Protokol za proteomiko: Brezstična ultrazvočna obdelava izboljša pripravo peptidnih vzorcev za MS

Proteomika po metodi »od spodaj navzgor« je postala temelj sodobnega odkrivanja biomarkerjev, strukturne biologije in klinične diagnostike. S predhodno razgradnjo beljakovin v peptide pred analizo z masno spektrometrijo (MS) lahko raziskovalci dosežejo bolj poglobljeno pokritost zaporedij in zanesljivejšo kvantifikacijo. Vendar pa priprava bioloških vzorcev visoke kompleksnosti za MS ostaja tehnično zahtevna. Nedavni metodološki napredek poudarja, kako nadzorovana ultrazvočna obdelava – zlasti z brezdotičnim ultrazvočnim aparatom VialTweeter Multi-Tube in ultrazvočnim aparatom za mikroplošče UIP400MTP – lahko znatno poenostavi ta delovni tok, izboljša ponovljivost in prepreči pogosta ozka grla pri delovanju instrumentov.
Poiščite podrobni protokol za pripravo vzorcev, s katerim boste pridobili peptide primerne velikosti za analizo z MS.

Kdo naj uporablja brezdotično ultrazvočno obdelavo za pripravo peptidnih vzorcev?

• Proteomika od spodaj navzgor & Discovery Labs: Raziskovalci, ki pripravljajo vzorce visoke kompleksnosti za postopke LC-MS ali MALDI in potrebujejo dosledno izkoriščanje peptidov z visokim izkoristkom v različnih bioloških matricah.
• S-Trap™ & Zadrževanje uporabnikov v suspenziji: Ekipe, ki uporabljajo čiščenje z mikrostolpci in potrebujejo nadzorovano drobljenje DNK, da preprečijo zamašitev stolpcev ter zagotovijo nemoteno nalaganje vzorcev in prebavo.
• Kliničnih & Skupine za translacijsko raziskovanje: Laboratoriji, ki obdelujejo tkiva, celice, plazmo, serum ali cerebrospinalno tekočino, kjer sta ponovljivost med serijami in neoporečnost vzorcev ključnega pomena.
• Kvantitativno & Ciljni MS Teams: Laboratoriji, ki izvajajo stroge primerjalne študije, v katerih sonikatorji z večkratno uporabo sond predstavljajo tveganje za navzkrižno onesnaženje, kar bi lahko ogrozilo kvantifikacijo peptidov z nizko koncentracijo.
• Osnovne zmogljivosti & Operacije z visoko zmogljivostjo: Skupine, ki hkrati obdelujejo več bioloških ponovitev in jim koristi sonikacija v zaprtih epruvetah v blokih z več epruvetami z napravo VialTweeter, saj to odpravlja potrebo po čiščenju sond, skrajša čas ročnega dela in ohranja aseptične pogoje.
• Srečanje staršev in učiteljev & Raziskovalci strukturnih beljakovin: Raziskovalci, ki potrebujejo nežno obdelavo z nadzorovano temperaturo, da ohranijo labilne spremembe in zagotovijo čim večji obseg sekvence med lizo celic in homogenizacijo.

Pregled protokola: Od tkiv in celic do peptidov, pripravljenih za MS

Široko sprejeti proteomski delovni postopek »od spodaj navzgor«, ki so ga opisali Wojtkiewicz in sod., ponuja zanesljivo in prilagodljivo metodo za pripravo peptidnih vzorcev iz različnih bioloških matric. Protokol, ki se začne z 50–100 mg hitro zamrznjenega tkiva ali 1–20 milijonov celic, vključuje tehnologijo zajemanja suspenzije (S-Trap™) za učinkovito odstranjevanje detergentov, soli in onesnaževalcev pred encimsko prebavo.
Po lizi, kvantifikaciji beljakovin, redukciji in alkilaciji se vzorec nakisli in naloži na centrifugalno kolono S-Trap™, kjer poteka prebava s tripsinom/lysC. Nastali peptidi se eluirajo, posušijo in podvržejo analizi LC-MS. Pri uporabi na 50 mg človeškega srčnega tkiva ta delovni postopek dosledno prinese zadostno količino peptidov za 30–40 injekcij, pri čemer se v vsakem ciklu identificira več kot 4.000 edinstvenih beljakovin. Čeprav so kemijski postopki in čiščenje s kolono natančno opredeljeni, je uspeh celotnega postopka v veliki meri odvisen od začetnih korakov fizičnega razbijanja in ravnanja z DNK.
Protokol priporoča uporabo sonikatorja VialTweeter Multi-Tube za lizo celic s sonikacijo in drobljenje DNK – oba koraka sta ključna za analizo peptidov.

Ultrazvočna liza celic in tkiv za ekstrakcijo beljakovin

V proteomskem delovnem postopku »od spodaj navzgor« je ultrazvočna obdelava ključni korak pri lizi celičnih vzorcev za ekstrakcijo beljakovin za nadaljnjo analizo z masno spektrometrijo. Po dodajanju SDS-pufra za lizo celic k celičnemu peletu se vzorci obdelajo z ultrazvokom z uporabo ultrazvočnega aparata VialTweeter Multi-Tube Sonicator. Protokol predvideva uporabo mikrocentrifugnih epruvet s prostornino 1,5 mL ter določa, da se sonikator uporablja pri 30 % moči v ciklu 10 sekund vklopa in 10 sekund izklopa, kar se ponovi v 3 ciklih. Po 1 minuti čakanja se cikel ponovi še dvakrat. Vzorci se med postopkom neprekinjeno ohlajajo z ledom.
Ta postopek ne le pripomore k razgradnji celic, temveč je nujno potreben za drobljenje genomne DNK, ki se sprošča med lizo. Učinkovito drobljenje DNK je ključnega pomena za zmanjšanje viskoznosti vzorca in preprečevanje zamašitev kolon S-Trap™, s čimer se zagotovi optimalna izkoristljivost beljakovin in zanesljiva nadaljnja prebava peptidov.

Ključna vloga ultrazvočnega drobljenja DNK

Ena najpogostejših napak v delovnih postopkih, ki temeljijo na S-Trap™, je zamašitev kolone, ki jo skoraj izključno povzroča genomna DNK z visoko molekulsko maso, ki se sprošča med homogenizacijo celic ali tkiva. Nepoškodovana DNK drastično poveča viskoznost vzorca, zadržuje peptide in zamaši mikroporozno sorbentno plast S-Trap™.
Ultrazvočna obdelava rešuje ta problem z mehanskim drobljenjem DNK na majhne, topne fragmente. Z uporabo nadzorovane akustične energije naprava VialTweeter učinkovito razreže nukleinske kisline, ne da bi pri tem nastajala prekomerna toplota ali se vnašale tuje nečistote. To zmanjšanje viskoznosti zagotavlja nemoteno nalaganje vzorcev, enakomerne pretoke in neprekinjeno potekanje prebave.

Optimizirani parametri ultrazvočne obdelave z napravo VialTweeter

Protokol določa visoko ponovljiv postopek ultrazvočne obdelave, optimiziran za ohranjanje celovitosti bioloških vzorcev in združljivost z nadaljnjimi postopki MS. Za vzorce v mikrocentrifugnih epruvetah s prostornino 1,5 ml, ob uporabi brezdotičnega blokovnega ultrazvočnega aparata Hielscher VialTweeter, naslednji parametri zagotavljajo lizo in optimalno razrezovanje DNA ob ohranjanju strukture beljakovin:

• Amplituda: 30 % moči
• Cikel delovanja: 10 sekund vklopljeno / 10 sekund izklopljeno
• Trajanje: 3 cikli (10 sekund vklopljeno/10 sekund izklopljeno) → 1-minutni počitek na ledu → ponovi še 2-krat
• Upravljanje temperature: Vzorci se med obdelavo shranijo na ledu, da se prepreči toplotna denaturacija in prezgodnja encimska aktivnost

Ta pristop s pulzno ultrazvočno obdelavo preprečuje lokalno pregrevanje, zmanjšuje oksidacijo peptidov na minimum ter zagotavlja enakomerno izpostavljenost ultrazvoku v vseh vialeh. Zaradi zaprtega sistema cevi tudi ni več potrebno čiščenje sonde med vzorci, kar bistveno skrajša čas ročnega dela in zmanjša vpliv operaterja.

Ključne prednosti za sodobne proteomske delovne tokove

Vključitev naprave VialTweeter v vaš proteomski postopek »od spodaj navzgor« prinaša številne operativne in znanstvene prednosti:

1. Dosledna fragmentacija DNK: Enakomerno dovajanje akustične energije v vse viale zagotavlja ponovljivo zmanjšanje viskoznosti in preprečuje odstopanja med posameznimi serijami pri polnjenju S-Trap™.
2. Ohranjanje labilnih modifikacij: Obdelava pri nizki temperaturi v ledeni kopeli ohranja posttranslacijske modifikacije (PTM) in preprečuje toplotno povzročeno agregacijo beljakovin med lizo celic.
3. Poenostavljena nadaljnja obdelava: Lizate, obdelane z VialTweeterjem, je mogoče neposredno očistiti s centrifugiranjem in količinsko določiti brez dodatnih korakov čiščenja, kar pospeši pot do prebave s S-Trap™.
4. Razširljivost & Prilagodljivost: Enake nastavitve ultrazvoka veljajo tako za tkivne vzorce visoke kompleksnosti kot za celične suspenzije, kar omogoča izvajanje delovnih postopkov na področju raziskovalne proteomike, ciljnega kvantificiranja in glikoproteomike. Ultrazvočni aparati za mikroplošče podjetja Hielscher omogočajo enostavno povečanje obsega na veliko število vzorcev v več luknjah.

Literatura / Reference