Striženje kromatina s sonikacijo
Striženje kromatina je ključni korak v številnih delovnih postopkih na področju epigenetike in molekularne biologije, zlasti pri imunoprecipitaciji kromatina (ChIP), ChIP-seq in sorodnih analizah. Cilj je fragmentirati kromatin v ponovljive komplekse DNA in proteinov, pri tem pa ohraniti celovitost epitopov in čim bolj zmanjšati izgubo vzorca. Med razpoložljivimi metodami je ultrazvočna fragmentacija kromatina postala široko uporabljen pristop, saj zagotavlja zanesljivo fragmentacijo brez reagentov z odlično ponovljivostjo.
Kaj je treba upoštevati pri striženju kromatina?
Učinkovito striženje kromatina zahteva skrben nadzor eksperimentalnih parametrov. Neustrezna fragmentacija lahko ogrozi nadaljnje poskuse ChIP, saj nastanejo fragmenti, ki so preveliki, preveč razgrajeni ali se med vzorci razlikujejo.
Eden najpomembnejših dejavnikov je želena porazdelitev velikosti fragmentov. Za večino aplikacij ChIP in ChIP-seq so optimalni fragmenti kromatina velikosti med 100 in 600 baznimi pari. Ta razpon velikosti omogoča učinkovito imunoprecipitacijo, hkrati pa zagotavlja zadostno ločljivost za genomsko kartiranje.
Drug ključni dejavnik je učinkovitost navzkrižnega povezovanja pred sonikacijo. Večina delovnih postopkov ChIP vključuje fiksacijo s formaldehidom za stabilizacijo interakcij med proteini in DNA. Vendar lahko prekomerno navzkrižno povezovanje poveča odpornost kromatina proti fragmentaciji, kar zahteva daljše čase sonikacije in lahko poveča izpostavljenost toploti.
Ključen je tudi nadzor temperature. Sonikacija ustvarja lokalizirano energijo, ki lahko zviša temperaturo vzorca. Povišane temperature lahko poškodujejo DNA ali denaturirajo proteine, kar vpliva na prepoznavanje s protitelesi med ChIP. Številni raziskovalci zato izvajajo cikle pulzne sonikacije v kombinaciji z intervali hlajenja, da ohranijo stabilnost vzorca.
Na učinkovitost fragmentacije vplivata tudi koncentracija in prostornina vzorca. Visoko koncentrirane suspenzije kromatina lahko zahtevajo daljše čase sonikacije, majhne prostornine vzorcev pa zahtevajo natančno dovajanje energije, da se prepreči prekomerna obdelava.
Nazadnje izbira naprave za sonikacijo močno vpliva na ponovljivost poskusov. Naprave, zasnovane za striženje kromatina, običajno zagotavljajo nadzorovano ultrazvočno energijo in standardizirano ravnanje z vzorci, kar omogoča enakomerno fragmentacijo več vzorcev.
Ultrazvočno striženje DNA med ChIP – imunoprecipitacijo kromatina
Kateri sonikator izbrati za striženje kromatina?
Različni laboratorijski delovni postopki zahtevajo različne konfiguracije sonikacije. Optimalni sistem je v veliki meri odvisen od zmogljivosti obdelave vzorcev, prostornine in eksperimentalnega formata.
Sonikator s sondo
Sonikator s sondo dovaja ultrazvočno energijo neposredno v vzorec prek titanove sonde. Ta konfiguracija zagotavlja zelo visoko gostoto energije in je zato primerna za intenzivno razgradnjo kromatina v posameznih vzorcih.
Sonikatorji s sondo so posebej uporabni za:
- Majhno do srednje veliko število vzorcev
- Kromatin, ki ga je težko fragmentirati
- Prilagodljive eksperimentalne protokole
Sonikator za več epruvet – VialTweeter
Za laboratorije, ki hkrati obdelujejo več vzorcev, sonikator za več epruvet VialTweeter zagotavlja rešitev z visoko ponovljivostjo. Sistem prenaša ultrazvočno energijo posredno prek držala za viale, kar omogoča fragmentacijo vsebine več zaprtih epruvet pod enakimi pogoji.
Ta konfiguracija ponuja pomembne prednosti:
- Vzporedno striženje kromatina v več vzorcih
- Odprava kontaminacije s sondo
- Visoka ponovljivost med epruvetami
- Poenostavljen delovni postopek za pripravo vzorcev za ChIP
Takšni sistemi za več epruvet so zelo primerni za rutinske poskuse ChIP in študije s srednjo zmogljivostjo obdelave vzorcev.
Sonikator za mikroplošče – UIP400MTP
Epigenetske študije z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev se vse bolj opirajo na obdelavo vzorcev v mikroploščah. Sonikator za mikroplošče UIP400MTP je zasnovan za fragmentacijo kromatina neposredno v standardnih mikroploščah brez prenašanja vzorcev.
Ta pristop omogoča:
- Hkratno obdelavo več deset ali več sto vzorcev
- Delovne postopke, primerne za avtomatizacijo
- Enakomerno porazdelitev ultrazvočne energije med vdolbinicami
- Znatno zmanjšanje števila korakov pri ravnanju z vzorci
Pri obsežnih presejalnih projektih ChIP-seq ali epigenetskih študijah z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev sonikacija v mikroploščah zagotavlja izjemno prilagodljivost obsegu obdelave in učinkovitost. Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP je zelo primeren za integracijo v sisteme za ravnanje s tekočinami in avtomatizirane laboratorijske delovne postopke.
Zakaj izbrati sonikacijo namesto drugih tehnik striženja kromatina?
V primerjavi z encimskimi pristopi sonikacija za ChIP zagotavlja nepristransko fragmentacijo, saj postopek ni odvisen od encimske aktivnosti, specifične za zaporedje. To je posebej pomembno pri epigenetskih študijah celotnega genoma, kjer je enakomerna pokritost bistvena.
Druga velika prednost je prilagodljivost obsegu obdelave. Ultrazvočni sistemi lahko obdelujejo posamezne vzorce, več epruvet ali celotne mikroplošče, kar laboratorijem omogoča izbiro najprimernejše konfiguracije glede na njihovo zmogljivost izvajanja poskusov.
Nazadnje sonikacija zagotavlja odličen nadzor nad parametri fragmentacije. S prilagajanjem pulznih ciklov, trajanja in ravni moči lahko raziskovalci zanesljivo dosežejo želeno porazdelitev velikosti fragmentov.
Fragmentacija kromatina z optimizirano sonikacijo vzorcev za ChIP.
(a) brez striženja (dolgi fragmenti v gelu);
(b) optimalen profil fragmentacije (obogatitev s fragmenti velikosti 200–600 bp);
(c) prekomerna fragmentacija DNA (prevelik delež fragmentov, krajših od 200 bp)
© Jarillo et al., 2018
Primerjava tehnik striženja kromatina
| Metoda striženja kromatina | Načelo | Prednosti | Omejitve |
| Sonikacija | Visokofrekvenčna akustična energija mehansko fragmentira kromatin. | Fragmentacija brez reagentov, zelo ponovljivi rezultati, nastavljiva porazdelitev velikosti fragmentov, združljivost z navzkrižno povezanim kromatinom, prilagodljivost obsega obdelave od posameznih epruvet do formatov z več vzorci in mikroplošč. | Zahteva opremo za sonikacijo in optimizacijo parametrov sonikacije. |
| Encimska razgradnja (MNase) | Mikrokokna nukleaza razgrajuje DNA med nukleosomi. | Blaga fragmentacija, uporabna za analizo nativnega kromatina. | Encimska pristranskost, prednostna razgradnja določenih zaporedij, težaven nadzor razgradnje, morebitna variabilnost med poskusi. |
| Mehansko striženje (igla / brizga) | Kromatin se razgradi s ponavljajočim se delovanjem fizične sile. | Preprosta metoda, ki zahteva minimalno opremo. | Slaba ponovljivost, omejen nadzor nad velikostjo fragmentov, delovno intenzivna obdelava več vzorcev. |
| Nebulizacija | Stisnjen zrak potiska DNA skozi majhne odprtine, kar povzroči fragmentacijo. | Hiter postopek fragmentacije. | Možna izguba vzorca, omejena prilagodljivost obsegu obdelave, zahteva specializirano opremo. |
Kako količinsko in kakovostno ovrednotiti izplen kromatina po ultrazvočni fragmentaciji?
Po sonikaciji za ChIP morajo raziskovalci ovrednotiti tako količino kot kakovost fragmentiranega kromatina. Ta korak preverjanja zagotavlja, da fragmentacija kromatina izpolnjuje zahteve nadaljnjih aplikacij, kot sta ChIP-qPCR ali ChIP-seq.
Količinsko vrednotenje se običajno začne z merjenjem koncentracije DNA. Spektrofotometrične metode, kot je analiza z Nanodrop, ali fluorometrične analize, kot je kvantifikacija DNA s Qubit, zagotavljajo zanesljive ocene izplena kromatina po odstranitvi navzkrižnih povezav in čiščenju.
Vendar sama koncentracija DNA ne razkrije, ali je bila fragmentacija uspešna. Raziskovalci zato ocenijo porazdelitev velikosti fragmentov z elektroforetskimi tehnikami. Elektroforeza v agaroznem gelu ostaja pogosto uporabljen pristop za prikaz fragmentov DNA in preverjanje, ali jih večina spada v ciljni razpon velikosti.
Naprednejši laboratoriji pogosto uporabljajo sisteme za kapilarno elektroforezo, kot sta Agilent Bioanalyzer ali TapeStation. Te platforme zagotavljajo natančne profile porazdelitve velikosti in raziskovalcem omogočajo odkrivanje prekomerne fragmentacije ali nepopolnega striženja.
Pri vrednotenju kakovosti kromatina po ultrazvočni fragmentaciji raziskovalci običajno potrdijo:
- Večina fragmentov DNA je v razponu 100–600 bp
- Porazdelitev fragmentov je enaka med ponovitvenimi vzorci
- Razgradnja DNA je minimalna
- Skupni izplen kromatina zadostuje za načrtovano analizo ChIP
Ustrezen nadzor kakovosti zagotavlja, da korak ultrazvočnega striženja kromatina daje ponovljive in biološko smiselne rezultate.
Zaključek: ultrazvočno striženje kromatina za zanesljive raziskave
Zanesljivo striženje kromatina je temelj uspešnih raziskav ChIP in epigenetike. Ultrazvočna fragmentacija ponuja zmogljivo rešitev, saj omogoča natančno in ponovljivo razgradnjo kromatina brez reagentov v širokem razponu eksperimentalnih formatov.
S skrbno optimizacijo parametrov sonikacije, preverjanjem porazdelitve velikosti fragmentov in izbiro ustreznega sistema za sonikacijo – bodisi sonikatorja s sondo, sonikatorja za več epruvet VialTweeter ali sonikatorja za mikroplošče UIP400MTP z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev – lahko raziskovalci dosežejo enakomerno fragmentacijo kromatina, ki podpira visokokakovostne rezultate ChIP in ChIP-seq.
Ker se epigenetske raziskave še naprej razvijajo v smeri večje zmogljivosti obdelave vzorcev in večje ponovljivosti poskusov, ostaja ultrazvočno striženje kromatina ena najbolj vsestranskih in zanesljivih metod, ki so na voljo sodobnim laboratorijem za molekularno biologijo.
Načrtovanje, proizvodnja in svetovanje – kakovost iz Nemčije
Ultrazvočne naprave Hielscher so dobro znane po najvišjih standardih kakovosti in zasnove. Robustnost in preprosta uporaba omogočata nemoteno integracijo naših ultrazvočnih naprav v industrijske obrate. Ultrazvočne naprave Hielscher brez težav obvladujejo težke razmere in zahtevna okolja.
Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visokozmogljivim ultrazvočnim napravam z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Seveda so ultrazvočne naprave Hielscher skladne z zahtevami CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.
Stojalo z epruvetami, obdelano s sonikacijo v UIP400MTP za striženje kromatina
Literatura / reference
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
Pogosta vprašanja
Kaj je kromatin?
Kromatin je strukturni kompleks DNA in z njo povezanih proteinov, ki organizira genetski material v jedru evkariontskih celic. Glavni proteini v kromatinu so histoni, okoli katerih je ovita DNA, da nastanejo nukleosomi. Ta organizacija zgosti DNA in hkrati uravnava dostop do genetskih informacij za procese, kot so transkripcija, replikacija in popravljanje DNA.
Katere vrste kromatina poznamo?
Kromatin na splošno razvrščamo v dve glavni obliki: evkromatin in heterokromatin. Evkromatin je rahlo zgoščen in transkripcijsko aktiven, kar transkripcijskemu aparatu omogoča lahek dostop do genov. Heterokromatin je bolj zgoščen in transkripcijsko neaktiven ter običajno vsebuje ponavljajoča se zaporedja DNA ali utišane gene. Heterokromatin lahko nadalje razdelimo na konstitutivni heterokromatin, ki ostaja trajno kondenziran, in fakultativni heterokromatin, ki lahko glede na celične razmere prehaja med aktivnim in neaktivnim stanjem.
Kaj je navzkrižno povezovanje?
Navzkrižno povezovanje je biokemični proces, ki se uporablja za stabilizacijo interakcij med biomolekulami z oblikovanjem kovalentnih vezi med njimi. Pri raziskavah kromatina se navzkrižno povezovanje pogosto uporablja za ohranitev interakcij med proteini in DNA v kromatinu pred analizo. Kemična sredstva, kot je formaldehid, se običajno uporabljajo za ustvarjanje reverzibilnih kovalentnih povezav med DNA in z njo povezanimi proteini, s čimer se molekularne interakcije učinkovito »zamrznejo« v določenem trenutku. Ta stabilizacija omogoča fragmentacijo in obdelavo kromatinskih kompleksov brez izgube nativnih povezav med DNA in regulatornimi proteini, kar je bistveno za tehnike, kot je imunoprecipitacija kromatina (ChIP).
Kaj je ChIP?
Imunoprecipitacija kromatina (ChIP) je tehnika molekularne biologije, ki se uporablja za raziskovanje interakcij med proteini in DNA v kromatinu. Pri tej metodi se kompleksi DNA in proteinov najprej stabilizirajo, običajno z navzkrižnim povezovanjem, nato pa se kromatin fragmentira. Protitelesa, specifična za ciljni protein, se uporabljajo za imunoprecipitacijo kompleksov proteinov in DNA, kar omogoča izolacijo in analizo povezanih zaporedij DNA.
Za kaj se uporablja ChIP?
ChIP se uporablja za prepoznavanje genomskih regij, na katere so vezani specifični proteini, povezani z DNA, kot so transkripcijski faktorji, histonske modifikacije ali regulatorni proteini, povezani s kromatinom. Tehnika se široko uporablja za preučevanje uravnavanja genov, epigenetskih modifikacij, vezavnih mest transkripcijskih faktorjev in strukture kromatina. V kombinaciji z nadaljnjimi analitskimi metodami, kot sta kvantitativni PCR (ChIP-qPCR) ali sekvenciranje z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev (ChIP-seq), omogoča kartiranje interakcij med proteini in DNA na ravni celotnega genoma.
Katere vrste ChIP poznamo?
Obstaja več različic imunoprecipitacije kromatina, odvisno od zasnove poskusa in nadaljnje analize. Najpogostejši pristopi vključujejo ChIP-qPCR, ki količinsko ovrednoti obogatitev specifičnih genomskih regij; ChIP-seq, ki uporablja sekvenciranje naslednje generacije za kartiranje interakcij med proteini in DNA po celotnem genomu; ter ChIP-chip, ki združuje ChIP z analizo z DNA-mikromrežami. Glede na obravnavano biološko vprašanje se široko uporabljajo tudi dodatne različice, kot sta nativni ChIP (N-ChIP), ki analizira kromatin brez navzkrižnih povezav, in navzkrižno povezani ChIP (X-ChIP), ki uporablja kemično navzkrižno povezovanje za stabilizacijo interakcij med proteini in DNA.
Striženje kromatina z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev s sonikatorjem za mikroplošče UIP400MTP
Hielscher Ultrasonics proizvaja visokozmogljive ultrazvočne homogenizatorje od laboratorijskih do industrijskih velikosti.