Ultrazvočna priprava vzorcev C. Elegans

C. elegans, glista, je v biologiji široko uporabljan modelni organizem. Priprava vzorcev pred analizo zahteva lizo, ekstrakcijo beljakovin in lipidov ter fragmentacijo RNA, kar je mogoče zanesljivo izvesti s sonikacijo. Ultrazvočne naprave za razgradnjo celic so zanesljive, dovršene in preproste za uporabo ter omogočajo hitro pripravo vzorcev C. elegans.

Ultrazvočna priprava vzorcev C. elegans

Caenorhabditis elegans so gliste, ki se pogosto uporabljajo v raziskovalnih laboratorijih za preučevanje genomike, razvojne biologije in bolezni. Številni geni v genomu C. elegans imajo funkcionalne ustreznike pri človeku. Zato je ta glista izjemno uporaben model za človeške bolezni. Druge prednosti, zaradi katerih je uporaba C. elegans tako razširjena, so preprosto in poceni gojenje na ploščah z bakterijami (npr. E. coli), prosojnost, priročno ravnanje ter možnost zamrzovanja in daljšega shranjevanja glist.
Analize beljakovin in lipidov so običajni laboratorijski postopki, ultrazvočna priprava vzorcev pa je uveljavljena metoda za lizo glist C. elegans v vseh razvojnih stadijih (tj. zarodkov, ličink L1-L4 in odraslih osebkov). Ker se C. elegans uporablja tudi kot sistem za izražanje beljakovin za čezmerno izražanje ciljnih beljakovin, je potrebna zanesljiva in ponovljiva metoda lize in ekstrakcije beljakovin, ki zagotavlja visoke izplene beljakovin. Ultrazvočni sistemi za razgradnjo celic in ekstrakcijo so na voljo kot homogenizatorji s sondo in kot ultrazvočne naprave za več vzorcev. Hielscher Ultrasonics ponuja idealno ultrazvočno napravo za razgradnjo celic za vaš laboratorijski postopek, ki omogoča priročno pripravo vzorcev različnih velikosti in v različnih številih.

Ultrazvočni protokoli za razgradnjo in lizo C. Elegans

Ultrazvočno homogenizacijo in lizo C. elegans ter nadaljnjo ekstrakcijo beljakovin in lipidov je mogoče izvesti z različnimi postopki z uporabo različnih pufrov za homogenizacijo in lizo itd. Vsem protokolom lize je skupno, da morajo biti vzorci ves čas na ledu, da se prepreči razgradnja beljakovin. V nadaljevanju predstavljamo nekaj zanesljivih in hitrih protokolov ultrazvočne lize in ekstrakcije za pripravo visokokakovostnih vzorcev C. elegans, ki vsebujejo beljakovine ali lipide.

Prednosti ultrazvočne lize C. elegans

• zanesljiva
• ponovljiva
• z natančnim uravnavanjem temperature
• zanesljiv nadzor procesa
• blaga metoda
• preprosta uporaba
• varna

Ultrazvočna ekstrakcija beljakovin iz vzorcev C. elegans

Ultrazvočno lizo in ekstrakcijo beljakovin iz glist C. elegans je mogoče izvesti z različnimi protokoli. V nadaljevanju predstavljamo nekaj zanesljivih in hitrih protokolov lize za ponovljive rezultate ekstrakcije beljakovin.

Hitra priprava citosolnega ekstrakta iz glist C. elegans s sonikacijo

Z naslednjim protokolom lahko pripravite lizate C. elegans v manj kot 30 minutah.
Zbiranje C. elegans
Izbrane gliste C. elegans prenesite v 1.5ml epruveto s fiziološko raztopino, pufrano s fosfatom (PBS), ali jih sperite s plošče z 1,5ml PBS. Centrifugirajte 1min pri 2000rpm, da nastane usedlina. Vzorci naj bodo ves čas na ledu.
Nato gliste dvakrat sperite s PBS.
Zatem gliste dvakrat sperite z ddH₂O.
Gliste resuspendirajte v najmanj 500ul homogenizacijskega pufra (HB). Vzorci glist so zdaj pripravljeni za ultrazvočno lizo.
Za višjo kakovost beljakovinskega ekstrakta boste morda želeli zmanjšati bakterijsko kontaminacijo tako, da gliste spirate po 5min v PBS in v sterilni ultračisti vodi (ddH₂O), ali izvedete flotacijo v saharozi. Vzorci glist naj bodo ves čas na ledu.

Protokol ultrazvočne lize C. elegans

• Ultrazvočno napravo pripravite vnaprej, da bo ultrazvočni homogenizator pripravljen za uporabo (nameščena sonda, vnaprej nastavljen program sonikacije). 

Če je vaša ultrazvočna naprava nameščena na stojalu, postavite ledeno kopel z epruvetami z vzorci pod ultrazvočno sondo in vstavite ultrazvočno sondo v 1.5ml epruveto.

• Za lizo C. elegans z UP200St ali UP200Ht je treba ultrazvočno obdelavo izvajati z mikrokonico (npr. 2mm sondo S26d2; glejte sliko na levi) pri 40% amplitudi 1sec s 30sec premori med posameznimi obdelavami. Za lizo C. elegans je idealnih 5 ciklov sonikacije, vsak po 1 sekundo, s 30sec premori. Če lizo izvajate prvič, lahko po vsakem pulzu z mikroskopom preverite napredovanje lize v majhnih alikvotih vzorca.
• Liza je uspešno zaključena, ko so gliste razgrajene. Čezmerna sonikacija povzroči razpad jeder, kar postane vidno, ko vzorec postane viskozen ali se peni. Za preprečevanje razgradnje vzorca po potrebi uporabite več pulzov. Za pridobivanje visokokakovostnih beljakovinskih ekstraktov ne podaljšujte trajanja posameznega cikla ultrazvočnega pulza.
• Celični lizat zbistrite s centrifugiranjem ultrazvočno liziranih glist pri 14.000rpm 10min pri 4ºC.
• Nato prenesite supernatant v novo epruveto in ga pripravite za imunoprecipitacijo ali druge teste.

Opomba glede homogenizacijskega pufra: Homogenizacijski pufer za zgornji protokol ultrazvočne lize pripravite tako:

Liza C. elegans z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev v ploščah s 96 vdolbinicami z ultrazvočno napravo za plošče UIP400MTP

Liza C. elegans (odrasle gliste)
UIP400MTP 80% amplituda, 20 ciklov (vsak cikel sonikacije: 30 sec VKLOP, 30 sec IZKLOP)
Pufer za lizo:

• Možnost 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Možnost 2) za koimunoprecipitacijo (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (koktajl inhibitorjev proteinaz Complete)

Fragmentacija DNA z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev
DNA C. elegans (odrasle gliste) 200–300bp: ultrazvočna naprava za plošče UIP400MTP – nastavite 80% amplitudo, 30pulzov – vsak 30sec vklop, 30sec izklop

Ultrazvočna naprava za plošče UIP400MTP za pripravo vzorcev z visoko zmogljivostjo obdelave enakomerno sonificira vzorce v ploščah z več vdolbinicami, mikrotitrskih ploščah in ploščah s 96 vdolbinicami

Ultrazvočna liza C. elegans za teste kvantitativnega afinitetnega čiščenja

Zarodke C. elegans (∼2 milijona na ponovitev) so sveže zbrali v treh bioloških ponovitvah z obdelavo mladih hermafroditov, ki nosijo jajčeca, z belilom ter jih sonificirali na ledu (cikel: 0,5 s, amplituda: 40–45%, 5 pulzov/serijo, 5 serij, interval med serijami: 30 s; ultrazvočni procesor UP200S z mikrokonico S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) v pufru za lizo (skupna prostornina: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerola, mešanica inhibitorjev proteaz, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Po sonikaciji so dodali Nonidet P-40 Substitute do 1% in lizate inkubirali z obračanjem čez glavo pri 4°C 30 min, nato pa jih centrifugirali pri 20.000 × g 20 min pri 4°C. Zbistreni lizat so nato odsesali, ne da bi zmotili zgornjo lipidno plast, in ga razdelili na polovici, ki so ju dodali agaroznim kroglicam anti-GFP oziroma blokiranim kontrolnim kroglicam (40–50 μl). Po obračanju čez glavo pri 4°C 60–90 min so kroglice enkrat sprali s pufrom za lizo, ki je vseboval 0,1% Nonidet P-40 Substitute, nato pa dvakrat s pufrom I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ali pufrom II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ali z obema. Za afinitetno zajemanje GFP:MBK-2 so izvedli dva ločena poskusa z različnimi pogoji spiranja. Beljakovine so eluirali z orbitalnim stresanjem v 50 μl 6 m sečnine/2 M tiosečnine pri sobni temperaturi. Pri poskusih afinitetnega zajemanja MBK-1::GFP so beljakovine dvakrat eluirali s stresanjem v 50μl 8 m gvanidinijevega klorida pri 90°C, čemur je sledilo obarjanje z etanolom. Eluirane beljakovinske vzorce so nato razgradili v raztopini.
(prim. Chen et al., 2016)

Ultrazvočna homogenizacija in liza glist

Za postopek lize C.elegans in ekstrakcije beljakovin so za vsak vzorec zbrali 30.000 glist ustreznega stadija in jih sprali z ledeno hladnim medijem S-basal, skoncentrirali s centrifugiranjem pri 1500 rpm 2 min., šestkrat sprali z ledeno hladnim medijem S-basal, da bi odstranili preostale bakterije, in jih nato hranili na ledu do uporabe. Za ekstrakcijo beljakovin so po zadnjem spiranju z medijem S-basal odraslim glistam, ki nosijo jajčeca, pustili, da tvorijo kompaktno usedlino. Usedline glist so nato resuspendirali v 1 ml ledeno hladnega ekstrakcijskega pufra [20 mM kalijevega fosfata, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibitorji proteaz (Sigma P2714)] in jih takoj obdelali.
∼30.000 odraslih glist, ki nosijo jajčeca (kar ustreza ∼100 mg mokre mase), so sonificirali na ledu z ultrazvočno napravo s sondo (npr. UP50H z mikrokonico MS2) pri 40% amplitudi v 10 ciklih s 3 sec vklopa in 30 sec izklopa v 1 ml ledeno hladnega ekstrakcijskega pufra. (prim. Baskharan et al. 2012)

Ultrazvočna ekstrakcija lipidov iz C. elegans

V lipidomiki, veji metabolomike, se karakterizira in analizira celoten nabor lipidov bioloških sistemov. C. elegans se v lipidomiki pogosto uporablja za preučevanje medsebojnega delovanja presnovnih lipidov ter njihovih vplivov na zdravje in življenjsko dobo.
Ultrazvočna liza in ekstrakcija se uporabljata za sproščanje lipidov, kot so sfingolipidi, iz zarodkov, ličink in odraslih glist C. elegans. Ultrazvočna obdelava se uporablja za pripravo homogenatov glist in nato za ekstrakcijo lipidov iz vzorca.
Protokol ultrazvočne ekstrakcije lipidov iz C. elegans
Usedlino C. elegans odtajajte na ledu in jo resuspendirajte z 0,5 ml ultrawater. Sonificirajte vzorce C. elegans v 1,5mL epruvetah, pri čemer naj bodo vzorci ves čas na ledu.
Sonikacijo lahko izvedete z ultrazvočno napravo s sondo, kot je UP200Ht, z ultrazvočno enoto za pripravo vzorcev VialTweeter (sočasna sonikacija 10 vzorcev) ali z UIP400MTP (za sonikacijo plošč z več vdolbinicami, kot so plošče s 96 vdolbinicami). Za ultrazvočno lizo z UP200Ht uporabite mikrokonico S26d2. V digitalnem meniju vnaprej nastavite način ultrazvočnih ciklov. Nastavite amplitudo na 10% in način sonikacijskih ciklov na 20 ciklov s pulzi po 2 sec ter s premorom 30 sec. med posameznimi zaporedji ultrazvočnih pulzov.
Supernatante prenesite v steklene epruvete z navojnim pokrovčkom. Izvedite ekstrakcijo po Folchu tako, da v vsako stekleno epruveto dodate 1 ml ultrawater, nato pa v vsako stekleno epruveto dodate 6 ml mešanice kloroforma/metanola (razmerje = 2:1).
Vsako stekleno epruveto 4-krat vrtinčno mešajte po 30 sec. Epruvete centrifugirajte pri 1.258 x g 15 min (Eppendorf, 5810 R), da dodatno izboljšate ločevanje faz. Spodnjo hidrofobno frakcijo prenesite v čisto stekleno epruveto s stekleno Pasteurjevo pipeto. Spodnjo hidrofobno frakcijo posušite v toku dušika v dušikovem uparjalniku. Posušeno usedlino do uporabe hranite v zamrzovalniku pri -80 °C. 


Ultrazvočna priprava lizatov glist

Lizat glist: Gliste v stadiju L4 so zbrali in trikrat sprali s pufrom M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl in 0,87 mM MgSO₄), da bi odstranili vse bakterije. Po odstranitvi čim večje količine pufra M9 so gliste resuspendirali v pufru za lizo: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-glicerofosfata, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM natrijevega fluorida, 1 mM natrijevega ortovanadata, 5 mM natrijevega pirofosfata, 0,2 mM fenilmetansulfonilfluorida in inhibitor proteaz. Gliste so trikrat zamrznili v tekočem dušiku in odtajali pri 37°C, nato pa jih sonificirali na suhem ledu z ultrazvočno enoto VialTweeter za sočasno pripravo 10 epruvet z vzorci. Sonikacijo so izvedli pri 50% amplitudi v 10 ciklih po 2 sec. s 30 sec premora med zaporedji sonikacijskih pulzov. Nato so vzorce centrifugirali pri 12.000 rpm pri 4°C 15 min. Supernatant so zbrali in shranili pri -70°C. Alikvot so uporabili za kvantifikacijo beljakovin z Bradfordovim testom.
Določanje skupnega glutationa, GSH in GSSG: Za kvantifikacijo glutationa so lizate pripravili in določanje izvedli istega dne. Z glukozo hranjene in kontrolne ličinke L4 so zbrali in trikrat sprali s pufrom M9. Po odstranitvi čim večje količine pufra M9 so gliste resuspendirali v ledeno hladni metafosforni kislini (5% w/v), nato pa jih sonificirali v ledu z ultrazvočno napravo VialTweeter pri 50% amplitudi v desetih ciklih sonikacije po 2 sec. s 30 sec. premora med posameznimi cikli. Nato so jih centrifugirali pri 12.000 rpm pri 4 ̊C 15 min.
(prim. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Priprava vzorcev C. elegans pred imunoprecipitacijo in prenosom po metodi western

Na kratko: za zarodne ekstrakte so ličinke C. elegans L1 gojili do odraslosti v obsežnih tekočih kulturah v mediju S. Zarodke so zbrali s standardno metodo z belilom in jih suspendirali v pufru za lizo (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerola, 0,05% NP-40, 1􏰅 koktajl inhibitorjev proteaz in 1􏰅 koktajl inhibitorjev fosfataz I in II), jih hitro zamrznili v tekočem dušiku in lizirali z ultrazvočno razgradnjo celic z uporabo ultrazvočne naprave z mikrokonico, kot je UP200Ht s S26d2, z 10 pulzi v 10 s pri 30% amplitudi. Če je treba pripraviti večje število vzorcev, priporočamo ultrazvočno napravo VialTweeter ali ultrazvočno napravo za več vzorcev UIP400MTP za plošče z vdolbinicami. Po sonikaciji so ekstrakte predhodno zbistrili s centrifugiranjem pri 30.000g 20 min pri 4°C. Predhodno zbistreni ekstrakt (300µg skupnih beljakovin) so inkubirali s 40µ􏰂g afinitetno očiščenega protitelesa anti-CDC-25.1 (ta raziskava), navzkrižno vezanega na protein A-agarozo, ali pa so kot kontrolo uporabili podobno količino kunčjega imunoglobulina (Ig)G, navzkrižno vezanega na protein A-agarozo, v skupni prostornini 200µl pufra za lizo z 1% NP-40, katerega dodatek je zmanjšal nespecifično vezavo beljakovin na matriks. Vzorce so vrteli 1 h pri 4°C, kroglice trikrat sprali s pufrom za lizo in eluirali s 30µl glicina/HCl in 200 mM NaCl, pH 2,2. Po imunoprecipitaciji so eluate razredčili v 30µ􏰂l vzorčnega pufra SDS, segrevali pri 95°C 4 min in običajno nanesli 3% celotne količine za vhodni vzorec ter 30% za eluate na SDS-PAGE, čemur je sledil prenos po metodi western s protitelesi anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubikvitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) ali anti-􏰁β-aktin (1:2000). Kadar ekstraktov niso podvrgli imunoprecipitaciji, so enako količino skupnih beljakovin iz teh ekstraktov resuspendirali v vzorčnem pufru SDS, segreli na 95°C in nato neposredno nanesli na SDS-PAGE ter analizirali s prenosom po metodi western. (prim. Segref et al. 2020)

Ultrazvočna liza z natančnim uravnavanjem temperature

Natančno in zanesljivo uravnavanje temperature je ključnega pomena pri ravnanju z biološkimi vzorci. Visoke temperature sprožijo toplotno povzročeno razgradnjo beljakovin v vzorcih.
Tako kot vse mehanske tehnike priprave vzorcev tudi sonikacija ustvarja toploto. Vendar je pri uporabi VialTweeter mogoče temperaturo vzorcev dobro uravnavati. Predstavljamo različne možnosti spremljanja in uravnavanja temperature vaših vzorcev med pripravo za analizo z VialTweeter in VialPress.

1. Spremljanje temperature vzorca: Ultrazvočni procesor UP200St, ki poganja VialTweeter, je opremljen z inteligentno programsko opremo in priključljivim temperaturnim tipalom. Temperaturno tipalo priključite na UP200St in njegovo konico vstavite v eno od epruvet z vzorci. V meniju UP200St lahko prek digitalnega barvnega zaslona na dotik nastavite določeno temperaturno območje za sonikacijo vzorcev. Ultrazvočna naprava se samodejno ustavi, ko je dosežena najvišja temperatura, in počaka, dokler se temperatura vzorca ne zniža na spodnjo vrednost nastavljene temperaturne razlike ∆. Nato se sonikacija samodejno znova začne. Ta pametna funkcija preprečuje toplotno povzročeno razgradnjo.
2. Blok VialTweeter je mogoče predhodno ohladiti. Blok VialTweeter (samo sonotrodo brez pretvornika!) postavite v hladilnik ali zamrzovalnik, da predhodno ohladite titanov blok in s tem odložite zvišanje temperature vzorca. Če je mogoče, lahko predhodno ohladite tudi sam vzorec.
3. Med sonikacijo za hlajenje uporabite suhi led. Uporabite plitev pladenj, napolnjen s suhim ledom, in nanj postavite VialTweeter, da se toplota lahko hitro odvaja.

Poiščite optimalno ultrazvočno napravo za razgradnjo celic za svojo uporabo pri lizi

Hielscher Ultrasonics je proizvajalec z dolgoletnimi izkušnjami na področju visokozmogljivih ultrazvočnih naprav za razgradnjo celic in homogenizatorjev za laboratorije, namizne sisteme in sisteme industrijskega obsega. Velikost vaše bakterijske celične kulture, vaš raziskovalni ali proizvodni cilj ter prostornina celic, ki jih je treba obdelati na uro ali dan, so bistveni dejavniki pri izbiri ustrezne ultrazvočne naprave za razgradnjo celic za vašo uporabo.
Hielscher Ultrasonics ponuja različne rešitve za sočasno sonikacijo več vzorcev (do 10 vial) in velikega števila vzorcev (tj. mikrotitrskih plošč / plošč s 96 vdolbinicami), od klasične laboratorijske ultrazvočne naprave s sondo z različnimi močmi od 50 do 400 vatov do povsem industrijskih ultrazvočnih procesorjev z do 16,000vati na enoto za komercialno razgradnjo celic in ekstrakcijo beljakovin v velikoserijski proizvodnji. Vse ultrazvočne naprave Hielscher so izdelane za delovanje 24/7/365 pri polni obremenitvi. Robustnost in zanesljivost sta temeljni lastnosti naših ultrazvočnih naprav.
Vsi digitalni ultrazvočni homogenizatorji so opremljeni s pametno programsko opremo, barvnim zaslonom na dotik in samodejnim beleženjem podatkov, zaradi česar je ultrazvočna naprava priročno delovno orodje v laboratorijih in proizvodnih obratih.
Sporočite nam, katere vrste celic, v kakšni prostornini, kako pogosto in s kakšnim ciljem morate obdelovati svoje biološke vzorce. Priporočili vam bomo najprimernejšo ultrazvočno napravo za razgradnjo celic za zahteve vašega procesa.

Spodnja tabela prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih sistemov, od kompaktnih ročnih homogenizatorjev in ultrazvočnih naprav za več vzorcev do industrijskih ultrazvočnih procesorjev za komercialno uporabo: