Ultrazvočna priprava vzorcev C. elegans
C. elegans, črv ogorčice, je široko uporabljen modelni organizem v biologiji. Priprava vzorca pred analizo zahteva lizo, ekstrakcijo beljakovin in lipidov ter fragmentacijo RNA, ki jo je mogoče zanesljivo izvesti z ultrazvočno razbijanjem. Ultrazvočni motilci celic so zanesljive, prefinjene in enostavne naprave za hitro pripravo vzorcev C. elegans.
Ultrazvočna priprava vzorcev C. elegans
C. elegans so okrogli črvi, ki se pogosto uporabljajo v raziskovalnih laboratorijih za raziskovanje genomike, razvojne biologije in bolezni. Številni geni v genomu C. elegans imajo funkcionalne kolege pri ljudeh. Zato je črv ogorčice izjemno uporaben model za človeške bolezni. Druge prednosti za široko uporabo C. elegans so enostavno in poceni gojenje na ploščah, ki vsebujejo bakterije (npr. E. coli), njegova preglednost, priročno ravnanje ter možnost zamrznitve in shranjevanja črvov za daljše obdobje.
Analiza beljakovin in lipidov je redni postopek v laboratorijih, ultrazvočna priprava vzorcev pa je uveljavljena metoda za lizo ogorčic C. elegans v vsaki razvojni fazi (tj. Zarodki, ličinke L1-L4, odrasli). Ker se C. elegans uporablja tudi kot sistem za izražanje beljakovin za prekomerno izražanje ciljnih beljakovin, je potrebna zanesljiva, ponovljiva metoda lize in ekstrakcije beljakovin, ki daje visoke donose beljakovin. Ultrazvočni sistemi za motnje in ekstrakcijo celic so na voljo kot homogenizatorji tipa sonde in kot ultrazvočni aparati z več vzorci. Za priročno pripravo vzorcev in vse vrste velikosti vzorcev ima Hielscher Ultrasonics idealen ultrazvočni motilec celic za vaš laboratorijski postopek.
- Priprava črvovih homogenatov
- ekstrakcija beljakovin
- ekstrakcija lipidov
- Kvantifikacija beljakovin
- Imunoprecipitacija
- Zahodno blotting
- Ekstrakcija RNA
- Encimski testi

VialTweeter enota za pripravo več vzorcev za sočasno ultrazvočno razbijanje 10 epruvet.
Ultrazvočni protokoli za motnje in lizo C. elegans
Ultrazvočna homogenizacija in liza C. elegans ter kasnejša ekstrakcija beljakovin in lipidov se lahko izvede z različnimi postopki z uporabo različnih pufrov za homogenizacijo in lizo itd. Vsem protokolom za lizo je skupno to, da je treba vzorce stalno hraniti na ledu, da se prepreči razgradnja beljakovin. V nadaljevanju vam predstavljamo nekaj zanesljivih in hitrih ultrazvočnih protokolov za lizo in ekstrakcijo za pripravo visokokakovostnih vzorcev C. elegans, ki vsebujejo beljakovine ali lipide.
Prednosti ultrazvočne lize C. elegans
- Zanesljiv
- Ponovljivo
- natančno nadzorovana temperatura
- zanesljiv nadzor procesov
- nežna metoda
- enostaven za uporabo
- Varen
Ultrazvočna ekstrakcija beljakovin iz vzorcev C. elegans
Ultrazvočna liza in ekstrakcija beljakovin črvov C. elegans se lahko izvede z različnimi protokoli. V nadaljevanju vam predstavljamo nekaj zanesljivih in hitrih protokolov za reprodukcijo rezultatov ekstrakcije beljakovin.
Hitra priprava citosolnega ekstrakta iz črvov C. elegans z ultrazvočnim razbijanjem
Z naslednjim protokolom lahko pripravite lizate C. elegans v manj kot 30 minutah.
Zbirka C. elegans
Želene črve C. elegans vzemite v 1,5 ml fiziološko raztopino s fosfatnim puferjem (PBS) ali jih sperite s plošče z 1,5 ml PBS. Centrifugiramo 1 min pri 2000 vrtljajih na minuto na pelet. Vzorce hranite ves čas na ledu.
Nato črve dvakrat operite s PBS.
Nato črve dvakrat operite z ddH2O.
Črve resuspendirajte v najmanj 500 ul homogenizacijskega pufra (HB). Vzorci črvov so zdaj pripravljeni za ultrazvočno lizo.
Za višjo kakovost beljakovinskih ekstraktov boste morda želeli zmanjšati bakterijsko kontaminacijo tako, da črve perete 5 minut v PBS in sterilni, ultra čisti vodi (ddH)2O) ali izvedite plavanje saharoze. Vzorce črvov hranite neprekinjeno na ledu.
Ultrazvočni protokol za lizo C. elegans
- Prepričajte se, da ste ultrazvočni aparat pripravili vnaprej, tako da je ultrazvočni homogenizator pripravljen za uporabo (nameščena sonda, prednastavljen program ultrazvočnega razbijanja).
- Za lizo C. elegans z UP200St ali UP200Ht je treba ultrazvočno razglasitev opraviti z mikrokonico (npr. 2 mm sonda S26d2; glej sliko levo) pri 40% amplitudi za 1 sekundo s 30 sekundami premorov vmes. 5 ultrazvočnih ciklov za vsako 1 sekundo s 30-sekundnimi premori je idealnih za lizo C. elegans. Če lizo izvajate prvič, lahko z mikroskopom preverite napredovanje lize v majhnih alikvotih vzorca po vsakem impulzu.
- Liza je uspešno zaključena, ko so črvi moteni. Prekomerno ultrazvočno razbijanje povzroči zlom jeder in postane vidno, ko vzorec postane viskozen ali penjen. Da preprečite razgradnjo vzorca, po potrebi uporabite več impulzov. Ne povečajte časa vsakega ultrazvočnega pulznega cikla, da dobite visokokakovostne beljakovinske izvlečke.
- Lizat čistih celic centrifugiramo s centrifugiranjem ultrazvočno liziranih črvov pri 14.000 vrtljajih na minuto 10 minut pri 4 ° C.
- Nato prenesite supernatant v svežo cev in se pripravite na imunoprecipitacijo ali druge teste.
Če je vaš ultrazvočni aparat nameščen na stojalu, postavite ledeno kopel z vzorčnimi epruvetami pod ultrazvočno sondo in vstavite ultrazvočno sondo v 1,5 ml cev.
Opomba za homogenizacijski pufer: Pripravite homogenizacijski pufer za zgornji protokol ultrazvočne lize, kot sledi:
- 15 mM Hepes pH 7,6 – 15 ml 0,5 M
- 10 mM KCl – 2,5 ml 2 M
- 1,5 mM MgCl2 – 075 ml 1 M
- 0.1 mM EDTA – 100 ul od 0,5 m
- 0.5 mM EGTA – 2,5 ml 0,1 M
- 44 mM saharoza – 14,7 ml 50 %
- Dodajte tik pred uporabo: 1mM DTT – 1000x od 1M
- plus zaviralec proteaze
Visoko zmogljiva liza C. elegans v 96-jamičnih ploščah z uporabo UIP400MTP Plate Sonicator
C. elegans Lysis (odrasle ogorčice)
UIP400MTP 80 % amplitude, 20 ciklov (vsak cikel ultrazvočnega razbijanja: 30 sekund vklopljeno, 30 sekund izklopljeno)
Pufer za lizo:
- Možnost 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
- Možnost 2) za koimunoprecipitacijo (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (popoln koktajl zaviralcev proteinaze)
Visoko zmogljiva fragmentacija DNK
C. elegans (odrasle ogorčice) DNA 200-300bp: sonikator UIP400MTP plošče – nastavi 80% amplitudo, 30 impulzov – vsakih 30 sekund vklopljeno, 30 sekund izklopljeno

UIP400MTP Plate Sonicator za visoko zmogljivo pripravo vzorcev enakomerno ultranificira vzorce v ploščah z več jamicami, mikrotitro in 96 ploščah
Ultrazvočna liza C. elegans za kvantitativne teste čiščenja afinitete
Zarodki C. elegans (∼2 milijona na repliko) so bili sveže pobrani v biološki trojni kopiji z beljenjem mladih gravidnih hermafroditov in sonikirani na ledu (cikel: 0,5 s, amplituda: 40–45%, 5 udarcev na sejo, 5 sej, interval med seansami: 30 s; UP200S ultrazvočni procesor z mikro konico S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) v pufru za lizo (skupna prostornina: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerol, mešanica zaviralcev proteaze, 0,1% nadomestek Nonidet P-40). Po ultrazvočni obdelavi je bil dodatek Nonidet P-40 dodan do 1% in lizati so bili inkubirani z rotacijo glave nad repom pri 4 ° C za 30 minut, čemur je sledilo centrifugiranje pri 20.000 × g 20 minut pri 4 ° C. Očiščeni lizat je bil nato aspiriran brez motenj zgornje lipidne plasti in razdeljen za polovico na agarozne kroglice proti GFP ali blokirane kontrolne kroglice (40–50 μl). Po vrtenju glave nad repom pri 4 °C 60–90 minut so bile kroglice enkrat sprane s pufrom za lizo, ki je vseboval 0,1 % nadomestka Nonidet P-40, čemur je sledilo dvakratno pranje v pufru I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ali pufru II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ali oboje. Za vlečne naprave GFP:MBK-2 sta bila izvedena dva ločena poskusa z različnimi pogoji pranja. Beljakovine so eluirali z orbitalnim tresenjem v 50 μl 6 m sečnine / 2 M tiouree pri sobni temperaturi. Za poskuse vlečenja MBK-1::GFP so bile beljakovine dvakrat eluirane s stresanjem v 50 μl 8 m gvanidinijevega klorida pri 90 °C, čemur je sledilo obarjanje etanola. Eluirani vzorci beljakovin so bili nato prebavljeni v raztopini.
(prim. Chen et al., 2016)
Ultrazvočna homogenizacija in liza črvov
Za lizo C.elegans in postopek ekstrakcije beljakovin je bilo zbranih 30.000 nemotodov ustrezne stopnje na vzorec in spranih v ledeno hladnem S-bazalu, koncentriranem s centrifugiranjem pri 1500 vrtljajih na minuto 2 minuti, šestkrat spranih z ledeno hladnim S-bazalom, da se odstranijo ostanki bakterij, in nato shranjenih na ledu, dokler ni pripravljen za uporabo. Za ekstrakcijo beljakovin je bilo dovoljeno, da odrasli črvi po zadnjem S-bazalnem pranju tvorijo kompaktno peleto. Pelete črvov so nato resuspendirali v 1 ml ledeno hladnega ekstrakcijskega pufra [20 mM kalijevega fosfata, pH 7,4, 2 mM EDTA, 1% Triton-X-100, zaviralci proteaze (Sigma P2714)] in takoj obdelali.
∼30.000 odraslih gravidnih črvov (kar ustreza ∼100 mg mokre teže) je bilo ultrazvočno obdelanih na ledu z ultrazvočnim aparatom tipa sonde (npr. UP50H z mikrokonico MS2) pri 40% amplitudi za 10 ciklov po 3 sekunde vklopa, 30 sekund izklopljeno, v 1 ml ledeno hladnega ekstrakcijskega pufra. (prim. Baskharan et al. 2012)
Ultrazvočna ekstrakcija lipidov iz C. elegans
V lipidomiki, veji metabolomike, je opisan in analiziran lipidni komplement bioloških sistemov. C. elegans se pogosto uporablja v lipidomiki za raziskovanje interakcije presnovnih lipidov in njihovih učinkov na zdravje in življenjsko dobo.
Ultrazvočna liza in ekstrakcija se uporablja za sproščanje lipidov, kot so sfingolipidi iz zarodkov C. elegans, ličink in odraslih črvov. Ultrasonication se uporablja za pripravo homogenatov črvov in nato za ekstrakcijo lipidov iz vzorca.
Protokol za ultrazvočno ekstrakcijo lipidov iz C. elegans
Pelet C. elegans odmrznite na ledu in ga ponovno suspendirajte z 0,5 ml ultravode.
Sonikirajte vzorce C. elegans v 1,5 ml epruvetah, pri tem pa vzorce neprekinjeno držite na ledu.
Sonication se lahko izvede z ultrazvočnim sondom, kot je UP200Ht, ultrazvočna enota za pripravo vzorcev VialTweeter (sočasno ultrazvočno razbijanje 10 vzorcev) ali UIP400MTP (za ultrazvočno razbijanje plošč z več vdolbinicami, kot so plošče z 96 vdolbinicami). Za ultrazvočno lizo z UP200Ht uporabite mikro konico S26d2. V digitalnem meniju vnaprej nastavite način ultrazvočnega cikla. Nastavite amplitudo na 10% in način ultrazvočnega cikla 2 sekunde impulzov po 20 ciklov s premorom 30 sekund med vsakim ultrazvočnim pulziranjem.
Supernatante prenesite v steklene cevi z navojnim pokrovčkom.
Izvedemo Folchovo ekstrakcijo tako, da vsaki stekleni epruveti dodamo 1 ml ultravode, nato pa vsaki stekleni epruveti dodamo 6 ml mešanice kloroforma/metanola (razmerje = 2:1).
Vsako stekleno cev vrtinčite 30 sekund 4-krat.
Epruvete centrifugiramo pri 1,258 x g 15 minut (Eppendorf, 5810 R), da še izboljšamo ločevanje faz.
Spodnjo hidrofobno frakcijo prenesemo v čisto stekleno cev s stekleno Pasteurjevo pipeto.
Spodnjo hidrofobno frakcijo posušimo pod pretokom dušika v uparjalniku dušika.
Posušene pelete shranjujte v zamrzovalniku pri -80 °C do uporabe.
Ultrazvočna priprava lizatov črvov
Lizat črvov: Črvi stopnje L4 so bili pobrani in trikrat oprani z pufrom M9 (42,26 mM Na2HPO4, 22,04 mM KH2PO4, 85,56 mM NaCl in 0,87 mM MgSO4), da bi odstranili vse bakterije. Po odstranitvi čim več pufra M9 so črvi resuspendirali v pufru za lizo: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM fosfat β-glicerol, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 50 mM natrijev fluorid, 1 mM natrijev ortovanadat, 5 mM natrijev pirofosfat, 0,2 mM fenilmetansulfonilfluorid in zaviralec proteaze. Črvi so bili zamrznjeni v tekočem dušiku in trikrat odmrznjeni pri 37 ° C, nato pa so bili črvi sonikirani na suhem ledu z ultrazvočno enoto VialTweeter za hkratno pripravo 10 vzorčnih epruvet. Ultrazvočno razbijanje je bilo izvedeno pri 50% amplitudi v 10 ciklih po 2 sekundi s 30-sekundnim premorom med ultrazvočnimi izbruhi. Nato so bili vzorci centrifugirani pri 12000 vrtljajih na minuto pri 4 ° C za 15 minut. Supernatant je bil zbran in shranjen pri -70 °C. Alikvot je bil uporabljen za kvantifikacijo beljakovin z Bradfordovim testom.
Določanje skupnega glutationa, GSH in GSSG: Za kvantifikacijo glutationa so bili lizati in določanje opravljeni isti dan. Ličinke L4, hranjene z glukozo in kontrole, so bile pobrane in trikrat sprane z pufrom M9. Po odstranitvi čim več pufra M9 so črve resuspendirali v ledeno hladni metafosforni kislini (5% m/v), nato pa so črve ultrazvočno razbijali v ledu z ultrazvočnim VialTweeterjem pri 50% amplitudi v desetih ultrazvočnih ciklih po 2 sekundi s 30 sekundami premora med vsakim ciklom. Nato centrifugiramo pri 12000 vrtljajih na minuto pri 4 °C 15 minut.
(prim. Alcántar-Fernández et al., 2018)
Priprava vzorca C. elegans pred imunoprecipitacijo in zahodnim blottingom
Skratka, za embrionalne izvlečke so ličinke C. elegans L1 gojili v velikih tekočih kulturah S-medium do odraslosti. Zarodki so bili zbrani s standardno metodo belila in suspendirani v pufru za lizo (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerola, 0,05% NP-40, 1 - koktajl zaviralcev proteaze in 1 - - koktajl inhibitorja fosfataze I in II), hitro zamrznjen v tekočem dušiku in liziran z ultrazvočno motnjo celic z uporabo ultrazvočnega zvočnega aparata z mikrokonico, kot je UP200Ht s S26d2 za 10 impulzov nad 10 s pri 30% amplitudi. Če je treba pripraviti večje število vzorcev, ultrazvočni VialTweeter ali MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP za plošče z vdolbinicami. Po ultrazvočni obdelavi so bili ekstrakti predhodno očiščeni s centrifugiranjem pri 30.000 g 20 minut pri 4 °C. Predhodno očiščen ekstrakt (300 μg skupne beljakovine) je bil inkubiran s 40 μ�ΰ anti-CDC-25.1 afinitetno prečiščenega protitelesa (ta študija), navzkrižno povezanega z beljakovino A-agarozo, ali pa je bila kot kontrola uporabljena podobna količina kunčjega imunoglobulina (Ig)G, premreženega z beljakovino A-agarozo, v skupnem volumnu 200 μl liznega pufra, ki vsebuje 1% NP-40, katerega vključitev je zmanjšala nespecifično vezavo beljakovin na matriks. Vzorce smo 1 uro vrteli pri 4 °C, kroglice so trikrat sprali z liznim pufrom in eluirali s 30 μl glicina / HCl in 200 mM NaCl, pH 2,2. Po imunoprecipitaciji so eluate razredčili v 30 μ� pufra vzorca SDS, segreli na 95 ° C za 4 minute, običajno pa so 3% skupnega vnosa in 30% za eluate nanesli na SDS-PAGE, čemur je sledil Western blotting z anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubikvitin (1:1000), anti-GSK3��� (1:500) ali anti---β-aktin (1:2000) protitelesa. Kadar ekstrakti niso bili podvrženi imunoprecipitaciji, je bila enaka količina skupnih beljakovin, pridobljenih iz teh ekstraktov, resuspendirana v pufru vzorca SDS, segreta na 95 °C in nato neposredno nanesena na SDS-PAGE in analizirana z Western blotting. (prim. Segref et al. 2020)

Ultrazvočni motilec celic UP200St z mikro konico S26d2 za lizo in ekstrakcijo beljakovin
Ultrazvočna liza pod natančnim nadzorom temperature
Natančen in zanesljiv nadzor temperature je ključnega pomena pri ravnanju z biološkimi vzorci. Visoke temperature sprožijo toplotno povzročeno razgradnjo beljakovin v vzorcih.
Kot vse mehanske tehnike priprave vzorcev, ultrazvočna obdelava ustvarja toploto. Vendar pa je temperaturo vzorcev mogoče dobro nadzorovati pri uporabi VialTweeterja. Predstavljamo vam različne možnosti za spremljanje in nadzor temperature vaših vzorcev, medtem ko jih pripravljate z VialTweeter in VialPress za analizo.
- Spremljanje temperature vzorca: Ultrazvočni procesor UP200St, ki poganja VialTweeter, je opremljen z inteligentno programsko opremo in vtičnim temperaturnim senzorjem. Priključite temperaturni senzor v UP200St in vstavite konico temperaturnega senzorja v eno od epruvet za vzorce. Prek digitalnega barvnega zaslona na dotik lahko v meniju UP200St nastavite določeno temperaturno območje za ultrazvočno razbijanje vzorca. Ultrazvočni aparat se bo samodejno ustavil, ko bo dosežena najvišja temperatura, in se ustavil, dokler se temperatura vzorca ne zniža na nižjo vrednost nastavljene temperature ∆. Nato se ultrazvočno razbijanje spet začne samodejno. Ta pametna funkcija preprečuje degradacijo, ki jo povzroča toplota.
- Blok VialTweeter je mogoče predhodno ohladiti. Postavite blok VialTweeter (samo sonotrode brez pretvornika!) v hladilnik ali zamrzovalnik, da se titanov blok predhodno ohladi, pomaga odložiti dvig temperature v vzorcu. Če je mogoče, se lahko tudi sam vzorec predhodno ohladi.
- Uporabite suhi led za hlajenje med ultrazvočnim razbijanjem. Uporabite plitki pladenj, napolnjen s suhim ledom, in postavite VialTweeter na suh led, da se toplota lahko hitro razprši.
Poiščite optimalni ultrazvočni motilec celic za vašo aplikacijo za lizo
Hielscher Ultrasonics je dolgoletni izkušen proizvajalec visoko zmogljivih ultrazvočnih motilcev celic in homogenizatorjev za laboratorije, namizne in industrijske sisteme. Velikost vaše bakterijske celične kulture, vaš raziskovalni ali proizvodni cilj in obseg celice za obdelavo na uro ali dan so bistveni dejavniki za iskanje pravega ultrazvočnega motilca celic za vašo uporabo.
Hielscher Ultrasonics ponuja različne rešitve za hkratno ultrazvočno razbijanje več vzorcev (do 10 vial) in masnih vzorcev (tj. Mikrotitrijske plošče / 96-vdolbinice), klasični laboratorijski ultrazvočni ultrazvočni aparat s sondo z različnimi stopnjami moči od 50 do 400 vatov do popolnoma industrijskih ultrazvočnih procesorjev z do 16.000 vatov na enoto za komercialne motnje celic in ekstrakcijo beljakovin v veliki proizvodnji. Vsi Hielscher ultrazvočni aparati so izdelani za delovanje 24/7/365 pod polno obremenitvijo. Robustnost in zanesljivost sta temeljni lastnosti naših ultrazvočnih naprav.
Vsi digitalni ultrazvočni homogenizatorji so opremljeni s pametno programsko opremo, barvnim zaslonom na dotik in samodejnim protokoliranjem podatkov, zaradi česar je ultrazvočna naprava priročno delovno orodje v laboratoriju in proizvodnih obratih.
Sporočite nam, kakšne celice, kakšen volumen, s kakšno frekvenco in s kakšnim ciljem morate obdelati svoje biološke vzorce. Priporočili vam bomo najprimernejši ultrazvočni motilec celic za vaše procesne zahteve.
Spodnja tabela vam prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih sistemov od kompaktnih ročnih homogenizatorjev in MultiSample ultrasonicatorjev do industrijskih ultrazvočnih procesorjev za komercialne aplikacije:
Obseg serije | Pretok | Priporočene naprave |
---|---|---|
96-jamične / mikrotitrijske plošče | n.a. | UIP400MTP |
10 vial po 0,5 do 1,5 ml | n.a. | VialTweeter na UP200St |
001 do 250 ml | 5 do 100 ml / min | UP50H |
0.01 do 500 ml | 10 do 200 ml / min | UP100H |
10 do 2000 ml | 20 do 400 ml / min | UP200Ht, UP400St |
0.1 do 20L | 00,2 do 4 l/min | UIP2000hdT |
10 do 100L | 2 do 10 l/min | UIP4000hdT |
n.a. | 10 do 100 l/min | UIP16000 |
n.a. | Večji | Grozd UIP16000 |
Kontaktirajte nas! / Vprašajte nas!
Literatura / Reference
- Chen J.-X; Cipriani P.G.; Mecenas D.; Polanowska J.; Piano F.; Gunsalus K.C.; Selbach M. (2016): In Vivo Interaction Proteomics in Caenorhabditis elegans Embryos Provides New Insights into P Granule Dynamics. Molecular & Cellular Proteomics 15.5; 2016. 1642-1657.
- Jonathan Alcántar-Fernández, Rosa E. Navarro, Ana María Salazar-Martínez, Martha Elva Pérez-Andrade, Juan Miranda-Ríos (2018): Caenorhabditis elegans respond to high-glucose diets through a network of stress-responsive transcription factors. PLoS One 13(7); 2018.
- Segref, A.; Cabello, J.; Clucas, C.; Schnabel, R.; Johnstone I.L. (2010): Fate Specification and Tissue-specific Cell Cycle Control of the Caenorhabditis elegans Intestine. Molecular Biology of the Cell Vol. 21, 2010. 725–738.
- Henderson S.T., Bonafe M., Johnson T.E. (2006): daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2006; 61:444–60.
Dejstva, ki jih je vredno vedeti
Caenorhabditis elegans
C. elegans je prosto živeča prozorna ogorčica (okrogla črv) dolžine približno 1 mm, ki se hrani z bakterijami (npr. E. coli) in ima razmeroma kratek življenjski cikel. Pri 20 °C ima laboratorijski sev C. elegans (N2) povprečno življenjsko dobo približno 2–3 tedne in generacijski čas 3 do 4 dni. Ko se C. elegans gojijo v velikem številu, kar je mogoče enostavno storiti v natančno nadzorovanih laboratorijskih pogojih, jih je mogoče zlahka pregledati za princip delovanja novih zdravil ter njihove učinke in interakcijo v kompleksnih molekularnih procesih pri človeških boleznih. Zaradi kratkega genoma, kratkega življenjskega cikla in enostavnega ravnanja v laboratorijskih okoljih je C. elegans idealen modelni organizem za raziskave, kot so genomika, proteomika, razvojna biologija, raziskave bolezni, razvoj zdravil itd.
Črvi Caenorhabditis elegans so lahko moški ali hermafrodit. Hermafroditi imajo moške in ženske reproduktivne organe. Vendar pa ženski črvi ne obstajajo. Hermafroditi se lahko samooplodijo ali pa se lahko razmnožujejo tudi z moškimi črvi. C. elegans lahko vsak dan proizvede več kot 1.000 jajc.
Ker je C. elegans eden najpreprostejših organizmov z živčnim sistemom, se črv ogorčice uporablja od leta 1963 kot modelni organizem za raziskave. Nevroni ne sprožijo akcijskih potencialov in ne izražajo nobenih napetostno nadzorovanih natrijevih kanalov. V hermafroditu ta sistem obsega 302 nevronov, katerih vzorec je bil celovito kartiran, v tako imenovanem konektomu.
Številni geni v genomu C. elegans imajo funkcionalne kolege pri ljudeh, zaradi česar je izjemno uporaben model za človeške bolezni in se na primer uporablja za preučevanje razvojne biologije, staranja in dejavnikov, ki vplivajo na dolgoživost. Poleg tega mutanti C. elegans zagotavljajo modele za številne človeške bolezni, vključno z nevrološkimi motnjami (npr. Alzheimerjeva bolezen), prirojenimi boleznimi srca in boleznimi ledvic.
Zaradi teh dejavnikov je C. elegans zelo dragocen model za številna raziskovalna področja. Posledično je bil C. elegans prvi večcelični organizem, ki je sekvenciral celoten genom. Genom vsebuje približno 20.470 genov, ki kodirajo beljakovine. Približno 35% genov C. elegans ima človeške homologe. Zanimivo je, da so človeški geni večkrat pokazali, da nadomeščajo svoje homologe C. elegans, ko so bili vneseni v C. elegans. Nasprotno pa lahko številni geni C. elegans delujejo podobno kot geni sesalcev.
Življenjska doba C. elegans je približno 3 tedne in je sestavljena iz šestih življenjskih stopenj: embriogeneza (jajčna faza), štiri ličinke (L1 do L4) in odrasla faza. Ogorčice se izležejo iz jajc kot ličinke L1, sestavljene iz 560 celic. Rast v vsaki fazi ličinke se pojavi z delitvijo celic in hipertrofijo celic. Kutikularno molting prekinja vsako stopnjo ličinke. Če težke okoljske razmere signalizirajo razvijajočemu se črvu, da pogoji verjetno ne bodo podpirali plodnosti odraslih, lahko C. elegans spremeni njegov razvoj in oblikuje nadomestno ličinko L3, kjer ličinke gredo v fazo dauerja. V tem stanju so živali izjemno odporne na stres in dolgožive ter lahko preživijo tri do devet mesecev. Ličinke Dauerja se izolirajo od stiske tako, da zaprejo ustno in analno votlino, skrčijo črevesje in vklopijo genetski program, ki je odvisen od daf-16 / FOXO, ki med drugim vodi do izražanja dauer-specifične povrhnjice. (prim. Henderson et al., 2006)
C. elegans Dauer ličinke
Dauer ličinke je izraz za ličinke ogorčic, ki so vstopile v alternativno razvojno fazo. Izraz "ličinke Dauer" se še posebej uporablja za črve iz družine rabditidov, vključno s Caenorhabditis elegans. Beseda "Dauer" je nemškega izvora in pomeni "trajanje” v pomenu “časovno obdobje". Ličinke Dauerja gredo v vrsto zastoja in lahko preživijo težke razmere. Če in ko ličinka vstopi v fazo dauerja, je odvisno od okoljskih pogojev. Dauerjeve ličinke so obsežno preučene v biologiji, ker larave kažejo izjemno sposobnost preživetja v težkih okoljih in življenja dlje časa. Na primer, ličinke C. elegans dauer lahko preživijo do štiri mesece, veliko dlje od njihove povprečne življenjske dobe približno tri tedne med normalnim reproduktivnim razvojem.
Pregled življenjskega cikla C. elegans
Razvoj C. elegans v ugodnih okoljih:
Caenorhabditis elegans (C. elegans) kažejo različno razvojno napredovanje v ugodnih in neugodnih okoljskih pogojih.
Odziv C. elegans na ugodne pogoje:
V ugodnih pogojih mikroskopski okrogli črvi Caenorhabditis elegans (C. elegans) sledijo dobro opredeljeni razvojni poti. Ogorčica običajno prehaja skozi svoj življenjski cikel precej hitro, ko so okoljske razmere optimalne, običajno pri temperaturah med 15 ° C in 20 ° C.
- Reproduktivni razvoj: C. elegans začne svoj življenjski cikel kot zarodek. Nato napreduje skozi štiri različne ličinke stopnje, skrajšano kot L1 do L4.
- Odrasla faza: Po zaključku štirih ličink C. elegans doseže odraslo fazo v samo 3 do 5 dneh. V tej fazi se lahko razmnožujejo in živijo še 2 do 3 tedne, odvisno od okoljskih dejavnikov.
Odziv C. elegans na neugodne razmere:
Vendar pa je C. elegans odporen organizem in se lahko prilagodi neugodnim razmeram s procesom, imenovanim tvorba dauer.
- Formacija Dauer: Ko okoljske razmere postanejo neugodne, kot so prenatrpanost, omejena oskrba s hrano ali visoke temperature, lahko C. elegans vstopi v izjemno tretjo ličinko, imenovano “dauer,” skrajšano kot L3d.
- Preživetje dauerja: Ličinke Dauerja so posebej prilagojene za preživetje v težkih pogojih. V tej fazi lahko živijo več mesecev, varčujejo z energijo in prenašajo zahtevna okolja.
Okrevanje v ugodnih okoljih:
Izjemen vidik C. elegans je njegova sposobnost, da se vrne v normalen življenjski cikel, ko se razmere izboljšajo.
- Vrnitev na ugodne pogoje: Ko ličinke C. elegans dauer spet naletijo na ugodne pogoje, kot so dovolj hrane, nižja gostota prebivalstva in primerne temperature, zaznajo spremembo v okolju.
- Predelava in razmnoževanje: Kot odziv na te izboljšane pogoje se ličinke dauerja podvržejo postopku, imenovanemu “Obnovitev.” Med okrevanjem preidejo nazaj v ličinke in na koncu postanejo reproduktivni odrasli z normalno življenjsko dobo.
Ta sposobnost preklapljanja med razvojnimi stopnjami kot odziv na okoljske razmere je poseben vidik biologije C. elegans. Omogoča jim preživetje in učinkovito razmnoževanje v številnih pogojih, zaradi česar so dragocen modelni organizem za znanstvene raziskave, zlasti pri preučevanju razvoja, genetike in staranja.