslednji parametri zagotavljajo lizo in optimalno strižno fragmentacijo DNA ob ohranjanju strukture proteinov:

• Amplituda: 30% moči
• Vzorec cikla: 10 sekund VKLOPA / 10 sekund IZKLOPA
• Trajanje: 3 cikli (10sek VKLOPA/10sek IZKLOPA) → 1-minutni premor na ledu → ponovite še 2-krat
• Uravnavanje temperature: vzorci so med obdelavo na ledu, da se preprečita toplotna denaturacija in prezgodnja encimska aktivnost

Ta pristop s pulzno sonikacijo preprečuje lokalno pregrevanje, zmanjšuje oksidacijo peptidov na najmanjšo možno mero in zagotavlja enakomerno akustično izpostavljenost v vseh vialah. Uporaba zaprtih epruvet odpravi tudi potrebo po čiščenju sonde med vzorci, s čimer se močno zmanjšata čas ročnega dela in variabilnost zaradi izvajalcev.

Ključne prednosti za sodobne proteomske postopke

Vključitev naprave VialTweeter v vaš potek dela v proteomiki od spodaj navzgor prinaša več operativnih in znanstvenih prednosti:

1. Dosledna fragmentacija DNA: Enakomerno dovajanje akustične energije v vse viale zagotavlja ponovljivo zmanjšanje viskoznosti in preprečuje variabilnost med serijami pri nanašanju na S-Trap™.
2. Ohranjanje labilnih modifikacij: Obdelava pri nizki temperaturi v ledeni kopeli varuje posttranslacijske modifikacije (PTM) in preprečuje agregacijo proteinov zaradi toplote med lizo celic.
3. Poenostavljena nadaljnja obdelava: Lizate, obdelane z napravo VialTweeter, je mogoče neposredno zbistriti s centrifugiranjem in kvantificirati brez dodatnih korakov čiščenja, kar pospeši pripravo na encimsko razgradnjo s tehnologijo S-Trap™.
4. Možnost povečanja obsega obdelave in prilagodljivost: Enake nastavitve sonikacije veljajo tako za tkivne vzorce z veliko kompleksnostjo kot za celične suspenzije ter podpirajo postopke proteomike za odkrivanje, ciljne kvantifikacije in glikoproteomike. Sonikatorji Hielscher za mikrotitrske plošče omogočajo preprosto povečanje obsega obdelave na veliko število vzorcev v ploščah z več vdolbinicami.

Literatura / Viri

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
• Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
• Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.