Striženje kromatina s sonikacijo
Striženje kromatina je ključni korak v številnih epigenetičnih in molekularnobioloških delovnih postopkih, zlasti pri imunoprecipitaciji kromatina (ChIP), ChIP-seq in sorodnih testih. Cilj je razdrobiti kromatin v ponovljive DNK-beljakovinske komplekse, pri tem pa ohraniti celovitost epitopov in čim bolj zmanjšati izgubo vzorca. Med razpoložljivimi metodami je postala ultrazvočna fragmentacija kromatina široko uporabljan pristop, saj zagotavlja zanesljivo fragmentacijo brez reagentov z odlično ponovljivostjo.
Kaj je treba upoštevati pri striženju kromatina?
Učinkovito striženje kromatina zahteva skrben nadzor eksperimentalnih parametrov. Nepravilno drobljenje lahko ogrozi nadaljnje poskuse ChIP, saj nastanejo preveliki, preveč razgrajeni ali nekonsistentni fragmenti med vzorci.
Eden najpomembnejših dejavnikov je želena porazdelitev velikosti fragmentov. Za večino aplikacij ChIP in ChIP-seq so optimalni fragmenti kromatina med 100 in 600 baznimi pari. Ta razpon velikosti omogoča učinkovito imunoprecipitacijo, hkrati pa zagotavlja zadostno ločljivost za genomsko kartiranje.
Drugi ključni dejavnik je učinkovitost zamreženja pred sonikacijo. Večina delovnih postopkov ChIP vključuje fiksacijo s formaldehidom, da se stabilizirajo interakcije protein-DNA. Vendar lahko pretirano zamreženje poveča odpornost kromatina na fragmentacijo, kar zahteva daljši čas sonikacije in lahko poveča izpostavljenost vročini.
Ključnega pomena je tudi nadzor temperature. Sonikacija ustvarja lokalizirano energijo, ki lahko dvigne temperaturo vzorca. Povišane temperature lahko poškodujejo DNK ali denaturirajo beljakovine, kar vpliva na prepoznavanje protiteles med ChIP. Številni raziskovalci zato izvajajo pulzne cikle sonikacije v kombinaciji z intervali hlajenja, da ohranijo stabilnost vzorca.
Na učinkovitost fragmentacije vplivata tudi koncentracija in prostornina vzorca. Visoko koncentrirane suspenzije kromatina lahko zahtevajo daljši čas sonikacije, medtem ko je pri majhnih količinah vzorcev potrebna natančna dostava energije, da se prepreči pretirana obdelava.
Nazadnje, izbira sonikacijske naprave močno vpliva na ponovljivost poskusov. Naprave, namenjene striženju kromatina, običajno zagotavljajo nadzorovano ultrazvočno energijo in standardizirano ravnanje z vzorci, kar omogoča dosledno fragmentacijo v več vzorcih.
Ultrazvočno striženje DNK med ChIP – Kromatinska imunoprecipitacija
Kateri sonikator naj izberem za striženje kromatina?
Različni laboratorijski delovni postopki zahtevajo različne konfiguracije sonikacije. Optimalni sistem je v veliki meri odvisen od prepustnosti vzorca, prostornine in oblike poskusa.
Sonikator tipa sonda
Sonikator s sondo prenaša ultrazvočno energijo neposredno v vzorec prek titanove sonde. Ta konfiguracija zagotavlja zelo visoko gostoto energije in je zato primerna za robustno prekinitev kromatina v posameznih vzorcih.
Sondni sonikatorji so še posebej uporabni za:
- Število vzorcev od majhnega do srednjega obsega
- Kromatin, ki ga je težko razdrobiti
- Prilagodljivi eksperimentalni protokoli
Sonikator z več cevmi - VialTweeter
Za laboratorije, ki obdelujejo več vzorcev hkrati, je sonikator VialTweeter z več epruvetami zelo ponovljiva rešitev. Sistem prenaša ultrazvočno energijo posredno prek držala viale, kar omogoča drobljenje več zaprtih epruvet pod enakimi pogoji.
Ta konfiguracija ima pomembne prednosti:
- Vzporedno striženje kromatina več vzorcev
- Odprava kontaminacije sonde
- Visoka ponovljivost med epruvetami
- Poenostavljen potek dela za pripravo vzorcev ChIP
Takšni sistemi z več epruvetami so primerni za rutinske poskuse ChIP in srednje zmogljive študije.
Sonikator za mikroplošče - UIP400MTP
Visoko zmogljive epigenetične študije se vse bolj zanašajo na obdelavo vzorcev na mikroploščah. Sonikator za mikroplošče UIP400MTP je zasnovan za fragmentacijo kromatina neposredno v standardnih mikroploščah brez prenosa vzorcev.
Ta pristop omogoča:
- Hkratna obdelava več deset ali več sto vzorcev
- Avtomatizaciji prijazni delovni tokovi
- Enakomerna porazdelitev ultrazvočne energije po vrtinah
- Znatno zmanjšanje števila korakov pri ravnanju z vzorci
Za obsežne presejalne projekte ChIP-seq ali visoko zmogljive epigenetske študije sonikacija mikrotitrskih plošč zagotavlja izjemno razširljivost in učinkovitost. Sonikator z več vdolbinicami UIP400MTP je primeren za vključevanje v sisteme za ravnanje s tekočinami in avtomatizirane laboratorijske delovne postopke.
Zakaj izbrati sonikacijo namesto drugih tehnik striženja kromatina?
V primerjavi z encimskimi pristopi sonikacija za ChIP zagotavlja nepristransko fragmentacijo, saj postopek ni odvisen od zaporedja specifične encimske aktivnosti. To je še posebej pomembno za epigenetske študije celotnega genoma, kjer je bistvena enakomerna pokritost.
Druga pomembna prednost je razširljivost. Ultrazvočni sistemi lahko sprejmejo posamezne vzorce, več epruvet ali celotne mikroplošče, kar laboratorijem omogoča, da izberejo najprimernejšo konfiguracijo za svojo eksperimentalno zmogljivost.
Sonikacija omogoča odličen nadzor nad parametri fragmentacije. S prilagajanjem impulznih ciklov, trajanja in moči lahko raziskovalci zanesljivo dosežejo želeno porazdelitev velikosti fragmentov.
Fragmentacija kromatina z optimizirano sonikacijo vzorcev ChIP.
(a) brez striženja (dolgi fragmenti v gelu);
(b) optimalni profil fragmentacije (obogatitev fragmentov z 200-600 bp);
(c) prekomerna fragmentacija DNK (prevelika zastopanost fragmentov, krajših od 200 bp)
© Jarillo et al., 2018
Primerjava tehnik striženja kromatina
| Metoda striženja kromatina | Načelo | Prednosti | Omejitve |
| ultrazvočno razbijanje | Visokofrekvenčna akustična energija mehansko drobi kromatin. | Fragmentacija brez reagentov, zelo ponovljivi rezultati, nastavljiva porazdelitev velikosti fragmentov, združljiva z zamreženim kromatinom, skalabilna od posameznih epruvet do več vzorcev in mikroplošč. | Potrebna je oprema za sonikacijo in optimizacija parametrov sonikacije. |
| Encimska razgradnja (MNaza) | Mikrokolčna nukleaza razgrajuje DNK med nukleosomi. | Nežna fragmentacija in uporabna za analizo nativnega kromatina. | Odklon encimov, preferenca zaporedja, težko nadzorovana prebava, možna variabilnost med poskusi. |
| Mehansko striženje (igla / brizga) | Kromatin se poruši s ponavljajočo se fizično silo. | Enostavna metoda, ki zahteva minimalno opremo. | Slaba ponovljivost, omejen nadzor nad velikostjo fragmentov, zamudno za več vzorcev. |
| Nebulizacija | Stisnjen zrak potisne DNK skozi majhne odprtine, kar povzroči drobljenje. | hiter proces drobljenja. | Možnost izgube vzorca, omejena razširljivost, potrebna je specializirana oprema. |
Kako količinsko opredeliti in kvalificirati izkoristek kromatina po ultrazvočni fragmentaciji?
Po sonikaciji za ChIP morajo raziskovalci oceniti količino in kakovost fragmentiranega kromatina. Ta korak preverjanja zagotavlja, da fragmentacija kromatina ustreza zahtevam aplikacij, kot sta ChIP-qPCR ali ChIP-seq.
Kvantifikacija se običajno začne z merjenjem koncentracije DNK. Spektrofotometrične metode, kot je analiza Nanodrop, ali fluorometrični testi, kot je kvantifikacija DNA Qubit, zagotavljajo zanesljive ocene izkoristka kromatina po dekromatizaciji in čiščenju.
Vendar samo koncentracija DNA ne pokaže, ali je bila fragmentacija uspešna. Raziskovalci zato ocenijo porazdelitev velikosti fragmentov z uporabo elektroforetičnih tehnik. Agarozna gelska elektroforeza je še vedno pogosto uporabljen pristop za vizualizacijo fragmentov DNK in preverjanje, ali večina spada v ciljno območje velikosti.
Naprednejši laboratoriji pogosto uporabljajo sisteme za kapilarno elektroforezo, kot sta Agilent Bioanalyzer ali TapeStation. Te platforme zagotavljajo natančne profile porazdelitve velikosti in raziskovalcem omogočajo, da zaznajo preveliko razdrobljenost ali nepopolno striženje.
Pri ocenjevanju kakovosti kromatina po ultrazvočni fragmentaciji raziskovalci običajno potrdijo:
- Večina fragmentov DNK je v razponu 100-600 bp.
- Porazdelitev fragmentov je dosledna med ponovljenimi vzorci
- Razgradnja DNK je minimalna
- Skupni izkoristek kromatina je zadosten za načrtovani test ChIP
Ustrezen nadzor kakovosti zagotavlja, da ultrazvočno striženje kromatina daje ponovljive in biološko pomembne rezultate.
Zaključek: Ultrazvočno striženje kromatina za zanesljive raziskave
Zanesljivo striženje kromatina je temeljnega pomena za uspešne raziskave ChIP in epigenetike. Ultrazvočna fragmentacija ponuja zmogljivo rešitev, saj omogoča natančno, ponovljivo in brez reagentov razdrobitev kromatina v širokem razponu eksperimentalnih formatov.
S skrbno optimizacijo parametrov sonikacije, preverjanjem porazdelitve velikosti fragmentov in izbiro ustreznega sistema za sonikacijo – ali gre za sonikator tipa sonda, večcevni sonikator VialTweeter ali zmogljiv sonikator za mikroplošče UIP400MTP – raziskovalci lahko dosežejo dosledno fragmentacijo kromatina, ki podpira visokokakovostne rezultate ChIP in ChIP-seq.
Ker se raziskave epigenetike še naprej širijo v smeri večje zmogljivosti in večje ponovljivosti poskusov, je ultrazvočno striženje kromatina še vedno ena najbolj vsestranskih in zanesljivih metod, ki so na voljo v sodobnih laboratorijih molekularne biologije.
Projektiranje, izdelava in svetovanje – Kakovost izdelana v Nemčiji
Hielscher ultrazvočni aparati so znani po svojih najvišjih standardih kakovosti in oblikovanja. Robustnost in enostavno upravljanje omogočata nemoteno integracijo naših ultrazvočnih aparatov v industrijske objekte. Težke pogoje in zahtevna okolja zlahka obvladajo Hielscher ultrasonicatorji.
Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visoko zmogljivim ultrazvočnim aparatom z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Seveda so Hielscher ultrazvočni aparati skladni s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.
Tube rack sonified in the UIP400MTP for chromatin shearing
Literatura / Reference
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
Pogosto zastavljena vprašanja
Kaj je kromatin?
Kromatin je strukturni kompleks DNK in povezanih beljakovin, ki organizira genetski material v jedru evkariontskih celic. Glavne beljakovine v kromatinu so histoni, okoli katerih je DNK ovita v nukleosome. Ta organizacija zgošča DNK, hkrati pa uravnava dostop do genetskih informacij za procese, kot so transkripcija, replikacija in popravljanje DNK.
Katere so vrste kromatina?
Kromatin na splošno delimo na dve glavni obliki: evkromatin in heterokromatin. Evkromatin je ohlapno zapakiran in transkripcijsko dejaven, kar omogoča, da so geni zlahka dostopni transkripcijskemu stroju. Heterohromatin je bolj gosto zapakiran in transkripcijsko neaktiven, običajno vsebuje ponavljajoča se zaporedja DNK ali gene, ki so utišani. Heterohromatin lahko nadalje razdelimo na konstitutivni heterokromatin, ki ostaja stalno kondenziran, in fakultativni heterokromatin, ki lahko prehaja med aktivnim in neaktivnim stanjem glede na celične razmere.
Kaj je navzkrižno povezovanje?
Omrežno povezovanje je biokemični proces, ki se uporablja za stabilizacijo interakcij med biomolekulami z oblikovanjem kovalentnih vezi med njimi. V raziskavah kromatina se navzkrižno povezovanje običajno uporablja za ohranjanje interakcij med beljakovinami in DNK v kromatinu pred analizo. Kemična sredstva, kot je formaldehid, se običajno uporabljajo za ustvarjanje reverzibilnih kovalentnih povezav med DNK in povezanimi proteini, kar učinkovito “zamrzovanje” molekularne interakcije v določenem časovnem trenutku. Ta stabilizacija omogoča drobljenje in obdelavo kromatinskih kompleksov, ne da bi se pri tem izgubile izvirne povezave med DNK in regulatornimi proteini, kar je bistveno za tehnike, kot je kromatinska imunoprecipitacija (ChIP).
Kaj je ChIP?
Imunoprecipitacija kromatina (ChIP) je metoda molekularne biologije, ki se uporablja za raziskovanje interakcij med proteini in DNK v kromatinu. Pri tej metodi se najprej stabilizirajo kompleksi DNK-protein, običajno z zamreženjem, nato pa se kromatin fragmentira. Za imunoprecipitacijo kompleksov protein-DNA se uporabijo protitelesa, specifična za ciljni protein, kar omogoča izolacijo in analizo povezanih zaporedij DNA.
Za kaj se uporablja ChIP?
ChIP se uporablja za identifikacijo genomskih regij, na katere se vežejo določene beljakovine, povezane z DNK, kot so transkripcijski faktorji, modifikacije histonov ali regulativne beljakovine, povezane s kromatinom. Tehnika se pogosto uporablja za preučevanje regulacije genov, epigenetskih modifikacij, vezavnih mest transkripcijskih faktorjev in strukture kromatina. V kombinaciji z nadaljnjimi analitičnimi metodami, kot sta kvantitativna PCR (ChIP-qPCR) ali sekvenciranje z visoko zmogljivostjo (ChIP-seq), omogoča kartiranje interakcij protein-DNA na ravni celotnega genoma.
Katere so vrste ChIP?
Obstaja več različic imunoprecipitacije kromatina, ki so odvisne od zasnove poskusa in nadaljnje analize. Najpogostejši pristopi vključujejo ChIP-qPCR, ki količinsko določa obogatitev določenih genomskih regij, ChIP-seq, ki uporablja sekvenciranje naslednje generacije za kartiranje interakcij protein-DNA v genomu, in ChIP-chip, ki združuje ChIP z analizo mikromrež DNK. Glede na raziskovano biološko vprašanje se pogosto uporabljajo tudi dodatne različice, kot sta nativni ChIP (N-ChIP), ki analizira kromatin, ki ni zamrežen, in zamrežen ChIP (X-ChIP), ki uporablja kemično zamreženje za stabilizacijo interakcij protein-DNA.
Visoko zmogljivo striženje kromatina s sonikatorjem za mikroplošče UIP400MTP
Hielscher Ultrasonics proizvaja visoko zmogljive ultrazvočne homogenizatorje iz laboratorij k industrijska velikost.