Povečanje obsega sinteze peptidov: ultrazvočne strategije za serijsko in kontinuirano proizvodnjo
Sinteza peptidov s pomočjo ultrazvoka združuje uveljavljeno peptidno kemijo z visokofrekvenčno mehansko energijo za pospešitev reakcijskih in transportnih procesov. Akustična kavitacija – nastanek in propad mikroskopskih mehurčkov – povzroča intenzivno lokalno mešanje, mikrostruge in strižne sile. Pri sintezi peptidov ti učinki izboljšujejo prenos reagentov, navlaževanje smole, raztapljanje in razbijanje agregatov. Nizkofrekvenčni ultrazvok zato deluje predvsem kot orodje za intenzifikacijo procesa: ne nadomešča kemije vezave, lahko pa znatno pospeši in izboljša učinkovitost vezave, odstranitve zaščitnih skupin, pranja, cepitve in nadaljnje obdelave.
Izziv povečanja obsega proizvodnje peptidov
Širitev proizvodnje peptidov iz laboratorija v serijsko proizvodnjo je zahtevna, saj se majhne neučinkovitosti kopičijo skozi številne cikle vezave in odstranjevanja zaščitnih skupin, kar zmanjšuje izkoristek in povečuje količino nečistot, ki jih je težko odstraniti. Večji reaktorji prav tako prinašajo omejitve pri mešanju, prenosu toplote, nabrekanju smole in transportu reagentov, medtem ko se poraba topil, zahteve po čiščenju in proizvodni stroški močno povečajo. Uspešno povečanje obsega mora zato ohraniti enakomernost reakcije in kakovost proizvoda, hkrati pa zagotoviti ponovljivo zmogljivost, učinkovito rabo virov in natančen nadzor nad vsemi ključnimi parametri procesa.
Farmacevtska serija z ultrazvočnim napravo UIP2000hdT za izboljšano sintezo peptidov
Strategije sinteze peptidov s pomočjo ultrazvoka
Ultrazvočna sinteza peptidov v trdni fazi
Sinteza peptidov v trdni fazi (SPPS) z uporabo Fmoc-tehnologije je najbolj podrobno raziskana ultrazvočna strategija. Ultrazvok izboljša prodiranje reagentov za odstranjevanje zaščitnih skupin in vezavnih reagentov v nabreknjene polimerne kroglice, hkrati pa zmanjša mirujoče mejne plasti okoli smole. Prav tako lahko prepreči agregacijo na smoli, kar je pomemben vzrok za nepopolno pretvorbo pri hidrofobnih in drugih “težko” zaporedja.
Eksperimentalne študije so pokazale, da je mogoče z ultrazvokom podprto sintezo biološko aktivnih peptidov, ki vsebujejo kar 44 aminokislinskih ostankov, izvesti z manjšo porabo surovin in krajšimi reakcijskimi časi, ne da bi se v navedenih pogojih opazilo povečanje glavnih stranskih reakcij. (glej Merlino in sod., 2019)
Druga študija je poročala o štiri- do štirinajstkratnem skrajšanju časa sestavljanja izbranih peptidov; 25-mer, bogat s hidrofobnimi ostanki, je bil sestavljen v 347 minutah. (glej Silva in sod., 2021)
Ultrazvok se lahko izvede med:
- Nabrekanje smole in izmenjava reagentov
- Odstranjevanje zaščitne skupine Fmoc ali Boc
- Aktivacija in vezava aminokislin
- Vmesno pranje
- Ciklizacija na smoli
- Odcepitev končnega peptida od nosilca
Sinteza v tekoči fazi in sinteza s pomočjo označevalcev
Ultrazvok lahko tudi izboljša konvencionalno sintezo peptidov v tekoči fazi, saj pospeši raztapljanje, disperzijo reagentov in prenos mase v heterogenih ali viskoznih zmesi. Njegova korist je na splošno največja, kadar je proces omejen z mešanjem ali prenosom; pri popolnoma homogeni reakciji, ki jo uravnava izključno notranja kemijska kinetika, je izboljšanje lahko manjše.
Pri sintezi peptidov z oznako se nastajajoči peptid veže na topno ali oborljivo organsko sidro. Reakcije potekajo v raztopini, nato pa se označeni vmesni produkt izolira z oborjenjem ali filtracijo. Ultrazvok lahko pospeši vezavo, odstranitev zaščitne skupine, ciklizacijo in odcep oznake, hkrati pa ohranja slabo topne vmesne produkte v dispergiranem stanju.
| Tehnika | Kako to spodbuja ultrazvok | Pomen in omejitve |
|---|---|---|
| Sinteza peptidov v trdni fazi z metodo Fmoc | Ultrazvok pospeši prodiranje piperidina in odstranjevanje Fmoc-produktov; izboljša prenos aktiviranih aminokislin v nabreknjeno smolo; prepreči agregacijo na smoli | Najmočnejši dokazi in ponavadi največja korist |
| Bocova sinteza v trdni fazi | Ultrazvok izboljša prodiranje kisline, izmenjavo reagentov, vezavo in izpiranje, podobno kot pri kemiji Fmoc | Pri ravnanju s kislinami in ogrevanju je potrebna previdnost |
| Sinteza v raztopini/tekoči fazi | Ultrazvok izboljša raztapljanje zaščitenih aminokislin, razprši oborine in poveča stik v dvofaznih reakcijah ali reakcijah s suspenzijo | Učinek je manjši, kadar je reakcija že homogena in je hitrost reakcije omejena s kemijskimi dejavniki. |
| Sinteza s pomočjo topnih označevalcev ali na osnovi precipitacije | Ultrazvok zagotavlja, da ostanejo označeni vmesni produkti dispergirani med vezavo, in lahko izboljša raztapljanje pred filtracijo ali precipitacijo | Uporabno za slabo topne ali obsežne pripravke; ultrazvok predvsem olajša ravnanje in prenos mase |
| Tokovska ali neprekinjena sinteza | Ultrazvok pomaga ohranjati stik med smolo in tekočino ter preprečuje nastanek lokalnih območij zastoja ali agregacije | Širitev z zasnovo pretočne celice za enakomerno izpostavljanje ultrazvoku |
| Ligacija fragmentov in ciklizacija | Ultrazvok lahko raztopi hidrofobne fragmente, razbije agregate in izboljša medmolekularni stik | To samo po sebi ne pospeši vsake naravne kemične ligacije ali makrocikilizacije; prevladati lahko še vedno prekomerno redčenje ali medmolekularna agregacija |
| Encimska sinteza peptidov | Pri ustrezni intenzivnosti lahko ultrazvok spremeni dinamiko encimov in izboljša prenos substrata, zlasti pri imobiliziranih encimih ali dvofaznih medijih | V veliki meri odvisno od encimov; prekomerna moč povzroči razgrnitev ali inaktivacijo |
| Ribosomska/rekombinantna sinteza | Nima neposrednega vpliva na prevod | Ultrazvok se uporablja predvsem za razbijanje celic po ekspresiji |
Ultrazvočno povečanje obsega: obdelava v serijah, z recirkulacijo in s kontinuiranim pretokom
Ultrazvočne naprave Hielscher je mogoče brez težav vključiti v vašo specifično proizvodno ureditev za sintezo peptidov.
Za povečanje obsega so pomembne tri konfiguracije reaktorjev:
- Serijsko ultrazvočno obdelovanje je preprosto in prilagodljivo, vendar se z večanjem prostornine posode težje doseže optimalno in homogeno ultrazvočno obdelovanje.
- Pri obdelavi z recirkulacijo se vsebina reaktorja večkrat črpa skozi ultrazvočno pretočno celico, kar zagotavlja bolj enakomerno obdelavo, hkrati pa ohranja prožnost pri obdelavi v serijah.
- Pri neprekinjenem pretoku reakcijski tok teče skozi eno ali več nadzorovanih con ultrazvoka. Čas zadrževanja, pretok in vnos energije je mogoče natančno določiti, zaradi česar je ta zasnova najprimernejša za visoko zmogljivo in ponovljivo proizvodnjo.
Pri postopkih na osnovi smole morajo pretok, črpalka in ventili omogočati pretok kroglic brez obrabe ali zamašitve. Alternativa je zadrževanje smole v reaktorju z mešanjem in cirkulacija le tekoče faze skozi ultrazvočno celico.
2 industrijska ultrazvočna naprava modela UIP4000hdT priključen na reaktor s pretočno celico iz nerjavečega jekla za proizvodnjo peptidov.
Pogosta vprašanja o širitvi sinteze peptidov z ultrazvokom
Kaj je ultrazvočna sinteza peptidov?
Pri ultrazvočni sintezi peptidov se uporabljajo visokointenzivni zvočni valovi za izboljšanje mešanja, prenosa snovi in reakcijske kinetike med sestavljanjem peptidov. Akustična kavitacija pomaga reagentom prodreti v nabreknjeno smolo, razprši agregate ter pospeši korake vezave, odstranjevanja zaščitne skupine, izpiranja in cepitve.
Kako ultrazvok izboljša sintezo peptidov v trdni fazi?
Pri ultrazvokom podprti sintezi peptidov v trdni fazi (US-SPPS) ultrazvok izboljša stik med peptidom, vezanim na smolo, in raztopljenimi reagenti. To lahko skrajša reakcijske cikle, omogoči popolnejše vezanje in zmanjša izgube v zaporedju, zlasti pri sintezi hidrofobnih, k agregaciji nagnjenih ali kako drugače zahtevnih peptidov.
Ali lahko ultrazvok poveča izkoristek in čistost peptidov?
Ultrazvok lahko izboljša konverzijo, surovi izkoristek in čistost, saj omogoča enakomerno porazdelitev reagentov in zmanjša število nepopolnih vezav. Rezultat je odvisen od peptidnega zaporedja, smole, topila, kemije vezave in ultrazvočnih parametrov, zato je treba vsak postopek optimizirati in analitično validirati.
Kateri koraki sinteze peptidov se lahko obdelujejo z ultrazvokom?
Ultrazvok lahko olajša nabrekanje smole, odstranitev zaščitnih skupin Fmoc ali Boc, vezavo aminokislin, izpiranje, kondenzacijo fragmentov, ciklizacijo in odcepitev s trdnega nosilca. Prav tako lahko izboljša raztapljanje in prenos mase pri sintezi peptidov v tekoči fazi in sintezi peptidov s pomočjo označevalcev.
Odkrijte ultrazvočno sintezo peptidov – za sintezo peptidov v trdni fazi in – sinteza z označevanjem v tekoči fazi!
Ali je ultrazvočna sinteza peptidov primerna za zahtevne sekvence?
Da. Ultrazvok je še posebej koristen pri hidrofobnih in k agregaciji nagnjenih sekvencah, saj kavitacija in mikroteci pomagata prekiniti agregacijo na smoli ter izboljšata dostop reagentov do reaktivnih mest. Pri zahtevnih vezavah so morda še vedno potrebni optimizirani reagenti, ponovna vezava ali prilagojeni reakcijski pogoji.
Ali je mogoče sintezo peptidov z ultrazvokom izvesti v večjem obsegu?
Ultrazvočno sintezo peptidov je mogoče prenesti iz laboratorijskih poskusov v serijsko, recirkulacijsko ali kontinuirano proizvodnjo. Povečanje obsega proizvodnje se doseže z ohranjanjem ključnih parametrov, kot so amplituda, specifična energija, temperatura in čas zadrževanja, ob hkratnem povečanju ultrazvočne moči, površine sonotrode ali števila obdelovalnih modulov.
Kaj pomeni linearna skalabilnost pri ultrazvoku?
Linearna skalabilnost pomeni, da se lahko pretok poveča približno sorazmerno z vgrajeno ultrazvočno močjo, če ostanejo zahtevana energija na enoto prostornine in drugi pogoji procesa nespremenjeni. Na primer, podvojitev efektivne ultrazvočne moči lahko približno podvoji pretok, pod pogojem, da se ohranijo geometrija reaktorja, temperatura in cilji glede kakovosti izdelka.
Zakaj so ultrazvočni aparati podjetja Hielscher primerni za povečanje obsega proizvodnje peptidov?
Ultrazvočni aparati Hielscher pokrivajo laboratorijske, pilotne in industrijske območja moči z uporabo doslednih in nadzorljivih obratovalnih parametrov. Njihova nastavljiva amplituda, avtomatsko beleženje podatkov, nadzor temperature in tlaka, združljivost s pretočnimi celicami ter modularne konfiguracije omogočajo ponovljiv prenos procesov in zanesljivo proizvodnjo.
Ali lahko ultrazvočni aparati podjetja Hielscher delujejo v okviru neprekinjene proizvodnje peptidov?
Da. Industrijske ultrazvočne naprave podjetja Hielscher je mogoče vgraditi v recirkulacijske zanke in reaktorje s kontinuirnim pretokom v liniji. Te konfiguracije omogočajo nadzorovani čas zadrževanja in dovajanje energije, hkrati pa zmanjšujejo odstopanja med posameznimi serijami. Industrijski sistemi so zasnovani za neprekinjeno delovanje 24 ur na dan, 7 dni na teden v zahtevnih proizvodnih pogojih.
Ali so za sintezo peptidov bolj primerne ultrazvočne kopeli ali sondni sonikatorji?
Ultrazvočne kopeli so lahko primerne za začetno pregledovanje in hkratno obdelavo majhnih zaprtih posod. Ultrazvočni generatorji v obliki sond ultrazvok oddajajo neposredno v medij, kar omogoča višjo intenzivnost, boljši nadzor nad parametri in večjo prilagodljivost. Zato se za pilotno in industrijsko proizvodnjo na splošno raje uporabljajo sonde in pretočne celice.
Kako se nadzira temperatura med ultrazvočno sintezo peptidov?
Ker ultrazvok vnaša energijo v reakcijsko zmes, je učinkovito hlajenje nujno. Ultrazvočni aparati podjetja Hielscher so na voljo z posodami z oplaščeno steno, zunanjimi toplotnimi izmenjevalniki, recirkulacijo s krmiljenjem temperature in impulznim ultrazvokom, kar učinkovito preprečuje pregrevanje. Vstavljivi temperaturni senzorji in programirljive temperaturne omejitve omogočajo zanesljivo spremljanje in beleženje temperature skozi celoten razvoj in proizvodnjo.
Kako izbrati ultrazvočni aparat Hielscher za sintezo peptidov?
Izbira je odvisna od prostornine serije, želenega pretoka, topila, viskoznosti, koncentracije trdnih snovi ali smole, potrebne specifične energije in proizvodnega načrta. Z laboratorijskim testiranjem se določi učinkovito procesno okno, na podlagi katerega je mogoče dimenzionirati Hielscherjev ultrazvočni aparat, sonotrodo in konfiguracijo pretočne celice za predvideno zmogljivost.
Literatura / Reference
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
Hielscher Ultrasonics proizvaja visoko zmogljive ultrazvočne homogenizatorje iz laboratorij k industrijska velikost.